1 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Sonuç Raporu Proje No: 2010/99 Projenin Başlığı p97/vcp (Valosin-containing protein) Lokalizasyonun Fertil ve İnfertil Bireylerin Spermlerinde İmmunositokimyasal Yöntemlerle Belirlenmesi Proje Yöneticisi Doç.Dr. Sevil ÇAYLI Birimi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji ABD Araştırmacılar ve Birimleri Doç.Dr. Fikret Erdemir Tıp Fakültesi Uroloji ABD (MAYIS / 2013)
ii ÖZET* p97/vcp (Valosin-containing protein) Lokalizasyonun Fertil ve İnfertil Bireylerin Spermlerinde İmmunositokimyasal Yöntemlerle Belirlenmesi Valosin-containing protein (p97/vcp), Ubiquitin proteasome system (UPS) substratlarının proteasomda parçalanmasını sağlayan şaperon bir proteindir. p97/vcp protein kompleklerinin birleşmesi, ayrılması ve onların gideceklere yönlere yerleştirilmesi için yardımcıdır. p97/vcp T hücre aktivasyonu boyunca tirozin fosforilasyonuna uğrar ve bu aktivasyon onun ATPaz aktivitesini değiştirmez. Tirozin fosforilasyonu p97/vcp nin hücre içindeki lokalizasyonunu da düzenler. p97/vcp nin ayrıca sperm kapasitasyonu boyunca tirozin fosforilasyonuna uğradığı da gösterilmiştir. p97/vcp nin birçok hücresel yolakta farklı fonksiyon gördüğü bilinse de, erkek üreme sistemindeki varlığı ve önemi gösterilmemiştir. Bu çalışmanın amacı fertil ve infertil bireylerin sperm hücrelerinde p97/vcp nin lokalizasyonlarının belirlenmesi ve bu ekspresyonun semen parametreleri ile karşılaştırılmasıdır. Fertil ve infertil bireylerin sperm örnekleri üzerinde immunositokimyasal teknikler uygulandı. Sonuçlarımız UPS proteinlerinden, p97/vcp nin sperm baş, boyun ve kuyruk bölgesinde lokalize olduğunu göstermiştir. Fakat bu lokalizasyonun en fazla baş bölgesinde yerleşim gösterdiği ve özellikle de infertil bireylerde p97/vcp nin fertil bireylere göre ekspresyonun daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu sonuçlar p97/vcp nin erkek infertilitesi değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir kriter olabileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, fertil ve infertil bireyler arasında p97/vcp nin ekspresyonu arasında anlamlı derecede farklılıkların bulunması ve semen parametreleri ile p97/vcp arasındaki negatif ilişkinin saptanması, p97/vcp nin erkek infertilitesinin değerlendirilmesinde kullanılabilecek bir faktör olabileceğini göstermektedir. Anahtar kelimeler: p97/vcp, Fertil, İnfertil, Sperm, İmmunositokimya *Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından desteklenmiştir
iii ABSTRACT The Determination of Localization of p97/valosin-containing Protein (VCP) by Immunocytochemistry In The Sperm of Fertile and Infertile Men Valosin-containing protein (p97/vcp), a member of the AAA family (ATPases Associated with various cellular Activities), has a role as a chaperone and aids in the assembly, disassembly, and functional operation of protein complexes. p97/vcp undergoes tyrosine phosphorylation during T cell activation, and although this phosphorylation did not alter its ATPase activity, tyrosine phosphorylation regulates the subcellular localization of this protein. p97/vcp has been shown undergo tyrosine phosphorylation during sperm capacitation. Although it is well known p97/vcp functions in several cellular pathways, it s presence and importancy have not been demonstrated in male reproductive system. The aim of the present study was to determine the cellular localization of p97/vcp and compare these expression with semen parameters in fertile and infertile men. Immunocytochemical methods were applied for sperm cells of fertile and infertile men. Our results showed that p97/vcp localized in the sperm head, midpiece and tail region. However, this localization was seen mostly in the head region of sperm, escpecially highly expressed in infertile men compared to fertile men. Additionally, p97/vcp was found to be negatively correlated with semen parameters such as sperm concentration, motility and morphology. These results showing the different p97/vcp expression in fertile and infertile men and negative correlation between p97/vcp expression and semen parameters suggest that p97/vcp may be used one of the important factors for the evaluation of male infertility. Key words: p97/vcp, Fertile, İnfertile, Sperm, İmmunocytochemistry
ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR) Proje yürütücüsü, bu çalışmanın gerçekleşmesine katkılarından dolayı, aşağıda adı geçen kişi ve kuruluşlara içtenlikle teşekkür eder. Projemizi başından sonuna kadar destekleyen GOP Universitesi BAP yöneticilerine ve tüm çalışanlarına, Uroloji ve Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD tüm öğretim üyeleri ve çalışanlarına, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı nın tüm çalışanlarına teşekkür ederim. iv
v İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZET ii ABSTRACT iii ÖNSÖZ (TEŞEKKÜR) iv İÇİNDEKİLER DİZİNİ v SİMGELER VE KISALTMALAR vii ŞEKİLLER DİZİNİ viii ÇİZELGELER DİZİNİ ix GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER 1 1.1.Erkek infertilitesi ve değerlendirilmesi 1 1.1.1.İnfertilite nedenleri 2 1.1.2.Erkekte İnfertilite Nedenleri 3 1.2.Erkek faktörünü ortaya koyan önemli testler: 4 1.3. Endokrinolojik inceleme 4 1.4. Semen Analizi (Spermiyogram) 5 1.4.1. Sperm Örneğinin Alınması 5 1.4.2. Semen Örneğinin Değerlendirilmesi 6 1.4.3. Semenin Makroskopik İncelenmesi 6 1.4.4. Semenin Mikroskopik İncelemesi 7 1.5. Protein Yıkımı 12 1.6. VCP Bağımlı Protein Yıkımı 12 1.7. Übikütin Protazom Sistemi (UPS) 14 1.8. p97/vcp in otofagozom oluşumundaki rolü 15 1.9. p97/vcp nin selektif otofajiyi yönetmesi 16 1.10. p97/vcp ve Patalojisi 17 1.11. p97/vcp ile İlişkide Olan Proteinler ve fonksiyonları 17 1.12. p97/vcp nin İnsan Sperm Kapasitasyonu İle İlişkisi 18 1.13. p97/vcp nin Testis ve Epididimis Dokusundaki Ekspresyonları 18 1.14. Çalışmanın amacı 19 MATERYAL VE METOD 13 2.1. Kimyasallar Ve Ait Oldukları Kaynaklar 13 2.2. Antikorlar, Ait oldukları Kaynaklar Ve Kullanım Oranları 13 2.3. Deney Aletleri Ve Markaları 14 2.4. Kromojenler 14 2.5. Örneklerin Temini ve Gruplandırılması 14 2.6. Deneysel Çalışma Planı 16 2.7. Sperm Yıkama 16 2.8. İmmunositokimya 16 2.9. İmmunofloresan 17 İSTATİKSEL ANALİZ 18
vi 3.1. Semiquantitative HSCORE analizi 18 BULGULAR 19 4.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/vcp ekspresyonun belirlenmesi 19 4.2. İnfertil ve fertil bireylerdeki p97/vcp pozitivite yüzdelerinin karşılaştırılması 19 4.3. p97/vcp ekspresyonunun semen parametreleri ile olan ilişkisi 20 4.4. p97/vcp ekspresyonunun sperm motilitesi ile olan ilişkisi 21 4.5. p97/vcp ekspresyonunun sperm morfolojisi ile olan ilişkisi 22 4.6. p97/vcp ekspresyonunun ve semen parametreleri 23 TARTIŞMA 24 KAYNAKLAR 27
vii SİMGELER VE KISALTMALAR aa : Aminoasit BSA : Sığır serum albumin cdna : Komplementer DNA COP : Sürekli fotomorfogenez DNA : Deoksiribonükleik asit DTT : Ditiotereitol DUB : Deübikütinaz EDTA : Etil diamin tetraasetik asit ERAD : Endoplasmik retikulum ilişkili yıkım FCS : Fetal sığır serumu HRP : Horse radish peroksidaz JAB1 : c-jun-aktivasyon domain-bağlayıcı protein 1 JNK : c-jun N-terminal kinaz kb : Kilo baz. kd : Kilo Dalton M : Molar NaCl : Sodyum klorit NCBI : Uluslarası Biyoteknoloji Bilgi Servisi NHS : Normal at serumu NP-40 : Nonidet P-40 PBS : Fosfat buferli tuz PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu PFA : Paraformaldehit ph : -log c[h + ] PVDF : Polivinlidenflorit RNA : Ribonükleik asit rpm : Revolutions per minute TE : Tris-EDTA TEMED : N-N -N -Tetrametilendiamin TNF-α : Tümor nekroz faktörü alfa Tris : Tris (hidroksimetil)-amino-methan UPS : Übikütin protazom sistem UV : Ultraviolet V : Volt VCP : Valosin-içeren protein µ : Mikro
viii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Sayfa Şekil 1.4.4.1: Makler sperm sayım kamerası 7 Şekil 1.4.4.2: Makler kamerasında semen örneğinin damlatılarak hazırlanması 8 Şekil 1.4.4.3: Makler kamerasında spermlerin görüntüsü 9 Şekil 1.4.4.4: Normal morfolojiye sahip, olgun sperm örneği 10 Şekil 1.4.4.5: Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm görüntüleri 11 Şekil 1.6.1: VCP nin yapısal domainleri 13 Şekil 1.7.1. Übikütin Sinyali 14 Şekil 1.11.1: p97/vcp nin çoklu fonksiyonları. 18 Şekil 4.1.1: İnfertil bireye ait semen yaymasında p97/vcp immunopozitif işaretli spermler. 19 Şekil 4.2.1. Fertil ve infertil bireylerde p97/vcp immunpozitivitesinin karşılaştırılması. 20 Şekil 4.3.1. p97/vcp immunoreaktivitesi ile sperm konsantrasyonu arasındaki negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon. 21 Şekil 4.4.1. p97/vcp immunoreaktivitesi ile sperm motilitesi arasındaki negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon. 22 Şekil 4.5.1.p97/VCP immunoreaktivitesi ile sperm morfolojisi arasındaki negatif ilişkiyi gösteren 20 hastadaki korelasyon. 23
ix ÇİZELGELER DİZİNİ Tablo Sayfa 1.3.1 Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan hormonlar ve etkileri 4 1.10.1 p97/vcp ile İlişkili Patolojiler 17 4.6.1: Fertil ve infertil hastalarda semen parametreleri 23
1 GİRİŞ VE KONU İLE İLGİLİ KAYNAK BİLGİLER 1.1.Erkek infertilitesi ve değerlendirilmesi Infertilite, kontraseptif bir yöntem uygulamadan, düzenli bir cinsel yaşama rağmen (ortalama haftada iki kez beraberlik düzenli cinsel yaşam olarak kabul edilir) bir yıl süreyle gebelik oluşmaması infertilite olarak tanımlanır. Yapılan araştırmalarda, toplumlarda infertilite oranının % 10-15 dolayında olduğu bildirilmiştir (Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004; Lens., 1996). Kliniklere infertilite problemi ile başvuran çiftlerin % 48 inde erkeğe bağlı faktörün olması erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasını bir ön koşul olarak beraberinde getirmektedir. Reprodüktif yaştaki erkeklerin % 6 sında infertilite problemi ortaya çıkmaktadır. Bu olguların yaklaşık % 90 ında da bozulmuş spermatogenez vardır (Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004; Irvine., 1996; Lens., 1996). Erkeklerde anatomik, endokrin, immünolojik bir bozukluk veya infeksiyon infertilite nedeni olabilir. İnfertilitede erkek faktörünün kesinlik kazanabilmesi için; öykü, genel fizik muayene, semen analizi ve hormonal tetkikler sırasıyla yapılmalı ve gereğinde testis biyopsisi; biyokimyasal ve fonksiyonel testlerle desteklenmelidir. Bu nedenle erkek faktörünü ortaya koyan en basit test spermiyogramdır. Dikkatli bir şekilde yapılan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesi ile aksesuvar bezlerin çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi olunmasını sağlayacaktır (Delilbaşı., 1997; Günalp.,2004; Lens., 1996). Semen analizi makroskopik, biyokimyasal ve mikroskopik araştırmaları kapsar ve özellikle şu noktalar üzerinde durulur. ejakülat hacmi ve semenin likefikasyonu semenin biyokimyasal özellikleri semendeki spermatozoa konsantrasyonu hareketli spermatozoa yüzdesi
2 spermatozoanın morfolojisi diğer hücrelerin tanımlanması (Lens., 1996). Spermin tanımlanıp semen analiz tekniklerinin kullanıma girmesi özellikle infertilite araştırmaları konusunda önemli bir çığır açmıştır. 1970 li yılların sonlarından itibaren ortaya çıkan yeni teknolojiler ve bunların klinik kullanımları hem infertiliteye yol açan nedenlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamış hem de milyonlarca çiftin çocuk sahibi olabilme şansını artırmıştır.1978 yılında in vitro fertilizasyon (IVF) yöntemi ile ilk tüp bebeğin doğumu gerçekleştirilmiş ve daha sonra bu yöntem erkek infertilitesi, açıklanamayan infertilite gibi bir çok endikasyon için başarıyla kullanılmıştır. 1992 de intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yöntemiyle elde edilen ilk gebelikler ile ICSI, günümüzde şiddetli erkek infertilite tedavisinde çok önemli bir yer edinmiştir. Daha öncede belirtildiği gibi, bir yıl içerisinde korunma yöntemi olmadan sürdürülen düzenli bir cinsel yaşama rağmen (ortalama haftada iki kez beraberlik düzenli cinsel yaşam olarak kabul edilir) gebelik oluşmamasına infertilite adı verilir. Hiç gebelik oluşmaması durumu primer infertilite; daha önce mevcut bir gebeliğin ardından gebelik elde edilmemesi ise sekonder infertilite olarak tanımlanır. Gebelik için hiçbir şansa sahip olmama sterilite olarak ifade edilir. Yapılan araştırmalarda, toplumlarda infertilite oranının % 10-15 dolayında olduğu bildirilmiştir (Duru., 1998; Delilbaşı., 1997). Erkek infertilitesi, infertil çiftlerin %10-30 unda tek neden, %15-30 unda ise kadındaki probleme ek olarak karşımıza çıkmakta, dolayısı ile vakaların yaklaşık %50 sinde görülmektedir (Duru., 1998). 1.1.1.İnfertilite nedenleri İnfertilite hem erkek hem de dişiyi etkileyen bir problemdir. Sperm % 30-40 Ovülatör % 15-20 Fallop tüpleri % 25-40 Serviks % 5 Nedeni bilinmeyen % 5-15 (Duru., 1998).
3 1.1.2.Erkekte İnfertilite Nedenleri Erkeklerde görülen infertilitede, aşağıdaki parametrelere bakılarak incelenmektedir (Setchell., 1994): Sperm ile ilgili problemler Düşük sperm sayısı Sperm üretiminde bozukluk (defektif sperm sayısında artış) Oligospermi (sperm sayısının düşük olması) Azospermi (sperm bulunmaması) Seminal kanallarda tıkanıklık Seminal sıvı bozuklukları Isı sperm potansiyelini azaltabilir: Kronik yüksek ateş, seks öncesi egzersiz, seks öncesi sıcak banyo Sperm kalitesi ya da sayısında düşmeyi genellikle etkileyen nedenler: Alkol, İlaçlar, Esrar, Nikotin, Bazı tıbbi uygulamalar, Pestisitler, Kurşun, Kronik alkolizm Belirli hormonal bozukluklar sperm kalitesini etkiler: Hipofiz bozuklukları, Feminizasyon Testiküler bozukluklar sperm üretimini etkiler Testiküler vein varikozu Testiküler hasar Testiküler tümör Varikosel Testikül anomali İnmemiş testis (çocuklukda başarılı şekilde müdahale edilmemişse) Testiküler burulma Kabakulak Radyasyona maruz kalma Testiküler kanalın bloke olması (sperm salınımını etkiler) Testiküler kanalda kızıl (scarring) Cinsel yolla bulaşan hastalıklar Gonera Klamidya Genital kanal anomalisi
4 Retrograd ejakülasyonu (mesaneye ters ejakülasyon-çeşitli nedenlerden dolayı oluşabilir) Prostat cerrahisi, Bazı tıbbi müdahaleler Ejakülasyonun oluşmaması (çeşitli nedenlere bağlı olabilir) İktidarsızlık (impotens) Erektil disfonksiyon Diabet Prostat cerrahisi Üretra cerrahisi Kan basıncı ile ilgili uygulamalar Bazı kromozom bozuklukları XXY erkekler Bazı tıbbi uygulamalar 1.2.Erkek faktörünü ortaya koyan önemli testler: 1. Spermiyogram 2. Postkoidal test 3. Antisperm antikor ölçümü(serum veya seminal plazmada) 4. Spermatozoanın fertilizasyon kapasite testleri 5. Serumda: Serbest ve total testosteron Luteinleştirici hormon Follikül uyarıcı hormon Prolaktin düzeyleri de önemlidir. 1.3. Endokrinolojik inceleme Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan erkek seks hormonları Tablo 1.3.1 de gösterilmiştir. Tablo 1.3.1 Sperm üretimi için ihtiyaç duyulan hormonlar ve etkileri (Setchell ve Maddocks., 1994). Hormon GnRH Etkisi FSH ve LH hormonlarının salgılanmasını sağlar. Beyinde hipotalamustan salgılanır.
5 FSH LH Prolaktin Testisteki sertoli hücrelerini uyararak sperm üretimini sağlar. Hipofiz bezinden salgılanır. Leydig hücrelerinde testosteron sentezlenmesini ve sperm üretiminin devamlılığını sağlar. Hipofiz bezinden salgılanır. LH ın Leydig hücreleri üzerindeki etkisini arttırır. Hipofiz bezinden salgılanır. Testosteron Sperm üretiminin devamlılığını sağlar. Testisteki Leydig hücrelerinden salgılanır Estradiol LH sentezini kontrol eder. Karaciğer, kas ve yağ dokusunda testosteronun metabolize edilmesi ile oluşur. %20-25 i Leydig hücrelerinden salgılanır. İnhibin Aktivin FSH salınımını engeller. Sertoli hücrelerinden salgılanır. FSH salınımını arttırır. Leydig hücrelerinden salgılanır. 1.4. Semen Analizi (Spermiyogram) İnfertil çiftlerde yarıya yakın bir oranda erkekte problem olduğu belirlenmiştir. Erkeklerde anatomik, endokrin, immünolojik bir bozukluk veya infeksiyon, infertilite nedeni olabilecektir. Bu nedenle erkek faktörünü ortaya koyan en basit test spermiyogramdır (Delilbaşı., 1997). 1.4.1. Sperm Örneğinin Alınması Hastalar ile yapılan ilk görüşmede örnek vermek için gelecekleri gün 3-5 günlük bir cinsel perhiz süresine uymaları tavsiye edilir. 2-7 gün arasındaki cinsel perhiz süresi yeterli görülürse de kısa süreli cinsel perhizde semendeki sperm sayısı az, uzun süreli cinsel perhizde de (erkek faktörü mevcut ise) sperm sayısı yeterli olsa bile motilitenin düşük olduğu gözlenmiştir. Yapılan araştırmalarda, uzun süreli cinsel perhizin spermlerin akrozin içeriğinde de azalmaya neden olduğu gösterilmiştir. Önerilen cinsel perhiz süresine uyulduğunda, dikkatli bir şekilde yapılan semen analizi testislerin spermatogenetik ve steroidogenetik aktivitesiyle aksesuvar bezlerin çalışması hakkında sağlıklı bilgi sahibi olunmasını sağlayacaktır (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
6 Hastalara steril şartlarda, steril kutular verilerek bu amaçla düzenlenmiş sperm verme odasını kullanmaları sağlanır. Hastalar, mastürbasyonla örnek vermeleri gerektiği konusunda bilgilendirilir, kullandıkları kutuların üzerine isimleri etiketle yapıştırılır. Örnek verme esnasında nelere dikkat etmeleri gerektiği önceden hazırlanmış bir bildiri ile kendilerine açıklanmalıdır. Örnek toplanması esnasında krem ya da kayganlaştırıcı bir madde kullanmaması, örnek toplanan kutuya su ya da başka bir madde kaçırmaması söylenir. Semen toplanan kutuyla ilgili olarak daha önceden yapılan kimyasal ve biyolojik testlerle toksik olmadığı ispatlanmış kutular satın alınmalıdır. Hastanın örneğini aldıktan sonra kendi eli ile laboratuvardaki ilgili biyologlara teslim etmeleri gerektiği izah edilmelidir (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996., Işık., 1999). 1.4.2. Semen Örneğinin Değerlendirilmesi Erkek fertilizasyon potansiyelinin araştırılmasında ilk basamak semen analizidir. Bu inceleme esnasında Dünya Sağlık Örgütü tarafından belirtilen kriterler (WHO, 1992) esas alınmaktadır. Semen analizi makroskopik ve mikroskopik incelemeden oluşur (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996., Setchell ve Maddocks., 1994). 1.4.3. Semenin Makroskopik İncelenmesi Makroskopik incelemede semen içeriği likefikasyon, görünüm, volüm ve ph özellikleri yönünden değerlendirilmektedir ( Enginsu ve arkd., 1995., Lens., 1996). 1. Likefikasyon (Semenin Çözünülürlüğü): Ejakülasyon sırasında akıcı olan semen koagüle olur. Prostattan salgılanan amilaz ve proteolitik enzimler 10-30 dakika içerisinde semenin likefiye olmasını (çözünürlük kazanmasını) sağlar. Laboratuvara ulaşan semen örneği 37 C de (etüvde) likefiye olana kadar bekletilir, sonra incelemeye alınır. Bu süreyi aşan örnekler viskoz olarak kabul edilir. 2. Görünüm: Normalde semen sarı-gri renkte, parlak ve homojendir. Prostat bezinden salgılanan spermin in oksidasyonundan kaynaklanan kendine özgü bir kokusu vardır. Semende eritrositlerin bulunması halinde renk kırmızı-kahverengidir. Uzun süreli cinsel perhizlerde ve pyospermide renk sarıya dönüşür. 3. Volüm: WHO kriterlerine göre semen hacmi 2 ml veya daha fazla olmalıdır. 1 ml den az olması durumu, hipospermik olarak isimlendirilip toplama sırasında örneğin
7 dökülmüş olabileceği, kısa cinsel perhiz süresi, retrograd ejakülasyonu veya ejakülatör kanalda darlık gibi nedenler düşünülebilir. Miktarı 6 ml den fazla olan semen içeriği hiperspermik olarak adlandırılır, bu durumda cinsel perhiz süresi uzun veya seminal sıvı fazladır. 4. ph: Normal ph değeri 7.2 8.0 arasındadır. Akut enfeksiyonlar da ph değeri 8 in üzerine çıkabilir. ph nın düşük olması sperm salınımının yetersizliği ve bu nedenle ejakülatın daha çok asidik prostat sıvısından oluştuğunu gösterebilir. 1.4.4. Semenin Mikroskopik İncelemesi Mikroskopik incelemede semen içeriği; sperm konsantrasyonu, hareketliliği (motilite), morfoloji ve yuvarlak hücre sayısı ve bu hücrelerin sınıflandırılması yönünden incelenmektedir (Işık., 1999; Setchell., 1994). 1. Konsantrasyon: Sperm sayımı için günümüzde en fazla kullanılan aletlerden biri Makler Sperm Sayım Kamerası dır (Şekil 1.4.4.1). 1978 yılında Prof. Dr. Amnon Makler tarafından sperm sayımı için özel olarak tasarlanmıştır. Semen örneğinin incelendiği kameranın 10 μm derinliğinde olması spermatozoanın tek bir düzlemde serbest hareketine olanak sağlamaktadır. Makler kamerası ile spermlerin hareketlilik yüzdeleri daha kesin olarak saptanabilmektedir. Şekil 1.4.4.1: Makler sperm sayım kamerası
8 Makler sperm sayım kamerasının yakın görünümü Güvenilir bir değerlendirme için ideal olan Makler sperm sayım aletindeki 100 karedeki spermleri saymaktır. Sayım şu şekilde gerçekleştirilir. Bir damla semen (5 μl) kameranın merkezine damlatılıp üzerine kapak camı kapatılır. Dört adet kuvartz bacak sayesinde spermler, 10 μm derinlikte yüzeceklerdir (Şekil 1.4.4.2). Bu derinlikte ancak bir adet sperm başı sığabilir. Bu sebeple bir hat üzerinde yapılacak sayım 20x büyütme altında 10 karede motil ve non-motil sperm sayılır ve 106 ile çarpılarak mililitredeki (x 106/ml) sperm sayısı belirlenir. Normal sperm konsantrasyonu >20x106/ml ve totalde 40x106 dur (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996). Şekil 1.4.4.2: Makler kamerasında semen örneğinin damlatılarak hazırlanması 2. Motilite: Motilite değerlendirilirken konsantrasyon sayımında olduğu gibi x20 büyütme altında ve 10 karede yapılır (Şekil 1.4.4.3). Motil spermlerin, toplam sperm sayısına oranı yüzde olarak motiliteyi verir (Delilbaşı., 1997; Lens., 1996).
9 Şekil 1.4.4.3: Makler kamerasında spermlerin görüntüsü Dünya Sağlık Örgütü hareketliliği 4 sınıfta değerlendirmektedir: a- hızlı doğrusal progresif hareket b- yavaş doğrusal ya da doğrusal olmayan hızlı hareket c- progresif olmayan hareket d- hareketsiz Normal sperm konsantrasyonunun >%50 si motil ve bu değerin %25 i progresif olmalıdır (Delilbaşı., 1997). 3. Morfoloji: Morfolojik değerlendirmede WHO veya Kruger in strict kriterleri kullanılmaktadır. WHO kriterlerine göre normal değer >%30 iken Kruger strict kriterlerine göre %14 olmalıdır. Morfolojik değerlendirmede sperm baş, boyun ve kuyruk anomalileri yönünden dikkatle incelenmelidir. Sperm morfolojisi değerlendirilirken önce lam üzerine yayma yapılarak seçilen boya ile boyama yapılır (WHO için Papanicolaou ve Kruger strict kriterleri için Diff-Quick veya Spermac). Değerlendirme immersiyon yağ altında yapılır tercihen 100 veya 200 sperm incelenerek % normal cinsinden sonuç verilir (Delilbaşı., 1997). Kruger Strict Kriterleri ne Göre Morfoloji Değerlendirmesinde Diff-Quick Boyama Tekniği: - 5 μl likefiye olmuş, taze semen örneği lam üzerine damlatılarak yayma yapılır. - Preparat 3-5 dakika dış ortamda kurutulur. - 5 dakika şale içerisinde bulunan fiksatif (tesbit) içerisinde bekletilir. - Boyama işlemi için Diff-Quick boya seti şu basamaklarla uygulanır
10 - I nolu boya içinde 1 dakika bekletilir ve su ile yıkanır (I nolu boya: Eozin G-pH 6.6 fosfat tamponu ile) - II nolu boya içinde 1 dakika bekletilir ve su ile yıkanır (II nolu boya: Eozin GpH 6.6 fosfat tamponu ile) - Preparat kurutulur - Üzerine immersion yağı damlatılarak (x100) faz kontrast mikroskopta incelenir. - Boyama sonrasında akrozom yeşil, nükleus kırmızı, boyun ve kuyruk yeşil boyanır (Enginsu., 1995). Normal Sperm Morfolojisi Morfolojik değerlendirme Kruger kriterlerine göre yapılmıştır. Normal sperm morfolojisi > %14 olmalıdır (Şekil 1.4.4.4). Kruger kriterlerine göre: Baş Boyun Orta kısım Kuyruk Düz oval Akrozom, başın % 40-70 ini oluşturur. Normal ölçüler; uzunluk 5-6 μm, genişlik 2.5-3.5 μm Borderline baş formları anormal olarak sınıflanır. Abaksiyel implantasyon olmamalı ve intakt olmalı Silindir şeklinde 1 μm genişlikte ve baş uzunluğunun 1.5 katı uzunlukta olmalı. Baş büyüklüğünün ½ den büyük sitoplazmik droplet olmamalı Orta kısımdan hafifçe ince, kıvrım içermeyen 45 μm uzunlukta olmalı (Enginsu., 1995). Şekil 1.4.4.4: Normal morfolojiye sahip, olgun sperm örneği
11 Şekil 1.4.4.5: Normal ve anormal morfolojiye sahip sperm görüntüleri Semen Ejakülat ya da semen (meni) hipotalamo-pitüiter aks dahilinde testislerin işlevi ve posttestiküler boşaltma kanallarıyla aksesuar bezlerin salgılarından oluşan bir son üründür. Normal insan ejakülatının ortalama hacmi yaklaşık olarak 3 ml olup 2-6 ml aralığında değişir ve iki komponenti vardır: 1. testisler tarafından üretilen spermatozoa, 2. seminal plazma; 1/3 ü prostat sekresyonundan, 2/3 ü seminal kese sekresyonundan oluşur (Isık., 1999; Setchell ve Maddocks.,1995). Normal semen hacminin % 10 unu spermatozoa, % 90 ını seminal plazma oluşturur. Seminal plazmanın en önemli görevi (ph = 7.2-7.8) spermatozoa transportu ve tampon görevi görerek vajinanın ph sının yükseltilmesidir. ph 6,2 nin altına düştüğünde spermatozoa yavaşca immobilize olacaktır. Hacmin az olması yeterince tampon kapasitesi oluşturamayacağı için spermatozoa immobilizasyonu gerçekleşecek, hacmin fazla olduğu durumda da spermatozoa konsantrasyonu düşecektir. Bu durum dezavantaj gibi görülmemelidir, çünkü spermatozoa ejakülatın ilk kısmında yer almaktadır. Seminal plazma, ejakülatın sıvı bölümüdür; erkekte çeşitli salgı bezlerinin (epididimis, vas deferens, ampülla, seminal vezikül, prostat bezi) sekresyonundan oluşan bir karışımdır. Aynı kişinin farklı ejakülatlarında, seminal plazma kompozisyonu mevsimsel farklılık gösterebilmektedir. Ayrıca ejakülasyondan sonra seminal plazmadaki enzim ve spermlerin metabolik aktivitesine bağlı olarak da seminal plazmanın kompozisyonu değişmektedir.
12 İnsan ejakülatının ilk fraksiyonu sperm ve prostatik bir sekresyon olan sitrik asit yönünden zengindir. Fruktoz konsantrasyonu, seminal veziküllerin majör sekretuar ürünüdür ve ejakülatın sonraki sekresyonlarında yükselmektedir (Lens., 1996). Diğer vücut sıvılarından farklı olarak seminal plazma yüksek konsantrasyonlarda potasyum, çinko, sitrik asit, fruktoz, fosforilkolin, spermin, serbest amino asitler, prostaglandinler ile önemli düzeyde asit fosfataz, betaglukronidaz, laktik dehidrogenaz, alfa amilaz ve prostat spesifik antijenler içermektedir. 1.5. Protein Yıkımı Protein yıkımı, hücre içerisindeki proteinlerin steady-state diye adlandırılan normal düzeylerinde fonksiyon görmelerini sağlamak amacıyla işleyen düzenli bir mekânizmadır. Ökaryotlarda protein yıkımı, hem sitoplâzmada hem de çekirdek Übikütin Protazom Sistemi (UPS) ve onun düzenleyici proteinleri sayesinde gerçekleşmektedir. Bu düzenleyici proteinler arasında hem COP9 signalozom (CSN) hem de p97/valosin containing protein (VCP) belirli substratların yıkımını kontrol etmektedirler (Ye ve arkd., 2001; Wei ve Deng, 2003). 1.6. VCP Bağımlı Protein Yıkımı 97-kDa luk Valosin-içeren protein (p97 ve ya VCP), übikütin-protazom sistemine bağlı proteolizde önemli fonksiyonlara sahiptir. Bu proteoliz, VCP nin, übikütin ve kofaktörleri ile ilişkisine bağlıdır. VCP, UPS de şaperon protein olarak görev yapmaktadır. Toplam hücresel proteinin 1% den fazlasının VCP olduğu bilinmektedir. VCP, tip II AAA (ATPases Associated with a variety of Activities: Birçok aktivitesi bulunan ATPazlar) ATPaz ailesine ait bir proteindir ve AAA domaini olarak adlandırılan iki ATPaz domainine sahiptir (Neuwald ve arkd., 1999; Zwickl ve Baumeister, 1999; Vale, 2000; Maurizi ve Li, 2001; Ogura ve Wilkinson, 2001). VCP çeşitli türlerde farklı isimlerle anılmaktadır. Örneğin: arkebakteride VAT, mayada CDC48, Drosophilada TER94, memeli ve bitkilerde ise p97 ve ya VCP olarak bilinmektedir (Frohlich ve arkd., 1991; Pamnani ve arkd., 1997). VCP, N-terminal domain (N), iki tane ATPaz domaini (D1 ve D2) ve de C-terminal domaini (C) olmak üzere dört domainden oluşmuştur. N terminal domaini, poliübikütin
13 zincirlerine bağlanma ve substrat tanınmasından sorumlu iken, D1 ve D2 domainleri, VCP nin şaperon aktivitesinden sorumludur (Figure 1.11.1) (Wang ve arkd., 2003). Şekil 1.6.1. VCP nin yapısal domainleri. A: Walker A, B: Walker B ve SRH: VCP nin D1 ve D2 domainlerindeki ikinci bölge homoloji motifleri. (Wang ve arkd., 2004). Elektron mikroskobu çalışmaları, VCP nin silindirik şekilli homo hekzemerik yapıda olduğunu kanıtlamıştır (Wang ve arkd., 2003). VCP, hücre içerisinde birçok aktivitede görev yapmaktadır: hücresiklusu gelişimi (Cao ve Zheng, 2004), mitoz sonrası membrane kaynaşması ve iğ ipliklerinin ayrılması (Kondo ve arkd., 1997; Cao ve arkd., 2003; Wojcik ve arkd., 2004), yanlış katlanmış proteinlerin ER dan geri atılımı (Ye ve arkd., 2001; Braun ve arkd., 2002; Jarosch ve arkd., 2002), proteazomda poliübikütinlenmiş proteinlerin degrade edilmesi (Ghislain ve arkd., 1996; Dai ve Li, 2001) ve transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu (Hitchcock ve arkd., 2001; Rape ve arkd., 2001). VCP, kofaktörlerinin de yardımıyla, übikütinlenmiş proteinlere özgün olarak bağlanır ve bu proteinlere 26S protazomda degrede olmadan önce, şaperonluk yaparak onlara yol gösterir. Substrat übikütinlenmesinden sonra, VCP protein komplekslerini birbirinden ayırmak için ATP yi kullanır ve proteinlerin protazoma yönlenmesini sağlar. Örneğin: Herhangi bir şekilde stimüle edilmeyen hücrelerde, NF-κB sitoplâzmada inaktif formda inhibitör IκB proteini ile etkileşim halindedir (Karin ve Ben-Neriah, 2000; Santoro ve arkd., 2003). Sitimulasyona cevap olarak, NF-κB aktive olur ve IκBα hızlıca fosforile olup, poliübikütinlenir (Karin ve Ben-Neriah, 2000). Bunu takiben, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα ya bağlanır ve onu NF-κB kompleksinden ayırır (Dai ve arkd., 1998). IκBα nın NF-κB dan ayrılmasından sonra, NF-κB hedef genin regülâsyonu nedeniyle nükleusa transfer edilir. Bu arada, VCP, poliübikütinlenmiş IκBα ya şaperonluk yaparak, onun 26S proteazomda yıkımı için yol gösterir (Dai ve arkd., 1998).
14 1.7. Übikütin Protazom Sistemi (UPS) UPS, ökaryotlarda hücreiçi düzenleyici proteinlerin seviyelerini kontrol etmede önemli bir fonksiyona sahiptir. UPS in übikütinleme ve übikütinlenmiş proteinlerin yıkımı olmak üzere iki temel fazı vardır. İlk übikütinleme fazında, übikütin (Ub) ATP yardımıyla übikütin aktive edici enzimin (E1) sistein kuyruğuna eklenir ve sonra übikütin bağlayıcı edici enzimin (E2) sistein kuyruğuna transfer edilir. Son olarak ise, übikütin, protein ligaz (E3) sayesinde substratın lizin kuyruğuna transfer edilir. Ub, substrata izopeptid bağı ile bağlanır. Ub aktivasyonu ve ligasyonu, Ub nin son aminoasidinin (G76) karboksil grubunda gerçekleşir (Şekil 1.2.1) (Pickart, 2001b, a). Tek bir übikütin molekülünün substrata eklenmesi (monoübikütinleme) ise, lizozomal sınıflandırma, gen ekspresyonu ve endositoz gibi substratın farklı görevlerde iş yapmasına neden olmaktadır (Schnell ve Hicke, 2003) Şekil 1.7.1. Übikütin Sinyali A: Übikütin, übikütin aktive edici enzim (E1) ile aktive edilip ve sonra übikütin bağlayıcı enzime (E2) transfer edilir. Substrat (mavi kutu) ve E2 enzimi özgün olarak übikütin protein ligaza bağlanabilirler ve de aktive olmuş übikütin substrata transfer olur. B: E3, substrata ve E2 ye farklı alanlarda bağlanır. Substrat, übikütinlenme sinyalı ile tanınır. C: Proteolizin gerçekleştiği 26S protazom, 19S kapak kısmı ve esas proteolitik aktiviteye sahip 20S kısmından