T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı Aspirin duyarlığı tanısında in vitro bazofil aktivasyonunun akım sitome

T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı Aspirin duyarlığı tanısında in vitro bazofil aktivasyonunun akım sitometriyle CD63 ve CD203c ölçümü ile değerlendirilmesi Proje Yürütücüsü Prof. Dr. Sevim Bavbek Proje Numarası 2006 08 09 227 Başlama Tarihi: Nisan 2006 Bitiş Tarihi: Eylül 2007 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - 2007

RAPOR FORMATI 1-PROJENİN TÜRKÇE VE İNGİLİZCE ADI VE ÖZETLERİ Aspirin duyarlığı tanısında in vitro bazofil aktivasyonunun akım sitometriyle CD63 ve CD203c ölçümü ile değerlendirilmesi ÖZET Aspirin (ASA) ve diğer nonsteroidal antiinflamatuvar ilaçlar (NSAİİ) anti-inflamatuvar ve ateş düşürücü özellikleri nedeniyle sık kullanılan ilaçlardandırlar. Bu sık kullanımlarına uygun olarak solunum yolları, cilt ve bazen de hayati tehdit edebilecek şiddette sistemik aşırı duyarlılık reaksiyonlarına yol açarlar. Aspirin ile ilişkili duyarlılık reaksiyonların görülme sıklığı genel popülasyonda % 0,5 2,5 iken, astım, nazal polip ve kronik sinüzit birlikteliğinde %30 40 gibi yüksek oranlara çıkabilmektedir. Klinik bulgular ve hastanın öyküsü aspirin duyarlığı kuşkusu uyandırmakla birlikte aspirin ile ortaya çıkan reaksiyonların tanısında en güvenilir yol hastanın aspirin ile provokasyonudur Oral aspirin provokasyon testleri aspirin duyarlığını göstermede altın standart kabul edilen in-vivo testlerdir. Aspirin duyarlığı tanısında kullanılacak güvenilir in-vitro testler ile ilgili yeterli veri yoktur. Flow sitometri çok sayıda hücrenin, hücre büyüklüğü ve hücre yüzey belirleyicileri gibi özelliklerinin saptanmasını sağlayabilen bir in vitro yöntemdir. Bu gün bazofil aktivasyonunu değerlendirmek için en çok kullanılan 2 yüzey antijeni CD63ve CD203c dir. Son yıllarda bazofil yüzey belirleyicilerinden CD203c nin bazofil aktivasyonunu değerlendirmede CD63 e göre daha duyarlı olduğu üzerinde durulmakta ve hatta akım sitometri ile yapılan çalışmalarda her iki yüzey molekülünü birlikte değerlendirmesi önerilmektedir. Bu iki molekül; inhalan allerjenler, besin allerjisi, latex allerjisi, venom allerjisi gibi bir grup allerjik reaksiyonun tanısına ek olarak bazı ilaç allerjilerinin tanısında da kullanılmıştır. Çok az sayıdaki çalışma; aspirin duyarlığı patogenezinde rolü olan hücrelerden bazofillerin aktivasyonunu değerlendirmenin CD63 molekülünün tanısal önemini değerlendirmiştir. Az sayıdaki bu çalışma sonuçları çelişkilidir. Ancak aspirin duyarlı astımlılarda in vitro bazofil aktivasyonu için CD203 molekülü ise henüz kullanılmamıştır. Bu çalışmada; aspirin duyarlığı öyküsü olan astımlı hastalarda in-vitro tanısal test olan

bazofil aktivasyonunu, CD63ve CD203c molekülü üzerinden flow sitometri ile değerlendirip sonuçları oral aspirin provokasyonu ile karşılaştırarak bu in-vitro testlerin aspirin duyarlığı tanısındaki yeri ve önemini ortaya koymak amaçlandı. Bu amaçla çalışmaya astım ve nazal polipli ve ASA duyarlığı olan hastalar (Grup 1: 18), astım ve nazal polipli ancak ASA duyarlığı olmayan hastalar (Grup 2: 12) ve ASA duyarlığı olmayan sağlıklı kontroller (Grup:3 12) alındı. Hastalarda ASA duyarlığı tanısı 2 günlük plasebo kontrollü oral provokasyon testi aspirin ile konuldu. Ardından hastaların kan örneklerinde flow sitometri ile bazofil aktivasyonu CD63 (Flow-CAST (Bühlmann Laboratories, AG, Basel, Switzerland) ve CD203c (Beckman Coulter, Mijdrecht, The Nedherlands) moleküllerinin ölçümü ile değerlendirildi. Nonspesifik uyarıları dışlamak için aktif bazofil oranının>%5 olması ve SI (SI: Allerjen uyarısı/negatif kontrol) nin> 2 olması esas alındı. Flow sitometri sonuçları ile ASA provokasyonunda pozitif ve negatif sonuç veren hasta sonuçları karşılaştırılarak testin duyarlık ve özgüllüğü saptandı. ASA uyarısı ile CD63 ölçümünün sensitivitesi %33,3, spesifitesi % 50 idi. İlk kez ASA duyarlığında değerlendirilen CD203c ölçümünün sensitivitesi % 16,7, spesifitesi % 100 idi. Diclofenac ile CD63 ve CD203c ölçümünün sensitivite ve spesifitesi ASA ya göre daha düşüktü. Hem CD63 ölçümü hem de CD203c birlikte değerlendirildiğinde sensitivitesi %33,3, spesifitesi % 50 bulundu. Bu nedenle CD63 ölçümüne CD203c eklenmesinin ek bir tanı değeri yoktu. Sonuç olarak ASA duyarlığı tanısında flow sitometrik olarak CD63 ve CD203c ölçümü anda yeterli duyarlığa sahip görünmemektedir. Daha standardize yöntemlerle, yeni aktivasyon markerleri ile ve çok sayıda olgu üzerinde yapılacak çalışmalar yol gösterici olacaktır. Anahtar kelimeler: Aspirin allerjisi, aspirin provokasyonu, bazofil, CD63, CD203c, flow sitometri

In- vitro diagnosis of aspirin hypersensitivity via CD63 and CD203c determination by flowcytometry SUMMARY Acetyl saliciylic acid (ASA) and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are among the most frequently used drugs because of their anti-pyretic and anti-inflammatory actions. A number of adverse reactions including upper and lower airway reactions, skin manifestations and even systemic reactions have been reported due to their popular use. In the general population the prevalence of ASA hypersensitivity ranges from 0.5% to 2.5% but higher prevalence ratio reaching 30-40% has been reported in a group of patients with asthma, nasal polypsosis and chronic rhinosinusitis. Despite extensive data on the mechanism of the disease, the diagnosis of ASA intolerance is currently based on history and oral or inhalation provocation tests with ASA. Provocation tests, especially oral provocation tests, are considered to be the golden standard in the diagnosis of ASA intolerance. However, they are time consuming and potentially harmful procedures and should be performed under the rigorous surveillance. Therefore, safe and easy in-vitro diagnostic tests would be extremely useful both for patients with ASA intolerance and for the allergist who are dealing with these patients. However, currently there is no established in-vitro method for the diagnosis of ASA intolerance. Flow cytometry is a useful tool for the analysis of different cellular types and can be used to identify specific cell populations. Flow cytometric analysis of in vitro activated peripheral blood basophils rests upon quantification of phenotypic alterations i.e changes in expression of basophilic activation marker after challenge with specific allergen. At present, the most commonly applied antigens in flow cytometric studies for basophilic activation are CD63 and CD203c. In peripheral blood, CD203c is exclusively expressed on the surface of basophils. Flow cytometric analysis of in-vitro activated patient basophils using CD63 and CD203c has been proved reliable for the diagnosis of different IgE-mediated allergies including inhalant allergens, food allergies, natural rubber latex allergy, venom allergy and drug allergies. Only a few studies have investigated flow cytometric analysis of in vitro activated basophils via CD63 in the diagnosis of hypersensitivity from ASA, metamizol and other NSAIDs. At present, the role of measurement of CD63 in the diagnosis of ASA hypersensitivity is a contradictory issue. Moreover there is no study evaluating the value of CD203c expression in response to in vitro stimulation ASA for ASA sensitivity

Therefore, in this study we aimed to evaluate measurement of CD63 and CD203c in the diagnosis of ASA sensitivity and to compare CD203C up-regülation or CD63 induction by basophils in patients with ASA/NSAID hypersensitivity Patients with asthma and/or nasal polyps with ASA sensitivity (Group 1:18), without ASA sensitivity (Group 2:12) and healthy volunteers without ASA sensitivity (Group 3: 12) were included in the study. A two-day, single-blind, and placebo controlled oral ASA provocation was performed in all patients. In-vitro activation of isolated peripheral blood basophils at baseline and after lys-aspirin (2.5mg/ml) and diclofenac stimulation was measured by Flow CAST TM (Bühlmann Laboratories- Schönenbuch, Switzerland) for CD63 and Allergenicity kit (Beckman Coulter, Mijdrecht, The Nedherlands) for CD203c. In order to rule out unspesific stimulation, only activation percentage equal or greater than 5% and stimulation index (percentage of activated basophils with ASA/percentage of activated basophils in basal conditions) was equal or greater than 2-5 were considered positive. The results of CD63 and CD203c were compared within groups and the sensitivity and specificity of the assay was measured against the results of the oral provocation testing. The sensitivity and specificity of CD63 measurement were %33.3, and % 50 respectively for in- vitro ASA stimulation. The CD203c protocol showed a lower sensitivity (%16,7) but perfect specificity (% 100) than the CD63 protocol. The addition of CD203c measurement to CD63 measurement did not improve the sensitivity and specificity of CD63. The sensitivity and specificity of CD63and CD203cmeasurement were less with in vitro diclofenac stimulation than ASA stimulation without showing any additional improvement to the sensitivity and specificity obtained with only ASA. In conclusion, at present flow cytometric analysis of in-vitro basophile activation using CD63 and CD203c does not seem to be optimally sensitive for the diagnosis of ASA sensitivity. However, standardized techniques with higher number of patients and with new activation markers will improve the clinical value of this method. Key words: Aspirin sensitivity, asthma, nasal polyp, basophile activation, CD63, CD203c, Flow-CAST, flow cytometry

1-AMAÇ VE KAPSAM Aspirin (Asetil salisilik asit: ASA) ve diğer nonsteroidal antiinflamatuvar ilaçlar (NSAİİ); ağrı kesici, ateş düşürücü ve antiinflamatuvar özellikleri nedeniyle çok yaygın kullanılan ilaçlardır. Bu yaygın kullanımına paralel olarak %21 25 lere kadar çıkabilen istenmeyen etki ile birliktedirler. Aspirin ve diğer NSAİİ ile ilgili istenmeyen reaksiyonlar; aspirin intoleransı, aspirin idiosenkrazisi, psödoallerjik reaksiyon veya aspirin duyarlığı gibi isimler altında tanımlanmaktadır. Bu raporda aspirin duyarlığı olarak yazılacaktır. Aspirin duyarlığı sonucu görülen reaksiyonlar 4 tiptedir (1). 1- Ciddi rinosinüzit ve nazal poliple birlikte olan astım (Aspirin duyarlı astım) 2- Ürtiker-angioödem (Ürtiker akut olarak aspirin alınımı sonrası görülebileceği gibi kronik ürtikeri olanlarda aspirin alımını takiben de ortaya çıkabilir) 3- Anafilaktik reaksiyon (Deri, gastrointestinal sistem, üst ve alt hava yolu ve kardiyovasküler sistemin tek veya birlikte etkilenmesi ile ortaya çıkan klinik bulgular topluluğu) 4- Hipersensitivite pnömonisi ve menenjiti Çalışma ASA/NSAİİ duyarlı astımlı hastalar üzerinde yapıldığı için bu konu daha ayrıntılı anlatılacaktır. Aspirin duyarlı astım: ADA Bronş astımı çeşitli fenotipik özellikler gösterir. Bunlardan biride ADA dır. Özel bir klinik tablo olan ADA, ASA ve diğer NSAIİ alımı ile tetiklenen astım ve rinit atakları ile karakterlidir ve ASA kullanımı ile ortaya çıkan reaksiyonlar arasında en iyi tanımlanmış ve mekanizması hakkında en fazla bilgi bulunan reaksiyon tipidir (2, 3). Pek çok hastada ilk yakınma 30 lu yaşlarda rinit ile başlar. Kadın hastalarda daha sıktır. Çoğunlukla viral bir enfeksiyon sonrası uzamış burun tıkanıklığı, burun akıntısı ve koku alamama ortaya çıkar. Fizik muayenede sıklıkla nazal polip gözlenir. Olguların %80 - %100 ünde sinüzit bulunduğu ve yılda ortalama 5 kez sinüzit atağı geçirdikleri rapor edilmiştir (2, 3). Nazal polip, ASA duyarlığı olmayan hastalara göre daha yaygındır ve ciddi seyirlidir. Nazal polipler yaklaşık olarak %70 olguda vardır ve sık nüks ederler. Bu hastaların nazal biyopsilerinde inflamatuar hücrelerde apoptozisin azalmış olması poliplerin daha ağır seyretmesinden sorumlu tutulmuştur. Rinit

yerleştikten 2 15 yıl sonra astım ve ASA duyarlığı klinik tabloya katılır. ASA veya bir diğer NSAIİ alımı ile üç saat içinde astım atağı ve buna eşlik eden yoğun burun akıntısı, konjuktivalarda kızarıklık, sulanma ve bazen yüzde-boyunda kızarma görülür. Reaksiyonlar genelde doz bağımlıdır ve yüksek dozlarda ilk 1 saate görülebilen ciddi reaksiyonlar izlenir. Sadece ASA değil, COX 1 enzimini inhibe etme oranına ve ilacın dozuna bağlı olarak diğer NSAİİ'lar da benzer reaksiyonlara neden olurlar Astım atakları bazen hayatı tehdit edecek, hastanın mekanik ventilasyona girmesini gerektirecek kadar ciddi olabilir (2, 4). Hastalığın hem rinosinüzit-polip, hem de astım komponentti, ASA veya NSAIİ dan uzak kalınsa bile genellikle ciddi seyreder ve hastalığı kontrol altına almak için sıklıkla sistemik steroidlere başvurulur (5). Aspirin duyarlığı yerleştikten sonra yaşam boyunca devam eder. Nadir olarak bir kaç olguda kaybolduğu bildirilmiştir. Ayrıca ADA lı olguların %25 inde ASA/NSAİİ sonrası ürtikeryal lezyonların çıktığı veya miyokardial iskemi, abdominal ağrı gibi atipik bulgular gelişebildiği de bildirilmiştir (6). Epidemiyoloji Aspirin duyarlığı genelde olduğundan daha düşük oranda bildirilmektedir. Analjeziklere karşı gelişen duyarlılığın toplumda %0.3-%0.9 oranında gözlendiği bildirilmiştir (7). Astımlı olgularda ise ASA ve diğer NSAİİ ile oluşan intolerans reaksiyonlarının sıklığı seçilen yönteme göre değişiklik göstermektedir. Hastanın öyküsüne göre ASA duyarlığı insidansı erişkin astımlılarda %3 5 dir, astıma kronik sinüzit ya da nazal polip eşlik ediyorsa ASA duyarlık oranı %40 lara ulaşabilmektedir (3, 8). Sistematik olarak ADA prevalansının değerlendirildiği bir çalışmada; öyküye göre %2 4 olan ADA prevalansının oral ASA provokasyonu ile erişkin grupta % 14 29 (%95 CI:%14 29); çocuklarda ise %0-14 (%95 CI:%0,14) yükseldiği bildirilmiştir (9). Bu değerlendirme sonucunda ADA ın daha önce düşünüldüğünden daha yaygın olduğu ve gerekli olduğu durumlarda oral provokasyon testleri ile ASA duyarlığının gösterilmesi önerilmiştir. Patogenez Aspirin ve NSAİİ duyarlığı ile ilişkili görülen bu klinik bulgulardan sorumlu bir grup mekanizma tanımlanmıştır. Bunlar IgE aracılı veya hücresel immünitenin katıldığı immün mekanizmalar olabileceği gibi non immün mekanizmalar da olabilir. ASA/NSAİİ ile ortaya çıkan üst-alt solunum yolu, dermatolojik ve sistemik reaksiyonların önemli bir bölümünden sorumlu temel mekanizma siklooksijenaz enzim (COX) inhibisyonu gibi görünmektedir. Klinik çalışmalar COX 1 enziminin ASA ve NSAİİ tarafından inhibe edilmesinin astım ataklarını tetiklediğini, COX 2 yi inhibe eden ilaçlarla ise astım atağının görülmediğini göstermiştir. COX 1 ve COX 2 enzimleri mast hücresinden PGD 2 ve diğer hücrelerden PGE 2 yapımına katılırlar. COX 1 enziminin inhibisyonu,

sentezlenmesinde önemli rol oynadığı PGE 2 de azalmaya neden olmaktadır. PGE 2 nin normalde mast hücre ve bazofil degranülasyonu ve 5-lipooksijenaz (5-LO) enzimini inhibe ederek sülpidopeptidolökotrien (slt) sentezini frenleme gibi antiinflamatuvar etkisi vardır. Aspirin ve diğer NSAİİ, COX 1 enzimini inhibe ederek PGE 2 nin azalmasına ve bunun kontrol ettiği 5-LO aracılı inhibisyonun ortadan kalkması ile de kontrolsüz sülpidopeptido-lökotrien sentezine ve de mast hücre, bazofil ve eozinofillerden inflamatuvar mediatörler salınmasına neden olmaktadır. Yoğun olarak salınan mediatörler ve özellikle lökotrienler, alt ve üst solunum yolunda ve derideki reseptörleri aracılığı ile aspirininin tetiklediği rinit, astım ve ürtiker kliniğine yol açmaktadır (1, 10, 11). Aspirin duyarlığında tanı a- İn- vivo testler Aspirin duyarlığı tanısında; öykü ve fizik muayene bulguları tanının ilk basamağını oluşturur. Öyküdeki bazı özellikler aspirin duyarlı astım, rinit ve ürtiker şüphesine neden olur. Bunlar arasında; aspirin alımını izleyen tipik solunum sistemi yakınmaları, burun tıkanıklığı ve akıntısının eşlik ettiği ciddi astım, sık nazal polip öyküsü, yoğun bakım gerektiren ciddi astım atakları sayılabilir. Klinik bulgular ve hastanın öyküsü ASA duyarlığı kuşkusu uyandırmakla birlikte aspirin ile ortaya çıkan reaksiyonların tanısında en güvenilir yol aspirin ile provokasyon testleridir. Aspirin duyarlı astım görülme sıklığı erişkinde hastanın öyküsü temel alındığında % 3 5 iken, aspirin ile provokasyon yapıldığında %8-20 lere çıkmaktadır (9). Öyküye göre oranın düşük olmasında; hastaların reaksiyon yaratabileceği korkusuyla aspirin almamaları, aspirinle ilgili hafif veya gecikmiş reaksiyonların fark edilememesi rol oynuyor olabilir. Avrupa da astımlı hastaların %15 inin, rinosinüzitli hastaların %34 ünün aspirin provokasyonundan önce aspirin duyarlılıkları olduğunu fark etmedikleri gözlenmiştir. Öte yandan aspirin duyarlığı olduğuna inanan hastaların %35 inde provokasyon testi negatif çıkmıştır. Bu yüksek oranlar klinik pratikte aspirin provokasyon testinin daha yoğun kullanılması gerektiğini göstermektedir. Böylece aspirin provokasyonu ile aspirin duyarlığı öyküsü olmayan ancak gerçekte aspirine reaksiyon gösterebilecek hastalar ya da yanlış olarak aspirin duyarlı kabul edilmiş hastalar ortaya çıkarılmış olmaktadır. Ayrıca aspirinin zararsız kabul edilen bazı antiasid, ve ağrı kesiciler içine konması, kafein, kodein, fenasetin, fenobarbital ve ergotaminle birlikte bazı ilaçlar içinde yer alması ve de diğer NSAİİ ile çapraz reaksiyonlar göstermesi ve aspirin duyarlığıolanların bu ilaçların göz damlası veya losyon gibi lokal uygulamalarına bile reaksiyon göstermesi aspirin duyarlı hastaların tanılarının açık ve net bir şekilde ortaya konulmasını zorunlu hale getirmiştir. Aspirin provokasyon testleri de bu açıdan altın standart kabul edilen in vivo testlerdir (12).

Oral provokasyonlar altın standart olarak kabul edilmekle birlikte akut astım ataklarını veya daha sistemik reaksiyonları tetikleyebilir. Bu nedenle ASA ile oral veya bronş provokasyonları; deneyimli kişilerce yoğun bakım olanaklarının ve entübasyon-ventilasyon için eğitilmiş kişilerin bulunduğu allerji merkezlerinde yapılması gerektiği unutulmamalıdır. Hastalar test sırasında deneyimli doktor kontrolünde tutulmalı ve gerektiğinde kullanılmak üzere beta 2 agonistler, steroidler, vazopressörler, IV sıvı ve oksijen hazır bulundurulmalıdır (10). b-in-vitro testler Aspirin duyarlığı tanısında bu kadar güvenilir sonuç veren in-vivo testlere karşın in-vitro testlerle ilgili veriler çok az sayıdadır. Son 20 yıldır ASA duyarlığı tanısında in-vitro tanı testlerinin yeri olmadığı ve tanının sadece provokasyonlar yoluyla konabileceği değişmez bir kural gibi görünüyordu. Gerçekten de histamin salınımı gibi klasik hücresel allerji testleri ASA diğer NSAIİ duyarlığı tanısında negatif sonuçlar vermiştir (13). Ancak 1990 lü yılların başından beri yapılmakta olan in-vitro hücresel allerjen uyarımı ve bunun sonucu ortaya çıkan lökotrien salınımının ölçümü (CAST) ve flow sitometrik olarak bazofil aktivasyonunun değerlendirilmesi (Flow-cytometric basophil stimulation tests: FAST gibi in vitro testlerde ortaya çıkan gelişmeler bu kuralın değişmezliğini tartışılır hale getirmiştir (14). Flow sitometrik bazofil uyarım testi: Bazofiller; allerjik rinit, allerjik astım gibi IgE aracılı immün mekanizmaların temel efektör hücrelerinden biridir. Ayrıca non-ige aracılı immün olaylara veya direkt olarak hücrenin uyarıldığı non-immün olaylara da katılırlar. Bazofillerin alerjenle karşılaşması, hücrenin aktive olmasına ve sonuçta yüzeyinde bazı molekülerin sayısında artışa veya yeni moleküllerin belirmesine neden olur. 1990 lı yılların başında bazofil aktivasyon markeri olarak CD63 ün keşfedilmesi alerjen spesifik bazofil aktivasyonunda flow sitometrik yöntemlerin gelişmesine neden olmuştur. Bazofil yüzey belirleyicilerinin flow sitometri ile analizi yeni bir yöntemdir. Flow sitometri çok sayıda hücrenin, hücre büyüklüğü ve hücre yüzey belirleyicileri gibi özelliklerinin saptayabilmektedir. İlaç allerjisi tanısında flow sitometri kullanımında temel mekanizma bazofil yüzey belirleyicilerinde, hücrenin antijenle karşılaşma sonrasında aktifleşmesi ile ortaya çıkan değişikliklerin değerlendirilmesi ve bu şekilde aktif bazofillerin tespit edilmesine dayanmaktadır (Şekil 1). Burada hastanın lökositleri, şüpheli ilacın farklı miktarları ile karşılaştırılmakta ve daha sonra aranan moleküle uygun monoklonal antikorlar kullanılarak aktif bazofiller tespit edilmektedir. Bazofiller, yüzeylerindeki IgE nin antijenle bağlanması ve bunu izleyen hücre aktivasyonu sonucu sadece histamin ve diğer biyoaktif mediatörleri sentezleyip salgılamaz aynı zamanda daha önce

belirtilen CD63 molekülüne ek olarak; CD45, CD69, ve CD203c gibi bir grup yüzey belirleyicisini de artmış oranda yüzeylerinde taşırlar ki bu artmış yüzey belirleyicileri spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak multicolour flow sitometri ile tespit edilebilir (15). Şekil-1 İstirahat halinde ve aktif bazofillerde CD63 ve CD203c yüzey molekülleri CD63, 53-Kda ağırlığında bir moleküldür. Transmembran 4 süper ailesinin bir üyesidir ve bazofile ek olarak mast hücresi, monositler, makrofajlar ve plateletlerin sitoplazmik granüllerinde bulunur. Uyarılmamış bazofillerde bazofilin intrastoplazmik granüllerine tutunmuş olan CD63 molekülü hem normal hem de allerjik kişilerde hücre yüzeyinde az miktarda bulunur. Ancak bazofilin aktivasyonu sonucu granüllerin hücre membranına bağlanarak içeriğini dışarı verdiği durumlarda bazofilden histamin salınımına paralel olarak hücre yüzeyine doğru hareket ederler ve bu şekilde yüzeyde bulunan CD63 sayısının artımına neden olurlar (15). Günümüzde bazofil aktivasyonunu gösteren çalışmalarda yüzey belirleyicisi olarak sıklıkla CD63 molekülü kullanılmaktadır. Bu yöntem ticari olarak Flow-CAST (Bühlmann Laboratories, AG, Basel, Switzerland), Orpegen (Orpegen Pharma GmBH, Heidelberg, Germany) ve BASOTEST (Beckton-Dickinson,) mevcuttur (16). CD203c; fosfodiesteraz multigen ailesine ait bir Tip2 transmembran metalloenzimdir. Periferik kanda özel ve yapısal olarak bazofil yüzeyinde bulunur. Allerjen, Anti-IgE ve anti-fcεr1 uyarısı ile hücre yüzeyindeki sayısı hızla ve CD63

den önce artar. CD63 ve CD203 ün hücre yüzeyinde artışını veya azalmasını sağlayacak uyarılara CD63 e göre farklı cevap verdiği ve bunun alternatif sinyal iletim mekanizması ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Uyarımı takiben CD203 ün hücre yüzeyinde artımı CD63 e göre daha azdır. CD203 ün periferik kanda sadece eozinofiller üzerinde olması nedeniyle bazofil aktivasyonu ile seyreden olaylarda bu durumu değerlendirmede yeni bir in-vitro yöntem olarak kullanılma olanağı ortaya çıkmıştır (15, 16). Yöntem ticari olarak Beckman Coulter da (Beckman Coulter, Mijdrecht, The Nedherlands) mevcuttur. Hem CD63 hem de CD203c kullanılarak in-vitro bazofil aktivasyonu inhalan allerjenler, gıda allerjisi, lateks allerjisi ve bazı ilaç allerjilerinin tanısında kullanılmıştır (15, 16, 18). Aspirin ve diğer NSAİİ duyarlılığın tanısında CD63 molekülünün yeri çok az çalışmada değerlendirilmiş, CD203c molekülü ise bu grup ilaçlara duyarlıkta henüz çalışılmamıştır. Periferik kanda sadece bazofiller üzerinde bulunan bu molekülün in-vitro tanısal test olarak kullanımı ve bunun CD63 ile karşılaştırılması flow sitometrik tanının gücünü artıracaktır. Tüm bu bilgilerin ışığında bu çalışmada ASA duyarlığı öyküsü olan hastalarda in vitro tanısal test olan bazofil aktivasyonunu, CD63ve CD203c molekülü üzerinden flow sitometri ile değerlendirip sonuçları oral aspirin provokasyonu ile karşılaştırarak bu in vitro bazofil aktivasyon testinin ASA duyarlığı tanısındaki yerinin ve öneminin ortaya konması amaçlandı. Çalışmaya ASA ile oral provokasyon yapılarak ASA duyarlığı tanısı konulmuş astımlı ve/veya nazal polipli hastalar alındı. Oral ASA provokasyonu negatif astımlı ve/veya nazal polipli hastalar ile sağlıklı kişiler kontrol grubu olarak kullanıldı. Tüm hasta ve kontrollerin kan örneklerinde flow sitometri ile ASA ve diklofenak ile uyarılmış bazofillerin aktivasyonu CD63 ve CD203c molekülleri üzerinden değerlendirildi. Flowsitometri sonuçları ile aspirin provokasyonunda pozitif ve negatif sonuç veren hasta sonuçları karşılaştırılarak testin duyarlık ve özgüllüğünün saptanması planlandı. Bu in vitro testin özgüllüğü ve duyarlığının iyi olması durumunda; oral provokasyonun getirdiği tecrübeli kişiler tarafından yapılmadıkça sistemik reaksiyon görülme riski ve bu nedenle yoğun bakım olanaklarının ve entübasyon-ventilasyon için eğitilmiş kişilerin bulunduğu allerji merkezlerinin gerekliliği gibi güçlüklerden kaçınarak ASA duyarlığı tanısında kullanılabilecektir.

3. MATERYAL VE YÖNTEM 1-Hasta seçimi: Çalışmaya ASA ve/veya NSAIİ alımı ile nefes darlığı, öksürük, hırıltı, burun tıkanıklığı, burun akıntısı, gözlerde sulanma ve kızarma, deride kızarıklık ve kabarıklık veya bunlara ek olarak tansiyon düşüklüğü öyküsü olan veya olmayan NP ve/veya astımlı, allerjik rinitli hastalar dâhil edildi. Aspirin veya diğer NSAIİ duyarlığı olmayan sağlıklı gönüllüler kontrol grubu olarak alındı. Çalışma protokolu Şekil-2 de gösterildi. Çalışma için Ankara Üniversitesi Etik Kurul komitesinden onay alındı (17.04.2006 tarih ve 10382 sayı). Çalışma kriterlerine uyan olgular araştırma hakkında bilgilendirildikten sonra imzalı onamları alındı ve araştırmaya dâhil edildi. *ASA duyarlığı değerlendirilmek için hastaların detaylı öykülerinin alınması ve fizik muayenelerinin yapılması Oral ASA provokasyonu Kan örneği alımı Bazofil ayrımı ASA ve diclofenac ile in vitro bazofil uyarımı Flow sitometri ile bazofiller üzerinde CD63 CD203 ekspresyonu ölçülmesi Şekil 2: Çalışma protokolü

2-Aspirin duyarlığının değerlendirilmesi Aspirin ve/veya NSAIİ alımı sonrası hayatı tehdit edici boyutta reaksiyon tarifleyen hastalar dışında tüm astım, allerjik rinit ve/veya NP li hastalara ASA ile tek-kör plasebo kontrollü oral provokasyon testi uygulandı. a- ASA oral provokasyon testi Aspirin provokasyonu; aspirinin uygulama biçimine göre oral, bronşial, nazal ve intravenöz (IV) olmak üzere 4 tipte uygulanmaktadır. Nazal ve bronş provokasyonları Avrupa ve Uzak Doğu da kullanılmakta, ABD de ise oral provokasyonlar yapılmaktadır. Provokasyon testi öncesi yapılması gerekli hastanın kullandığı ilaçlarla ilişkili hazırlıklar tabloda özetlendi (Tablo 1). Tablo 1. Aspirin provokasyon testi öncesi hazırlıklar FEV1: %60 Kısa etkili beta2 agonistler: 8 12 saat önce kesilmeli Uzun etkili beta2 agonistler: 24 saat önce kesilmeli Teofilin ve oral beta2 agonistler: 24 48 saat önce kesilmeli Prednizolon: >10 mg/gün olmamalı Antihistaminikler: 1 hafta önce kesilmeli Antikolinerjikler: 12 24 saat önce kesilmeli Na kromoglikat, Nedokromil Na: 12 24 saat önce kesilmeli Antilökotrienler: 24 saat önce kesilmeli

Aspirin duyarlığının değerlendiriminde hastalara Szczeklik ve ark. tarafından tanımlanan oral provokasyon protokolü kullanıldı (19). Testin ilk gün plasebo, ikinci günü ASA ile provokasyon yapıldı. Plasebo ile test yapılmasının nedeni, bronş çapında belli sınırlar içinde değişiklik olmayan yani stabil hastaları ASA provokasyonu için seçmekti. Bu amaçla test sırasında 1,5 2 saat ara ile plasebo tablet verildi ve bunun alımı süresince FEV 1 de ortaya çıkan değişikliklerin % 15 i aşmamasına dikkat edildi. İkinci gün ASA toplam 500 mg olacak şekilde 1,5 2 saat ara ile 10, 17, 44, 117 ve 312 mg gibi geometrik artışlar içinde verildi. Oral ASA provokasyon protokolü Tablo 2 de özetlendi. Bu dozda ASA içeren tabletler ve bunların aynı görünümdeki plasebo tabletleri Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesinden Doç Dr Tuncer Değim tarafından hazırlandı. Test boyunca her 30 dakikada bir FEV 1 değeri kaydedildi. Ayrıca nefes darlığı, hırıltı, göğüste tıkanma hissi gibi alt solunum, burun akıntısı, tıkanıklığı gibi üst solunum ve de gözde sulanma, göz çevresinde şişlik, ciltte kızarıklık, ürtiker plakları gibi genel yakınmalar açısında hastalar gözlendi. FEV 1 'de %20'den fazla düşme olması ve/veya buna eşlik eden ekstrabronşial yakınmaların çok yoğun olması durumunda test pozitif kabul edildi. En sık görülen ekstrabronşial yakınmalar; burun akıntısı, tıkanıklığı, gözde sulanma, göz çevresinde şişlik, yüzde ve gövdenin üst tarafında kızarıklık, bulantı ve karın ağrısı olarak bildirilmiştir. Bu yakınmalar 0 5 arasında skorlandı (0: yakınma yok, 1: hafif, 2: orta şiddette, 3:şiddetli, 4: çok şiddetli) En fazla skor 24 tü, ve ekstrabronşial yakınmalar 12 ve üzerinde olduğunda ekstabronşial yakınmaların yoğun kabul edildi. Oral ASA provokasyonu sırasında başlangıç FEV 1 de en az % 20 düşme izlenen hastalarda %20 lik düşme yapan ASA dozu (PD20 ASA) hesaplandı. Bu PD20 ASA değeri logaritmik doz-cevap eğrisinden otomatik olarak hesaplandı. Oral provokasyon testinde ortaya çıkan klinik bulguların sınıflaması Tablo-3 de özetlendi. Tablo. 2. Aspirin duyarlığı tanısında oral ASA provokasyon test protokolü 1. Gün 2. Gün (ASA, mg) Zaman Ardışık dozlar Toplam dozlar 8: 30 Plasebo 10 mg 10 mg 11: 00 Plasebo 17 mg 27 mg 13.30 44 mg 71 mg 16: 00 117 mg 188 mg 18: 30 312 mg 500 mg

Tablo 3. Aspirin duyarlığında oral ASA provokasyon testini izleyen reaksiyon tipleri Reaksiyon Tipi Yanıt yok Klasik yanıt Astmatik yanıt Rinit yanıtı Kutanöz yanıt Sistemik yanıt Bulgular Semptom yok, FEV 1 de <%15 değişim FEV 1 de>%20 azalma ile birlikte nazo-okuler yakınmalar FEV 1 de >%20 azalma Nazo-okuler yakınmalar Eritem±kaşıntı, ürtiker anjioödem Kutanöz ve/veya solunumsal yakınmaları olsun olmasın yoğun ekstrapulmoner semptomlar (skor 12) b- Flow-cast metodu ile in-vitro bazofil aktivasyonu Kit Adı: FLOW-CAST Marka: Bühlmann Laboratories, Ag FK-BAT Kit ile beraber verilen ve liyofilize ya da konsantre halde olan malzemeler kitin prospektüsünde öngörüldüğü biçimde hazırlandı. FLOW-CAST Çalışmasında kullanılan İlaç (Aspirin ve Diclofenac) Konsantrasyonlarının Hazırlanışı Aspirin A (2,5 mg/m): Liyofilize haldeki Aspirin üzerine 250 ul Stimülasyon Buffer eklenip karıştırıldı. Aspirin B (0.5 mg/ml): Aspirin A karışımından 40 ul alınıp 160 ul Stimülasyon Buffer içine karıştırıldı. Diclofenac A (0.025 mg/ml ): Liyofilize haldeki Diclofenac üzerine 250 ul Stimülasyon Buffer eklenip karıştırıldı. Diclofenac B (0.005 mg/ml ): Diclofenac A karışımından 40 ul alınıp 160 ul Stimülasyon Buffer içine karıştırıldı.

Mononükleer hücrelerin elde edilmesi ve hazırlanışı EDTA lı tüpe alınan 6 cc periferik kan örneği Histopak üzerine yayılarak 500 xg de santrifüj edildi. Santrifüj sonunda histopak ile plazmanın birleştiği sınırda toplanan buffy coat pipet yardımıyla alınıp ayrı bir tüpe aktarıldı. Buffy coat içeren tüp santrifüj edildi. Santrifüj sonunda süpernatan pipetle alınarak uzaklaştırıldı. Tüpün dibinde kalan ve lökositleri içeren pellet üzerine başta kullanılmış olan her ml periferik kan için 100 µl Stimülasyon Buffer eklenip resüspanse edildi. Çalışma için hastadan alınan periferik kan örneği 6 cc olduğundan pelleti resüspanse etmek için 600 µl Stimülasyon Buffer kullanıldı. Metod Her hasta ya da sağlıklı kontrol için 6 adet flow tüpü hazırlandı ve her bir tüpe 50 µl lökosit süspansiyonu dağıtıldı. PB (Patient Background) tüpü içine 50 µl Stimülasyon Buffer; PC (Patient Control) tüpü içine 50 µl Stimülasyon Control; Aspirin A tüpüne 2.5 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Aspirinden 50 µl; Aspirin B tüpüne 0.5 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Aspirinden 50 µl; Diclofenac A tüpüne 0.025 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Diclofenactan 50 µl; Diclofenac B tüpüne ise 0.005 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Diclofenactan 50 µl eklendi. Nazikçe karıştırılan tüpler, kapakları kapatılarak 37 C su banyosunda 40 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda tüm tüplere 50 µl soğuk Blocking Buffer ve 20 µl soğuk Staining Reagent eklenip nazikçe karıştırıldı. Tüm tüpler buzdolabında 30 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda tüm tüplere oda sıcaklığına gelmiş Lysing Reagent dan 3,5 ml eklenip, oda sıcaklığında 5 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda reaksiyonu durdurmak için tüm tüplere 1 ml Blocking Buffer eklendi. Tüm tüpler 1000 1200 xg de 5 dakika santrifüj edildi Santrifüj sonunda süpernatanlar uzaklaştırıldı. Dipte kalan pellet üzerine 500 µl Blocking Buffer eklenip karıştırıldı. Hazırlanan tüpler 2 saat içinde analiz edildi (Cytomics FC500 Flow Cytometer- Beckman Coulter). Bazofillerde CD63 ekspresyonu % 5 ten büyük ve Stimülasyon İndexi (SI) 2 ya da 2 den büyük olduğunda sonuç pozitif kabul edildi (14).

c-allergenicity kit metodu ile invitro bazofil aktivasyonu Kit Adı: Allergenicity Kit, Cellular Analysis of Allergy Marka: Beckman Coulter A17116 Kit ile beraber verilen ve liyofilize ya da konsantre halde olan malzemeler kitin prospektüsünde öngörüldüğü biçimde hazırlandı. ALLERGENİCİTY KİT Çalışmasında kullanılan İlaç (Aspirin ve Diclofenac) Konsantrasyonlarının Hazırlanışı Aspirin A ( 2.5 mg/m ): Liyofilize haldeki Aspirin üzerine 250 ul PBS eklenip karıştırıldı. Aspirin B ( 0.5 mg/ml ): Aspirin A karışımından 40 ul alınıp 160 ul PBS içine karıştırıldı. Diclofenac A ( 0.025 mg/ml ): Liyofilize haldeki Diclofenac üzerine 250 ul PBS eklenip karıştırıldı. Diclofenac B ( 0.005 mg/ml ) : Diclofenac A karışımından 40 ul alınıp 160 ul PBS içine karıştırıldı. Metod EDTA lı tüpe 4 cc periferik kan alındı. Her hasta ya da sağlıklı kontrol için 6 adet flow tüpü hazırlandı ve her tüpe 100 µl periferik kan dağıtıldı. Negatif kontrol tüpüne 20 µl PBS; pozitif kontrol tüpüne Pozitif Kontrol; Aspirin A tüpüne 2.5 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Aspirinden 20 µl; Aspirin B tüpüne 0.5 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Aspirinden 20 µl; Diclofenac A tüpüne 0.025 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Diclofenactan 20 µl; Diclofenac B tüpüne ise 0.005 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan Diclofenactan 20 µl eklendi. Ardından tüm tüplere 20 µl CRTH2/CD203c/CD3 monoklonal antikoru ve 100 ul Aktivasyon solüsyonu eklendi. Nazikçe karıştırılan tüpler 37 C su banyosunda 15 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda tüm tüplere 100 ul Stop solüsyonu ve Fix and Lyse karışımından 2 ml eklenip nazikçe karıştırıldı. Tüm tüpler oda ısısı-karanlıkta 10 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda tüpler 200 xg de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatanlar uzaklaştırıldı. Dipte kalan pellet üzerine 2 ml PBS eklenip tüm tüpler tekrar 200 xg de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatanlar uzaklaştırıldı. Tüm tüplere 500 ul PBS eklenip karıştırıldı. Hazırlanan tüpler 2 saat içinde analiz edildi (Cytomics FC500 Flow Cytometer-Beckman Coulter). Bazofillerde CD 203c ekspresyonu % 5 ten büyük ve Stimülasyon İndexi (SI: İlaç uyarı ile ortaya çıkan bazofil aktivasyonu/negatif kontrolle elde edilen bazofil aktivasyonu) 2 ya da 2 den büyük olduğunda sonuç pozitif kabul edildi.

Çalışma sonuçları 3 grup halinde değerlendirildi: Grup 1: Oral ASA provokasyon testi pozitif hastalar Grup 2: Oral ASA provokasyon testi negatif hastalar Grup 3: Allerjik rinit, NP ve/veya astımı, enfeksiyon hastalığı, kardiyolojik, hepatik ve endokrinolojik bir hastalığı olmayan olgular sağlıklı gönüllüler. Bu gruptaki bireyler migren, dismenore gibi nedenlerle sık ASA/NSAIİ grubu ağrı kesici kullanıyor ve herhangi bir duyarlılık reaksiyonu tanımlamıyorlardı. İstatistikî değerlendirme Veri girişi ve istatistik incelemeler SPSS 15.0 for Windows, (Chicago, Illinois) paket programında yapıldı. Hastaların ASA duyarlı olan ve olmayanların ve de sağlıklı kontrollerin karşılaştırmasında Kruskall-Wallis varyans analizi kullanıldı. Numerik değerler; ortalama± standart sapma ve ortanca olarak ifade edildi. p<0,05 anlamlılık sınırı olarak kabul edildi. Tanı testlerinin ASA provokasyonu pozitif ve negatif olgular arasında performansını belirlemek için alıcı işlem eğrileri (receiver operated curve: ROC) çizilerek eğri altında kalan ve standart hatalar hesaplandı. İstatistiksel olarak anlamlı olanların tanı koymada yeterli performansa sahip olacağı düşünüldü.

4.BULGULAR Çalışmaya ASA/NSAİİ duyarlığı araştırılmak üzere başvuran olgulardan yazılı ve sözel bilgilendirmeyi takiben araştırmaya katılmayı kabul eden ASA ve/veya NSAİİ ile reaksiyon öyküsü olan ve/veya astım ve/veya NP li 30 olgu alındı. ASA oral provokasyonu pozitif 18 (Grup 1), negatif 12 olgu (Grup 2) ile 12 sağlıklı gönüllünün(grup 3) klinik ve laboratuvar değerlendirilmesi yapıldı. Grupların demografik özellikleri Tablo-4 de gösterildi. Tablo 4. Çalışma grubunun demografik özellikleri Grup 1 Grup 2 Grup 3 p n=18 n=12 n=12 Yaş, ort.±sem 36,3±3,2 41,8±1,5 32,3±2,2 0.03* Cinsiyet Kadın 14 (78) 7 (58) 8 (67) AD Erkek 4 (22) 5 (42) 4 (33) Deri testi (aeroallerjen) Negatif 12 (67) 5 (42) 12 (100) 0.009# Pozitif 6 (33) 7 (58) - Tanı Nazal polip 1 (6) 4 (33) - Nazal polip-astım 16 (88) 6 (50) - AD İlaç reaksiyonu 1 (6) 2 (17) - *, #Grup 1 ve grup 2 benzer, farklı grup 3 (Kruskal Wallis ve Mann Whitney- U test) AD: Anlamlı değil

Hasta ve sağlıklı kontrol gruplarının her bir ilaç konsantrasyonu ile ortaya çıkan bazofil aktivasyonu CD63 ve CD203c aktivasyonu ile değerlendirildi. Tablo 5 ve 8 de grup 1, Tablo 6 ve 9 da grup 2 ve Tablo 7 ve 10 da da grup 3 için FLOW-CAST (CD63) ve Allergenicity (CD203c) ölçümleri negatif kontrol, pozitif kontrolü de içine alacak şekilde gösterilmiştir. Tablo 5. Oral aspirin provokasyonu pozitif olan hastalarda FLOW-CAST (CD63) sonuçları Yaş Tanı Deri Sorumlu ASA PD20 Bazal Neg. Poz. Asp. Asp. Diklo. Diklo. Cins testi İlaç OPT mg/ml 2.5 mg/ml 0.5 mg/ml 0.025 0.005 mg/ml mg/ml 19,K NP,A Neg. ASA Sis. 113 1031 (0.8) 2 85.4 14 10.3 5.9 2.8 16,K NP,A Akar, polen ASA, Klasik 117 715 (0.4) 2.1 34.8 24.1 12.4 6.6 4.6 M 33,K NP,A Neg. ASA, M Sis. - 1226 (0.4) 2.4 68.9 22.4 9.4 7.5 1.9 NSAİİ 42.K İlaç rxn. Akar NSAİİ Klasik 202 885 (0.5) 2.1 78.7 21.4 9.4 3.3 0.7 40,K NP,A Neg. ASA, M Hayatı tehdit 794 (0.6) 1.3 84.3 15.2 5.1 2.8 1.1 edici öykü 16,K NP,A Polen NSAİİ, M Klasik 180 965 (0.6) 0.8 56.8 11.7 9.2 3.9 1.4 53,K NP,A Neg. NSAİİ Klasik 312 757 (0.5) 2.5 60.4 3 2.7 2.6 1.7 24,E NP Neg. ASA Sis. 1440 (0.7) 3.5 63.3 3.6 3.1 2.4 2.1 62,K NP,A Neg. ASA,M, Klasik 27 986 (1.5) 1.1 30.2 4.1 1.3 3.3 1.3 NSAİİ 32,E NP,A Akar - Klasik 102 521 (1.3) 1 26.3 4.1 2.2 1.3 0.6 55,K NP,A Akar ASA,M Hayatı tehdit 552 (0.7) 1.6 68.4 3 1.7 1.4 0.6 NSAİİ edici öykü 27,K NP,A Polen ASA, Rinit - 1941 (0.8) 0.4 37.5 2.8 1.1 1.7 1.4 NSAİİ 52,K NP,A Neg. M Klasik 188 1188 (0.7) 1.1 35.9 4.5 1.9 2.4 0.7 32,K NP,A Neg. ASA,M, Klasik 188 942 (0.7) 0.7 31.1 3.1 1.7 0.8 0.7 NSAİİ 40,K NP,A Neg. ASA,M, Klasik 71 1076 (0.7) 1.1 39.5 3.4 3.1 1.5 0.8 NSAİİ 31,E NP,A Neg. ASA,M Klasik 500 599 (0.4) 1.5 30 3.9 3.6 2.7 2.3 38,K NP,A Neg. ASA Klasik 312 588 (2) 1 61.5 3 1.5 1.7 1.1 42,E NP,A Neg. NSAİİ Klasik 140 709 (0.6) 1.8 26.1 1 0.9 1.1 0.9

Tablo 6. Oral aspirin provokasyonu negatif olan hastalarda FLOW-CAST (CD63) sonuçları Yaş Tanı Deri Sorumlu ASA Bazal Neg. Poz. ASA ASA Diklo. Diklo. Cins testi İlaç OPT 2.5 mg/ml 0.5 mg/ml 0.025 0.005 mg/ml mg/ml 52,K NP,A Neg. - Neg. 1640 (0.5) 1.9 55.4 6.9 5.3 2.9 0.8 47,K A Polen ASA Neg. 806 (1.1) 1.1 63.8 6.2 3.9 0.7 0.5 46,E İlaç reak. Akar ASA, Neg. 539 (1.3) 2 38.9 3 2.6 2.2 0.6 NSAİİ 36,K NP Akar NSAİİ Neg. 600 (1) 1.9 60.4 7 5.2 5 3.6 39,K A Polen ASA Neg. 596 (1.4) 3 46.8 24.9 18.1 10.8 10.3 45,K İlaç reak. Polen NSAİİ,P Neg. 685 (0.8) 3.5 52.6 19.2 14.9 15.3 7.2 43,E NP Neg. - Neg. 595 (0.5) 0.5 68.6 1.1 1 1.2 0.9 45,E NP Neg. - Neg. 581 (1) 0.9 50.1 2.7 0.6 1.4 0.5 41,E NP Akar - Neg. 590 (0.4) 0.7 8.6 2.1 1.7 1.9 0.3 42,K NP,A Akar - Neg. 705 (0.8) 0.1 53.1 2.8 2 1.7 1.1 36,K İlaç reak. Akar NSAİİ, M Neg. 606 (0.7) 2 15.9 2.6 1.5 1.3 0.8 35,E NP,A Neg. - Neg. 765 (0.8) 1.3 64.5 12.9 9.7 5.4 3.8

Tablo 7. Sağlıklı kontrollerde FLOW-CAST (CD63) sonuçları Yaş Tanı Deri Bazal Neg. Poz. ASA ASA Diklo. Diklo. Cins testi 2.5 mg/ml 0.5 mg/ml 0.025 0.005 mg/ml mg/ml 30,K Kontrol Neg. 648 (0.3) 2.2 25 3.8 3.1 3.4 1.8 30,K Kontrol Neg. 530 (0.2) 0.9 36 2.8 1.6 1 0.7 18,K Kontrol Neg. 1050 (0.7) 2.4 60.9 2.5 2.1 1.7 1.2 27,E Kontrol Neg. 632 (0.4) 0.4 63.9 3.3 1.6 1.1 0.7 27,E Kontrol Neg. 849 (0.7) 0.1 29.1 2.3 1.4 2.8 1 36,E Kontrol Neg. 606 (0.3) 1.9 68.8 4.3 3.3 4.1 3.1 27,K Kontrol Neg. 526 (0.3) 9.5 7.4 3.6 1.1 2 0.8 43,K Kontrol Neg. 1612 (0.8) 4.2 1.7 3.5 1.4 1.8 1.6 47,K Kontrol Neg. 2960 (0.8) 1 64 3.2 2.9 0.9 0.7 32,K Kontrol Neg. 1390 (1.5) 2.8 25.7 0.9 0.7 0.9 0.3 36,K Kontrol Neg. 727 (0.6) 3.2 57.2 3.3 2.8 0.9 0.6 35,E Kontrol Neg. 504 (0.3) 0.4 19.1 4.8 2 2.1 1.8

Tablo 8. Oral aspirin provokasyonu pozitif olan hastalarda ALLERGENICITY (CD203c) sonuçları Yaş Tanı Deri Sorumlu ASA PD20 Bazal Neg. Poz. ASA ASA Diklo. Diklo. Cins testi İlaç OPT mg/ml 2.5 mg/ml 0.5 mg/ml 0.025 0.005 mg/ml mg/ml 19,K NP,A Neg. ASA Sis. 113 802 (3,8) 1,8 80,8 10,9 4,6 5,5 3,2 16,K NP,A Akar, polen ASA, Klasik 117 516 (3,1) 2,1 34,4 23,2 18,9 15,6 13 M 33,K NP,A Neg. ASA, M Sis. - 716 (3) 2,7 79,8 20,3 17,6 15,6 9,6 NSAİİ 42.K İlaç rxn. Akar NSAİİ Klasik 202 762 (4,1) 2,1 62,2 2,4 2,3 2 1,8 40,K NP,A Neg. ASA, M Hayatı tehdit 924 (4,7) 2,1 83,7 2,3 1,7 1,2 0,8 edici öykü 16,K NP,A Polen NSAİİ, M Klasik 180 1169 (4,5) 2,1 74,1 4,2 3,2 3 2,2 53,K NP,A Neg. NSAİİ Klasik 312 564 (7,3) 2 44 3,6 3,2 4,5 3,8 24,E NP Neg. ASA Sis. 2671 (4,4) 2,4 49,7 3,1 2,4 2,3 2,1 62,K NP,A Neg. ASA,M, Klasik 27 775 (0,6) 2,2 54 3,7 3,6 5,5 2,5 NSAİİ 32,E NP,A Akar - Klasik 102 659 (2,3) 2,6 19 4,3 3 1,8 1,3 55,K NP,A Akar ASA,M Hayatı tehdit 538 (7,6) 1,9 93,3 2,6 1,2 2,5 2,2 NSAİİ edici öykü 27,K NP,A Polen ASA, Rinit - 722 (5,6) 2,1 9,6 2,5 1,7 1,9 1,3 NSAİİ 52,K NP,A Neg. M Klasik 188 1990 (4,2) 2 63,7 3,2 2 1,4 1 32,K NP,A Neg. ASA,M, Klasik 188 1076 (3,7) 2,2 31,6 1,2 0,6 1,4 1 NSAİİ 40,K NP,A Neg. ASA,M, Klasik 71 882 (11,9) 2,5 47,9 2,2 1,8 1,1 0,8 NSAİİ 31,E NP,A Neg. ASA,M Klasik 500 831 (2) 1,5 77,8 3,3 2,1 2,7 2,3 38,K NP,A Neg. ASA Klasik 312 2228 (10,9) 2,1 40,5 2,1 1,1 1,7 1,3 42,E NP,A Neg. NSAİİ Klasik 140 895 (3) 2,1 34 1,5 0,9 2,2 0,6

Tablo 9. Oral aspirin provokasyonu negatif olan hastalarda ALLERGENICITY (CD203c) sonuçları Yaş Tanı Deri Sorumlu ASA Bazal Neg. Poz. ASA ASA Diklo. Diklo. Cins testi İlaç OPT 2.5 mg/ml 0.5 mg/ml 0.025 mg/ml 0.005 mg/ml 52,K NP,A Neg. - Neg. 1180 (2,3) 47,K A Polen ASA Neg. 2135 (2,9) 1,9 38 3,3 2,5 1,8 1,3 2,1 66,2 3,6 2 3,4 2 46,E İlaç reak. Akar ASA, NSAİİ Neg. 540 (1,2) 1,9 13,7 4,1 2,3 2,5 1,5 36,K NP Akar NSAİİ Neg. 681 (1) 2,2 68,9 3,8 2,9 3,9 2,5 39,K A Polen ASA Neg. 1708 (5,5) 1,9 41,4 3 2,6 3,2 1,5 45,K İlaç reak. Polen NSAİİ,P Neg. 1018 (4) 1,1 18,3 2,8 2 2,1 1 43,E NP Neg. - Neg. 741 (3,8) 45,E NP Neg. - Neg. 757 (4,2) 41,E NP Akar - Neg. 867 (1,3) 42,K NP,A Akar - Neg. 1360 (5,4) 0,5 59,7 1,7 0,6 0,6 0,2 2 69,5 2,5 2 1,4 1,1 1,3 25,9 1,1 1 1,3 1,2 1,8 82,5 2,7 2,4 1,5 1,2 36,K İlaç reak. Akar NSAİİ, M Neg. 1122 (1,4) 2 7 2,2 1,8 1,2 0,8 35,E NP,A Neg. - Neg. 2695 (6,7) 1,2 56,8 1,9 1,7 1,4 1,2

Tablo 10. Sağlıklı kontrollerde ALLERGENICITY (CD203c) sonuçları Yaş Tanı Deri Bazal Neg. Poz. Asp. Asp. Diklo. Diklo. Cins testi 2.5 mg/ml 0.5 mg/ml 0.025 0.005 mg/ml mg/ml 30,K Kontrol Neg. 857 (0,8) 1,1 86 3,8 2,3 4 1,1 30,K Kontrol Neg. 731 (3,3) 2,5 28,4 1,5 1,3 1,1 1 18,K Kontrol Neg. 1317 (4,1) 1,3 62,5 2,4 0,7 1,7 0,7 27,E Kontrol Neg. 674 (3,5) 1,2 68,2 1,1 1 1,4 1,2 27,E Kontrol Neg. 1260 (4,3) 1,1 87,9 1,7 1,4 1,6 0,7 36,E Kontrol Neg. 570 (3,5) 1,9 54,3 4,9 3,6 2,3 1,4 27,K Kontrol Neg. 1049 (4) 2 55,4 3,6 1,3 2,7 2,6 43,K Kontrol Neg. 1789 (7) 2 41,8 3,7 1,4 2 1,8 47,K Kontrol Neg. 1187 (2,8) 2 57 2,9 2,7 2,3 1,7 32,K Kontrol Neg. 682 (2,4) 1,5 32,3 1,1 0,3 0,7 0,5 36,K Kontrol Neg. 829 (1,4) 0,2 59,1 1,6 1,1 0,9 0,5 35,E Kontrol Neg. 759 (2,5) 2,2 22,8 1 0,5 0,7 0,5

Grupların karşılaştırmasında; hem ASA hem de Diclofenac ile FLOW-CAST (CD63 ölçümü) ve Allergenicity (CD203c ölçümü) yöntemleri ile CD63 ve CD203c ölçümlerinde: 1-Üç grup arasında 2 farklı ASA konsantrasyonu uyarısı ile bazofilleri üzerinde eksprese olan CD63 yüzdeleri arasında fark yoktu. (P:0.221 ve p:0.191) 2-Üç grup arasında 2 farklı Diclofenac konsantrasyonu uyarısı ile bazofilleri üzerinde eksprese olan CD63 yüzdeleri arasında fark yoktu. (p:0.276 ve p:0.698). 3-Üç grup arasında 2 farklı ASA konsantrasyonu uyarısı ile bazofilleri üzerinde eksprese olan CD203c yüzdeleri arasında fark yoktu. (p:0.248 ve p:0.065). 4-Üç grup arasında 2 farklı Diclofenac konsantrasyonu uyarısı ile bazofilleri üzerinde eksprese olan CD203c yüzdeleri arasında fark yoktu. (p:0.133 ve 0.051) 5-Üç grup arasında 2 farklı ASA konsantrasyonu uyarısı ile elde edilen CD63 molekülü için SI arasında fark yoktu. (p:0.246 ve p:0.303). 6-Üç grup arasında 2 farklı Diclofenac konsantrasyonu uyarısı ile elde edilen CD63 molekülü için SI arasında fark yoktu. (p:0.238 ve p:0.741) 7-Üç grup arasında 2 farklı ASA konsantrasyonu uyarısı ile elde edilen CD203c molekülü için SI arasında fark yoktu. (p:0.904 ve p:0.478) 8-Üç grup arasında 2 ASA Diclofenac konsantrasyonu uyarısı ile elde edilen CD203c molekülü için SI arasında fark yoktu. (p:0.988 ve p:794) ROC analizi sonucunda incelenen hiçbir değişkenin anlamlı olmadığı belirlendi. Bu nedenle değişkenlerin tanı koymada yeterli güce sahip olmadığı ve kesim noktalarının bulunmadığı anlaşıldı. Bu yüzden çalışmada kullanılan in- vitro tanı testlerinin, gold standart olan oral ASA testine göre sensitivite ve spesifitesi hesaplanarak tanı koyma gücü değerlendirildi. Gruplar arasında bazofil aktivasyon yüzdeleri ve SI açısından farklar olmaması nedeni ile de sensitivite ve spesifitesi hesaplamasında Grup 1 ve Grup 2 verileri kullanıldı. ASA uyarısı ile CD63 ölçümü; pozitiflik kriteri olarak CD63 eskpresyonun > % 5 olması alınırsa; sensitivitesi %33,3, spesifitesi % 50 idi. Daha düşük ASA dozu ile de benzer sensitivite ve biraz yüksek spesifite değerleri elde edildi. Diğer NSAİİ olan diclofenac ile CD63 ölçümünün sensitivite ve spesifitesi ASA ya göre daha düşüktü ve daha düşük diclofenac dozunda hiçbir bazofil uyarısı olmadığı görüldü. (Tablo 11)

ASA uyarısı ile CD63 ölçümü pozitiflik kriteri olarak SI>2 alınırsa sensitivitesi %77,8, kadar çıkıyordu ancak spesifitesi % 16,7 e düşüyordu. Benzer şekilde diclofenac sensitivitesinde de artış görülüyordu. (Tablo 11) ASA uyarısı ile CD203c ölçümü; pozitiflik kriteri olarak CD203c eskpresyonun > % 5 olması alınırsa; sensitivitesi % 16.7, spesifitesi % 100 idi. Daha düşük ASA dozu ile de düşük sensitivite ve benzer spesifite değerleri elde edildi. Diğer NSAİİ olan diclofenac ile CD203c ölçümünün sensitivite ASA ya göre daha düşüktü ve spesifitesi % 100 dü. Daha düşük diclofenac dozunda sensitivite düşmekle birlikte spesifite değişmemişti. ASA uyarısı ile CD203c ölçümü; pozitiflik kriteri olarak SI>2 alınırsa sensitivitesi biraz artmakla birlikte spesifitesi düşüyordu. Benzer şekilde diclofenac sensitivitesinde de spesifite düşmeden artış görülüyordu. ASA uyarısı ile CD63 ölçümü; pozitiflik kriteri olarak CD63c eskpresyonun > % 5 ve SI>2 alınırsa; sensitivitesi ve spesifitenin tek başına >% 5 değerinin alınması ile elde edilen sonuçları verdiği ve SI eklenmesinin sensitivite ve spesifitesi üzerinde herhangibir etkisini olmadığı görüldü. Benzer sonuçlar diclofenac içinde geçerliydi ASA uyarısı ile CD203c ölçümü; pozitiflik kriteri olarak CD203c eskpresyonun > % 5 ve SI>2 alınırsa; sensitivitesi ve spesifitenin CD63 e benzer özellik gösterdiği ve SI eklenmesinin sensitivite ve spesifitesi üzerinde herhangibir etkisini olmadığı görüldü. Benzer sonuçlar diclofenac içinde geçerliydi. Hem CD63 ölçümü hem de CD203c birlikte değerlendirildiğinde ve pozitiflik kriteri >% 5 alındığında sensitivitesi %33,3, spesifitesi % 50 bulundu. Bu değerler; pozitiflik kriteri olarak CD63 eskpresyonun > % 5 olması alınması ile elde edilen değerlerin aynıydı. Hem CD63 ölçümü hem de CD203c birlikte değerlendirildiğinde ve pozitiflik kriteri SI>2 alınırsa alındığında sensitivitesi %77,8, spesifitesi % 8.3 bulundu. Hem CD63 ölçümü hem de CD203c birlikte değerlendirildiğinde ve pozitiflik kriteri >% 5 ve SI>2 alınırsa alındığında sensitivitesi %33,3, spesifitesi % 50 bulundu. Bu değerler; pozitiflik kriteri olarak CD63 ekspresyonun > % 5 olması ile elde edilen değerlerin aynıydı. ASA uyarısına, diclofenac eklenmesinin CD63 ve CD203c sonuçları üzerinde bir etkisi yoktu.

Tablo 11. FLOW-CAST ve Allergenicity yöntemlerinin tanısal değerleri CD63 (FLOW-CAST) Eksp.>%5 SI>2 Eksp.>%5 SI>2 CD203c (ALLERGENICITY) Eksp.>%5 SI>2 Eksp.>%5 SI>2 CD63 ve CD203c FLOW-CAST and ALLERGENICITY Eksp.>%5 SI>2 Eksp.>%5 SI>2 Sensitivite 33,3 77,8 33,3 16,7 27,8 16,7 33,3 77,8 33,3 ASA 2,5 mg/ml Spesifisite 50 16,7 50 100 75 100 50 8,3 50 PPV 50 58,3 50 100 62,5 100 50 56 50 NPV 33,3 33,3 33,3 44,4 40,9 44,4 33.3 20 33.3 ASA 0,5 mg/ml Sensitivite 33,3 61,1 33,3 11,1 16,7 11,1 Spesifisite 58,3 25 58,3 100 100 100 PPV 54,5 55 54,5 100 100 100 NPV 36,8 30 36,8 42,9 44,7 42,9 Sensitivite 16,7 44,4 16,7 22,2 27,8 22,2 22.2 50 22.2 Diclofenac 0.025 mg/ml Spesifisite 66,7 41,7 66,7 100 100 100 66.7 41.7 66.7 PPV 42,9 53,3 42,9 100 100 100 50 56.3 50.0 NPV 34,8 33,3 34,8 46,2 48 46,2 36.4 35.7 36.4 Sensitivite 0 11,1 0 11,1 11,1 11,1 Diclofenac 0.005 mg/ml Spesifisite 83,3 66,7 83,3 100 100 100 PPV 0 33,3 0 100 100 100 NPV 35,7 33,3 35,7 42,9 42,9 42,9

4. SONUÇ VE ÖNERİLER Flow sitometride son 20 yılda ortaya çıkan gelişmeler sonucunda bu yöntemin tıbbın pek çok alanında kullanıma girdiği görülmüştür. In-vitro aktive edilmiş bazofillerin CD63 ve CD203c ile gösterilmesi etkin, güvenli ve hızlı yeni bir tanısal yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Bu tanısal yöntemin klinik geçerliliği inhalan allerjenler, besin allerjisi, lateks allerjisi, venom allerjisi ve bazı ilaç allerjileri için gösterilmiştir. Çalışmalar bu grup allerjik hastalıkların tanısında flow sitometri ile periferik kan bazofilleri üzerinde CD63 ve CD203c ölçülmesinin duyarlığını sırasıyla %56 100, özgüllüğünü ise %83-100 arasında bildirmiştir (15, 18). İlaç allerjisi tanısı; ilaçların çok çeşitli olması, hem immün hem de non-immün mekanizmaları uyarabilmeleri ve bazı olgularda olaya katılan temel mekanizmanın bilinememesi nedeniyle oldukça güçtür. En uygun tanısal yöntem olan provokasyon testleri ise hem riskli hem de her zaman için kolay uygulanabilir değildir. Bu nedenle ilaç allerjisi tanısında; güvenilir, risksiz ve hızla sonuç verecek in-vitro testler son derece yararlı olacaktır. Bu in vitro yöntemlerden biri olan flow sitometri ilaç allerjisi tanısında da denenmiştir (20). Özellikle CD63 molekülü flow sitometrik çalışmalar için en popüler molekül olmuştur (15). CD63 molekülü ölçülerek bazofil aktivasyonu kas gevşeticilerle ortaya çıkan anafilâksi olgularında çalışılmış ve duyarlığı %64, özgüllüğü de % 93 olarak bildirilmiştir (21). Benzer şekilde CD63 molekülü beta-laktam antibiyotiklere allerji tanısında da çalışılmış ve referansın spesifik IgE ve deri testi pozitifliği olması durumunda testin duyarlığı %50, özgüllüğü %94 olarak bulunmuştur (22). ASA diğer NSAİİ lar çok geniş kullanım alanı, kolay ulaşılabilirliği ve genelde uygun fiyatlarda olması nedeniyle sık kullanılır ve bu nedenle de bu grup ilaçlara içinde duyarlık reaksiyonlarının da olduğu bir grup istenmeyen ilaç reaksiyonlarına yol açarlar. Aspirin duyarlığı tanısında flow sitometrik in vitro yöntemlerin kullanımına ait çalışmalar son derece az sayıdadır ve bu çalışmaların neredeyse tümü aynı çalışma grubu tarafından ve aynı ticari kit (Flow-CAST) kullanılarak yapılmıştır. Bunlardan ilkinde ASA ve/veya diğer NSAİİ alımı ile anafilâksi öyküsü olan 9 hastada olaya IgE aracılı mekanizmaların katılımı; aspirin sige, lizin aspirinle prik veya intradermal test pozitifliği ve flow sitometri ile CD63 taşıyan aktif bazofillerin artışı ile gösterilmiştir (23). Daha sonra aynı araştırma grubu CD63 molekülünün bu grup ilaçların tanısındaki yeri açısından değerlendirmiştir. Gamboa ve arkadaşları sadece metamizol alımı ile erken tip aşırı duyarlılık reaksiyonu tanımlayan, diğer NSAİİ tolere edebilen 26 hastada FAST yönteminin güvenilirliğini değerlendirmişler (24) ve testin duyarlığını %43,2, özgüllüğünü de %100 bulmuşlardır. Hastaların cilt testi sonuçları Flow-AST ile birlikte