vtral HASTALıKLARıN TEŞHİSİNDE tmmunoperokstdaz

A. O. Vet. Fak. Dert:. 40 (4): 497-510 1993 vtral HASTALıKLARıN TEŞHİSİNDE tmmunoperokstdaz M. Çabaları Y. Akçaa Im.munoperoksidase in the diagnosis oc viral disease. Su~ary: Immıınoperoxidase assay is an alternative methodfor identifying antigen and antiboriy, ıısed in eell eulture and histopathology studies an en{yme-labeled antibody. In ıhis method, en{yme eonjugated antibodies generate insoluble eolored products reacting with ehemieal substrate. This en{ymatic reaetion can be visııalized by naked eye or by both of light and eleetron microseope. Özet: Jmmunoperoksidaz testi gerek histopatolojik gerekse hücre kültütü [alışmalarında histo-kimyasal olarak antijen yada antikor tespitine yönelik olarak kullanılan alternatif bir yöntemdir. Bu yöntemde, enzim le konjuge edilen reaktif/er substrat ile reaksiyona girerek renkli ürünler meydana getirmektedir. Bu enzimatik reaksiyon gö'zle yada basit bir ışık mikroskobu veya Elektron mikroskop ile değerlendirilebilmektedir. Giriş Enfeksiyöz hastalıkların tanısında, özellikle viruslar ve yavaş çoğalan bakterilerin kültürlerde üretilmeleri için uzun zamana ihtiyaç duyulduğundan, direkt etken izolasyonu Ye identifikasyonu yanısıra, Hemaglutinasyon İnhibisyon (HI), İndirekt Remaglutinasyon İnhibisyon (IRA), Agar jel presipitasyon (AGP), Komplement Fikzasyon (KF), İmmunoelektroforez (le) gibi çok sayıda serolojik yöntem geliştirilmiştir (27). Coons ve ark. (14) 1940 yılında fluorescein isothiocyanate ile işaretli antikorlar kullanarak dokular i~indeki antijenleri göstermeyi başarmışlardil Berenhaum 1958 yılında antikorları radyoaktif 1 Dr., Yüzüncü Yıl D., Veteriner Fakültesi, Viroloji Bilim Dalı., Van. 2 Doç. Dr., A.D. Veteriner Fakültesi, Viroloji Bilim Dalı., Ankara.

498 M. ÇABALAR - Y. AKÇA maddelerle işaretlemiş, Nakane ve Pierce'de 1966 yılında antikorların enzimlerk işaretlenebileceğini savunmuşlar vc denemelerinde başarılı olmuşlardır. Enzimlerk işaretleme yönteminde antijen-antikor reaksiyonu sonucu katı faza bağlanan enzim işaretli reaktiflerden yararlanılmaktadır. Değerlendirme enzim ile substratın oluşturacağı renk reaksiyonuna göre yapılıp, ortaya çıkan renkli ürünlerin miktarı, enzim işaretli reaktiflerin ve dolayısıyla katı faza bağlanan antijen veya antikor miktarını belirlemektedir (17, 27). Fluorescein isothiocyanate ilc yapılan çalışmalarda özel mikroskoplara ihtiyaç duyulması, fluoresanmaddelerinzamanla aktivitelerini kaybetmeleri, ayrıca dokularda bulunan otofluoresan özelliğin değerlendirmeyi güçleştirmesi Klcdeniyle, bu yöntemle sonuçların değerlendirilmesi subjektiftir (10, 2,4). Radyoaktif maddeler ile işaretli reaktiflerden yararlanılarak kullanılan Radioimmunoassay (RIA) 'in ise objektif bir tanı yöntemi olmasına rağmen, radyoaktif maddelerin yarılanma süreleri, sonuçların değcrlendirilmesindegama sayıcıları gibiözelaygıtların gerekliliği ve daha da önemlisi radyoaktif madde kullanımının sakıncaları bu duyarlı yöntemin olumsuz taraflarıdır (13, 27). EnzimIerIc işaretleme yönteminde, enzim işaretli reaktifkr uzun süre saklanabilmekte, sonuçlar b~liren renklcnmcnin şiddetine göre değerlendirilmektc ve direkt göz, basit bir İşık mikroskopu yada kolorometre iic antijen veya antikorun respiti yapılabilmektedir (17, 24, 27). Bu üstüdükleri ncdeniyle virus, bakterı, mantar; parazit antijenleri ve antikorları yanında, immunoglobulinler, serum proteinleri, tümör antijenleri gibi çeşitli maddelerin araştırılmasında enzimle işaretlemc yönteminden yararlanılmaktadır (2, 7). lmmunoperoksidaz yöntemi, enzimlerk işaretli reaktiflerin oluşturdukları antijen-antikor kompleksinin histokimyasal olarak incelenmesi esasınadayanır (2, 3, 4, 9, 24). Gerek histopatolojik çalışmalarda gerekse doku kültürü çalışmalarında immunoperoksidaz yönteminden yararlanılmakta ve kromojenicrin meydana getirdikleri rcnkli ürünler ilc antijen yada ap.tikor tespitine gidilmektedir (2, 4, 12, 19, 24). An-!İjenlerin ultrastruktural lokalizasyonlarının saptanması amacıyla, İrnmunoperoksidaz ilc Elektron mikroskopi (EM) çalışmalarıda yapılabilmektedir (13,24, 26). Eğer test materyalinin dilusyonları hazırlanırsa, görülen en son renk dq'i;işiminin oluştuğu sulandırma basamağı o test materyalinin titresidir. Hesaplama Kaerber metodu vasıtasıyla yapılır (8, 9).

VİRAL HAST.\L1KL\RI~ TEŞHİSİNDE İMMl'NOPEROKS1DAZ 499 Kuduzun teşhisi amacıyla yapılan bir çalışmada (1), direkt immur.operoksidaz (IP) ve fluorcsan antikor tekniği (FAT) karşılaştırılmış ve birbirir.e paralel sonu~jar elde edildiği bildirilmiştir. Diğer bir çalışmada isc (LO),direkt I P, direkt FAT ve Seller boyama yöntemleri kuduzun teşhisi amacıyla kullanılmış, FAT ve ip yöntemlerinin Seller boyamadan daha duyarlı olduğu ve FAT'daki dezavantajlardan dolayı IP'nın FAT'ın yerini alabileceği savunulmuştur. Hyera ve ark. (8) Bovine viral diarrhea (BVD) virosu nötralizan antikodarının saptanması amacıyla Neutralizin.g peroxidasc-linked antibody (NPLA) \T Mikro nötralizasyon testlerini (MNT) kullanmışlar ve sonuçta test edilep. 425 sığır serumundan :t\pla ilc % 48, MNT ile % 45'inin pozitif olduğunu saptamışlardır. İmmunoperoksidaz yönteminde aşağıda belirtilen teknikler kullanılmaktadır (2, 8, 15, 16, 1, 24). 1. Direkt yö~tem 2. İndirekt yöntem 3. Peroksidaz anti-peroksidaz (PAP) yöntemi 4. :"Jötralizasyon immunoperoksidaz yöntemi (NPLA) j. Avidin-Biotin immunoperoksidaz yöntemi a) Direkt Avidin-Biotin Peroksidaz Kompleks (ABC) yöntemi b) İndirekt ABC yöntemi c) Avidin-Biotin işaretlerne yöntemi 6. İmmunoperoksidaz plak yöntemi a) Direkt immunoperoksidaz plak yöntemi b) İndirekt immunoperoksidaz plak yöntemi 1. Direkt Yöntem Antijene spesifik an.tikorlardan yararlanarak antijen varlığının ortaya konması esasına dayanır. Bu yöntemde spesifik antikor peroksidaz ile kimyasalolarak bağlanır. Hazırlanan bu konjugat antijenle reaksiyona girerek, substratm ilavesiyle antijenin lokalize olduğu alanlarda renkli bir presipitat meydana getirir (Şekiıı). Meydana gelen rengir. şiddeti örnekteki <ıptijen miktarı ile orantılı olacaktıi". Duyarlı bir yöntem olmasına rağmen, her ar.tijen için spesifik bir antikora ihti. yaç göstermesi direkt yöntemin yaygın olarak kullanılmasını önlemekte \'e indirekt yöntemin önemini artırmaktadır cı, 2, 6, 10, 24).)

500 M. ÇABALAR - Y. AKÇA 1. AntıJen adsorbe edılır (doku kültürü/doku kesıtı) /\ 2. Enzımle ışaretli spesifik a~tıkor ılave edılir' 3. Substrat ilave edilir ~-- ı:."iz~z 7\ o o o:>~ ~1~~B~O o o 001\ o o " 4.!nkübasyon sonunda degişen substratın degerlendirilmesi(gözle, mıkroskopik) Şekil ı. Direkt Yöntem 2. indirekt Yöntem Bu yöntemde, konjuge edilmemiş antikor numunede antijene bağlarıır. Reaksiyona girmeyen maddelerin yıkama ışlemiyle ortamdan uzaklaştınlmasından sonra, konjuge edilmemiş antikora karşı elde edilmiş anti-antikorların işaretlenmesiyle hazırlanan spesifik konjugat ilave edilir. Konjugat ilk aşamada meydana gelen antijen-antikor kompleksindeki antikora bağlarıır. Sonra bu lokalize reaksiyona substrat ilave edilir (Şekil 2). Meydana gelen ref'.gin şiddeti örnekteki antijen miktarı ile orantılıdır (2, 6, 24). 3. Peroksida::: Anti-Peroksida::: (PAP) Yöntemi Bu yöntemde primer antikor, sekonder arıtikor ve PAP kompleks olmak üzere 3 reaktife ihtiyaç vardır. Primer antikor direkt olarak antijene bağlarıır. Yıkama işleminden sonra sekonder antikor ilave

VİRAL H..ASTALlKLARIN TEŞHİSİ~OE tmmunoperokstoaz 501, Antijen adsorbe edılır (doku kültürü/doku kesıtı) 1\ EKAMA 2. Spesifık ar.tıkor kapsaya:. serum ılave edılır YIK.l.MA 3. KonJugat ılave edilir 4. Substrat ilave edılerek de~erlendirme yapılır(gözle, ffiıkroskopık) Şekil 2. İndirekt Yöntem edilir. Sekonder antikor (bağlayıcı antikor), primer antikor ve PAP kompleksi birbirine bağlar. Tekrar yıkama işleminden sonra PAP kompleks ve daha sonra da substrat ilave edilir. Test sonunda beliren rengin şiddeti numunedeki antijen miktarı ile orantılıdır (Şekil 3). Duyarlı olması ve enzim ilc işaretli reaktifiere gerek olmaması bu yöntemin üstünlükleridir (2, 3, 4., 6, ll, 13, 24). 4. Avidin-Biotin lmmunoperoksida;::, Yöntemi Avidin-Biotin ili~kisine dayanan bu yöntem, bir vitamin olan biotinin 4 molekülünün, glikoprotein olan avidin ile nonimmunolojik olarak birleşmesi esasına dayanır (2, 5, 21, 22). a) Direkı Avidin-Biotin Peroksida;::, Kompleks (ABC) yöntemi Bu yöntemde biotinle işaretli antikor direkt olarak antijene bağlanır. Reaksiyona girmeyen maddelerin yıkama ile ortamdan uzak.laştırılmasından sonra, avidin-biotin peroksidaz kompleks (ABC) ilave edilir. Substrat ilavesiyle antijenin lokalize olduğu danlar görünür hale gelir (2, 5, 2 ı, 22).

502 M. ÇABALAR - Y. AKÇA 1. Antı]e~ ad~c~be edılir (doku k~ltürü!doku kes:tı) 2. Prımer antikor ı:ave edıl~: ymma 3, Sekcnder a~tı~cr ::a,e edılır 4. PA? koffipleks ıla,e e::.ır c SJbstrat ılave edılerek iegerlendı:me yapılır(gözle, ffiıkrcskop:k, o:-~~oı ~o.., O~ ~. Şekil 3. Pemksidaz-Antiperoksidaz Yöntemİ (PAP) b) lndirekt ABC yöntemi Indirekt ABC yöntemi 3 reaktife ihtiyaç gösterir. Lokalize olan antijen için spesifik primer antikor direkt olarak antijene bağlanır. Yıkama işleminden sonra biotirtle koııjuge edilmiş sekoıı.der antikor ve bunu takiben de ABC ilave edilir Dahasonra substrat ilave edilerek değerlendirme yapılır (Şekil 4) (2, 5, 21, 22). c) Avidin-Biolin /şaretlemc yöntemi Bu yöntemde biotinle işaretlenmiş antikor direkt olarak antijene bağlanır. Yıkama işleminden sonra enzimlc koııjuge edilmiş avidin ilave edilir. Substrat ilavesiyle lokalize reaksiyon görünür hale getirilir (Şekil 5) (2, 21).

vtral HASTALıKLARı:'! TEŞHİst:'!DE tidiunoperokstdaz 503 1. Antije~ adsdrbe e~~li: (ccku k~lt~rüjdoku kesı~:; 1\ ~. ~riffierantıkgr ılave edılır 3. Biotinle işaretlı autikor ilave edilir ( 4, Avıdin-bıt.ın peroksıdaz kompleks ılave ediln j, Substrat ılave edilerek degerle~dır~e yapılır(gczle, mıkrcskoplk; Şekil 4. İndirekt ABC Yöntemi 5. Nötralizasyon ImmUlıoperoksidaz Yiinlemi (NPLAY- Bu yöntemin esası, bilinen antijen ilc şüpheli serumun nötrajizasyona bırakıldıktan sonra, nötralizasyonun meydana gelip gelriı~diği~, nin immunoperoksidaz ilc kontrol edilmesidir. Testin ilkaşaması olan nötralizasyondan sonra, l)ilinen virus ile şüpheli serum dilusyonlai'l hüc" re kültürüne inokule edilir. Daha sonra bu hüere kültürü antijene' spesifik konjugatla karşılaştırılır ve substrat ilavesiyle renkli ürünlerin meydana gelip gelmediğinin kontrolü yapılır (Şekil 6) (8,25). Renkli ürünler meydana gelmiş ise; şüpheli serum bilinen virusa karşı spesifik antikor taşımamaktadır ve virus peroksidaz ile işaretli antikorla birleşmiş demektir.

504 M. ÇABALAR - Y. AKÇA l. An~:)en adsorbe edı~:r (doku kültürü/dcıu ıesıtl) YIKAHA 1\ ı. Bıotınle ışaretlı antıkor ılave edılır J. Peroksidaz enzı~ı ıle işaretli avıdın ılave e:ılı~ 4. Substrat ilave edı:i: 5. lnkubasyon scn~nda degışen s~bstratın degerlendırilmesı(gözle, mıkroskopıki Şekil 5. Avidin.Biotin İşaretlerne Yöntemi i;1 0'\ o o o ~ FSZ-hd5~Z oz's 0 0 Renkli ürünler meydana gelmemiş ise, şüpheli serum bilinen vinısa karşı spesifik antikor taşımaktadır ve bu antikorlar antijen ile birleştiğinden, peroksidaz ile işaretli antikodar antijen1c birleşmemiş demektir. 6. Jmmunoperoksidaz Plak Yöntemi Hücre kültüründe, yarı katı vasatın etkisiyle, enfeksiyon yerinde lokalize olarak çoğalan virusun immunoperoksidaz yöntemi ile gösterilmesi esasına dayanır (l3, ı5, 20).

ytral HA~TALIKL\Rı!\ TEŞHt~t;'WE ımml;;\operok~ıdaz 5(15 :::;.~..;~:.;~:~.\s..:;ı.. : : Ş ~::: -. :~.:.~::; S::.,L,:::,,::.. ":.:.,;: :'"'s:) ;:.~ S::,ı.,., ~.:;~::,. 1" 1 ;1: ~:'; i :.:.~:: \ ~; Şekil 6. ı\pla YÖKTEi\Iİ a) Direkt immunoperoksida;. plak )'ölltcmi Bu yöntemde petrilerde üretilen hücre kültürlcril'.e,'irus sulandırmasından inokule edilir ve inkuba~yona hırakılır. İnkııbasyop. sonunda kültür vasatı uzaklaştırılır vc her bir pctriye vasat -]- agaroz karışımı hücre üzerine yayılarak doi1uı~.caya. kadar bekletilir. Petrilcr içindeki donmuş agaroz 3.-4 gün sonra hücreye zarar vermeden uzakl~tırılır. Fikzasyonu takiben ilave edilen konjugat ap.t~jerıle reaksiyona girecek ve substratın ilavesiyle virusun lokalize olduğu alanlarda sınırlı ve renkli üreme odakları görülecektir (I 3, 20). lı) Indirekt immunopcroksidaz plak )lontcmi Bu yöntemde ilk aşamada antijen pleytlcri hazırlanır. Bnnun için önce pleytlerde hücre üretilir. S071ra virus inokule edilerek inkubasyona bırakılıf. İnkubasyon sonrası hücre üzeriec' agaroz dökülür ve 4-5 gün sonra agaroz hücreye za,ar vermeden uzaklaştırılır. Fikzasyondan sonra plcytler kullanılana kadar -70'C'de 12 ay süre ile muhafaza edilebilir. Gerektiğinde pleytlcr dondurlıeud",-ı çıkarılır, çözülür ve şüpheli serum ilave edilerek inkubasyona bırakılır. İI'.kubasyon sonrası ko~ıjugat, daha sonra da substrat solusyonu ilave edilerek değerlendirme yapılır. Bu yö:,ltem, hücre kültürüne adapte edilebilen ve ürctilcbilen viruslarla uygulanabilmektedir (I 6).

506 ~f. (:.-\BALAR - Y.. \KÇA İmmunoperoksidaz yönteminin kullanımında çeşitli maddeler testin duyarlılığında roloynamaktadır. Bunlar, Koııjııgrıt Koııjugatın hazırlanmasında enzim (horseradislı peroxidasc: HRP), enzime doğal kurucu (işaretlcnecek antikor yada antijen) ve bağlanma için kullanılacak kimyasal maddeye (glu teraldehid, bcnlokinon) ihtiyaç vardır. Bağlanmada kullanılan maddeler aracılığı ile enzim ve immunoreaktiflerin (antikor, antijen) kovalcnt bağlanmaları sonucunda konjugat elde edilir. Bir enzim molekülü çok sayıda substrat molekülü ile reaksiyona girerek r,~nkli ürünler oluşturur. Bu nedenle enzimle i~aretli reaktiflerin (konjugat) özellikleri test sonucunu etkilediğinden, kullanılan enzimlerin kolay hazırlaıı.abilmeleri, stabil ve yüksek aktiviteye sahip olmaları gerekir (5, 24, 27). Peroksidrız Peroksidaz 40.000 molekül ağırlığında bir hemaglikoproteindir. Peroksidazın küçük hacimli olması, pahalı olmaması ve çok stabil olması kullanımını cazip hale getirmektedi.r. Konjugasyon sonunda peroksidazın aktivitesinde kayıp da az olmaktadır. Peroksidazın kullarumdaki dezavantajı ise spesifik substratlarının kansorejen özelliğe sahip olmalarıdır. Peroksidaz bitkisel dokularda bulunur ve ba5lıca kaynağı yabani turbdur (2, 26). Avidin-Biotiıı Konjugasyon sırasında reaktifin ve enzimin substratı bağlama bölgelerinin bir bölümünde blokasyon meydana gelir. Bu durum konjugatın immunolojik ve.~n.zimatik aktivitesinde kayıplara neden olur. Bu tip aktivasyon kayıplarını önkycn kofaktör sistemler geliştirilmiştir. En ~:ok kullanılanı Avidin-Biotin. sistemidir. Biotin molekül ağırlığı 244 olan bir monokarboksilik asittir. Birçok mikroorganizma ve bitki yaprakları tarafından sentezlenil Yumurta bol miktarda biotin içerir. Avidinin ise molekül ağırlığı 70.000 olup, birbirine benzeyen 4 alt birimden oluşmuştur. Hcl' alt birim bir biotini bağlayabilir. Avidin ç.iğ yumurta akında bulunan bazik bir glikoproteindir (2, 5, 21). Substl'a! Soluıyonları Su bstratlar enzimlerle reaksiyona girerek immun kompleksin varlığını ortaya koyan maddelerdir. Enzimler su bs tran ürüne dönüş-

vtral HA~TALIKLARI:'\ TFŞHtsİi\'OE t:\bw'\operukstoa7. 507 türerek katalizör görevi yaparlar. Enzim (E), Suhstrat (S), Ürün (Ü) ile gösterilirsc, E + S - -- -- ~> E. S ----- - -~-Ü + E ',' o Enzim-ı.-uhstrat reaksiyonu ortamdaki enzim miktarına bağlıdır. Enzim (peroksidaz) tükenmez ve substratın (HzÜz) diğer molekülleri ile tekrar reaksiyona girerek daha çok renkli ürün meydana getirirler. Tek bir Horscradish pero:..:idasc (HRP) cp,zim molekülü bir dakikada substratın 100.000 molekülü ilc reaksiyona girerek gözle görülebilen ürün meydana getirebilmektedir (2, 24). HRP + H20 Z - -o' HRP H:P2 t Elektron (elektron donor verici) rcnkli ürün -L HR P o H 1 0 Enzim reaksiyonunda elektron donor olarak kullanılan birkaç renk verici madde (kromojen) vardır ('rablo 1) (2, 4, 8, 9, 24). Tablo ı. Substrat solusyonları ve oluşturdukları renkler. Enzim.----- Substr~ts()lusyoıı~_._---_._._---rt~-~k : 3,3 diaıııinobenzidin tctrahvdr()clıoloridı~' i (DAB) + H z 0 2._-----------------_._--- i Kahverengi ı, i _...._-----.._--- 3-aınino 9-cthy / carha,.;ole (AEC) +H 2 0 z: Kırmızı i i -----------------.- ---_..._..-1 Peroksidaz 14-chlom ı-naphtol (Chloro-Naphtol). -+ HzOz Mavi P-phcııylencdiaminc dihydrochlııridc.' ~ i pyrocatechol (Hanker- Yatcs) -+ H 2 0'? Mavi-Siyah i.l Or~~_~~_~idine(O_~~~~di~et-=t-~~~~~~=-l_~a~'i '=~-=i Sonuç Bu derlemede özellikle viral hastalıkların teşhisindc bütün dünyada laboratuvar tanı yöntemi olarak kullanılan immunoperoksidaz testi ilc ilgili farklı teknikler incelcnmiş YC hunlarınu ygulanabilirliklcri tartışılmıştır. Ayrıca immunoperoksidaz yöntemi diğer tanı yöntcmleri ilc de karşılaştırılmıştır.

S08 ~. ÇA13AL,\R \. AKÇA Kavnaklar 1. Anjaria, J.M., Jhala, Ci. (1985). Immurıopernxidas rcaction ın di. (lgrıosis of rabies. Int...J. Zoon., 12: 267-<~75. 2. Bourne,,LA. (1983). Handbook of im1llunopcroxide.~a staırııng mcthoris. Immunochemistry Lahoratory. Dako Corporation. 3. Cherringıon, J.M., Ghallli, H.V., Sawyer, M.M., Osburo, B.I. (1985). Delection of viral antijcns in bluetollque virus infeeted ovine tissue using thc peroxida.~c.antı:pl!roxidase tf!clıniqııe. Am..1. Vet. He~.,J,6: 23:>6- ~3:i9. L (;imeııo, E.J., Nosetto, E.O., ~Iarıin, A.A., Galois, C,M., Ando, Y., Elchcverrigaray, M.E. (1987). Demostration of Equine Herpes Virus ( EH V-I) in histolo{{ical section and tissllc cu/tl/res by the peroxidaseantiperoxidase (PAP) tcchnique. J. Vet. Med., H: 74,O-ı,t2. ;). GucsdQn,.ı.L., Ternynck, T., Avrameas, S. (1979). The use of avidinbiotin intcraetion in immıınoen:ymatic tcehniques. J. of Histoche. and Cytoch., 27 (8):1131-1139. 6. I1ydel'man, E. (1979). imnııınoperoxidase tı!chnique in histopatlıology : ııpp/ications, methods und ı:orıtrofs..j onrnal af Clinical Patholagy, 32:971-978. j. Hill, A.C. (1978). Demostration of Mycoplusıııas in tissue by the immunoperoxidase teehniqııe..1. of inf. Disease., 137 (2): 152-154. 8. Byera, J.M.K., Liess, B., Fl'ey, H,R. (1987). A Direkt Neutralizing- Peroxidase-Linked Antibody (Issay fot dr/edion and titration of antibqdies to Bovi,,~Viral /)ial'l'1ı()c(l6.rııs. J. Vet. Med., 34: 227-237. 9. Kalz, J.B., Kuheman, L.,.Pemherton, J., Selımen, 1\1.,J. (1987). Deteetion of bovine virus diarr/ıea virus in eell culture usiııg an immunoperoxidase teehnigue. Vctf~rinary Micwbiology, 13:1:>3-157. 10. Kolwal, S., Narayan, K.G. (i 9R5). Direkt i mmruıopcroxidase test ın the diagnosis of rabies -(in alternaüve to fluot'eseent antibody test. lut. J. ZOOIl., 12 (J): ljo--w). ll. Macaerlney, L., MacarlDe)', C.M. (1986). Canine parvovirus: development of immunof/uorezcencc a"d imm.wzopernxiı1asc techniques. Res. Vet. Sci., 40: 201-208.

J V1R.\J. TBSTALJKL.\HI" n:şnhti\"f)e İM~IF,OPEHOKSjDAZ 509 12. Miry, C., Ducatelle, R., Tboonen, H., Hoornes, J. (1983). Immıınoperoxidase study of canine distemper virus pneumonia. Res. Vet. Sci., 34:1.15-11-8. 13. Moriarty, G.C., Michael, C.M., Sternberger, L.A. (19n). ljltrastruôtural immunocytochemisıry 1l'ith ımlabcled antibodie.~ and ıhr peroxidaseantiperoxidase ı:omplex. A technique more sensitivr than radioimmıınoassay. J. Histochl'. aud Cytoclır., 21(9): 825-833. 14. Özcel, M.A. (1978). Immunofuloresans 1'1' parazitolojide uygulamasi, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Yayını, No. 108,. Ege Üni. Bamnevi. 15. Pan, I.C., Huang, T.S., Hess, W.R. (1982). iyen method of antihody deteetion by indirekt immunoperoxidase plaque stnining for serodiag" nosis of Afriean Sıvine Fever. J. Clinical Microbio., 16 (4):650-655. 16. Pan, I.C., Schimizu, M., Hess, W.R. (1978). African Sıvine Fever: Mieroplaque assay by an' immunoperoxidase method. Am..J. Vet. Res., 39 (3): 491-497. ı7. Piroid, R., Lombard, M. (1980). Les ınethodes immunoenzymatiqves et leurs applieations serologives. Revue Med. Vct., 131 (1): 25-42. 18. Rai, A., Prasad, I.J. (1980). Jmmunoperoxidase technique in rapid detection of Foot and JlI/ounth Disease t,irus. Indian J. Anim. Sci., 50 (ll): 957-960. 19. Rodriguez, M., Heinlein, A.S., Ruiz, M., Metzler, A.E., Sehudel, A.A. (1989). Detection of bovine herpesvirus type 1 1Jia an immunoperoxidase method, using monocional anıibodies. Am. J. Vet. Res., 50 (5):619-621. 20. Sanders, G. (1991). Charakterisierııng zytopathogener und nichtzytopathogener bioıypen unler Sıaırınıen / isolaten des B VD-virus in einem lmmılnoplaque-tesı. IllHugural-Dissertation. TierartIiche Hochschule Hannover. 21. Su-ming, USU., Raine, L., Fanger, H. (1981). A comparaıive study of ıhe peroxidase-antiperoxidase method md an Avidin-Bioıin Conıplex meılwd for studying polypeptid hormon es wiıh Radioimmonoassay antibodies. Am. J. elin. Pathol. 75: 734.-739. 22. Su-ıning, HSU., Raine, L., Fanger, H. (1981). Use of avidin-bioıinperoxidase complex (ABC) in immunoperoxidase ıechniques: A com-

510 M. Ç:\RAUH - Y. AKÇ,\. parisoıı bptll'een A Be and Uıılabelad antibod)' (PA P) procedurps. ]. Histoch. and Cytneh., 29 (4): 577-,580. 23. Sutmoller, P., Cowan, K.M. (1974). The detl'ctl~ollof Foot-and,UOIlIlth- Disease virus antigl'lls ı:n iı~rected ecu cultures by immıınoperoxic1use terhniqııes..t. Gen. Vi ro!., 23: 287-291. 24. Taylor, C.R. (1978). lmmluloperoxidlıse techniques. Arclı. Patho!' Lab. :\1('(1., 102:113-]21. 2,5. Terptra, C., Bloemhraad, :M., Gielkend, A.L.J. (1984). The lleutralizing peroxidase-linked assay for dptection of anıibid," againsı Sıdne Fel'er virus. Veterinary Microbiology 9:11 3--120. 26. Ward, A.C.S., Kaerberle, M.L. (1984). Use of an immıınoperoxidase stain for the demostration of bovl'neriml diıırhea virus by light and electron mieroscopies. Am. ]. Vet. Hes., 4,5: 165-169. 27. Yolken, R.H., Leililter, F., Whitcomb, L., Davis, D., Mears, M.ı. (1983). Enzyme imlllunoassay for the diagntjsis ofljiml infeetions. Ann. N.Y. Aead. Sei., 420:37]-390.