TUTUKLANMIŞ SHIPWORM BAKTERİSİ (Teredinobacter turnirae) İLE PROTEAZ ÜRETİMİ M. ELİBOL, M.Ş. TANYILDIZI, Ş. BULUT, D. ÖZER Fırat Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 23119, Elazığ ÖZET Bu çalışmada, proteaz üretimi için Teredinobacter turnirae hücreleri Ca-aljinat içerisinde tutuklanmıştır. Maksimum proteaz aktivitesi, %3 Na-aljinat, %3 CaCl2 konsantrasyonu ve 1 / 2 mikroorganizma / aljinat oranında 24 U/ml olarak elde edilmiştir. Ortama ilave edilen glutaraldehit, proteaz aktivitesinde azalmaya sebep olurken, 2 tanecik sayısından sonra aktivitede fazla bir değişim gözlenmemiştir. Tutuklanmış mikroorganizmalar ardarda sekiz batch deneyde aktifliğini koruruken, dördüncü batch den sonra volumetrik proteaz aktivitesinde yaklaşık 3.5 katlık bir artış gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Ca-aljinat; İmmobilizasyon; Proteaz; Shipworm; Teredinobacter turnirae GİRİŞ Proteaz enzimi, tüm canlı varlıklarda bulunan, büyüme ve çoğalma için gerekli olan bir enzimdir. Proteinlerin hidrolizinde spesifik olarak katalitik rol oynayan, fizyolojik ve ticari açıdan oldukça öneme sahip enzimlerden biridir. 1998 yılındaki verilere göre, toplam 1.3 milyar $ lık endüstriyel enzim üretiminin, yaklaşık 4 milyon $ kısmı deterjan endüstrisi için harcanmıştır [1]. Önümüzdeki on yıl içinde bu kullanım oranının çok daha artacağı beklenilmektedir. Proteolitik enzimlerin (proteazlar) kullanıldığı en önemli alanlar: evsel, endüstriyel, ticari çamaşırhaneler ve bulaşık makineleridir. Ancak, evsel kullanım ticari açıdan en büyük payı oluşturmaktadır. Proteazlar, deterjan sanayinde kullanılan en önemli katkı maddeleridir. Çünkü çamaşırlarda sıklıkla bulunan, kan, yemek, ter gibi bazı kirlerin çözünüp çamaşırdan ayrılmasını sağlarlar. Proteaz enzimleri, proteinli kirlerdeki peptid bağlarını hidroliz ederek, kumaş üzerinden kirleri uzaklaştırırlar [2]. Endüstriyel birçok firma, sürekli olarak, katalitik aktiviteyi artıracak yeni enzimleri bulmaya, onları tanımlamaya ve büyük ölçekli proseslerde elde etmeye çalışmaktadırlar. Bunlardan bir tanesi de, ilk defa 1983 yılında Ruth Turner ın izole ettiği, bir shipworm (marinal) bakteri olan Teredinobacter turnirae tarafından üretilen oldukça aktif proteaz enzimidir [3,4] T.turnirae nin büyümeyle paralel giden en az iki proteaz enzimini salgıladığı bilinmektedir ve bu enzimler fenilmetilsulfonil florür (FMSF) e olan hasasiyetle birbirinden ayırt edilebilir ve ultrafiltrasyon metoduyla da ayrılmaları mümkündür [5] Subtilisin gibi proteaz enzimlerinin deterjanlarda kullanılabilmesi için, istenen birçok özelliklere sahip olmasına rağmen, deterjan formülasyonunda sıkça kullanılan perboratlar ve oksitleyici maddelere karşı oldukça hassastırlar ve olumsuz yönde etkilenirler. T.turnirae den elde edilen proteazın bu maddelerin varlığında bile kararlılık göstermesi, diğer enzimlere kıyasla bu enzimi bir adım öne çıkarmaktadır. Alkaline proteaz, deterjan endüstrisinde sıkça kullanılan proteaz enzimlerden biri olup, enzim piyasasının oldukça önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Detarjana eklenen proteaz, proteinli maddelerin kirden uzaklaştırılmasını sağlar. Alkaline proteazın deterjan endüstrisindeki artan
kullanımı, bu tür enzimin temizleme yeteneğinin çevre kirliliği açısından (non-fosfat) kabul edilebilir düzeyde olmasından kaynaklanmaktadır. Yıkama etkinliğini artırmasına ilaveten, bu enzimlerin kullanımı, yıkama sıcaklığını ve karıştırma peryodunu düşürür. Proteaz ve lipaz enzimlerinin birlikte kullanılarak, protein ve yağ lekelerini uzaklaştırma prosesinin de oldukça faydalı olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, deniz bakterisinden elde edilen alkaline proteazın, kontak lens temizleme çözeltilerinde düşük sıcaklıklarda etkili olduğu bulunmuştur [5]. Bu çalışmada esas olarak, kalsiyum aljinat içinde tutuklanmış mikroorganizma kullanılarak proteaz üretimi için gerekli proses şartlarının optimizasyonu hedeflenmiştir. DENEYSEL Bir marinal bakteri olan mikroorganizma, simbiotik olarak yaşadığı Teredinidae familyasından ve Deshayes salgı bezlerinden izole edilmiştir. Proteaz enziminin yanı sıra selülaz enzimini de üretmektedir. Yapılan tüm deneylerde besi ortamı olarak: (litrede) 5 g sakkaroz, 1 g NH 4 Cl,.4 g KCl, 1.9 g MgSO 4.7H 2 O, 1.5 g MgCl 2.6H 2 O,.4 g CaCl 2.2H 2 O, 4.9 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)- 1-piperazineethanesulfonic acid),.1% (v/v) Antifoam 289, 1 ml Çözelti A, 1 ml metal çözeltisi. Çözelti A (litrede) 24 g K 2 HPO 4.3H 2 O, 12 g Na 2 CO 3,.3 g Fe 2 (SO 4 ) 3. Metal çözeltisi ise 2.9 g H 3 BO 3, 7.2 g MnCl 2.4H 2 O,.2 g ZnSO 4.7H 2 O,.4 g Na 2 MoO 4.2H 2 O,.5 g CoSO 4.7H 2 O,.8 g CuSO 4.5H 2 O tuzlarından oluşmaktadır [6]. Ortam ph sı başlangıçta 8 e ayarlanmış ve fermantasyon süresince doğal seyrine bırakılmıştır. Deneyler 5 ml besi ortamı içeren 25 ml lik erlenlerde ve 3 C, 12 rpm çalkalama hızında gerçekleştirilmiştir. Tutuklama işlemi için, belirli oranlarda kültür, sodyum aljinat ile karıştırılmış ve elde edilen karışım CaCl 2 içine 1 ml kapasiteli enjektör ve 19 G 1-1/2 lik iğne ile damlatılarak aljinat tanecikleri elde edilmiştir. Serbest ortamdaki mikroorganizma konsantrasyonu 6 nm de spektrofotometrik olarak, tutuklanmış mikroorganizma konsantrasyonu ise BCA metodu ile protein ölçülerek tayin edilmiştir. Proteolitik aktivite ise %.8 azokazein kullanılarak belirlenmiştir [7]. SONUÇLAR Özellikle tutuklanmış mikroorganizmalar bulundukları mikroçevreye ve ortamda yapılacak küçük değişimlere karşı oldukça hassastırlar. Bu yüzden bu çalışmada birçok parametrenin proteaz üretimi üzerine etkileri araştırılmıştır. Na-Aljinat Konsantrasyonunun Etkisi Mikroorganizmanın aktivitesi ve dolayısıyla proteaz üretimi, oluşan taneciklerin aljinat içeriğinden şuphesiz etkilenecektir. Optimum Na-aljinat konsantrasonunu bulmak için %1 (w/v) ile % 5 (w/v) arasında değişen beş farklı Na-aljinat konsantrasyonu kullanılmış ve proteaz üretimi üzerine etkileri incelenmiştir. Kültür içeren çözelti farklı konsantrasyonlardaki Na-aljinat ile 1/1 oranında karıştırılmış ve elde edilen karışım, çaprazbağlama için gerekli olan %3 (w/v) CaCl 2 içine damlatılmıştır. Elde edilen maksimum biyomas ve proteaz aktiviteleri Şekil 1 de verilmiştir. Na-aljinat konsantrasyonu elde edilen taneciklerin yoğunluğunu önemli derecede etkilemektedir. Şekillerden de anlaşılacağı üzere, düşük Na-aljinat konsantrasyonlarında elde edilen taneciklerde mikroorganizma tam olarak matriks içinde tutuklanamamakta ve tanecikten dışarı sızmaktadır. Dolayısıyla ortamda serbest halde mikroorganizma da yer almaktadır. Yüksek Na-aljinat konsantrasyonlarında elde edilen taneciklerdeki gözenekliliğin düşük olmasından dolayı, kütle transfer problemleri ortaya çıkmakta; bu da proteaz üretimini olumsuz yönde etkilemektedir. Sonuç olarak bu parametrelerin değerlendirilmesiyle %3 Na-aljinat konsantrasyonu, T.turnirae nin tutuklanması için en uygun değer olarak görülmektedir.
4 25 Biomas (g/litre) 3 2 1 1 2 3 4 5 6 Na-Aljinat (%, w/v) 2 15 1 5 Maksimum Proteaz (U/mL) Şekil 1 Na-aljinat konsantrasyonu ile maksimum biomas (immobilize) konsantrasyonu ve proteaz aktivitesinin değişimi. ( Biomas; Maksimum Proteaz) (Mikroorganizma / Aljinat Oranı: 1/1; % 3 CaCl 2 ; ~3 Aljinat Taneciği) CaCl 2 Konsantrasyonunun Etkisi CaCl 2, immobilizasyon işlemi esnasında polimerin (aljinat) çapraz bağlanması amacıyla kullanılmaktadır. Dolayısıyla CaCl 2 konsantrasyonu, elde edilecek taneciklerin stabiltitesi ve gözeneklilikleri açısından oldukça önemlidir. Bu amaçla, %1-5 arasında değişen beş farklı durum için CaCl 2 konsantrasyonun etkisi incelenmiş ve sonuçlar Şekil 2 de verilmişir. Sonuçlardan T.turnirae nin Ca-aljinat içinde immobilizasyon işlemi esnasında en uygun konsantrasyonunun % 3 olduğu sonucuna varılmıştır. %1 ve %2 CaCl 2 konsantrasyonlarında mikroorganizmanın matriks içinden ortama sızdığı, daha düşük biomas ve proteaz aktivitesi; %4 ve %5 CaCl 2 değerlerinde de ise ortamda serbest mikroorganizma yok denecek kadar az olmasına rağmen, %3 değerine oranla nispeten daha düşük biomas ve proteaz aktivitesi elde edilmiştir. Dolayısıyla bundan sonraki immobilize hücrelerin kullanıldığı deneylerde %3 Na-aljinat ve %3 CaCl 2 konsantrasyonları kullanılmıştır. Mikroorganizma / Na-Aljinat Oranının Etkisi Bundan önceki deneylerde immobilizasyon işlemi esnasında, kültür (mikroorganizma) / Na-aljinat karışımı 1/1 oranında alınmıştı. Ancak jel matriks içinde tutuklanan mikroorganizma miktarının proteaz fermantasyonu üzerine etkisi olabileceği düşünülerek, bu oran.1-2 arasında olmak üzere 8 farklı değer için değiştirilmiş ve genel sonuçlar Şekil 3 de verilmiştir. Görüldüğü gibi, en yüksek proteaz aktivitesi 1/2 oranındaki karışımdan elde edilmiştir. Yüksek oranlarda (özellkle 2/1 değerinde) nispeten daha fazla hücre, polimer matriks dışına çıkmış ve ortamda serbest mikroorganizma konsantrasyonu ölçülmüştür. 1/2 den daha düşük oranlarda elde edilen tanecikler ise daha düşük proteaz üretimini gerçekleştirmişlerdir. Ayrıca 1/2 ve daha düşük oranlarda hazırlanan tanecikler, yüksek oranlarda hazırlanan taneciklere oranla çok daha düzgün yapıda küreler şeklinde elde edilmiştir. Dolayısıyla bundan sonraki immobilizasyon işleminde mikroorganizma / Na-aljinat oranı 1/2 olarak alınmıştır.
4 25 Biomas (g/litre) 3 2 1 2 15 1 5 Maksimum Proteaz (U/mL) 1 2 3 4 5 6 CaCl 2 (%, w/v) Şekil 2 CaCl 2 konsantrasyonu ile maksimum biomas (immobilize) konsantrasyonu ve proteaz aktivitesinin değişimi. ( Biomas; Maksimum Proteaz) (Mikroorganizma / Aljinat Oranı: 1/1; % 3 Na-aljinat; ~3 Aljinat Taneciği) Ortamda Bulunan Tanecik Sayısının Etkisi Tüm fermantasyon sistemlerinde olduğu gibi, T.turnirae den proteaz üretiminde de şüphesiz ortamda bulunan mikroorganizma miktarı, üretimi etkileyen en önemli parametrelerden biridir. Bu kısımda besi ortamı hacmi (5 ml) ve substrat içeriği sabit tutularak, fermantasyon ortamında kullanılan aljnat tanecik sayısı 1 ile 3 arasında değişen yedi farklı değerde ortama ilave edildi. Elde edilen sonuçların özeti Şekil 4 de görülmektedir. Maksimum proteaz aktivitesi 2 tanecik içeren duruma kadar artış göstermekte, bu değerden sonra pek fazla bir değişiklik görülmemektedir. Dolayısıyla proteaz T. turnirae den proteaz üretimi için 2 aljinat taneciğinin en uygun değer olduğu söylenebilir. Bu şekilde 24 U/ml aktiviteye sahip proteaz üretimi söz konusu olabilmektedir. 25 Maksimum Proteaze (U/mL) 2 15 1 5 2/1 1/1 1/2 1/5 1/1 1/2 1/5 1/1 Mikroorganizma / Aljinat Oranı Şekil 3 Mikroorganizma / Na-aljinat oranı ile maksimum proteaz aktivitesinin değişimi. (Na-aljinat: %3; CaCl 2 : %3, ; ~3 Aljinat Taneciği)
3 Maksimum Proteaz (U/mL) 25 2 15 1 5 1 2 3 4 Tanecik sayısı Şekil 4 Tanecik sayısının proteaz üretimi üzerine etkisi (Na-aljinat: %3; CaCl 2 : %3, ; Mikroorganizma/Na-aljinat : 1/2) Glutaraldehit İlavesinin Etkisi Yapılan tüm deneylerde mikroorganizmanın, kullanılan ortama bağlı olarak az veya çok, polimer matriks içinden sıvı ortama sızdığı gözlenmiştir. Bu durum Ca-aljinat taneciklerinin zamanla kararlılığını yitirmesi şeklinde açıklanabilir. Bunu gidermek için immobilizasyon sonrası elde edilen tanecikler, farklı konsantrasyonlarda ve farklı zaman peryotlarında glutaraldehit ile muamele edildi. Bunun için önce, tanecikler %.5, %.1 ve %.5 (w/v) oranlarında glutaraldehit çözeltisi içinde 3 dakika sure ile bekletildi. Şekil 5 de görüldüğü gibi, glutaraldehit konsantrasyonu arttıkça, proteaz aktivitesi de azalmaktadır. Kullanılan tüm konsantrasyonlarda, mikroorganizma sızıntısı ihmal edilecek düzeyde olmasına rağmen (polimer matriks sertliğinin artması sonucu), glutaraldehitle muamele proteaz aktivitesinde önemli düşüşlere neden oldu. Ca-Aljinat taneciklerinin glutaraldehit çozeltisi içinde bekletme süresinin de, tanecik sertliğinde, dolayısıyla immobilizzasyon işlemi üzerinde etkisi olabileceği düşüncesiyle, elde edilen tanecikler farklı zaman peryotlarında %.5 (w/v) glutaraldehit çözeltisi içinde bekletildi. Bunun için immobilizasyon ile elde edilen Ca-aljinat tanecikleri 3 dakika, 1 saat ve 5 saat sürelerle glutaraldehit içinde bekletildi. Ancak bu deneyde de bir öncekinde olduğu gibi, bekletme süresi arttıkça proteaz aktivitesinin azaldığı gözlendi (Şekil 6). Bu durum, glutaraldehitin aljinat taneciklerinin sertliğini ve/veya stabilitesini artırdığı; ancak bunun yanında poroziteyi azaltarak kütle transfer olaylarını güçleştirdiği ve dolayısıyla proteaz aktivitesinin de azaldığı şeklinde açıklanabilir. İmmobilize T.turnirae nin Tekrar Kullanılabilirliği (Repeated-Batch) İmmobilize haldeki mikroorganizmanın en büyük avantajlarından biri de özellikle sürekli sistemlerde tekrar kullanılabilirliğidir. Ca-aljinat taneciklerine tutuklanmış T.turnirae nin tekrar kullanılabilirliğini incelemek amacıyla her 3 günde mikroorganizma tarafından kullanılan besi yeri yenisiyle değiştirildi. Bu şekilde 8 kez değiştirilen ortamda, mikroorganizma aktif bir şekilde proteaz üretimini gerçekleştrirebildi. Şekil 7 den da görüldüğü gibi, başlangıçta maksimum proteaz üretimi 3.gün sonunda elde edilirken, özellikle 4 ve 5. değişimden sonra maksimum proteaz çok daha kısa sürede elde edildi. Bunun sebebi, ilk başlarda mikroorganizma, gelişimi için gerekli olan lag evresini tamamlarken; zamanla bu evre önceden tamamlandığından, daha kısa sürede aşıldı ve daha önce maksimum proteaz aktivitesi ölçüldü.
Proteaz (U/mL) 3 25 2 15 1 5 Proteaz (U/mL) 3 25 2 15 1 5 5 1 15 Zaman (saat) 5 1 15 Zaman (saat) Şekil 5 Glutaraldehitle muamelenin Şekil 6 Ca-Aljinat taneciklerinin proteaz aktivitesi üzerine etkisi %.5 (w/v) Glutaraldehit çözeltisi içinde ( Kontrol %.5, %.1, %.5) bekletme sürelerinin, proteaz aktivitesi üzerine etksi. ( Kontrol 3 dak, 1 saat, 5 saat) 3 25 Proteaz (U/mL) 2 15 1 5 1 2 3 4 5 6 Zaman (saat) Şekil 7. İmmobilize T.turnirae nin Tekrar Kullanılabilirliği (Repeated-Batch) KAYNAKLAR 1. Godfrey,T. The industrial enyzmes market, http://www.biocatalysts.com, 2. 2. Eriksen, N., Detergents in Industrial Enzymology. T. Godfrey and S. West (ed.). Stockton Press, 2nd. Ed., London, 1996. 3. Waterbury, J.B., Calloway, C.B., Turner, R.D., A cellulolytic nitrogen-fixing bacterium cultured from the gland of Deshayes in shipworms (Bivalvia:Teredinidae), Science, 221, 141-143. 1983. 4. Waterbury, J.B., Calloway, C.B., Turner, R.D., Bacteria for cellulose digestion, 1989. U.S. Patent 4,861,721. 5. Greene, R.V., Cotta, M., Griffin, H.L., A novel symbiotic bacterium isolated from marine shipworm secretes proteolytic activity, Current Microbiology, 19,353-356, 1989. 6. Grene, R.V., Ferrer, S.N., Growth characteristics of a novel nitrogen-fixing cellulolytic bacterium, Appl.Environ.Microbiol., 52, 982-986, 1986. 7. Cotta, M.A. and Hespell, R.B. Proteolytic activity of the ruminal bacterium Butyrivibrio fibrisolvens, Appl.Environ.Microbiol, 52, 51-58, 1986.