BİTKİ ANALİZ YÖNTEMLERİ Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 8. Ders
Yağlar Ham Yağ Analizleri Yağ Asit Analizleri Uçucu Yağ Analizleri 2
YAĞLAR; Suda ÇÖZÜNMEZLER Eter, Benzen ve Kloroform gibi organik çözücülerde ÇÖZÜNÜRLER. Yağ asitleri, yağda eriyen vitaminler, steroidler, mumlar, karotenoidler 3
KONKSİYONLARI Enerji kaynağı (2.25 kat daha fazla enerji depolanması) 9 kcal/g yağ Vücut sıcaklığının korunması Hücre zarının önemli yapı taşları (fosfolipidler) Prostaglandinlerin ön maddesidir. Kolesterol (sinir sistemi, hormon üretimi, safra tuzları sentezi) 4
Kimyasal yapılarına göre sınıflandırma 1. Gerçek Yağlar (Trigliseridler) 2. Yağ Benzeri Maddeler 5
1. Gerçek Yağlar (Trigliseridler) Gliserol +3 molekül Yağ Asidinden oluşmuştur 6
Yağ Asitlerinin Kimyasal Yapıları 2 veya 2 nin katları olan sayılarda C atomu içerirler En çok rastlanan yağ asitleri 16-18 C ludur. Yapılarında ÇİFT BAĞ içeren yağ asitlerine DOYMAMIŞ yağ asitleri denir. Tüm C atomları H iyonu taşıyan yağ asitlerine DOYMUŞ yağ asitleri denir. Her yağ asidinin sonunda bir adet COOH vardır 7
Doymuş ve Doymamış Yağ Asidi 8
Yağ asitleri Doymuş Yağ Asitlerine ait Özellikler Sistem. Gös. Kısa Göster. Erime Nok. ( o C) Kaynak Bütirik n-butanik C-4:0-8 Süt yağı Kaproik n-hekzanik C-6:0-2 Süt yağı Kaprilik n-oktanik C-8:0 16 Süt ve Palmiye yağı Kaprik n-dekanik C-10:0 31 Süt ve Palmiye yağı Laurik n-dodekanik C-12:0 44 Süt ve Domuz yağı Miristik n-tetradekanik C-14:0 54 Süt ve Domuz yağı Palmitik n-hegzadekanik C-16:0 63 Hayvan ve Bitki yağl. Stearik n-oktadekanik C-18:0 70 Hayvan ve Bitki yağl. Araşidik n-aykosanik C-20:0 76 Yer Fıstığı ve Süt yağı 9
Doymamış Yağ Asitlerine ait Özellikler Yağ asitleri Kısa Göster. Erime Nok. ( o C) Kaynak Palmitoleik C-16:1 1 Balık ve Hayvansal Yağl. Oleik C-18:1 13 Hayvan ve Bitki Yağları Linoleik* C-18:2-6 Soya Yağı Linolenik* C-18:3-11 Keten ve Soya Yağı Araşidonik* C-20:4-50 10
Numerik Sembol İsim Kimyasal Yapı 14:0 Myristic acid CH 3 (CH 2 ) 12 COOH 16:0 Palmitic acid CH 3 (CH 2 ) 14 COOH 16:1 D9 Palmitoleic acid CH 3 (CH 2 ) 5 C=C(CH 2 ) 7 COOH 18:0 Stearic acid CH 3 (CH 2 ) 16 COOH 18:1 D9 Oleic acid CH 3 (CH 2 ) 7 C=C(CH 2 ) 7 COOH 18:2 D9,12 Linoleic acid CH 3 (CH 2 ) 4 C=CCH 2 C=C(CH 2 ) 7 COOH 18:3 D9,12,15 Linolenic acid CH 3 CH 2 C=CCH 2 C=CCH 2 C=C(CH 2 ) 7 COOH 20:4 D5,8,11,14 Arachidonic acid CH 3 (CH 2 ) 3 (CH 2 C=C) 4 (CH 2 ) 3 COOH 11
Esansiyel Yağ Asitleri Yapılarında ÇİFT BAĞ içerirler Linoleik, Linolenik ve Araşidonik Asitler Hayvanlar için esansiyel özelliğe sahiptirler. Düşük düzeyde ihtiyaç nedeniyle yetersizlik belirtisi fazla görülmez. Sadece deri epitel hücrelerinde bozukluklar, gelişmede yavaşlama, verim düşüklüğü ve kısırlık görülür. 12
Bazı Yağların Yağ Asidi Kompozisyonu Katı Yağ Laurik Miristik Palmitik Stearik Oleik Linoleik Linolenik Tereyağ 1-4 8-13 25-32 8-13 22-29 2-4 Sığır 2-3 24-32 20-25 37-43 2-3 Domuz 1-2 25-30 12-16 40-50 3-8 Sıvı Yağ H. cevizi 44-50 13-18 7-10 1-4 5-8 1-3 Zeytin 0-1 0-2 7-20 2-3 53-86 4-22 Yerfıstığı 0-1 6-10 3-6 40-65 17-38 Pamuk to. 0-3 17-23 1-3 23-44 34-55 Mısır 1-2 8-12 2-5 29-49 34-56 Soya 0-1 6-10 2-5 20-30 50-60 2-10 Keten to. 0-1 5-9 4-7 9-29 8-29 45-67 13
UÇUCU YAĞLAR Uçucu yağlar (esanslar, eterik yağlar) kokulu bitkilerin salgıladığı uçucu karışımlardır. Genellikle sıvı olan bu karmaşık karışımlar kokulu kimyasal bileşiklerden oluşurlar. İlaçlarda selüloz, nişasta, pektin, protein, şeker gibi tedavi yönünden etkisiz maddeler yanında çok az miktarlarda bile, farmakolojik etkilere sahip bileşikler de bulunmaktadır. Bu bileşiklere " ismi de verilmektedir. Bu maddelerden biri olan esanslar, esas itibariyle terpenlerden oluşmuş karışımlardır. 14
Oda sıcaklığında sıvı, bazen donabilen uçucu, kuvvetli kokulu ve yağımsı karışımlardır. Su buharı ile sürüklenir, suda çözünmez, organik çözücülerde kolaylıkla çözünürler. Uçucu yağlar ya bitkinin belirli organlarında örneğin taç yaprak, yaprak, meyve, kabuk, meyve sapı, odunsu doku gibi ya da bitkinin tüm organlarında ayrıca bazen bir organın belirli dokularında da bulunabilirler. Bu yağlar bitkilerin bağlı bulunduğu familyalara göre salgı tüyünde, salgı ceplerinde, salgı kanallarında veya salgı hücrelerinde bulunmaktadır. 15
16
17
18
19
Kekik, adaçayı, lavanta, biberiye, oğulotu, fesleğen, nane, gibi Labiatae üyelerinin yapraklarında bulunan salgı tüylerinde, anason, kimyon, rezene ve kişniş gibi Umbellifeae üyelerinin meyvelerinde bulunan salgı kanallarında, portakal, limon, greyfurt, mandarin gibi Citrus türlerinin kabuklarında bulunan salgı ceplerinde, karaçam, sarıçam ve kızılçam gibi Pinus türlerinin ise gövde kabuklarında bulunan reçine kanallarında uçucu yağlar salgılanır. 20
Uçucu yağlar bitkinin tamamına yayılabileceği gibi, sadece bir organında da yoğunlaşabilirler Yasemin, misk adaçayı, lavanta, neroli, ylang-ylang, gül gibi aromatik bitkilerin çiçeklerinde, anason, kimyon, rezene, kişniş, vanilya gibi aromatik bitkilerin meyvelerinde, kekik, oğulotu, biberiye, okaliptus, defne, ıtır, adaçayı gibi aromatik bitkilerin yapraklarında, vetiver, melekotu, eğir, zencefil, süsen gibi bitkilerin köklerinde, sandal, sedir, tarçın gibi odunsu bitkilerin gövde kabuklarında, bergamut, limon, portakal, turunç gibi bitkilerin meyve kabuklarında uçucu yağlar yoğunlaşmıştır. 21
Uçucu yağlar genellikle renksizdirler, ancak hava ile uzun süre temasta bırakıldıklarında zamanla renkleri ve kokuları değişir. Bu nedenle uçucu yağlar mümkün oldukça cam kaplarda, 20 C yi aşmayan sıcaklıkta ve karanlıkta saklanmalıdırlar. 22
Uçucu yağlar tek bir ana bileşenden oluşmaz; kimyasal yapıları farklı onlarca, hatta yüzlerce farklı bileşenlerden meydana gelirler. Gül yağını (Oleum Rosae) oluşturan 100'den fazla madde vardır, ancak bunlardan üçü (sitronellol, geraniol ve nerol) çok önemlidir. Yine, kekik yağında (Oleum Thymi) 10'dan fazla madde vardır, ancak bunlardan ikisi (karvakrol ve timol) çok önemlidir. Nane yağında (Oleum Menthae) ise yine onlarca madde vardır, bunlardan en önemli ikisi menthol ve menthondür. 23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
HAM YAĞ ANALİZİ* Kullanılacak Araç, Gereç ve Kimyasallar -Hassas laboratuvar terazisi -Soxhelet cihazı -Kurutma fırını -Desikatör -Balon jojeler (500 ml lik) -Çözücü (Petrolium eter veya hexan) -Kurutma kağıdı -Yağ kartuşları -Değirmen -Pamuk *Uzun F. Tarla Bitkilerinde Laboratuvar Analizleri Uygulama Ders Notu, Chapter Arslanoğlu F. ve Uzun F. Sf. 38-43 39
Ham yağ analizleri iki yöntemle yapılır. 1. Yöntem: Analizi yapılacak olan örnek, 1 mm lik elekten geçecek şekilde öğütüldükten sonra 5 g örnek alınır. Bu numuneyi alacak büyüklükte kurutma kağıdı uygun boyutlarda kesilir (Yaklaşık 10x10 cm). Kesilen kurutma kağıtları külah şekline getirilir ve içine bir miktar pamuk konularak darası alınır. Analiz edilecek örnek tartılarak külah içine yerleştirilir, üzerine yine bir miktar daha pamuk konulur ve dökülmeyecek şekilde zımbalanır. 40
Toplam kartuş ağırlığı alındıktan sonra, üzerine değeri ve örnek numarası yazılır. Daha sonra örnekler soxhelet cihazının resimlerde de görülebileceği üzere distile kısmına yerleştirilir. Balon jojeler içerisine 250 ml çözücü (petrolium eter veya hekzan) konulur. Cihazın termostatı 60 C a ayarlanır (Bu sıcaklık derecesi eterin kaynaması için yeterlidir). Isıtıcı ile birlikte cihazın, musluğa bağlı olan soğutma sistemi de çalıştırılır. 41
Bu şekilde kaynama gerçekleşince, buharlaşan çözücü, soğutma sistemi sayesinde tekrar yoğunlaşarak analiz edilecek örneğin üzerine damlamaya başlar. Bu şekilde işlem 5-6 saat kadar sürdürülür. Eterin damlama hızı saniyede 5-6 damla ise, işlem 4 saatte tamamlanır. Bu süre zarfında örneklerin bulunduğu kısım, damla damla gelen çözücü ile dolar ve bu esnada örnek içerisindeki yağ çözünür. Bu şekilde analiz edilecek örneklerin yerleştirildiği distile kısmındaki çözücü seviyesi belli bir doluluk oranına ulaşınca, kendiliğinden sifon yaparak çözündürdüğü yağ ile birlikte balon jojelerin içerisine boşalır. 42
Bu işlem belirtildiği gibi 4 saat süre zarfında defalarca tekrarlanır. İşlem süresi tamamlandığında kartuş, cihazdan alınarak 2-3 saat kadar laboratuvarda açık havada ve daha sonra da 70 C da kurutma fırınında sabit ağırlığa gelene kadar kurutulur (Bu süre yaklaşık 4 saat olmasına rağmen bitki örneğine göre süre uzayabilir). Sabit ağırlığa gelen örnek, etüvden çıkarılarak desikatörde oda sıcaklığına gelene kadar soğumaya bırakılır. Bu şekilde yaklaşık 1-2 saat bekleyen örnek, desikatörden çıkarılarak tartılır. Örneğin ilk ağırlığı ve son ağırlığı arasındaki fark, örnekten ayrılan yağın miktarını verir. 43
44
Not: Örneğin yağını çözündürmede kullanılan petrol eter ve hexan ın kaynama sıcaklıkları oldukça düşük (Petrol eter = 34.6 C, Hexan = 69 C), çabucak gaz haline geçebilen ve çabuk alev alabilen bir özelliğe sahiptir. Bu nedenle soxhelet cihazındaki işlem bitince, kurutma kağıdından yapılan külah şeklindeki kartuşlardan uzaklaştırılabilmeleri için, kurutma dolabına konulmadan önce 2 saat kadar bir süreyle laboratuvar ortamında açık havada bekletilmeleri, çalışma emniyeti açısından gerekli olan bir işlemdir. Örnekler daha sonra kurutma dolabında 70 C sıcaklık derecesinde sabit ağırlığa gelene kadar kurutulmalıdır. 45
2. Yöntem: Bu yöntem, 1. yöntemin sistem olarak aynısıdır. Bu yöntemde yapılan işlem, örnekten çözündürülen yağın, çözücüden ayrılarak miktarını tespit etme prensibine dayanır. Bu yöntemde de analiz edilecek örnekten 5 g tartılır ve yağ analizi için özel olarak yapılmış kartuşa konulur (Kartuşun içine örnek konulmadan önce bir miktar pamuk yerleştirilir üzerine 5 g örnek ve örnek üzerine de tekrar pamuk konulur. Aynı diğer metotta olduğu gibi cam aparatın ilgili kısmına yerleştirilir. 46
Cihaz çalıştırılır, çözücünün kaynaması gerçekleştirilir ve önceki yöntemde belirtilen süre zarfında kartuş içerisindeki örnekten yağın çözündürülerek balon jojeye aktarılması sağlanır. İşlem sonucunda balon jojedeki çözücü+yağ karışım evaporatör ile yağdan ayrılarak, balon jojede sadece yağın kalması sağlanır. Daha sonra balon joje+yağ birlikte tartılır. Daha önceden darası bilinen balon jojenin ağırlığı bu değerden çıkarılarak örnekteki yağ miktarı belirlenir. 47
1. yöntemle analiz yapmak, yani kurutma kağıtlarından hazırlanan kartuşlarla örnekteki yağ kaybından yararlanılarak daha kısa süre ve daha az miktarda kimyasal kullanımı ile gerçekleşmektedir. Bu işlemde, önemli olan her bir örneğin üzerindeki numaranın analiz esnasında silinmemesi ve örneklerin ait olduğu işlemin karıştırılmamasıdır. Bu nedenle her bir kartuşun üzerine kurşun kalem ile, analize konulmadan önceki toplam ağırlık ve örnek numarası birkaç yere yazılmalı ve ayrıca laboratuvar defterine kaydedilmelidir. 48
Kurutma kâğıtlarından kartuş hazırlamada, analiz sırasında kurutma kağıdı dışına öğütülmüş örneklerin çıkmaması ve süzülme işleminin daha iyi olabilmesi için kartuş (külah), iki kat kağıdın üst üste konulmasıyla hazırlanmalı, analiz edilecek örnek kartuşlara yerleştirilirken hem altına hem de üstüne bir miktar pamuk konulması unutulmamalıdır. 49
50
UÇUCU YAĞ ANALİZİ* Kullanılacak Araç, Gereç ve Kimyasallar -Hassas laboratuvar terazisi -Clevenger aparatları -Balon jojeler -Saf su *Uzun F. Tarla Bitkilerinde Laboratuvar Analizleri Uygulama Ders Notu, Uzun F. Ve Çırak C. Sf. 35-37 51
Analizin Yapılışı Kurutulmuş olan 80-100 g kadar örnek 500 ml lik bir balon jojeye konulur. Kaynamanın iyi olması için yuvarlak kısmının yaklaşık olarak 1/3 i kadar kısmı boş kalacak şekilde saf su ile doldurulur ve cihazın üzerindeki yuvasına yerleştirilir. Balon jojede belirtilen miktarda boşluk bırakılmaz ve daha fazla örnek-saf su karışımı ile doldurulursa, analiz esnasında meydana gelecek olan kaynama nedeniyle oluşan genleşme ve fokurdama sonucunda, analiz edilecek örnek, cam malzemenin üst kısımlarına doğru çıkar ve analizin sağlıklı bir şekilde gerçekleşmesi engellenmiş olur. 52
Daha sonra cihazın bağlı bulunduğu ve soğutma sisteminin çalışmasını sağlayan musluk açılarak suyun devir daimi sağlanır. Bu suyun soğutma sisteminden geçtikten sonra tahliyesini sağlayacak olan hortum da lavabonun gideri üzerine bırakılır. Bu şekilde analiz edilecek örnek ve saf su karışımı kaynamaya bırakılır. Kaynama esnasında saf su ile çözünen uçucu yağ, gaz halinde cam malzemeden yukarıya doğru yükselir. 53
Cam malzemenin üst kısmında, içinden sürekli soğuk suyun devir daim yapması nedeniyle sürekli soğuk olarak tutulan ve örnekten ayrılarak gaz formuna geçen uçucu yağın çıkış yolunu tıkayan, üst kısmı yuvarlak top şeklinde, ayrı bir cam malzeme vardır. Bu malzeme, soğuk olduğu için gaz halinde yükselen uçucu yağı yoğunlaştırır ve damlalar halinde en alt ucunda cam musluk bulunan kola dökülmesini sağlar. Bu kolda, uçucu yağ ve buharlaşan saf su birlikte biriktirilir. 54
Uçucu yağ, sudan hafif olduğu için suyun üst kısmında, saf su ise alt kısmında toplanır. Fazla biriken saf su, cam malzemenin ekli bir tahliye borusundan tekrar kaynama haznesine kendiliğinden tahliye olur. İşlem bu şekilde 4 saatlik bir süre ile devam ettirilir. Bu süre sonunda biriken uçucu yağ, ölçü camının üzerindeki miktar okuma çizgilerinden okunur. Daha sonra uçucu yağın alt kısmında biriken su, dikkatli bir şekilde ayrı bir kaba alınır. Su alındıktan sonra uçucu yağ, musluk seviyesine inince bu yağı alacağımız kap, aşağıdaki resimlerden de görüldüğü üzere musluğun ucuna tutulur ve çok dikkatli bir şekilde alınarak, koyu renkli, güneş ışığını engelleyen cam bir şişede biriktirilir. 55
Uçucu yağ alınırken çok dikkatli ve hassas olunmalıdır. Çünkü miktar olarak uçucu yağ, toplam örnek miktarının çok düşük bir oranını oluşturur. Dolayısıyla alınırken dikkatli olunmalı, yağın alt kısmındaki su boşaltılırken yağın da su ile birlikte kaçması engellenmelidir. Aşağıda resimlenen uçucu yağ analiz çalışmasında, 40 g lavanta örneği kullanılmıştır. Bu çalışma neticesinde elde edilen uçucu yağ miktarı 0.5 ml dir. Lavanta örneğinde bulunan uçucu yağın oransal ifadesinin hesaplanması örnek hesaplama olarak aşağıda verilmiştir. 56
Not: Analizde kullanılan cam malzemeler bir sonraki örneğin analiz işlemi için temizlenmelidir. Çünkü, analiz esnasında ölçü kolunda biriken uçucu yağ cama bulaşıktır. Yıkama yapılmazsa bu kalıntı nedeniyle, su ve yağ bir sonraki analizde ara ara birbirinin arasına girebilir. Bu durum, uçucu yağın alınmasında güçlük oluşturmaktadır. Bu da, çalışmadan hassas bir sonuç elde edilmesini engellemektedir. Bu nedenle kullanılan cam malzemenin temiz olması doğru ve sağlıklı bir çalışma için oldukça önemlidir. Yapılan analiz işlemi sonunda su banyosunun cam aksamı yağı çözerek temizleyen eter veya aseton gibi kimyasal maddeler ile temizlenmelidir. Bu maddeler uçucu olduğundan yıkanan malzemede kalıntı da bırakmamaktadır. Cam malzemeler, bu maddelerle yapılan temizlik sonrasında saf sudan da geçirilerek bir diğer analiz için hazır hale getirilir. 57
YAĞ ASİT ANALİZLERİ Tohumların yağ asidi içeriğini belirlemek amacıyla yaklaşık 1 gr tohum örneği iyice öğütülerek toz haline getirilir. Öğütme işlemi öncesi tohumların içerisinde yabancı ot veya yabancı madde olmamasına özen gösterilir. Öğütülen örnekler cam tüplere aktarılır ve üzerlerine 3 ml petroleum eter ilave edilir. Cam tüplerin ağzı kapatılarak 30 dakika oda sıcaklığında bekletilir. Sürenin sonunda cam tüplerin üstte kalan berrak çözelti kısımlarından, alttaki tortu kısımlara değdirmeden ve bulanıklık oluşturmadan, 0,8 ml sıvı alınarak temiz tüplere aktarılır. 58
Tüplerin ağzı açık olacak şekilde traklara yerleştirilip, yağ örnekleri bir gece desikatörde bekletilir. Tüplerdeki solvent tamamen uçurulduktan sonra her bir tüpe 2 ml NaMethylat (CH3ONa) ilave edilir. Her bir tüp parmakla çalkalanarak tüpün dibinde hiç yağ tortusu kalmayacak şekilde karışım sağlanır. Sonrasında tüpler oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir. Sürenin sonunda her bir tüpe 1,5 ml iso-oktan ilave edilip elle tekrar çalkalanarak yağın iso-oktan safhasına geçmesi sağlanır. Her bir tüpün ağzı alüminyum folyo ile kapatılıp, tüpler buzdolabında 30 dakika bekletilir. Süre sonunda her bir tüpün üst kısmındaki parlak faz tabakasından 0,6 ml alınarak analiz şişelerine (viol) aktarılır. 59
Hazırlanan Yağ Örneklerinin Yağ asit içeriği Gas Kromotografi (GC) kullanılarak belirlenebilir. https://www.youtube.com/watch?v=k5xojmv9w34 60
Ders ile ilgili iletişim için; Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADÜ; Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü Slaytlara Ulaşmak İçin http://web.adu.edu.tr/user/huseyin.uysal/ 61