Echinococcus granulosus ANTİJENLERİNİN İZOLASYONU VE TANIDAKİ DEĞERLERİNİN ARAŞTIRILMASI

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Echinococcus granulosus ANTİJENLERİNİN İZOLASYONU VE TANIDAKİ DEĞERLERİNİN ARAŞTIRILMASI Tuncay ÇELİK MİKROBİYOLOJİ VE KLİNİK MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI PARAZİTOLOJİ DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Çiğdem GÜNGÖR Bu tez, Tübitak Altyapı Projesi tarafından 1055005 (SBAG-AYD-491) proje numarası ile desteklenmiştir 2006 - Ankara

ii Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Parazitoloji Doktora Programı çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 05/06/2006 Jüri Başkanı Prof. Dr. Çiğdem Güngör Ank. Üniv. Tıp Fakültesi Prof. Dr. A. Murat Aksoy Ank. Üniv. Tıp Fakültesi Prof. Dr. Ahmet Doğanay Ank. Üniv. Veteriner Fakültesi Prof. Dr. Sibel Ergüven Hacettepe Üniv. Tıp Fakültesi Prof. Dr. Aydın Karaaslan Ank. Üniv. Tıp Fakültesi

iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar ii iii v vı 1. GİRİŞ 1 1.1. Genel Bilgiler 4 1.1.1 Tarihçe 4 1.1.2. Sınıflandırma 4 1.1.3. Suşlar 5 1.1.4. Morfoloji, biyoloji ve yaşam döngüsü 8 1.1.4.1. Onkosfer zarının ortaya çıkması 12 1.1.4.2 Onkosferin aktifleşmesi 12 1.1.4.3. Yumurta 13 1.1.4.4. Metasestod form 13 1.1.5. Hidatik antijenler 14 1.1.6. Epidemiyoloji 23 1.1.6.1. Dünyadaki durumu 23 1.1.6.2. Türkiye de durum 23 1.1.7. Patoloji ve Klinik 24 1.1.8. Tanı 26 1.1.8.1 Klinik tanı 26 1.1.8.2 Laboratuar tanı 26

iv 1.1.8.2.1. Direkt mikroskobi 26 1.1.8.2.2. Spesifik tanı 27 1.1.8.3. Serolojik yöntemler 27 1.1.8.4. Görüntüleme yöntemleri 27 1.1.9. Tedavi 29 2. GEREÇ VE YÖNTEM 30 2.1. Serumlar 30 2.2. Antijen hazırlanması 30 2.2.1. Kist sıvısı 30 2.2.2 Protein konsantrasyonunun ölçülmesi 31 2.3. Gradient jel elektroforez ve Western Blot (WB) Analizi 32 2.3.1. Tampon ve solüsyonlar 32 2.3.2. Separasyon jelinin hazırlanması 36 2.3.3. Stacking jelin hazırlanışı (%5) 37 2.3.4. Antijen hazırlanması 37 2.3.5. Jelin boyanması 38 3. BULGULAR 41 4. TARTIŞMA 46 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 51 ÖZET 52 SUMMARY 54 KAYNAKLAR 56 ÖZGEÇMİŞ 62

v ÖNSÖZ Doktora eğitimim süresince yardımlarını ve desteğini esirgemeyen danışmanım sayın Prof. Dr. Çiğdem GÜNGÖR e, Parazitoloji Bilim Dalı başkanımız sayın Kürşat ALTINTAŞ a, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı başkanımız sayın Prof. Dr. Murat Aksoy a, laboratuar çalışmaları sırasında yardımcı olan sayın Prof. Dr. Haluk ATAOĞLU ve çalışma arkadaşlarına, her konuda yardımını esirgemeyen Uzm. Dr. Gülay Akarsu ya, parazitoloji ve mikrobiyoloji bölümünde çalışan personel ve asistan arkadaşlara sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, çalışmamda hasta serumu sağlamakta yardımcı olan Gastroloenteroloji Bilim Dalı öğretim üyesi sayın Prof. Dr. Necati ÖRMECİ ye teşekkürlerimi sunarım. Tuncay ÇELİK Bu tez, TÜBİTAK Alt Yapı Projesi tarafından desteklenmiştir

vı SİMGELER VE KISALTMALAR EDTA AE Antijen B Antijen 5 BT DAB dh 2 O EITB ELISA ERCP Ig kda KE MRI PE SDS-PAGE TEMED USG : Etilen-diamino-tetrasetik asit : Alveolar ekinokokoz :AgB :Arc5, Ag5 : Bilgisayarlı tomografi : Diaminobenzidine : Distile su : Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot : Enzyme-linked immunosorbent assay :Endoskopik Retrograd Kolanjiopankreatografi : İmmunoglobulin : Kilodalton : Kistik ekinokokozis : Manyetik rezonans imaging : Polikistik ekinokokozis : Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis : N,N,N,N-tetramethylenediamine :Ultrasonografi µ : Mikron

1 1. GİRİŞ Hidatidosis in meydana getirdiği, insan ve hayvanlarda yaygın olarak görülen bazen öldürücü olabilen bir hastalıktır. Dünyada bir çok ülkede görülen bu hastalık, Türkiye de de gerek sağlık, gerek ekonomik açıdan önemli bir sorun oluşturmaktadır (Sarımehmetoğlu ve ark., 1998). İnsanlarda Kistik Ekinokokkozis (KE) prevalansı, koyun, sığır gibi besi hayvanlarındaki prevalansla yakından ilişkilidir. Buna ek olarak hijyen koşulları, parazit genotipi gibi faktörler de prevalansı etkilemektedir. Çoğunluğu koyunculuk yapılan bölgelerde olmak üzere, 2 milyon insanda E. granulosus ekinokokozu olduğu düşünülmektedir. (Romig, 2003). Sağlıksız şartlarda ve bilinçsizce kesilen kasaplık hayvanların kistli karaciğer ve akciğer gibi organlarının köpeklere yedirilmesi sonucu infekte olan köpekler, gerek insanlar gerekse evcil hayvanlar için sürekli bulaş kaynağını oluşturmaktadır. Böylece özellikle köpekler ile koyun ve sığır gibi evcil hayvanlar arasında oluşan döngünün insanlara bulaşması, infekte köpeklerle temas ile veya köpek dışkısı ile infekte olmuş sebze ve meyve gibi yiyecek maddelerinin tam yıkanmadan yenmesiyle gerçekleşmektedir (Saygı, 1998; Craig ve ark., 2003). Önemli bir halk sağlığı sorunu olan ve yaşamı tehdit edici ciddi tablolar oluşturan KE e, etkili ve zamanında tedavi protokolünün planlanabilmesi için hastalığın tanısının mümkün olan en erken dönemde ve güvenilir bir yöntemle konması gerekmektedir. KE tanısında, günümüzde bilinen bütün serolojik tanı yöntemlerinden faydalanılmaktadır. Özgül antikorların araştırıldığı serolojik yöntemlerde karşılaşılan hatalı ve non spesifik sonuçlar, araştırıcıları daha özgül ve daha duyarlı serolojik tanı yöntemlerinin geliştirilip uygulamaya konulması konusunda aktive etmektedir. Bu aktivasyon neticesinde hidatik kist sıvısındaki antijen komponentleri ayrıştırılmış ve bu komponentlerin herbirine karşı hasta serumunda oluşan özgül antikorların

2 gösterilmesi esasına dayanan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ve western blot (WB) yöntemi geliştirilmiştir (Maddison ve ark., 1989; Sbihi ve ark., 2001; Lorenzo ve ark., 2005). Kist sıvısı içinde en iyi özgüllük gösterenlerin antijen B ve antijen 5 olduğu bildirilmektedir. Antijen B nin 8[12]kDa luk alt ünitesine karşı oluşan antikor yanıtının, E. granulosus türüne değil, cinsine özgül olduğu bildirilmiştir (Ito ve ark., 1998). Ancak bu antijenlerin bile E. multilocularis ve Taenia solium infeksiyonları varlığında, çapraz reaksiyon verdiği gösterilmiştir. (Kittelberger ve ark., 2002; Rafiei ve Craig, 2002). KE tanısında radyolojik görüntüleme yöntemleri (ultrasonografi, bilgisayarlı tomografi, manyetik rezonans görüntüleme ve direkt grafi) ile beraber uygulanan serolojik yöntemler arasında kompleman fiksasyon testi, lateks aglütinasyon testi, indirekt hemaglütinasyon testi, indirekt immunofloresans antikor testi, immunoelektroforez, immunodiffüzyon, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblotting gibi yöntemler bulunmaktadır. Tüm bu serolojik yöntemlerin duyarlılık ve özgüllüklerinin uyumlu olmamasının nedeni, standardize edilmemiş, saflaştırılmamış veya kısmen saflaştırılmış antijenlerin kullanılmasıdır (Sbihi ve ark., 1997; Sbihi ve ark., 2001; Galitza ve ark., 2005). Günümüzde, SDS-PAGE ve WB yöntemi infeksiyon ajanlarının protein yapısındaki antijenlerini ortaya çıkararak, indirekt tanı yöntemlerinin değerini düşüren çapraz reaksiyonlar gibi olumsuzlukları ortadan kaldırmaktadır. Bu tekniğin, insanlarda ve hayvanlarda paraziter hastalıkların tanısında son derece hassas ve özgül olduğu bildirilmektedir (Sarımehmetoğlu ve ark., 1998; Galitza ve ark., 2005).

3 KE li hastaların, cerrahi olarak veya kemoterapi ile tedavi edildikten sonra nükslerin görülebildiği, immünolojik yanıtın 2 yıldan daha fazla süreyle pozitif kaldığı bildirmektedirler (Zarsoza ve ark., 1999). Operasyon sonrası nükslerin daha sağlıklı bir şekilde değerlendirilebilmesi için ön tanının serolojik tanı yöntemleriyle desteklenmesi gerektiği kabul edilmektedir (Craig ve ark., 1997; Eckert ve Deplazes, 2004; Wulamu ve ark., 2004). Serolojik yöntemlerde kullanılan antijen kaynağının iyi seçilmesi, mümkünse saflaştırılarak kullanılması ve tanıda en az iki testin birlikte kullanılması gerektiği vurgulanmaktadır (Kanwar ve ark., 1992; Ito ve ark., 1998; Ortano ve ark., 2003). Çalışmamızda, kist sıvısındaki antijenik fraksiyonlar saptanarak, molekül ağırlıklarına ve yapısal özelliklerine göre ayrıştırılmıştır. Ayrıca, KE li hastaların serumlarında; hastalığın farklı dönemlerinde, değişik antijenik fraksiyonların tanısal değerinin saptanması amaçlanmaktadır.

4 1.1. Genel Bilgiler 1.1.1. Tarihçe Echinococcus ların erişkin formları ve özellikle de larva evreleri hakkındaki ilk bilgiler çok eski zamanlara dayanmaktadır. Hippocrat (MÖ 460-347) sığır ve domuzda KE un varlığını bildirmiş, insan karaciğerinde saptadığı KE i, su dolu kese anlamındaki Jecur aqua repletum ile tanımlamıştır. Aristotales (MÖ 384-322), KE in karaciğer ve akciğerde yıkım yaptığına dikkat çekmiştir. Galenos (MÖ 131-201), sığırların karaciğerlerinde çok kez gördüğü hidatik kese leri insanda da gördüğünü bildirmiştir (Merdivenci ve Aydınlıoğlu, 1982). Tyson (1691), koyun leşlerinde gördüğü hidatik kistleri tarif etmiştir. Goeze (1782), kistlerin içindeki skolekslerden bahsetmiş, Siebold (1853) ise Echinococus granulosus un yaşam döngüsünü deneysel olarak kanıtlamıştır. Echinococus multilocularis in tür tayini, E. granulosus un tanımlanmasından çok sonra Rausch (1954) tarafından parazitin saptanması ve Vogel (1957) tarafından tilkilerle kemirgenler arasında süregelen vahşi yaşam döngüsünün anlaşılmasından sonra yapılabilmiştir (Flisser, 1998). Echinococus vogeli, Tatche ve Sousa (1966), Echinococus oligarthrus ise, Rausch ve D Alessandra (1978) tarafından isimlendirilmişlerdir. 1920-1960 yılları arasında en az 10 farklı tür önerisi yapılmış, ancak daha sonra tekrarlanan çalışmalar sonucunda tür sayısı dört olarak belirlenmiştir (Flisser, 1998; Yazar, doktora tezi 1998). 1.1.2. Sınıflandırma İnsanda Kistik Ekinokokoz a neden olan 4 tür bulunmaktadır. E. multilocularis, E. oligarthrus ve E. vogeli genetik olarak tek tip olan yapıları nedeniyle tam olarak sınıflandırıldıkları halde, E. granulosus genetik ve epidemiyolojik açıdan

5 değişkendir. İnsanlarda belirgin olarak farklı patojeniteye sahip genotip veya suşları olduğu gözlemlenmiştir (Romig, 2003; Eckert ve Deplazes, 2004) (Tablo 1). Tablo 1. Echinococcus türlerinin uluslararası sınıflandırmaya göre yerleşimi (Romig, 2003; Craig ve ark., 2003; Thompson ve MacManus, 2002). Tür Yaptığı hastalık Dağılım E. granulosus Kistik ekinokokoz Kozmopolit E. multilocularis Alveolar ekinokokoz Kuzey Yarımküre E.vogeli Polikistik ekinokokoz Orta ve Güney Amerika E. oligarthrus Polikistik ekinokokoz Orta ve Güney Amerika Echinococcus türlerinin sınıflandırmadaki yeri aşağıda yer almaktadır (Soulsby, 1986). Kingdom (Ülkealtı): Metazoa Phylum (Alem): Class (Sınıf): Plathelminthes Cestoda Subclass (Alt sınıf): Eucestoda Order (Takım): Family (Aile): Genus (Cins): Species (Tür): Cyclopylidea Taenidae Echinococcus E. granulosus E. multilocularis E. oligarthrus E. vogeli 1.1.3. Suşlar Genom çalışmaları türler arası ve tür içi farklılıkların belirlenmesinde olduğu kadar, taksonomi çalışmaları, türler arası akrabalığın belirlenmesi ve moleküler epidemiyoloji çalışmalarında da kullanılmaktadır. E. granulosus türünün morfolojik,

6 biyolojik, biyokimyasal ve özellikle moleküler biyolojik özelliklere dayanarak 9 genotipe (G1-G9) ayrıldığı ileri sürülmüştür (Thompson ve McManus, 2002). Genotipik özellik gösteren bu varyantlar (suş) morfolojik özellikler, gelişme oranı, konak dağılımı, patojenite ve coğrafik dağılımları arasında farklılıklar göstermektedir. G1 suşunun bulunduğu Güney Amerika, Kuzey ve Doğu Afrika, Asya ve Avustralya da koyun çiftliklerinin olduğu bölgelerdeki insanlarda KE prevalansının yüksek olduğu görülmektedir. Avrupa, Orta Doğu ve Güney Afrika da at suşu olarak bilinen G4 ün görüldüğü fakat insan vakasına rastlanmadığı bildirilmektedir. Bu suşun insanda patojen olmadığı düşünülmektedir. Avrupa, Asya, Afrika nın bir bölümü ve Güney Amerika da saptanan, sığır suşu olarak bilinen G5 in diğer genotiplerine göre daha zayıf konak özgülllüğü gösterdiği bildirilmiş olup, günümüze kadar yalnızca bir hastadan izole edilmiştir. E. granulosus koyun suşlarının, insan patojenitesinin zayıf olduğu görüşü yaygındır. G6 (deve), G7 (domuz), G8 (geyik) suşları genetik olarak yakın suşlar olup, aralarında çok az farklılık bulunmaktadır (Thompson ve McManus, 2002; Craig ve ar., 2003; Romig, 2003; Eckert ve Deplazes, 2004; Dinkel ve ark., 2004) (Tablo 2).

7 Tablo 2. E. granulosus türüne ait farklı suşlar (Eckert ve Deplazes, 2004). Suş ve izolat G1 (Koyun suşu) G2 (Tazmanya Koyun suşu) G3 (Buffalo suşu) Kesin konak (K) İnsan Arakonak (A) infeksiyonu Coğrafik Dağılım Avrupa, Orta Doğu, Afrika, K :köpek, tilki, çakal, sırtlan İran, Hindistan, Nepal, A: koyun, sığır, domuz, deve, Evet Avustralya, Yeni Zelanda, US, keçi Güney ABD, Tasmanya K: köpek, tilki A: koyun, sığır Evet Tazmanya, Arjantin K: köpek, tilki A: buffalo, sığır? Asya G4 Avrupa, Orta Doğu, Güney K: köpek A:at Hayır/? (At suşu) Afrika Avrupa, Güney Afrika G5 K: köpek Evet Hindistan, Nepal, Sri Lanka, (Sığır suşu) A:? Rusya, Güney ABD G6 K: köpek Orta Doğu, İran, Afrika, Çin, Evet (Deve suşu) A: deve, keçi, sığır Nepal, Arjantin G7 K: köpek Polonya, Slovakya, Ukrayna, Evet (Domuz suşu) A: domuz Rusya, Arjantin G8 (Geyik) K: kurt, köpek A:? Evet Kuzey ABD, Avrasya G9?? Evet Polonya Aslan suşu K: aslan A: zebra, antilop, yaban domuzu, bufalo, çeşitli antilop türleri, Zürafa, hipopotam? Afrika Türkiye den elde edilen iki koyun izolatı, Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) yöntemiyle analiz edilmiş, G1-G3 aralığına oldukça yakın oldukları görülmüştür (Yolasığmaz, 2004).

8 1.1.4. Morfoloji, Biyoloji Ve Yaşam Döngüsü Birkaç milimetre uzunluğunda olan Echinococcus erişkinleri, 2-6 halkalı sestodlardır. Toplu iğne başı büyüklüğündeki baş yapısı (skoleks) üzerinde dört emici disk ve çift sıralı çengel taşıyan rostelyum bulunmaktadır. Boyun bölgesinden sonra gelen gövdedeki (strobila) son halka, genellikle parazitin boyunun yarısından fazladır; bu halkada 200-800 adet yumurta bulunmaktadır. 20-50µ büyüklüğündeki yumurtalar çift membranlıdır; onkosferi (embriyon) çevreleyen embriyofor birbiri üzerine yerleşmiş bloklardan oluştuğundan, iki membran arasında radyan çizgilenmeler göze çarpmaktadır. Embriyofor, dış ortamda bulunan yumurta içindeki embriyonu çevresel koşullardan korumaktadır. Kuru toprakta, don koşullarında iki hafta canlılığını koruyabilmekte, kaynatılmaya bir dakika dayanabilmektedir. Yumurtalar, son konaktan atıldıklarında, içlerinde uygun arakonaklar için infektif olan, tam olarak gelişmiş embriyofor bulunmaktadır (Craig ve ark.,, 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). E. granulosus un yaklaşık 6 mm uzunluktaki erişkinlerinde, skoleks yapısından sonra üç halka bulunmaktadır. Rostelyum üzerinde çift sıra yerleşmiş, 34-38 çengel vardır. Skoleksten sonraki ilk halka genç, ikinci halka olgun, son halka ise gebe halkadır. Boyu eninin iki katı kadar olan olgun halkada böbrek biçiminde ovaryum ve tek tarafa açılan genital deliğin çevresinde sayıları 30-60 arasında değişen testisler bulunmaktadır. Son halkada 200-800 yumurta vardır (Thompson ve McManus, 2002; McManus ve ark., 2003; Eckert ve Deplazes, 2004) (Şekil 1). Şekil 1. E. granulosus erişkini

9 E. multilocularis, 1.2-4.5 mm uzunluğunda olup, 2-6 halkalıdır. Rostelyum üzerine çift sıra yerleşmiş, 14-34 çengel vardır. Gebe olan son halka gövdenin yarısı kadar uzunluktadır. İki loblu olan ovaryum üzüm salkımı görüntüsündedir. Testisler 14-36 adettir. Son halkada 250-400 yumurta bulunmaktadır (Saygı, 1998; Altıntaş, 2002). E. vogeli, 3.9-5.9 mm uzunluğunda olup, 3 halkalıdır. Rostelyum üzerine çift sıra yerleşmiş, 28-36 çengel vardır. Gebe olan son halka gövdenin yarısı kadar uzunluktadır. Olgun halkada at nalı şeklinde ovaryum ve 50-67 testis bulunmaktadır (Saygı, 1998; Altıntaş, 2002). E. oligarthrus, 1.9-2.9 mm uzunluğunda olup, 3 halkalıdır. Rostelyum üzerinde çift sıra yerleşmiş, 26-40 çengel vardır. Genital deliğin arka kısmında 35-46 adet testis bulunmaktadır (Saygı, 1998; Altıntaş, 2002). Echinococcus türleri genel olarak diğer sestodlarda olduğu gibi yaşam döngülerini tamamlayabilmek için iki farklı konak türüne ihtiyaç duymaktadır. Bağırsaklarında erişkin formları taşıyan kesin konakları köpekgiller, tilkiler veya kedigillerdir. Echinococcus erişkinleri bağırsak içeriği ile beslenir, dokuları istila etmezler; bu nedenle son konakta birkaç bin parazitin bulunduğu ağır infeksiyonlar bile genellikle asemptomatik seyretmektedir (Merdivenci ve Aydınlıoğlu, 1982; Romig, 2003). Çevreye dışkıyla saçılan Echinococcus yumurtaları son konakları için infektif özellikte değildirler. Larva evresi olan metasestod yapı, gelişebilmek için farklı konak türlerine gereksinim duymaktadır. İnsanın da içinde bulunduğu çok sayıda memeli türü Echinococcus türlerinin metasestodlarıyla infekte olabilmektedir (Şekil 2). İnsanda en sık karşılaşılan kistik ekinokokoz (kist hidatik, hidatidoz) etkeni E. granulosus dur. E. multilocularis alveolar ekinokokoz (AE), E. vogeli polikistik ekinokokoz (PE) etkenidir. E. oligarthrus bugüne kadar dört olguda (PE) etkeni olarak bildirilmiştir (Romig, 2003).

10 Şekil 2. E. granulosus ve E. multilocularis in yaşam döngüsü (McManus ve ark., 2003). İnsan arakonaklar, genellikle kör nokta oluşturarak yaşam döngüsünde kesintiye neden olurlar. Ancak hiperendemik bölgelerde yaşayan, Afrika yerlilerinin hayvanlarıyla beraber yaptıkları mevsimsel göç sırasında ölülerini açıkta bırakmaları sonucunda kesin konakların kistli cesetleri yemesi, insanla döngünün devam ettiği istisnai durumlardandır (McManus ve ark., 2003). E. vogeli nin kesin konağı çalı köpekleri (Speothos venaticus); arakonakları kemirgenlerdir. Karaciğer, akciğer ve diğer organlarda yerleşen larva evresinin içe ve dışa doğru gelişmesiyle çok sayıda vezikül meydana gelmektedir. E. vogeli gibi PE etkeni olan E. oligarthrus un yaşam döngüsünde vahşi kediler son konak, kemirgenler arakonaktır (Eckert ve Deplazes, 2004). E. granulosus larvaları primer infeksiyonu takiben herhangi bir anatomik bölgeye yerleşebilirler. En sık karaciğer (%63) ve akciğerlerin (%25) tutulduğu görülmekte, daha az sıklıkla kas (%5), kemik (%3), böbrek (%2), kalp (%1), dalak (%1), pankreasda (%1) yerleşebilmektedir (McManus ve ark., 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). Bulaşmadan sonra yumurtadan serbestleşen onkosferler çengellerini kaybederek, yerleştikleri dokuda dördüncü günde 40µ çapa ulaşırlar; içinde kist

11 boşluğu oluşmaya başlar, yedinci günde belirgin veziküler kist hidatik kabarcığı gelişir. Onuncu günde çimlenme zarının gelişmesi ve çimlenme çekirdeklerinin oluşumu izlenir, 30 uncu günde kist çeperinin konağa ait fibröz doku tabakası ile çevrelenmesiyle kist oluşumu tamamlanmış olur (Altıntaş, 2002; McManus ve ark., 2003). Üniloküler yapıda olan E. granulosus larvası içte çimlenme zarı (germinatif tabaka) ve dışta çok katlı kütikül ile çevrelenmektedir. Mukopolisakkarit yapısındaki hücresiz kütikül tabakası hem destekleyici özelliktedir, hem de canlı olan çimlenme zarından tomurcuklanarak aseksüel yolla çoğalan protoskoleksleri korumaktadır. Konağa ait fibröz doku en dışta, ilk ikisini çevrelemektedir (Eckert ve Deplazes, 2004). Antijenik özellikte olan berrak kist sıvısında tuzlar, enzimler, proteinler ve toksik maddeler bulunmaktadır. Taneli yapıda ince hidatik sıvı içinde serbest bulunan protoskoleksler, hidatik bir zar olan germinatif tabaka, kist içine ve bazen dışa doğru tomurcuklanır. İnsanda ender görülen dışa doğru oluşan keselere çift tırnaklılarda sıkça rastlanmaktadır. Meydana gelen çimlenme kapsülleri içinde aseksüel çoğalmayla meydana gelmiş protoskoleksler bulunmaktadır. Hidatik sıvı içinde 140-160µ büyüklüğünde, içeri çekilmiş skoleks bulunduran infektif yapılar olan protoskoleksler, kesin konak bağırsağında erişkin parazite gelişebilmektedir. Kist parçalanması sonrasında serbestleşerek sekonder kistlerin ortaya çıkmasına neden olmakta ve endojenik yolla ana kist içinde kız vezikülleri meydana getirebilmektedir. Her kız vezikül ana kistin tam bir kopyasıdır. Kız veziküller çok sayıda olduklarında multiveziküler kist yapısının ortaya çıkmasına neden olurlar (McManus ve ark., 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). Genel olarak son konakların dışkılarıyla dış ortama saçtıkları yumurtaların ağız yoluyla, sular ve besinlerle alınması sonucu E. granulosus larvaları insanlarda ve diğer ara konaklarda gelişmektedir. Bazı durumlarda yumurtaların bir kısmı infekte köpeklere yakın ortamlarda yaşayan diğer köpeklerin tüylerine, ayaklarına ve dışkıyı koklama sırasında burunlarına yapışmaktadır. Yakın temas sonucunda yumurtalarla

12 kirlenen ellerin ağza götürülmesiyle de insanlara bulaş olabilmektedir. Dışkıdan beslenen sinekler de yumurtaları mekanik olarak taşıyıp besinleri ve suları kirletebilmektedir. İnsanlar, solunum yolu ile yumurtaları alarak infekte olabilmekte, ayrıca fetusda plasenta yolu ile intrauterin bulaş da meydana gelebilmektedir. Yumurtanın ince bağırsakta açılması iki aşamada meydana gelmektedir (Yazar, 1998; McManus ve ark., 2003). 1.1.4.1. Onkosfer zarının ortaya çıkması Embriyoforun parçalanmasında pepsin ve pankreatin gibi proteolitik enzimler rol oynamaktadır. Embriyofor parçalanmadıkça onkosfer aktifleşmemektedir. Onkosfer membranının açığa çıkması ile birlikte safra tuzlarının etkisi ile membran geçirgenliğinde değişiklikler oluşmakta ve onkosfer aktif hale geçmektedir (Yazar, 1998). 1.1.4.2. Onkosferin aktifleşmesi Aktif hale geçen onkosfer serbest kaldığında ritmik hareketlerle ince bağırsak villuslarına tutunup 30-120 dakika içinde onkosfer salgılarının da yardımıyla lamina propria ya ulaşır. Bağırsak duvarını delerek venöz dolaşım ile pasif olarak karaciğere taşınır. Larval gelişme burada olabileceği gibi, burada tutunamayanlar portal sistemle kalbe, oradan akciğerlere geçip yerleşebilmektedir. Akciğerlerde de tutunamazlarsa pulmoner venler aracılığı ile tekrar kalbe, oradan da sistemik dolaşımla vücudun herhangi bir organına gidip yerleşebilmektedir (Eckert ve ark., 1984; Eckert ve Deplazes, 2004).

13 1.1.4.3. Yumurta Embriyonlu yumurta ince kabuklu, oval, 32-36/25-30 μ büyüklüğündedir. İçinde embriyofor ile çevrili heksakant embriyon bulunan yumurtalar ışık mikroskobu ile köpekteki Multiceps ve Taenia yumurtalarından kesin olarak ayırtedilememektedir (Thompson, 1995) (Şekil 3). Şekil 3. Echinococcus spp. yumurtası (Thompson, 1995) 1.1.4.4. Metasestod form KE'e sebep olan metacestod, içi ''kaya suyu" da denen kist sıvısıyla dolu uniloküler bir küre biçimindedir. Kist duvarı içte aseksüel tomurcuklanma ile çimlenme kapsüllerini oluşturan bir germinal tabaka, dışta ise hücresiz, elastik fakat dayanıklı bir laminar tabakadan oluşmaktadır. En dışta konak dokusu tarafından oluşturulan fibröz adventisiyal tabaka bulunmaktadır. Bazen kist rüptüre olup değişik ebatlarda kistler oluşturabilmektedir. İnsanda ise çok büyük kistler gelişebilir ve kistler içinde yavru veziküller görülebilmektedir (Eckert ve Deplazes, 2004) (Şekil 4).

14 Şekil 4. Metasestod formu (Morseth, 1967) 1.1.5. Hidatik Antijenler E. granulosus'un değişik yaşam evrelerindeki antijenlerinde farklılıklar bulunmaktadır. E. granulosus ve E. multilocularis ekstraksiyonundan elde edilen tüm vücut antijenlerinin incelenmesi sonucu, erişkin parazit antijeninin özelliklerinin kist sıvısında, protoskolekslerde, hatta kist membranlarında bulunmadığı tespit edilmiştir. Metasestod larvasının antijenleri üzerinde birçok çalışma yapılmış ve halen yapılmaktadır. Protoskoleksler, kist sıvısı ve kist membranları, serolojik tanı yöntemlerinde antijen kaynağı olarak eskiden beri kullanılmakta ve bunların antijenik özellikleri üzerine karşılaştırmalı olarak araştırmalar yapılmaktadır. Bu materyallerin hepsi çoklu antijenik bileşimler içermektedir. Bu antijenlerden bazıları antijen kaynaklarının hepsinde bulunmasına rağmen, bazılarının belli yapılara özgün olduğu bildirilmektedir (Craig ve ark., 1997; Rafiei ve Craig, 2002; Zhang ve McManus, 2003). Birçok antijenin Echinococcus türleri için özgün olmadığı, bazı ekinokok antijenlerinin sadece diğer sestodlarla değil, aynı zamanda trematod ve nematod'ların antijenleriyle de reaksiyon verdikleri gösterilmiştir. Diğer paraziter hastalıklarla

15 çapraz reaksiyon veren laminar membran, kist sıvısı ve protoskolekslerde bulunan antijenler, KE tanısında özgünlüğün düşmesine neden olmaktadır. KE'li hastaların yüksek P1 aktivitesine sahip olduğu bildirilmektedir; diğer bazı paraziter hastalıklarda da bu aktivite olduğundan çapraz reaksiyon görülebilmektedir. Ayrıca bazı malign tümörlerdeki yüksek anti-p1 aktivitesi de çapraz reaksiyonun sorumlusu olarak kabul edilmektedir. Kist hidatik sıvısında bulunan, insan protein komponentleriyle reaksiyona giren otoantikorların da yalancı pozitifliklere neden olduğu bildirilmiştir (Kagan ve Norman, 1961; Ortano ve ark., 2003). E. granulosus antijenlerinin duyarlılığını ve özgünlüğünü saptamak için yapılan bir çalışmada; protoskoleks ve erişkin antijenlerinin duyarlılıkları sırasıyla %89.8 ve %82.5, özgünlükleri ise %48.5 ve %65 oranında bulunmuştur (Craig ve ark., 1997). KE tanısında en çok kullanılan antijen, kist sıvısıdır. Kist sıvısının bir antijen karışımı olduğu, birden çok protein ve karbonhidrat fraksiyonu içerdiği, bu fraksiyonların da protein ve karbonhidrat metabolizması sonucu oluştukları tespit edilmiştir. Değişik arakonaklardan elde edilen kist sıvılarının antijenik özelliklerinin de farklı olduğu, fertil olmayan kist sıvılarında antijenik aktivitenin yetersiz kalabileceği, kist dokularına ait ekstrakttan elde edilen antijenin daha duyarlı olduğu bildirilmiştir (Zhang ve McManus, 2003). Farklı konaklardan alınan kist sıvılarının antijen konsantrasyonlarını karşılaştırılmıştır. İnsan ve koyun kistlerinin sığır ve domuz kistlerine, karaciğer kistlerinin ise akciğer kistlerine oranla daha fazla antijenik proteinlere sahip olduğu saptanmıştır (Rafiei ve Craig, 2002). Bir başka çalışmada protoskoleksler, kist membranları ve kist sıvısını serolojik testler için antijenik özellikleri bakımından denenmiş ve kist sıvısının serolojik testler için en uygun antijenik özelliğe sahip olduğu belirlenmiştir (Kagan ve Norman,1961). Çeşitli laboratuarlardan alınan test sonuçlarına göre kist sıvısının duyarlılığı ve özgüllüğünü karşılaştırılmış; duyarlılık %31-96, özgüllüğün %41-100 arasında değiştiği görülmüştür (Carmen ve ark., 2005).

16 KE li hastaların serolojik tanısında en fazla koyun kistlerinden elde edilen antijenler kullanılmakla beraber, deve gibi diğer arakonaklarda görülen E. granulosus kist sıvısı antijenlerinin de tanısal bir potansiyele sahip olabilecekleri bildirilmektedir. Kist sıvısı antijenleriyle karşılaştırıldığında, E. granulosus a ait metasestod antijenleri gibi diğer antijenler ile ilgili bilgi çok azdır (Rafiei ve Craig, 2002). Kist sıvısı antijenlerinden en iyi özellik gösterenlerin antijen B ve antijen 5 olduğu bildirilmektedir. 8[12] kda luk alt üniteye sahip olan antijen B nin daha özgün olduğu yapılan çalışmalarla ispatlanmıştır. Ancak bu antijenlerin bile E. multilocularis ve Taenia solium infeksiyonları varlığında, çapraz reaksiyon verdiği gösterilmiştir. KE li hastalarda tüm immünolojik tanılarda antijen B nin duyarlılığının; hastanın durumu, kistin patolojisi ve kistin yerleşimine bağlı olarak %60-90 arasında değişkenlik gösterdiği saptanmıştır (Schantez ve ark., 1980; Barbieri ve ark., 1993; Sbihi ve ark., 1996; Kittelberger ve ark., 2002; Rafiei ve Craig, 2002). Kist sıvısında Ag5 saflaştırılıp, pozitif hasta serumuyla ELISA IgG test edildiğinde, özgünlük 95.7-100% oranında saptanmıştır. Ancak, cysticercosis li hasta serumlarıyla %16, leishmaniosis, toxoplasmosis ve trichinosis li hasta serumlarıyla %8 oranında yalancı pozitiflik verdiği görülmüştür (Doiz ve ark., 2002). Antijen 5: KE in tanısal değeri üzerine bir çok çalışma yapılmaktadır. Antijen 5; çimlenme zarında, protoskolekslerin parankiminde ve çıkartı sisteminde bulunmaktadır. "Arc5 veya Ag5" adı da verilen bu antijenin tanıdaki önemi birçok araştırıcı tarafından vurgulanmışsa da E.multilocularis ve E.vogeli ile infekte hasta serumlarında bu antijene karşı antikor geliştiği, Taenia hydatigena'nın sistiserkus sıvıları içinde de bu antijenin bulunduğu saptanmıştır. Kromatografik analizlerde; antijen 5 in, 56 C ye kadar ısıya dayanabildiğini ve ph 4-7 arasında çalışabildiğini saptamışlardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda indirgenmemiş koşullarda 22-24 kda ve38 kda molekül ağırlıklarına sahip iki proteinden oluşan, 67 kda molekül ağırlığına sahip bir glikoproteindir. 38 kda luk antijen, Ag5 nin en iyi antijenik özellik gösteren alt ünitesidir (Lightowlers ve ark., 1989; Barbieri ve ark., 1993; Lorenzo ve ark., 2005).

17 Antijen B (AgB): 100 0 C de 15 dakika ısıtmaya dayanıklı bir lipoproteindir. Bu antijenin kist sıvısı kaynatıldıktan sonra antijenik özelliğini koruyan en önemli determinant olduğu bildirilmektedir. İmmünohistolojik çalışmalarda AgB nin, hem protoskoleksin tegümen bölgesinde hem de metasestod un germinal bölgesinde bulunduğu, kist sıvısı içerisine sekrete olduğu bilinmektedir. Moleküler ağırlığı 120 kda civarında olduğu tahmin edilen AgB, üç ayrı komponentten oluşmaktadır. Kist sıvısından çok daha immunojenik ve özgün olan Arc5'e oranla 10 kat daha yoğun olarak bulunduğu ispatlanmıştır. AgB nin indirgenmiş ve indirgenmemiş koşullarda tanınabilen 8[12], 16 ve 24 kda luk alt ünitelerden oluştuğu saptanmıştır. KE li hastalarda AgB nin immünojenitesi güçlü olan 8[12] kda luk en küçük alt ünitesine özgü antikorlar %80-90 oranında saptanırken, E. multilocularis ile infekte hastaların yaklaşık %40 ında bu antijene karşı antikorların oluştuğu bildirilmektedir. AgB, antiproteaz aktivitesiyle, nötrofillerin kemotakisisini engelleyerek parazitin yaşamını sürdürmesini sağlamaktadır. Ayrıca, antikorlarlarla işbirliği yaparak komplemanı aktive etmekte ve buna bağlı olarak diğer sestodların ortadan kaldırılmasında da önemli rol oynamaktadır (Kagan ve Norman, 1961; Maddison ve ark., 1989; Leggat ve McManus, 1994; McVie ve ark., 1997; Rafiei ve Craig, 2002; Zhang ve McManus, 2003). Koyun kist sıvısını SDS-PAGE yöntemi ile analiz edildiğinde molekül ağırlıkları 29, 45, 58, 68, 98 ve 116 kda olan 6 özgül bant saptanmıştır. Aynı çalışmada, EITB (enzyme-linked immünoelectrotrasfer blot) testi ile pozitif koyun serumu incelenmiş ve 29, 38, 42, 58, 62, 68, 98, 116, 120, 150 ve 205 kda luk bantlar görülmüştür (Şimşek ve Köroğlu, 2004). Koyun, keçi, domuz ve insandan alınan hidatik kist sıvılarında, molekül ağırlıkları 8-116 kda arasında değişen en az 15 protein fraksiyonu saptanmış, KE li insanların serumları ile karşılaştırdıklarında, 16, 24, 38, 45 ve 58 kda luk bantlara karşı antikor yanıtının oluştuğu görülmüştür. Fakat bu bantların diğer bazı paraziter infeksiyonlu insan serumlarıyla da çapraz reaksiyonlar verdiği tespit edilmiştir. Aynı zamanda 8[12] ve 116 kda luk iki antijene karşı, KE li insan serumlarında özgün antikor yanıtının oluştuğu bildirilmiştir (Kanwar ve ark., 1992).

18 İnsan ve çeşitli hayvanlardan alınan kist hidatik sıvılarını indirgenmiş koşullarda gradient jel elektroforez yöntemiyle yürütüp, gümüş boyası ile boyadıklarında, 52-65 kda ve 8[12] kda luk bölgelerde çok sayıda bant görmüşlerdir (Maddison ve ark., 1989). Pratikte kullanılan ELISA testinde saf (crude) hidatik kist sıvısı kullanıldığında, yüksek duyarlılık elde edilirken, özgüllüğün çoğu zaman düşük çıktığı yapılan çalışmalarda ispatlanmıştır. Saflaştırılmış antijenler (örneğin AgB) ve özel teknikler (örneğin, immunoblot analizi, IgG4 antikorlarının tespiti, immunoelectropheresis) kullanıldığında, özgüllük artarken ortalama duyarlılığın oldukça düşük çıktığı bildirilmektedir. Bunun yanı sıra karaciğer kistli hastaların %10-20 sinde, akciğer kistli hastaların yaklaşık %40 ında özgün antikorlar oluşmamakta ve yanlış negatif sonuçlar ortaya çıkabilmektedir (Oriol ve ark., 1971; Ortano ve ark., 2000; Sbihi ve ark., 2001; Eckert ve Deplazes, 2004). KE li hastalarda antikor tespitinde kullanılan testlerin duyarlılıkları, özgüllükleri ve çapraz reaksiyonları Tablo 3 de gösterilmektedir. Tablo 3. E. granulousu antijenleri ve tanısal değerleri (Eckert ve Deplazes, 2004). Test Antijen Duyarlılık Özgüllük Çapraz Reaksiyon Sestodlar (%89), Kist sıvısı 80-90 61,7 Trematodlar (%30), IgG Nematodlar (%39) ELISA AgB (nativ veya 63-92 85-93 AE sentetik peptit) IgG4 ELISA Kist sıvısı 61-67 >99 AE Yalnız T. solium Kist sıvısı 71 >98 (cysticercosis) EITB AgB fraksiyonu 92 100 - AgB alt üniteleri 34-36 >99 - EITB: Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot.

19 Saflaştırma yöntemi olarak; diyaliz, afinite kromatografisinin değişik tipleri, Western immunoblotting, agar jelde çift difüzyon kullanılmaktadır. SDS-PAGE ve Western blot (WB) yöntemleri, infeksiyon ajanlarının protein yapısındaki antijenlerini ortaya çıkararak, indirekt tanı yöntemlerinin değerini düşüren çapraz reaksiyonları ortadan kaldırdığı bildirilmektedir (Harry ve ark., 1979). Koyun hidatik kist sıvısı, G-Sepharose protein kolonunda saflaştırıldıktan sonra WB yöntemiyle 12-14, 16, 20, 24-26, 34, 39, 42 kda luk antijen fraksiyonları saptanmıştır. Ameliyat öncesinde 13 hastanın serumları ile bu antijenler karşılaştırılıp, duyarlılıkları test edilmiştir. Duyarlılığın en fazla 20 (%69), 39 (%92) ve 42 kda luk (%85) bantlarda yoğunlaştığı görülmüştür (Doiz ve ark., 2001). KE hastalarda özellikle IgG, IgM ve IgE seviyelerinde artış görüldüğü bilinmektedir. Seropozitif bireylerde Ag5 ve AgB yi tanıyan IgG1 ve IgG4 antikorlarının baskın olduğu bildirilmektedir. Diğer helmint infeksiyonlarında olduğu gibi, KE hastalarda da Th1 ve Th2 sitokinleri uyarılmaktadır. Th1 hücreleri IL-2, interferon-γ (IFN-γ) ve lenfotoksinleri uyarırken, Th2 hücrelerinin IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 ve fonksiyonu bilinmeyen p600 genini uyardığı tespit edilmiştir. Bu iki hücre arasında bir çaprazinhibisyon olduğu bilinmektedir. Th2 hücrelerinin çoğalması IFN-γ, Th1 uyarımının, IL-10 tarafından inhibe edildiği gösterilmiştir. Bu sitokinlerin genellikle birbirlerinin uyarımlarını baskılamalarına rağmen, KE de her iki sitokinin de seviyelerinin yüksek olma nedeni bilinmemektedir. Bunun hidatik kist sıvısının çok kompleks olan antijen içeriğinden kaynaklandığı düşünülmektedir. IL-5 kontrol deneklerinde negatifken, KE li hastaların %90 nında özellikle parazitin antijenleri tarafından uyarıldığı gösterilmiştir. Birçok çalışmada da IL-5 in özgüllüğü, IgE ve IgG4 antikorlarının düzenlenmesiyle ilişkili olduğu bildirilmiştir. KE infeksiyonlarında IL-6 nın özgün olarak oluşmadığı görülürken, IL-5 antijene özgül oluşmaktadır. KE li hastalarda görülen IgG4, IgE ve IL-5 uyarımları arasında önemli bir korelasyon bulunduğu bildirilmektedir. Total IgE seviyesi yalnızca tanısal amaçlı olmayıp, operasyon sonrası hastalığın seyri hakkında çok önemli ipuçları verebilmektedir. Hastalığın ileri dönemlerinde kistin gelişimi ve büyümesi üzerine IgG4 ün etkili olduğu, kist konak tarafından parçalandığında IgG1, IgG2 ve IgG3 yanıtının baskın olarak ortaya çıktığı

20 gösterilmiştir (Force ve ark., 1992; Vedat ve ark., 2001; Cardoza ve ark., 2002; Kittelberger ve ark., 2002; Zhang ve McManus, 2003; Ortano ve ark., 2003; Stephen ve ark., 2004). Deneysel olarak oluşturulan sekonder infeksiyonda, farelere intraepitelyal yolla protoskoleks enjekte edildiğinde, üç gün içerisinde aktive olmuş makrofaj hücrelerinin de içinde bulunduğu hücresel infiltrasyonla protoskolekslerin etrafının sarıldığı ve daha sonra nötrofil, eozinofil ve lenfositlerin de devreye girdiği bildirilmektedir. İn-vitro koşullarda splenositler tarafından salgılanan IL-4, IL-5 ve IL-10, infeksiyondan bir hafta sonra tespit edilebilmektedir. Serumda yüksek seviyede tümör nekrozis faktör (TNF), IFN-γ, IL-6 ve özgül IgG1 tespit edilmiştir (Kittelberger ve ark., 2002; Ortano ve ark., 2003; Zhang ve McManus, 2003). Karaciğer, akciğer veya her iki organda KE i olan 33 hastanın 31 inde IFN-γ aktivitesi gözlenirken, karaciğer yerleşimli kistin ameliyat ile alınmasından sonra nüks görülen iki hastada ve oküler KE li hastalarda IFN-γ aktivitesine rastlanmamıştır. Aynı çalışmada, dolaşım sisteminde bulunan IFN-γ seviyesi ve parazitin antijenlerine karşı immünolojik aktivitenin oluştuğu tespit edilmiştir (Boukoffa ve ark., 1997). Fare deneyinde, E. granulosus a bağlı infeksiyonun erken döneminde, düşük dozda parazitinin tip-o sitokin sentezini uyardığı, yüksek dozda parazit inokülasyonunda tip-2 sitokinlerinin uyarıldığı saptanmıştır (Sylvia ve ark., 2003). Genellikle, kistin gelişim döneminde immün yanıtın etkili olmadığı kabul edilmektedir. Ancak koyunlarda, doğal infeksiyonlarda, bazı kistlerin gelişimleri sırasında ortadan kaldırıldıkları gösterilmiştir. Kist gelişiminde bozulma meydana geldiğinde immün yanıtın, parazitin öldürülmesinde rol oynadığı düşünülmektedir. Deneysel infeksiyonlarda protoskolekslerin %10 dan daha az bir kısmının kist formunda yaşamını sürdürdüğü, parazit ölümünün çoğu zaman infeksiyondan sonraki iki hafta içinde gerçekleştiği kabul edilmektedir. Aktive olan makrofajların, protoskolekslerin parçalanmasında görev aldığı bilinmektedir (Zhang ve McManus, 2003).

21 E. granulosus un konağa özgül suşları veya genotipleri olarak bilinen farklı formları görülmesine rağmen, infekte insanlarda veya memelilerde suşa veya genotipe özgü antikor yanıtının varlığı kesin olarak açıklığa kavuşturulamamıştır (Rafiei ve Craig, 2002). IgG tanısı için yapılan testlerin genellikle cerrahi ve kemoterapi sonuçlarının değerlendirilmesinde düşük duyarlılığa sahip olduğu bildirilmektedir (Altıntaş ve Yazar, 2004). KE li hastalarda, ilaç tedavisi ve cerrahi girişim sonrasında hastalığın ortadan kalktığından emin olmak için, dikkatlice izlenmesi gerektiği düşünülmektedir. Cerrahi sonrası kistleri başarılı şekilde çıkarılmış hastalarda IgG4 ün negatifleştiği, nüks görülen hastaların ELISA değerlerinde ise IgG4 ün yüksek titrede devam ettiği görülmüştür. Bu nedenle KE li hastaların takibinde IgG4 titresinin önemli olduğu vurgulanmaktadır. Tedavi sonrasında hastalarda yalnız IL- 12 tespit edilmesinin tedavinin başarısını, IL-4 görülmesi ise başarısızlığını gösterdiği düşünülmektedir (Zhang ve McManus, 2003; Stephen ve ark., 2004). KE un tanısında başvurulan tanı yöntemleri esas olarak radyolojik yöntemler olmasına rağmen, tümör, apse, basit kist gibi diğer yer kaplayan olgularla ayırıcı tanısının yapılabilmesi ve cerrahi sonrası nükslerin daha sağlıklı bir şekilde değerlendirilebilmesi için, ön tanının mutlaka serolojik yöntemler ile desteklenmesi gerekmektedir. Serolojik yöntemlerde kullanılacak antijen kaynağının iyi seçilmesi, mümkünse saflaştırılarak kullanılması ve tanıda en az iki testin birlikte kullanılması gerektiği vurgulanmaktadır (Kanwar ve ark., 1992; İto ve ark., 1998; Ortano ve ark., 2003). E. granulosus un antijenik komponentlerinin saflaştırılmasında iyon-değişim kromatografisi, monoklonal antikorlar, izoelektrik fokuslama, affinite kromatografisi gibi çeşitli metodlar uygulanmaktadır. Çalışmalarda antijenin ve standartize edilmiş tekniklerin kullanılması gerektiği kabul edilmektedir (Zhang ve McManus, 2003).

22 Son yıllarda yeni kolon dolgu maddelerinin bulunmasıyla biyomoleküllerin ayrılmasında yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılmaya başlanmıştır. Böylece proteinlerin yapısal ve fonksiyonel analizlerini yapmak üzere çok kısa sürede ve etkin biçimde saflaştırılmaları mümkün olabilmektedir. HPLC yöntemi ile çok az miktardaki maddeler bile saflaştırılabilmektedir. HPLC nin avantajları; ayırma gücü, duyarlılığı ve geri kazanımı yüksek, hızlı bir yöntem olmasıdır (Ertan ve Arda, 1999) Çalışmamızda, kist sıvısında antijenik fraksiyonlar tespit edilerek, molekül ağırlıklarına ve yapısal özelliklerine göre ayrıştırılmıştır. KE li hastaların serumlarında; hastalığın farklı dönemlerinde, değişik antijenik fraksiyonların tanısal değerinin saptanması amaçlanmaktadır.

23 1.1.6. Epidemiyoloji 1.1.6.1. Dünyadaki Durumu İnsanlarda KE prevalansı, koyun, sığır gibi besi hayvanlarındaki prevalansla yakından ilişkilidir. Buna ek olarak hijyen koşulları, parazit genotipi gibi faktörler de prevalansı etkilemektedir. Çoğunluğu koyunculuk yapılan bölgeler olmak üzere, iki milyon insanda E. granulosus ekinokokozu olduğu düşünülmektedir (Merdivenci ve Aydınlıoğlu, 1982; Romig, 2003). Parazit prevalansının en yüksek olduğu bölgeler Avrasya, Afrika, Avustralya ve Güney Amerika nın bazı bölgeleridir. İnfeksiyonun endemik olarak görüldüğü bölgelerin yanında sporadik olarak da saptanabildiği, Grönland ve İzlanda da ise parazite hiç rastlanmadığı bildirilmiştir (Eckert ve Deplazes, 2004). E. multilocularis, tilki leşleriyle direkt temasla veya infekte dışkılarını bulaştığı meyvelerin yenmesiyle insanlara bulaşmaktadır. AE etkeni olan E. multilocularis kuzey yarım kürede, ılıman ve soğuk iklimli bölgelerde görülen önemli bir zoonozdur. Dünya üzerinde 100.000 kadar insanı infekte ettiği tahmin edilmektedir (Romig, 2003). PE etkeni olan E. vogeli sporadik olarak insanlarda görülmektedir. Günümüze kadar Orta ve Güney Amerika da bildirilmiş 120 olgu bulunmaktadır. E. oligarthrus un kesin konakları insanlara bulaşta direkt rol oynamazlar. İnfekte arakonakları yiyen av köpekleri hastalığı insanlara bulaştırmaktadır (Romig, 2003). 1.1.6.2. Türkiye de Durum Ülkemizde KE e, veteriner kontrolünde olmayan sokak köpeklerinin yaygınlığı ve gerekli önlemlerin alınmaması nedeniyle oldukça sık rastlanmakta, verilerin büyük

24 çoğunluğu hastane kayıtlarına dayanmaktadır. KE, ülkemizin birçok bölgesinde görülmesine rağmen, AE soğuk iklimli ve çok yüksek yerleşimli doğu bölgelerimizde sınırlı kalmaktadır (Altıntaş, 2003). E. granulosus taşıyan köpeklerin sıklığı, Ankara da %44, Bursa da %36, Sivas ta %28, Kars ta %40.5 olarak bildirilmiştir (Doğanay, 1983; Tınar ve ark., 1989; Ataş ve ark., 1997; Umur ve Arslan, 1998). İzmir civarındaki beş köyde 2055 kişide yapılan taramada %3.45 oranında seropozitiflik saptanmıştır (Altıntaş ve ark., 2003). Malatya ve çevresindeki durumun belirlenmesi amacıyla İnönü Üniversitesi Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuarında KE ön tanılı toplam 392 hastanın serumları incelenmiş, 159 olgu pozitif olarak değerlendirilmiştir. Cerrahpaşa Tıp Fakültesine başvuran, KE şüpheli 53 hastanın serum örnekleri çalışılmış ve %49 oranında seropozitiflik saptanmıştır (Karaman ve ark., 2002) (Aslan ve ark., 2003). Sağlık Bakanlığından alınan kesin olmayan 2004 yılı verilerine göre; hastanede yatan hasta sayısı 3948, KE den ölen hasta sayısı 37 ve hastaların hastanede kaldığı gün sayısı 36426 tır. 1.1.7. Patoloji ve Klinik İnsanlarda kistin başlıca yerleşim yerleri karaciğer (%66) ve akciğerdir (%22). Kistlerin daha az görüldüğü doku ve organlar ise kemik (%2), böbrek (%3), beyin (%1), kalp, dalak, kas ve tiroid (%6) olarak sıralanmaktadır Kist oluşumunun başlangıç döneminde kistler genellikle sessiz seyretmekte ve 5 cm çapa ulaşıncaya kadar herhangi bir belirti vermemektedir. Kistlerin toplam %40-60 ı belirti vermeden canlılıklarını sürdürmektedir. Bu dönem uzun yıllar hatta hayatın sonuna kadar devam edebilmektedir. Komşu organ ve dokulara yapılan baskı sonucu semptomların ortaya çıkması için geçen inkübasyon döneminin, kistin yerleşim yerine ve büyüme

25 hızına bağlı olduğu bildirilmektedir. Ayrıca yaş, immun sistemin durumu, konağa ait diğer hastalıklar ve parazit suşuna bağlı olarak patolojik seyrin değişebildiği gösterilmiştir (McManus ve ark., 2003; Eckert ve Deplazes, 2004; Sayek, 2004). Ayrıca çevre dokularda basınca bağlı olarak atrofi ve nekroz meydana geldiği bildirilmektedir. Beyine ve göze yerleşmiş kistlerde semptomlar daha erken dönemde ortaya çıkarken, karaciğer ve akciğer yerleşimli kistlerde semptomlar daha geç dönemde ortaya çıkmaktadır. Bu nedenle intraserebral kistler daha erken dönemlerde tespit edilebilirken, karaciğer ve akciğer yerleşimli kistlerin tanısı uzayabilmektedir (Sayek, 2004). Protoskolekslerin tam olarak ne zaman oluşmaya başladığı bilinmemesine rağmen, infeksiyondan 10 ay sonra ortaya çıktıkları düşünülmektedir (Pawlowski ve ark., 2001). Genellikle, insanlarda 5 ay-1 yıl arasında kist çapında 1 cm büyüme görülmektedir. Bir çalışmada kistlerin %30 unun yılda 1-5mm, %43 ünün yılda 6-15mm, %11 nin yılda 31mm büyüdüğü ve %16 sının büyüklüğünde herhangi bir değişiklik olmadığı saptanmıştır (McManus ve ark., 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). Karaciğer yerleşimli KE li hastaların, genellikle künt bir sağ üst kadran ağrısı ve karın bölgesindeki şişkinlikten yakındıkları, fiziksel muayenede en sık hepatomegali görüldüğü bildirilmektedir (Eckert ve Deplazes, 2004; Sayek, 2004). Parazite karşı ilk inflamatuar yanıtın birkaç saat içinde mononükleer hücreler ve eozinofil infiltrasyonu ile histolojik olarak ortaya çıktığı ifade edilmektedir (Altıntaş ve Yazar, 2004). Büyüyen kistlerin etrafında endotel hücreleri, eozinofiller ve dev hücreler içeren fibröz bir doku oluşmakta, böylece kist çevresinde fibroblasttan ve kapillerden zengin, kollagen bir tabaka meydana gelmektedir (Zhang ve McManus, 2003).

26 1.1.8. TANI 1.1.8.1. Klinik Tanı KE, belirgin olmayan klinik bulgu ve belirtiler vermektedir. Klinik tablo çok farklı olmakla birlikte, her yaşta ve her organda görülebilmektedir. Selim huylu ya da ağır bir hastalık tablosu çizebilmekte veya kronik, subakut ya da bazen acil tedavi gerektiren akut bir seyir gösterebilmektedir. Endemik olmayan bölgelerde KE in klinik tanısı çok zordur. Bunların görüntüleme teknikleri ve serolojik testler ile doğrulanması gerektiği bildirilmektedir. Hastanın geçmişi incelendiğinde endemik bir bölgede yaşaması veya burayı ziyaret etmiş olması, (tatil veya göç dahil) genellikle şüphe uyandırmaktadır. Ancak klinik muayeneye çok fazla katkıda bulunmadığı da bildirilmektedir. Hastalığa ait tipik özellikler olan hepatosplenomegali ve eozinofili saptanmaması durumunda KE den uzaklaşılmaktadır (Schantez ve ark., 1980; Maddison ve ark., 1989; Zhang ve McManus, 2003; Altıntaş ve Yazar, 2004). 1.1.8.2. Laboratuar Tanı 1.1.8.2.1. Direkt Mikroskobi Kist sıvısında, doğrudan veya çöktürme sonrası protoskoleksler, membran parçaları ve/veya çengeller aranmaktadır. Perkütan aspirasyon biyopsisi gibi invaziv tanısal yöntemler, ancak hastanın karaciğerinde hidatik kist bulunmasına rağmen seronegatif ise uygulanabilmektedir. Aspiratta protoskoleks, çengel ve membranların gözlenmesi, tanıyı doğrulayıcıdır. Aspiratta antijene bakılması steril kist sıvısında bile sonuç verebilir. Çünkü böyle sıvılarda da antijen olabileceği yolunda çalışmalar bulunmaktadır. Balgam veya idrarda da hidatik kist parçaları aranabilmektedir (Chandrakesan ve Parija, 2003; Eckert ve Deplazes, 2004).

27 1.1.8.2.2. Spesifik Tanı Klinik olarak pozitif olan olgularda, bir kistin varlığını onaylamak için invaziv olmayan görüntüleme tekniklerinin ve bunların sonucunu desteklemek için ise serolojik tekniklerin kullanılması gerekmektedir (Craig ve ark., 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). 1.1.8.3. Serolojik yöntemler Günümüzde, KE tanısında radyolojik tanı yöntemleri tercih edilmekle beraber. Ekinokok kistinin tümör, apse, basit kist gibi diğer yer kaplayan olgularla ayırıcı tanısının yapılabilmesi ve operasyon sonrası nükslerin daha sağlıklı bir şekilde değerlendirilebilmesi için ön tanının serolojik tanı yöntemleriyle desteklenmesi gerektiği kabul edilmektedir. Ancak serolojik test sonuçlarının yorumlanmasında da bazı zorlukların olduğu bilinmektedir. Bazı kişilerde kistin büyüklüğü, lokalizasyonu, yapısı, canlılığı ve kişinin immun sistem aktivitesine bağlı olarak antikor oluşmaması, bu nedenle de negatif serolojik test sonuçlarının her zaman KE tanısından uzaklaştırıcı bir sebep olmadığının bilinmesi gerektiği düşünülmektedir (Craig ve ark., 1997; Eckert ve Deplazes, 2004; Wulamu ve ark., 2004). 1.1.8.4. Görüntüleme yöntemleri Ultrasonografi (USG) Günümüzde KE, USG sırasında ortaya çıkmaktadır. USG nin çok etkin bir teknik olmadığı ve sonucun kullanıcıya, alete ve hastaya oldukça bağlı olduğu bildirilmektedir. Son çalışmalarda USG ile saptanmış, yer kaplayan bir karaciğer lezyonunun KE olma olasılığı Polonya da %13.5 ve Çin de %57.3 olarak saptanmıştır. Bazı endemik bölgelerde yaşayan çocuklarda yaygın malformasyonlar

28 ve malign lezyonlar nedeni ile bu olasılığın düşük olduğu bildirilmektedir (Craig, 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). Bilgisayarlı tomografi (BT) 1970 lerin sonlarından beri KE un tanısında kullanılmaktadır. BT, herhangi bir organı izleme olanağını sunması, daha küçük kistleri saptaması, kistlerin boyutlarını ölçmesi, kistin lokalizasyonunu tespit etmesi ve parazitik kist oluşumlarını, parazitik olmayanlardan daha kolay ayırdedebilmesi özellikleri nedeniyle, USG ye oranla daha üstündür. Ancak BT nin maliyetinin yüksek olması, bazı endemik ülkelerde sınırlı kullanımına yol açmaktadır (Craig, 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). Manyetik rezonans görüntüleme (MR) Ameliyat sonrası residüel lezyonların, nükslerin ve ekstrahepatik infeksiyonların değerlendirilmesinde iyi bir görüntüleme yöntemi iken, bu olgular dışında kullanımı oldukça az olup, BT veya USG den daha üstün olmadığı bildirilmektedir (Craig, 2003; Eckert ve Deplazes, 2004). X-ray muayeneleri Akciğer KE unde ve sporadik olarak herhangi bir yerdeki kalsifiye lezyonları belirlemede değerini koruduğu bildirilmektedir. Anjiografi, intravenöz veya perkütan kolanjiografinin, günümüzde yerini endoskopik retrograd kolanjiopankreatografi (ERCP) ye bıraktığı düşünülmektedir. 1960 larda kullanılan izotop karaciğer taramasının ise yerini USG ve BT ye bıraktığı bildirilmektedir (Akarsu, 1999; Eckert ve Deplazes, 2004).

29 1.1.9. Tedavi İnsanda KE için esas olarak cerrahi tedavi (drenaj, kistektomi veya karaciğer rezeksiyonu) uygulanmaktadır. Cerrahinin başarısının; kistin sayısı, büyüklüğü, organ yerleşimi, kistlerin durumu ve hastanın genel durumuna bağlı olarak değiştiği bildirilmektedir (Akarsu, 1999; Eckert ve Deplazes, 2004). Antihelmintik tedavinin, 7 mm çaptan küçük, izole kistler için minimal adventisyel tabakanın olması durumunda etkili olduğu bildirilmektedir. Komplike, yavru kistleri olan veya kalsifiye, kalın adventisyel tabakalı kistlerde ise tedavinin daha az etkili olduğu görülmektedir. Albendazolün aynı grupta yer alan diğer ajanlara göre bağırsaktan daha iyi emildiği ve kiste daha iyi penetre olduğu bildirilmektedir. Praziquantel ise herhangi bir nedenle kist rüptürü veya kist sıvısında sızma olması durumunda (perkütan aspirasyon biyopsisi) verilebilmektedir. Ameliyat öncesinde protoskolekslerin inaktive edilmesi için albendazol kullanıldığı bildirilmektedir (Akarsu, 1999).

30 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Serumlar Ameliyat sırasında veya ultrason ile KE olduğu tespit edilmiş ve ilk ay içerisinde beş hastanın kanları alınmış, serumları ayrılarak -20 C de saklanmıştır. Ayrıca, PAIR (Puncture, Aspiration, Injection, Reaspiration) uygulanarak kisti inaktif hale getirilmiş 45 hastanın kanları alınarak, serumları ayrılmış ve -20 de saklanmıştır. Kanlar, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Bilimdalı, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilimdalı ve İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalına başvuran hastalardan temin edilmiştir. KE hastalığı bulunmayan 20 sağlıklı insandan ve çapraz reaksiyonları saptayabilmek için de, parazit olduğu (Taenia saginata, Hymenolepis nana, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichura, Enterobius vermicularis ) tespit edilmiş beş hastadan kan alınmış ve serumları ayrılarak -20 C'de saklanmıştır. 2.2. Antijen Hazırlanması 2.2.1 Kist sıvısı Ankara iline bağlı Çubuk ve Kazan ilçelerindeki KE'lu koyunların karaciğer kist sıvıları, steril şartlarda alınarak soğuk zincirle Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Bilimdalı laboratuarına ulaştırılmıştır. Steril olduğu anlaşılan koyunların kist sıvıları kullanılmamış, fertil olan koyun kist sıvıları çalışmaya alınmıştır.

31 Metalloproteaz aktivitesinin engellenmesi için, kist sıvılarının içerisine 1g/l sodyum azid ve 5mM EDTA eklenmiştir. Protoskolekslerin ve diğer partiküllerin çökmesi için 30 dakika bekletilmiş, 1000 devir/dak. da 15 dakika santrifüj edilmiş, üstteki sıvı alınarak -20 o C de saklanmıştır. Kist sıvısından, tuzu uzaklaştırmak için diyaliz tüpü (Sigma D-7884) kullanılarak diyaliz yapılmıştır. Liyafilizatörde iki gece bekletilerek toz haline getirilen kist sıvısının üzerine 5ml distile su eklenmiş, Bradford yöntemiyle protein miktarı ölçülmüştür. 2.2.2. Protein konsantrasyonunun ölçülmesi (Bradford yöntemi) 5xBradford Reagent (BR): Coomassie brillant blue G-250 Alkol (%95) Fosforik Asit (%85) 100gr 50ml 100ml Coomassie brillant blue, %95 alkol içinde çözüldükten sonra 100ml fosforik asit eklenmiş ve distile su ile 1lt ye tamamlanmıştır. Işık almayacak şekilde folyoyla kaplanmış, kullanılıncaya kadar cam şişe içerisinde +4C o de saklanmıştır. PBS (ph:7.4) : Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 NaCl 1.67gr 0.57gr 8.5gr Son hacim dh 2 O ile 1lt ye tamamlanarak, ph 7.2 ye ayarlanmıştır.

32 Bovin Serum Albumin (BSA): 30ml PBS içerisine 1gr/ml BSA eklenip karıştırılarak buzdolabında saklanmıştır. Testin Yapılışı: - Mikrotitre plağında birinci sıradaki 1-9 kuyucuklara, 5µl BSA eklenmiştir. 2-9 kuyucuklara 5µl dh 2 O eklenmiştir. BSA solüsyonundan 5µl alınarak 2. kuyucuktan itibaren dilüsyon yapılmış ve 8. kuyucuktan sonra atılmıştır. - Mikrotitre plağının ikinci sıradaki kuyucuklarına kist sıvısından 5µl konulmuştur. - BR sulandırıldıktan sonra, her bir kuyucuğa 250µl eklenmiştir. - 595nm de ELISA okuyucusunda okutulmuştur. 2.3. Gradient jel elektroforez ve Western Blot (WB) Analizi (Towbin ve ark., 1979) 2.3.1. Tampon ve solüsyonlar: % 30 Acrylamide: dh 2 O Acrylamide Bisacrylamide 100 ml 29.2gr 0.8gr 65ml dh 2 O içerisinde 0.8gr bisacrylamid çözüldükten sonra 29.2gr acrylamid eklenmiş, son hacim 100ml olacak şekilde dh 2 O ilave edilmiştir.

33 1.5M Tris (ph:8.8): 18gr Tris üzerine dh 2 O eklenerek son hacim 100ml ye tamamlanmıştır. 0.5M Tris (ph:6.8): 6gr Tris üzerine dh 2 O eklenerek son hacim 50ml ye tamamlanmıştır. %10 Ammonium Persulfate (APS): APS 15mg dh 2 O 150µl Ependorf tüpüne15mg APS üzerine 150µl dh 2 O eklenerek kullanılmıştır. (Bu solüsyon her seferinde yeniden hazırlanmıştır) %10 Sodium Dodecyl Sulfate(SDS): SDS dh 2 O 50gr 500ml 50gr SDS, 500ml dh 2 O içerisinde çözüldükten sonra kullanılıncaya kadar +4C o de saklanmıştır. SB (Sample Buffer): 0.5M Tris-Cl ph:6.8 1.2ml Gliserol 1ml %10 SDS 4ml %0.5 Bromphenol Blue 0.5ml

34 Son hacim dh 2 O ile 10ml ye tamamlanmış, üzerine %5 β-mercaptoetanol eklenmiştir. Ependorf tüplerine 400µl SB konularak -20C o de saklanmıştır. kullanılmadan önce SDS in erimesi için bir süre benmaride bekletilerek çözülmesi sağlanmıştır. 5XRunning Gel Buffer: Tris 15gr %10 SDS 72gr Glysine 5gr Son hacim dh 2 O ile 1lt ye tamamlanmıştır. 5xTransfer Buffer: Tris Glycine 3.625gr 18.025gr Son hacim dh 2 O ile 500ml ye tamamlanmıştır. Kullanılacağı zaman üzerine %20 metanol eklenmiştir. Tespit Solüsyonu (Fixing solution): 60ml %12 trikloroasetik asit içerisine 40ml metanol eklenmiştir. +4C o de saklanmıştır. Boyama Solüsyonu (Staining solution): 100ml %12 trikloroasetik asit içerisine, %5 R. 250 Coomasie blue eklenmiş, +4 0 C de saklanmıştır.

35 Açma Solüsyonu (Destaining Solutuion): %12 glasiyal asetik asit içerisine, %5 metanol eklenerek hazırlandıktan sonra +4 0 C de saklanmıştır. PBS (ph:7.4) : Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 NaCl 1.67gr 0.57gr 8.5gr Son hacim dh 2 O ile 1lt ile tamamlanarak, ph 7.4 e ayarlanmıştır. PBS-T (Yıkama solüsyonu): 1 lt PBS solüsyonuna 500ml tween 20 eklenerek +4 0 C de saklanmıştır. Blocking Solüsyonu: (%5 Yağsız süt tozu): TBS Yağsız süt tozu (skimmilk) 100ml 5gr Karıştırılarak hazırlanmıştır (Bu solüsyon hemen kullanılması gerektiğinden her seferinde yeniden hazırlanmıştır). Konjugat: Peroxidase conjugate-goat anti-human IgG-γ (Sigma, SIA6029) Substrat: 3,3 - Diaminobenzidine [DAB] (Sigma, D-4168)

36 2.3.2. Separasyon jelinin hazırlanması: (%5) (%20) dh 2 O 2.850 μl ----- %30 Acrylamide 840 μl 3.300μl 1.5M Tris 1.250 μl 1.250μl %10 SDS 50 μl 50μl TEMED 1.7μl 1.7μl %10 APS 45μl 10μl Sükroz ----- 750mgr - İki adet 10ml lik kapaklı plastik tüpe sırasyla hazırlanan, %5 lik ve %20 lik solüsyonlardan konulmuştur. Sükroz geç çözüldüğünden, tamamen eriyinceye kadar manyetik karıştırıcıda çalkalanmıştır. Hava kabarcıklarının kalmaması için ultrasonik banyoda 15 dakika bekletilmiştir. - Tüplerin üzerine önce TEMED, sonra %10 APS ilave edilerek tekrar manyetik karıştırıcıda çalkalanmıştır. - Hazırlanan iki ayrı solüsyondan 2.800μl alınarak gradient (marker) oluşturucuya ayrı ayrı konulmuş, her iki kapak aynı anda açılarak bir hortum yardımıyla cam plaklar arasına dökülmüştür. Üzerine 100μl bütanol ilave edilerek solüsyonun hava ile teması kesilmiş, ayrıca jelin üst yüzeyinin düzgün hale gelmesi sağlanmıştır. - Polimerizasyon için 45 dakika beklendikten sonra donan jelin üzeri çeşme suyu ile yıkanmış, kurutma kağıdı ile su uzaklaştırılmıştır.

37 2.3.3. Stacking jelin hazırlanışı (%5): dh 2 O 3.000μl %30 Acrylamide 665μl 0.5M Tris 1.250μl %10 SDS 50μl TEMED 5μl %10 APS 25μl - İlk dört solüsyon bir tüpe konulduktan sonra, üzerine TEMED ve %10 APS ilave edilip manyetik karıştırıcıda çalkalanmıştır. - Hazırlanmış olan stacking jel solüsyonu pipet ile seperasyon jel üzerine konup, taraklar hava kabarcığı oluşmayacak şekilde yerleştirildikten sonra polimerizasyon için 45 dakika bekletilmiştir. 2.3.4. Antijen hazırlanması: - Çukur başına 15 μl olacak şekilde hesaplanan antijen, %5 β-mercaptoetanol içeren sample buffer ile birebir oranında karıştırılmıştır. - Eppendorf tüpüne alınan antijeni denatüre etmek için, 99 o C de beş dakika beklenmiştir. - Buharlaşan suyun dibe çökmesi için buz kabında bir süre bekletilen antijen, manyetik karıştırıcıda çalkalanmıştır.

38 Örneklerin çukurlara konması ve jel elektroforezi: - Jel donduktan sonra tarak dikkatlice çıkarılmış, 1. kuyuya 5µl Renkli Marker, diğer kuyulara 20µl antijen yüklenerek elektrik akımı verilmiştir. - Antijen, jelin en altına ulaşıncaya kadar 18mA. sabit akım uygulanmıştır. 2.3.5. Jelin boyanması: Jelin boyanması işlemi, antijenin ayrılıp ayrılmadığının kontrolü amacıyla yapılmıştır. WB işlemine devam edileceği zaman bu işlem yapılmamıştır. - Spacer'lar çıkarılıp cam plaklar açılarak jel çıkarılmıştır. - Kullanılan marker renkli olduğu için, jelin üzerindeki markerın boyanmaması için o bölge çıkarılmıştır. - Jel, bir saat tespit solüsyonunda bırakılmıştır. - Tespit solüsyonundan çıkarılan jel, boyama solüsyonu içinde bir saat bırakılmıştır. - Boyanan jel üzerindeki boya fazlalığını gidermek için, bantlar görülünceye kadar 1 saat süreyle çalkalayıcıda bırakılmıştır. - Böylece jel üzerinde ayrılmış antijene ait değişik moleküler ağırlığa sahip proteinlerin oluşturduğu bantlar görünür hale gelmiştir

39 Separe olan proteinlerin nitrocellulose membrana transferi: Jel büyüklüğünde kesilen nitrocellulose membranlar metanol içinde bekletilirken, süngerler tampon solüsyonunda bekletilmiştir. İmmobilize edilmiş membran ve transfer tamponu içinde ıslanmış kurutma kağıtları, aşağıdaki gibi sıralanarak transfer tankına (Semi-dry blotting) yerleştirilip üzeri kapatıldıktan sonra, 56mA. lik sabit akımda bir saat bekletilmiştir. -Elektrod (Katod) -Sünger -Transfer membranı (Nitrocellulose membran) -Jel -Sünger -Elektrod (Anod) Blocking: - Membran şeritlerinin üzerindeki proteinlere non-spesifik bağlanmaları önlemek için, şeritler PBS-T içinde hazırlanan %5 lik yağsız süt tozunda, +4 o C de bir gün bekletilmiştir. - Blocking yapılmış membran şeritler,10 dakika PBS-T ile yıkanmıştır. Primer antikor bağlanması: - PBS-T solüsyonu ile serumlar 1/50 olacak şekilde sulandırılmıştır. - Membran şeritlerinin her biri ayrı tüplerdeki serum dilüsyonları içerisine konularak, çalkalayıcıda bir buçuk saat süreyle oda ısısında inkübe edilmiştir.

40 Membran tekrar PBS-T ile bir kez 10, iki kez 5 er dakika olacak şekilde çalkalayıcıda yıkanmıştır. Sekonder (işaretli) antikorların bağlanması: - Membran şeritleri, PBS-T içerisinde 1/10.000'lik oranında sulandırılan konjugat içerisinde, oda ısısında, 1 saat süreyle çalkalayıcıda bırakılmıştır. - Bir kez 10, üç kez de 5 er dakika olacak şekilde yıkama işlemi yapılmıştır. Substrat reaksiyonu: Hazır olarak alınmış DAB ( Diaminobenzidine/H 2 O 2 ) solüsyonu, membran üzerine dökülerek 10 dakika bekletildikten sonra kurutulup filmi çekilmiştir

41 3. BULGULAR KE olduğu bilinen toplam 50 hastadan; kontrol grubu oluşturmak için 20 sağlıklı insandan alınan ve çapraz reaksiyonları saptayabilmek için de başka paraziter hastalıkları olduğu belirlenmiş beş hastanın serum örneklerinde, Gradiyent jel elektroforez ve WB yöntemiyle spesifik antikorlar araştırılmıştır. Hastaların sayısı ve kanların ne zaman alındığı ve saptanan bantlar Tablo 4 de gösterilmiştir. Kist sıvısı, iki gece diyaliz edildikten sonra liyafilizatör cihazında toz haline getirilmiştir. Üzerine yaklaşık 5ml dh 2 O eklenmiş, Bradford yöntemi ile protein miktarı 0.8 µg/µl olarak bulunmuştur. Protein miktarı mikrotitre plağında, ½ oranında dört kez seri olarak sulandırıldıktan sonra jel tarağının her kuyucuğuna bu dilüsyonlar yüklenmiş ve elektrik akımı uygulanmıştır. Bantların en iyi görüldüğü protein miktarının 0.4 µg/µl olduğu tespit edilmiştir. Elektroforez işleminin ilk aşamasında 0.4 µg/µl protein içeren antijenden 10, 15, 20, 25 µl miktarlarda yüklenmiş, protein bantlarının en iyi görüldüğü miktarın 20 µl olduğu saptanmıştır. Serumlar 1/50 oranında dilüe edilmiştir. Stok antijen solüsyonundan 20 µl miktarlarda olacak şekilde, yüklenerek yapılan gradient jel elektroforez işlemi sonucunda elde edilen jel, coomassie blue ile boyandıktan sonra 8, 16, 29, 45, 66, 95, 116 kda luk farklı büyüklüklerde 7 protein bandı saptanmıştır (Şekil 5).

Tablo 4. KE li hastalardan tedavi veya ameliyat sonrası serumların alınma zamanları ve saptanan bantlar 42 Antijen Bantları (kda) Hastalar Kan alınma zamanı 6.5 8 14.2 20 29 45 50 66 116 120 205 215 1 1. Ay + + + + 2 1. Ay + + + + + + + + + 3 1. Ay + + + 4 1. Ay + + + + + + 5 1. Ay + + + + + + + + 6 1. Ay + + + + + + + + 7 1. Ay + + 8 1. Ay + + + + + + + 9 1. Ay + + + + + + + 10 1. Ay + + + + + + + + + 11 1. Ay + + + + + + + + 12 1. Ay + + + + + + + 13 1. Ay + + + + + + + 14 1. Ay + + + + + + 15 1. Ay + + + + + + 16 1. Ay + + + + + + + + + 17 1. Ay + + + + + + + + 18 3. Ay + + + + + + + + 19 3. Ay + + + 20 3. Ay + 21 3. Ay + + + + + 22 4. Ay + + + + + + + + 23 4. Ay + 24 6. Ay + + + + 25 6. Ay + + + + + + + + + 26 6. Ay 27 6. Ay + 28 1. Yıl + + + + + 29 1. Yıl + + + + + + + + 30 1. Yıl + + + + + + + + 31 1. Yıl + + + + + + + + 32 1. Yıl + + + + + + 33 1. Yıl + + + + + + 34 2. Yıl + + + + 35 2. Yıl + + + + + + + 36 2. Yıl + + + + + + + 37 2. Yıl + + + 38 3. Yıl + + 39 4. Yıl + + + + + + + 40 4. Yıl + + + 41 4. Yıl + + + + + 42 6. Yıl 43 6. Yıl + + + + 44 10. Yıl + + + + 45 11. Yıl + + 46 11. Yıl + + + + + 47 11. Yıl + + + + 48 14. Yıl 49 14. Yıl + + + 50 16. Yıl + +

43 116 95 66 45 29 16 8 Şekil 5. Jelin, coomassie blue ile boyandıktan sonraki görüntüsü KE li hastaların tedaviden veya ameliyattan hemen sonra alınan (1.ay-16.yıl) serumlar WB ile test edildiğinde 215, 205, 120, 116, 66, 50, 45, 29, 20, 14.2, 8 ve 6.5 kda molekül ağırlığına sahip 12 adet özgül bant saptanmıştır. Bant saptanmayan beş hastanın serumu tekrar yürütülmüş ve sadece bir örnekte bant görülmüştür. Parazit saptanmış beş hastanın (Hymenolepis nana, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides Taenia saginata Trichuris trichura,) serumları sırayla test edildiğinde 8, 29, 62, 66, 116 kda molekül ağırlıklarına sahip bantlar görülmüştür (Şekil 6). Hastaların serumlarında görülen antijen bantları Tablo 5 de gösterilmiş. Parazit görülen hastaların serumlarında, WB yöntemiyle görülen bantlar Şekil 6 da gösterilmiştir.

44 Tablo 5. Parazitli hastaların serumlarında saptanan bantlar (kda) H. nana E. vermicularis A. lumbricoides T. saginata T. trichura 8 + + + + + 29 + + + + 62 + + + + + 66 + + + + + 116 + 116 66 62 29 8 Şekil 6. Parazit saptanmış hastaların serumlarında WB yöntemiyle görülen bantlar Toplam 50 hastanın serumlarında görülen protein bantlarının aylara ve yıllara göre dağılımı Tablo 6 da görülmektedir.