METANOJENLERDE TİYAZOL SENTEZİNİN MEKANİZMASI VE TİYAZOLDEKİ KÜKÜRTÜN KAYNAĞI Yrd. Doç. Dr. Bekir Engin Eser Bekir E. Eser 1, Prem Chanani 2, Xuan Zhang 3, Steven E. Ealick *3 ve Tadhg P. Begley *2 1 Zirve Üniversitesi Emine-Bahaeddin Nakıboğlu Tıp Fakültesi Biyokimya A.B.D. 2 Department of Chemistry, Texas A&M University, 3 Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University
B1 Vitamini (Tiyamin) Tiyamin Pirofosfat (TPP) 1910 yılında keşfedilmiştir ilk keşfedilen vitamindir Prokaryotlar ve bazı ökaryotlar tarafından sentezlenir (mantar ve bitkiler) Hayvanlar ve insanlar için elzem bir vitamindir Eksikliğinde Beriberi ve Wernicke-Korsakoff sendromu görülür Tiyamin pirofosfat, amino asit ve karbonhidrat metabolizmasındaki birçok enzim için kofaktör görevi görür
Tiyamin Biyosentezi Tiyazol Pirimidin Tiyamin Pirofosfat Tiyamin biyosentezi bütün canlılarda tiyazol ve pirimidin halkalarının ayrı ayrı sentezlenip daha sonra bu iki halkanın birleştirilmesiyle gerçekleştirilir
Tiyazol Halkasının Biyosentezi sistein Prokaryotlarda 5 enzim tarafından glisin xylulose Tiyazol sistein Tiyamin Pirofosfat glisin NAD Ökaryotlarda sadece tek bir enzim tarafından Jurgenson, C.T. et al. Biochemistry 2006, 45, 11061-11070
Ekmek Mayasında (S.Cerevisiae) Tiyazol Sentezi Tiyazol Sentaz (Saccharomyces Cerevisiae) ScThi4p Aktif merkez sisteini C205 (Adenile Tiyazol) NAD (Nikotinamit adenin dinükleotid) glisin Begley, T P., Ealick, S.E., McLafferty, F.W. Biochemical Society transactions 40.3 (2012):555
Demir(II) iyonu olmadan reaksiyon ara basamakta duruyor Demir(II) eklenmesiyle reaksiyon son ürüne kadar gidiyor ADT Chatterjee, A.P. et al (2011) Nature 478, 542-546 34 Da luk kütle kaybı - H 2 S - Sadece tek bir çevrim (single turnover) - Enzimden çok substrat özelliği Sistein (C205) kükürt kaynağı
S.Cerevisiae Thi4p: Kendini Feda Eden Enzim Begley, T P., Ealick, S.E., McLafferty, F.W. Biochemical Society transactions 40.3 (2012):555
Amino Asit Sekansları Karşılaştırması: Arke ve Ökaryotlar Maya Thi4p ve Metanojenik Thi4p arasında yaklaşık % 30 özdeşlik, % 43 benzerlik Mayadaki sistein e karşılık gelen pozisyonda çoğunlukla histidin amino asidi mevcut (C205 H164)
Maya Tiyazol Sentaz (ScThi4p) ve Metanojenik Tiyazol Sentaz (MjThi4p) proteinlerinin Kristal Yapıları MjThi4 kristal yapısı ScThi4 kristal yapısı MjThi4 Monomerik yapısı
Arkelerde Thi4-benzeri Proteinler: Katalitik Sisteine Sahip Olmayan Ortologlar Metanojenlerde Thi4-benzeri proteinlerin ortologlarının bir kısmı ribuloz-1,5-bifosfat sentaz olarak veritabanlarında yer almış Methanococcus Jannaschii organizmasından elde edilmiş Mj0601isimli protein ribuloz-1,5-bifosfat sentaz olarak literatürde yayınlanmış (Finn&Tabita, J.of Bacteriology, 2004, 186, 6360-6366)
Metanojenlerde Thi4-benzeri Proteinler: Methanococcus jannaschii Mj0601Proteini (MjThi4) - Methanococcus jannaschii bir tür metanojenik arkedir (metan üreten) Hipertermofiliktir (85 C optimum yaşam sıcaklığı) Anaerobturlar (Oksijensiz ortamda yaşarlar) Sülfürce (S 2- ) zengin ortamlarda yaşar Sülfür yaşamları için gereklidir Hücreleri içerisinde mm konsantrasyonda sülfür bulunur Fe-S cluster ve metiyonin biyosentezinde kükürt kaynağı sistein yerine serbest sülfürdür (Liu et al., JBC 2010, 285, 31923-31929) Cevabını Aradığımız Sorular: Metanojenlerde tiyazol oluşumunda kükürt kaynağı nedir? Reaksiyon mekanizması S.Cerevisiae deki mekanizmaya benzer mi? Enzim katalizi esnasında birden fazla çevrim gözlenebiliyor mu? Kataliz metal-bağımlı mı? Bağımlıysa spesifikliği ne ölçüde?
Metod: E.Coli de Rekombinant Protein eldesi (pet 28 ekspresyon vektörü) Proteinin Nikel-afinite yöntemiyle saflaştırılması Enzim reaksiyonlarının enzim ve substratların anaerobik ortamda (glove box) karıştırılmasıyla başlatılması Reaksiyon ürün ve ara ürünlerinin HPLC yardımıyla analizi
MjThi4 da Kükürt Kaynağının Tanımlanması: mau (260 nm) 100 80 60 40 20 0 ADT 11.4 11.6 11.8 12 time (min) sodium sulfide thiosulfate thioacetate no sulfur source cysteine Glutathione Reaksiyon koşulları: 100 um Mjhi4, 300 um NAD, 1 mm glisin, 400 um FeAS ve 800 um Na 2 S, 25 C de 85 o C de yaklaşık 8 kat daha yüksek aktivite gözlendi Reaksiyonlar anaerobik koşullarda (oksijensiz ortam) gerçekleştirildi (glovebox içerisinde) Serbest Sülfür (S 2- ) kükürt kaynağı
Metaller ve Aktivite Maya Enzimi (ScThi4p) sadece Fe(II) nin olduğu ortamda aktivite gösteriyor diğer metallerle aktivite gözlenmedi MjThi4p de ise birçok divalent metal iyonu aktiviteyi destekledi MjThi4p metal cinsi ve yükseltgenme basamağına daha az duyarlı
Ürün (ADT) Oluşum Kinetiği Koşullar: 500 um ADP-Riboz, 1 mm glisin, 800 um Na2S, 400 um FeAS, 600 um Dithionite, at 80 C inside glovebox,ph 7.8 k burst = 0.15 min -1 k linear = 0.005 min -1 Burst Amp. = 0.89 MjThi4 da ürün salınımı hız belirleyici basamak Çevrim hızı maya enziminden (ScThi4p) çok daha hızlı ScThi4p un aksine MjThi4 ile çoklu çevrim gözlendi MjThi4p gerçek bir enzim çoklu çevrim gözlendi
Demire bağlı kararlı bir kromofor ara ürün tespiti Kararlı ve kromoforik bir ara ürün Yük-transfer kompleksi Glisin eklenmesi sonucu 380 nm de artış
Demire bağlı kararlı kromofor ara ürünün X-ray ışını kristalografisi Glycine-Imine Asp161 Fe His176 - Aktif merkeze bağlı demir atomunun gözlendiği ilk X-ışını kristal yapısı (380 nm kromofor ara ürünün kristal yapısı)
ScThi4 aktif merkez metal iyonu sadece Fe(II) olabilir 1) sisteinden kükürtün sökülmesi ve 2) kükürtün ara ürüne transferi MjThi4 aktif merkez metal iyonu birçok metal aktiviteyi destklemekte 1) kükürtün ara ürüne transferi
Sonuç Özeti: MjThi4p proteini metal-bağımlı bir tiyazol sentaz enzimidir Maya (S.Cerevisae) Thi4p nin aksine, metanojenik Thi4p kükürt kaynağı olarak serbest sülfürü kullanır organizmanın habitatı önemli MjThi4p gerçek bir enzimdir ve çoklu-çevrim gösterir MjThi4 metalin cinsi ve yükseltgenme basamağına daha az duyarlıdır (ScThi4p ye göre)
Teşekkür Prof. Dr. Tadhg Begley Prem Chanani Dr. Dinuka Abeydeera Dr. Abishek Chatterjee Begley Labı Kristalografi Çalışmaları Prof. Dr. Steve Ealick Dr. Xuan Zhang @ Cornell University NIH & Welch Foundation Finansal Destek
Dinlediğiniz İçin Teşekkürler