SAKARYA ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ ENSTRÜMANTAL ANALİZ UYGULAMA KILAVUZU Yrd. Doç. Dr. Ayşe AVCI 2014- Sakarya
İÇİNDEKİLER LABORATUVAR ÇALIŞMALARINDA UYULMASI GEREKEN KURALLAR. 2 UYGULAMA NO: 1; KAĞIT KROMATOGRAFİSİ VE İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ 4 UYGULAMA NO: 2; GAZ KROMATOGRAFİSİ... 7 UYGULAMA NO:3; YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC)... 10 UYGULAMA NO: 4; YAĞLARDA KIRILMA İNDİSİ TAYİNİ... 13 UYGULAMA NO: 5; POLARİMETRE İLE ŞEKER TAYİNİ 15 UYGULAMA NO:6; SPEKTROFOTOMETRİK İNDİRGEN ŞEKER TAYİNİ (DNS YÖNTEMİ İLE) 18 KAYNAKLAR 20 UYGULAMA RAPORU ŞABLONU 21 RAPOR YAZIMINDA DİKKAT EDİLECEK NOKTALAR 22 1
LABORATUVAR ÇALIŞMALARINDA UYULMASI GEREKEN KURALLAR - Laboratuvarın ciddi, düzenli ve dikkatli çalışılması gereken bir yer olduğunu unutmayınız! - Her öğrenci, laboratuvar saatinde laboratuvarda hazır bulunmalı. Aksi takdirde laboratuvara alınmayacaktır! - Çeşitli kimyasal maddelerin etkilerinden korunmak amacı ile öğrencilerin beyaz laboratuvar önlüğü giymeleri zorunludur. Öğrencilerin önlük düğmelerini iliklemeleri, uzun saçlı olanların saçlarını toplamaları gerekmektedir. - Giyilen ayakkabılar laboratuvar çalışma şartlarına uygun olmalıdır. Açık ayakkabı ve sandaletler çözelti ve kimyasal sıçramalarına ve cam kırıklarına karşı ayakları korumaz. En iyi, en yeni elbiselerinizi laboratuvarda giymeyin. Çünkü bazı kimyasallar giysilerinize sıçradığında delikler açabilir ve kalıcı lekeler bırakabilir. - Öğrenciler, laboratuvardaki masaların üzerine oturmamalıdır. - Laboratuvarda hiçbir şey yenilmez, içilmez, koklanmaz ve etiketler dil ile ıslatılmaz. - Laboratuvarda yersiz şakalar yapılmamalı. Bu durum ciddi sonuçlar doğurabilir. - Analizlerin anlayarak yapılabilmesi için, o gün yapılacak deneyle ilgili; deneyin amacı, yapılışı ve gerekli teorik bilgiler öğrenilmelidir. - Cihazlar titizlikle kullanılmalıdır. Dikkatsiz çalışma hayati önem taşır! - Kullanımı iyi bilinmeyen alet ve ekipman ile mutlaka deneyimli bir kişinin denetiminde çalışılmalıdır. - Bir maddeyi kullanmadan önce etiket dikkatlice incelenmeli. Bilinmeyen madde kesinlikle kullanılmamalı. - Kolayca buharlaşan, yanıcı veya zehirli buhar oluşturan maddelerle çalışırken çeker ocak kullanılmalı gerekiyorsa pencereler açık bırakılmalıdır. - Şişe kapakları açıldığında ters çevrilerek konulur. İç taraf yukarı gelecek şekilde konulması durumunda bulaşma olabilir. - Kimyasal maddelere el ile dokunulmamalı. Kimyasal maddelerin ve çözeltilerin tadına bakılmamalıdır. - Kimyasal katı maddeler temiz bir spatülle alınır. Sıvı olanlar pipetle çekilir ancak, asitli ve yanıcı kimyasal maddeler ağızla çekilmez, puar veya otomatik pipetle çekilir. - Kimyasal madde ve çözeltilerin bulunduğu stok şişelerine pipet, baget, kaşık, spatül gibi cisimler sokulmamalı. Kullanılacak kadar malzeme temiz bir kaba alınarak oradan kullanılmalı, artan kısım ise tekrar yerine konmamalıdır. - Kimyasal maddeler kaynatılırken üstten bakılmaz. Taşma ve buhar çıkışı olabilir. 2
- Kimyasal maddeler kaynatılırken veya karıştırılırken ağzı kapatılmaz. - Kimyasal maddelerin konulduğu şişeler etiketlenmeli ve etikete maddenin adı, konsantrasyonu, varsa faktörü, tarih ve çözeltiyi hazırlayanın adı yazılır. Kullanılmadığı zaman kapakları mutlaka kapalı tutulur. - Şişelerden sıvı dökülürken etiketli taraf yukarı doğru tutulmalıdır. Aksi halde damlalar sızıp etiketi bozabilir. - Asit çözeltiler hazırlanırken asit üzerine su dökülmemelidir. Gerekli miktardaki su üzerine yavaş yavaş asit dökülerek çözelti hazırlanmalıdır. - Laboratuvarda bulunan çöp kutularına atık kimyasal maddeler kesinlikle atılmamalıdır. - Kullanılan alet, malzeme ve masaların üstü daima temiz tutulmalıdır. Deney bitiminde, laboratuvardan çıkmadan önce hepsi temizlenerek laboratuvardan çıkılmalı. Çıkarken eller sabunla yıkanmalı. - Çalışma esnasında bozulan elektrikli veya elektronik aletler onarılmaya çalışılmamalı, mutlaka ilgili servisten yardım istenmelidir. - Öğrenciler laboratuvar ile ilgili bir problem olduğunda görevli araştırma görevlilerine ve/veya öğretim üyelerine başvuracaklardır. 3
UYGULAMA NO: 1 KAĞIT KROMATOGRAFİSİ VE İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ UYGULAMANIN AMACI: Kağıt Kromatografisi ve İnce Tabaka Kromatografisi yardımıyla bir maddenin bileşenlerine ayrılmasının gözlenmesi. KAĞIT KROMATOGRAFİSİ (KK) Kromatografi, bir karışımdaki bileşenlerin birbirinden ayrılmasını ve tanımlanmasını gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır. Uygulaması en basit yöntemlerden olan kağıt kromatografisi (KK), uygulaması sıvı-sıvı partisyon kromatografisidir. Bu yöntemde, kalın bir süzgeç kağıdı destek; gözeneklerine yerleşen su ise, sabit "sıvı fazı oluşturur. Hareketli faz bir yürütücü tank içine yerleştirilmiş uygun bir sıvıdır. KK genellikle kalitatif amaçlı kullanılır. Bu uygulamada, çeşitli gıda boyalarının KK ile kendisini oluşturan renklere ayrılması gözlenecektir. Deneyin Yapılışı Gerekli malzemeler Whatman no.1 filtre kağıdı Kırmızı ve yeşil gıda boyaları Developman çözeltisi (%70 propanol; %30 Amonyak) Develoman tankı Kurşun kalem Cetvel Filtre kağıdı uygun boyutlarda kesilir. Kurşun kalem ve cetvel yardımıyla kağıdın 2 cm altından düz bir çizgi çizilir. Örnek sayısına göre, örnekler arasında yaklaşık 2 cm aralık olacak şekilde çizginin üzeri işaretlenir. Gıda boyaları suda çözündürülür. İşaretlenen kısımlara 5 ul örnek, beneğin dağılmasını önlemek için yavaş bir şekilde uygulanır. Developman tankına su konulur. Su miktarı beneklerin 0.5-1.0 cm altında olmalıdır. Kağıt çözücüye paralel pozisyonda tutularak daldırılmalı ve kesinlikle benekler çözücü ile doğrudan temas etmemelidir. Aksi takdirde örnek çözücüye geçer. Kağıt tanka yerleştirildikten sonra tankın kapağı hemen kapatılarak çözücünün kağıt üzerinden yükselmesi sağlanır. Çözücü kağıt üzerine 1.5-2.0 cm kadar yaklaşınca tankın kapağı açılarak kağıt tanktan çıkarılır. Böylece kağıdın developmanı tamamlanmış olur. Kağıdın üzerindeki çözücünün hızla buharlaştırılması gerekmektedir. Aksi halde difüzyon etkisiyle benek çapları büyüyecektir. Kağıt açık havada veya etüvde kurutulur. Sonucun değerlendirilmesi: İşlem sonunda gıda boyasının kaç farklı bileşenden oluştuğu, bu bileşenlerin kağıtta yürüme hızları kalitatif olarak değerlendirilir. İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ (İTK) 4
İnce tabaka kromatografisi "katı sıvı adsorpsiyon kromatografisidir. Sabit faz, bir plaka üzerine ince bir tabaka halinde sıvanmış katı adsorbant madde; hareketli faz ise sıvıdır. Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyişi, aşağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür. İTK de ayırmada genel kural, örneği oluşturan bileşenlerin polarlık derecelerine uygun polarlıkta çözücü seçmektir. Çoğu kez apolar bileşikler için kuvvetli aktif adsorbantlar; polar bileşikler için ise zayıf aktif adsorbantlar seçilir. Bu uygulamada çeşitli gıda boyalarının İTK ile kendisine oluşturan renklere ayrılması sağlanacaktır. ITK ile çeşitli gıda örneklerinde aminoasit analizi yapılacaktır. Deneyin Yapılışı Gerekli Malzemeler Silikajel ince tabaka Kırmızı ve yeşil gıda boyaları Peynir altı suyu Amino asit standartları Developman çözeltisi ( %70 Propanol; %30 Amonyak) Ninhidrin Cetvel Kurşunkalem Silikajel tabaka, örnek sayısına göre, uygun boyutlarda kesilir. Kurşun kalem ve cetvel yardımıyla tabakanın 2 cm altından düz bir çizgi çizilir. Örnek sayısına göre, örnekler arasında yaklaşık 2 cm aralık olacak şekilde çizginin üzeri işaretlenir. Gıda boyaları suda çözündürülür. İşaretlenen kısımlara 5 µl örnek, beneğin dağılmasını önlemek için yavaş bir şekilde uygulanır. Developman tankına developman çözeltisi konulur. Çözeltinin miktarı beneklerin 0.5-1.0 cm altında olmalıdır. Tabaka çözücüye paralel pozisyonda tutularak daldırılmalı ve kesinlikle benekler çözücü ile doğrudan temas etmemelidir. Aksi takdirde örnek çözücüye geçer. Tabaka tanka yerleştirildikten sonra tankın kapağı hemen kapatılarak çözücünün kağıt üzerinden yükselmesi sağlanır. Çözücü tabaka üzerine 1.5-2.0 cm kadar yaklaşınca tankın kapağı açılarak tanktan çıkarılır. Böylece tabakanın developmanı tamamlanmış olur. Çözücünün seviyesi kurşunkalem ile işaretlenir. Tabaka açık havada veya etüvde kurutulur. İTK ile amino asitlerin analizinde aminoasitleri belirlenecek örnek ile birlikte aminoasit standartları da tabakaya uygulanır. İşlem yukarıda açıklandığı şekilde aynı çözücü kullanılarak yapılır. İşlem sonunda tabakaların üzerine ninhidrin püskürtülerek 60 ⁰C de 10 dak bekletilir. Böylece developman sonrası görünmez hale olan amino asitler görünür hale getirilir. 5
Sonuçların değerlendirilmesi: Örneğin uygulandığı yerden itibaren çözücünün aldığı yol bir cetvel yarımıyla ölçülür. Oluşan beneklerin orta noktaları işaretlenerek örneğin uygulandığı noktadan itibaren beneğin orta noktasına kadar olan yol da cetvel ile ölçülür. Bu ölçümler yardımıyla Rf değeri hesaplanır. Örneğin aldığı yol (cm) Rf değeri = ------------------------------------------ Çözücünün aldığı yol (cm) 6
UYGULAMA NO: 2 UYGULAMANIN ADI: GAZ KROMATOGRAFİSİ CİHAZININ TANITIMI UYGULAMANIN AMACI: Bu uygulamada Gıda Mühendisliği Bölümü laboratuvarında bulunan gaz kromatografisi cihazının bölümleri tanıtılacak ve çalışma prensipleri anlatılacaktır. Gaz kromatografisi, bir karışımda gaz halindeki veya kolaylıkla buharlaştırılabilen (uçucu) bileşenlerin birbirinden ayrılması amacıyla kullanılan kromatografi yöntemidir. Hareketli faz: gaz (azot, helyum, argon) Sabit faz: sıvı veya katı Sıvı (partisyon): katı bir destek maddesi üzerine tutturulmuş sıvı (Gaz-sıvı kr-glc) Katı (adsorbsiyon): Gaz-katı kr (GSC): bileşenlerin katı yüzeyde farklı derecelerde adsorblanmaları esasına dayanır Gaz kromatografisinin bölümleri 1) Taşıyıcı gaz 2) Enjeksiyon bloku 3) fırın (kolon) 4 Dedektör 5) kaydedici-integratör-bilgisayar 1) Taşıyıcı gaz: Kural olarak GC de kullanılan gazların kuru ve %99.99 saflıkta olması istenir. Ayrıca inert de olmalıdır. Bu nedenle soy gaz (inert) olan helyum veya azot daha çok kullanılır. Kapiler kolonlarda hidrojen de taşıyıcı gaz olarak kullanılmaktadır. Dolgulu kolonlarda ucuz olduğu için azot gazı tercih edilir. Taşıyıcı gazın kuruluğu kolonun performansına etki eden en önemli faktörlerdendir. Taşıyıcı gazda bulunan eser miktardaki su kolon sabit fazını giderek bozar. Bu durum özellikle polar sıvı fazlarda kendini daha çok gösterir. Bu durumu gidermek için gaz hatlarına filtre takılır. Filtre olarak moleküler elek ve silikajel kullanılır. Filtre zaman zaman 100 ⁰C nin üzerinde içerisinden kuru azot geçirilerek temizlenmelidir (rejenerasyon). Taşıyıcı gaz, tüplerinde (silindir, tank) su konsantrasyonu azalan tüp basıncıyla artmaktadır. Bu nedenle tüpteki basınç azalınca taşıyıcı gaz tüpünü kullanmayıp dolusu ile değiştirilmelidir. 7
2) Enjeksiyon bloku: Sıvı örnekler şırıngalarla, silikon kauçuğundan yapılmış bir septumdan örnek odasına enjekte edilir. Enjeksiyon miktarı genellikle 0.1-5.0 µl arasında değişir. Örnek enjektörle kolon girişine bir hamlede verilir. Gaz örnekler gaz kaçırmayan özel gaz enjektörleriyle veya özel gaz verme musluklarıyla verilir. Katı örnekler ise uygun çözücüde çözüldükten sonra sıvı enjektörleriyle cihaza verilir. Örneğin gaz haline dönüşmesi için enjeksiyon blokunun örnekteki bileşenlerin kaynama noktası en yüksek olanın k.n dan genellikle 50 C daha fazla ısıtılması gerekir. 3) Kolon: Kolon GC nin kalbidir, en önemli parçasıdır. Çünkü bütün ayırımlar burada gerçekleşir. Kolonlar cam veya metal (paslanmaz çelik) olabilir. Çapları 1/16,1/18 ve 1/4 olabilmektedir. İnert olması bakımından cam kolonlar tercih edilir, ancak kırılganlığı ve cihaza bağlama zorlukları dezavantajıdır. Kolon sıcaklığı çok iyi ayarlanabilen (±1 C duyarlıkta) bir fırın içerisine yerleştirilir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tam bir sıcaklık ve taşıyıcı gaz akış kontrolü gereklidir. Kolonlar iki tiptir: a) Dolgulu kolonlar (1.2-2.5 m uzunluğunda ve 2-4 mm iç çapında); b) Kapiler kolonlar (10-100 m uzunluğunda ve 0.1-0.5 mm iç çapında). GC de dolgulu kolonlar hem kalitatif hem de teşhis gerekse kantitatif tayin için kullanılmaktadır. Ancak dolgulu kolonların bazı dezavantajları bulunmaktadır. Örn. dolgulu kolonlarda kolon boyu uzatılarak daha iyi bir ayırma sağlanabilir. Ancak kolonun boyunu uzatmak kolondan geçen gazın basıncı nedeniyle sınırlıdır. Kolon boyu uzadıkça kolondan geçen taşıyıcı gazın basıncı aşırı derecede yükselecektir. GC de dolgulu kolonlar hem kalitatif hem de teşhis gerekse kantitatif tayin için kullanılmaktadır. Ancak dolgulu kolonların bazı dezavantajları bulunmaktadır. Örn. dolgulu kolonlarda kolon boyu uzatılarak daha iyi bir ayırma sağlanabilir. Ancak kolonun boyunu uzatmak kolondan geçen gazın basıncı nedeniyle sınırlıdır. Kolon boyu uzadıkça kolondan geçen taşıyıcı gazın basıncı aşırı derecede yükselecektir. Kapiler kolonlarda cam veya metalden yapılmaktadır. Kapiler kolonlarda dolgulu kolonlarda olduğu gibi şartlandırıldıktan sonra kullanılmalıdır. 4) Dedektörler: Bir GC detektörü taşıyıcı gazdan farklı bir maddenin varlığını algılayan ve bu bilgiyi elektrik sinyaline dönüştüren bir araçtır. Kolonda ayrılmış bileşenler, dedektör yardımıyla kantitatif olarak ölçülebilirler. Dedektörler analizi yapılacak örneğe göre farklılık gösterirler. Analizde kullanılacak dedektörler; taşıyıcı gaza cevap vermemeli, sadece örnek bileşenlerine duyarlılık göstermelidir. Ayrıca, dedektörün verdiği cevap yani sinyal ve buna 8
bağlı olarak pik, örnek bileşenlerinin konsantrasyonlarıyla doğru orantılı olmalıdır. Dedektör bloku cihaz üzerinde ısıtılan bölgelerden biridir. Dedektör blokunun sıcaklığı iyi kontrol edilmeli, sabit olmalı ve voltajdan etkilenmemelidir. Gıda analizlerinde genellikle kullanılan dedektörler: Alev iyonizasyon dedektörü (FID) Alkali alev iyonizasyon dedektörü (Alkali FID) Isıl iletkenlik dedektörü (TCD) Elektron yakalama dedektörü (ECD) Alev fotometrik dedektör (FPD) Alev iyonizasyon dedektörü (FID): GC de en çok kullanılan dedektörlerdir. Prensibi; Organik maddelerin, hidrojen+hava alevi sıcaklığında bozunurak iyonlaşması ve alev ortamı akımın ölçülmesidir. Gazların elektrik geçirgenliği gaz ortamındaki yüklü taneciklerin miktarıyla orantılıdır. Bu dedektörün çalışması için dedektöre kolondan gelen taşıyıcı gazdan başka hidrojen ve hava da verilir. Kolonda ayrılarak taşıyıcı gazla birlikte kolonu terk eden bileşikler dedektörde H ve hava karışımı ile yakılır ve iyonlaşırlar. Bu bileşiklerin iyonlaşması ile elektrik akımı oluşur ve oluşan akım ölçülür. Böylece alev ortamından iyonlaşan tanecik miktarıyla orantılı bir akım geçer. Akımdaki bu değişim madde miktarı olarak yorumlanır. FID yüksek hassasiyete sahiptir. Dezavantajı kolonda ayrılan bileşenlerin parçalanmasıdır. FID ler organik maddelere duyarlı olup, inorganik maddelere duyarlı değildirler. Ayrıca, He, Ar, N2 gibi inert gazlara da duyarlık göstermezler. Bu nedenle bu dedektörle yapılan çalışmalarda bu gazlar taşıyıcı olarak kullanılır. Taşıyıcı gazın hızı genellikle 2 mm iç çaplı kolonlarda için 30 ml/dak, H2 hızı bunun %10 fazlası ve havanın hızı da H2 in hızının 10 katı olduğunda iyi sonuç alınır 9
UYGULAMA NO: 3 UYGULAMANIN ADI: YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) CİHAZININ TANITIMI UYGULAMANIN AMACI: Bu uygulamada Gıda Mühendisliği Bölümü laboratuvarında bulunan Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi cihazının bölümleri tanıtılacak ve çalışma prensipleri anlatılacaktır. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), en yaygın olarak kullanılan analitik tekniklerden bir tanesidir. HPLC, bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler, ilk olarak çözgende çözünürleştirilir ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar. Modern sıvı kromatografisinin temel kriterinin basınç olduğu düşünülmekteydi ve bu nedenle yüksek basınçlı sıvı kromatografi olarak adlandırılmaktaydı. Yüksek performans sadece basıncın değil bir çok faktörün birleşmesiyle oluşturulduğundan günümüzde yüksek performanslı sıvı kromatografi adlandırılması kullanılmaktadır. Çok küçük boyutlarda partiküllerden (5µm) oluşan sabit faz kullanılır. Küçük partiküller daha geniş yüzey alanı oluşturur ve böylece daha iyi ayırım gerçekleşir. HPLC de kolonlar çok sıkı bir şekilde doldurulmuş olduğundan kolondan örnek ve hareketli fazı geçirebilmek için basınç uygulanması gerekir. Bunun içinde pompalar kullanılır. 400 atm kadar basınç uygulanabilir. HPLC nin bölümleri 1. Hareketli faz Rezevuarı: Hareketli fazın konulduğu kabın adıdır. Kullanımdan önce hareketli fazda gazın alınması gerekir (degassing) bunun için vakum, ultrason veya ortamdan inert bir gaz geçirilebilir. Hareketli faz iyi bir şekilde degas edilmezse pompada hava cebi oluşabilir ve giderek akış hızı azalır, sonunda akış durur. Solvent rezervuarının çalışma sırasında ağzının kapalı olmasına dikkat edilmelidir. Buharlaşmadan dolayı hareketli fazın kompozisyonu değişir. 2. Pompalar: Emme-basma pompalar kullanılır. İki pistona sahiptirler. Biri emiş yaparken diğeri basma yapacak şekilde 180 farkla çalışırlar. Pompanın gücü kullanılan kolonun boyut ve tipine ve hareketli fazın vizkozitesine bağlıdır. Örn: 5mm iç çaplı kolonlarda akış hızı 1-2 ml/dak ve bunun için gerekli basınçta 60 bardır. Basınç kolon boyuna, partikül büyüklüğüne ve çözgene bağlıdır. Kolon ne kadar dar olursa akış hızı da o kadar düşecektir. 10
3. Enjeksiyon sistemi: İdeal enjektör örneği, kolonun başına solvent akışına zarar vermeden verebilmelidir. Yaygın olarak örneğin bir tüpe (loop) injeksiyonunu içeren enjeksiyon valfi sistemi kullanılmaktadır. Pompadan gelen çözücü akışı, kolonun üst kısmına örneği itmek için loop kısmına yönlendirilir. Böylece pompadan gelen çözücü daha önceden enjekte edilmiş örneği süpürerek kolona taşır. 4. Kolonlar: HPLC de kullanılan kolonlar 4.5-5.0 mm iç çaplı ve 10-30 cm uzunluğunda, 5-10 µm sabit faz partikülleriyle paketlenmiştir. Paslanmaz çelikten yapılırlar. Pek çok durumda kolonun baş kısmına takılan koruyucu (guard) bir kolona ihtiyaç duyulur. Bununla analitik kolon kısa zamanda kirlenmekten korunur. Kromatografik kolonda partikül büyüklüğü önemlidir. Partikül çapı küçüldükçe teorik plaka sayısı artar. Ancak solvent akışına direnç de o oranda yükselir. Kısa etkili kolonların kullanımıyla (örn. 3.3 cm boyutunda) çok hızlı ayırımlar elde edilebilmektedir. Ancak, böyle kolonlara küçük hacimde örnek verilebilir. 1-2 mm iç çaplı kolonlar kullanımda daha yaygındır. Bu kolonlarda 40 µl/dak lık bir akış hızı 5 mm çaplı kolonlarda 1 ml/dak akış hızına denk gelir. Böylece mobil fazdan tasarruf sağlanır. Küçük iç çaplı kolonlar teşhis duyarlılığında artışa neden olur. Pek çok HPLC ayırmaları oda sıcaklığındaki kolonlarda gerçekleştirilir. Ancak tekrarlanabilir sonuçlar sadece kolon sıcaklığı sabit olduğu zaman alınabilmektedir. Bunun için su ceketiyle, fırınla veya ısıtılmış metal blokla sabit sıcaklık sağlanabilir. Dedektörler: kolonda birbirinden ayrılan maddeler hareketli faz ile birlikte dedektöre gelirler. Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir. HPLC de kullanılan dedektörler Absorbans Dedektörü Floresans Dedektörü Refraktif index dedektörü (Kırılma İndisi Dedektörü) Elektrokimyasal Dedektör İletkenlik Dedektörü Absorbans dedektörler: En çok kullanılan dedektörlerden biridir. Maddelerin çoğu UV - görünür bölgede çeşitli dalga boylarında absorbansa sahiptirler. Kantitatif ölçümlerin esası Lambert-Beer yasasına dayanır. Absorbans dedektörleri, akış hücrelerinden geçen sıvının -sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki- ışığı absorpsiyonunu ölçerler. Radyasyon 11
kaynağı UV bölgede (200-400 nm) döteryum lambası, görünür bölgede (400-700) ise tungsten lambadır. Dalga boyu seçicisi olarak monokromatörler kullanılır. 200-800 nm UV ve görünür bölgeyi kapsayan yüksek duyarlılığa sahip dedektörler bulunmaktadır. Ayrıca çift ışın yollu cihazlar bulunmaktadır (Diyot dizinli dedektör- Diode array detector- DAD). DAD da ışın kaynağı olarak tungten ve döteryum lambalar kullanılmakta ve 195-950 nm arasında çalışılabilmektedir. Birden fazla dalga boyunda kromatogramlar izlenebilmektedir. Floresan dedektörler: Floresans dedektörler, belli bir dalga boyunda ışığı absorpladıktan sonra başka bir dalga boyunda ışın yayan yani florasans özellik gösteren maddelerin yaydığı ışık şiddetini ölçerler. Dedektörde hücreden mobil faz içerisinde çözünmüş halde bileşikler geçerken üzerine uygun dalga boyunda monokromatik ışın gönderilir. Bileşik tarafından absorbe edilen bu ışın daha sonra başka dalga boyunda geri verilir. Floresans ölçümde bu emisyon analiz için değerlendirilir. Floresan dedektörler, en duyarlı dedektörlerden biridir. Bu nedenle iz miktardaki maddelerin analizinde kullanılır. Aflatoksinler, bazı vitaminler ve türevlendirilmiş aminoasitlerin analizinde kullanılır. Dalga boyu seçicileri filtreler veya monokromatörler olabilir. Refraktif index dedektör: Bileşenlerin kırılma indekslerinin ölçümüne dayanır. Dedektörde bir kuvartz membranla bölünmüş iki parçalı akış hücresi bulunmaktadır. Dedektör her iki yarı hücredeki mobil fazdan ışık geçirilerek sıfırlanır. Kolondan ayrılan bileşikler yarı hücrenin birisinden geçirilir. Refraktif indeksteki (RI) değişiklik, başlangıç sıfırlama şartlarında bir değişikliğe yol açar. Bu dedektörün cevabıdır. Kolondan gelen 20-40 ug a kadar maddeye duyarlıdır. RID sıcaklık ve basınç değişmelerine, darbeye ve mobil fazdaki çözünmüş havaya karşı aşırı duyarlık gösterir. Bu nedenle deney sırasında bu faktörlere özel dikkat göstermek gerekir. Bu dedektörler dereceli elüsyon kullanılmaz. Özellikle şeker ve lipit analizlerinde kullanılmaktadır. 12
UYGULAMA NO: 4 UYGULAMANIN ADI: YAĞLARDA KIRILMA İNDİSİ TAYİNİ UYGULAMANIN AMACI: Refraktometrenin kullanımı öğrenmek ve çeşitli yağların kırılma indislerini belirlemek Işığın bir ortamdan yoğunluğu farklı bir ortama geçerken yön değiştirmesine ışığın kırılması denir. Bu koşullarda gelen ışının normal ile yaptığı açının sinüsünün kırılan ışının normal ile yaptığı açının sinüsüne oranına da kırılma indisi denir. Bir maddenin kırılma indisi belli koşullar altında sabittir ve o maddeye özgüdür. Yağların kırılma indislerinden yararlanılarak karakterizasyonu yapılabilir. 20 ⁰C de yemeklik sıvı yağların kırılma indisleri sabittir. Kırılma indisinden yararlanılarak yağların karakterizasyonu, saflık kontrolü, acılaşmanın kontrolü yapılabilmektedir. Bu çalışmada bazı yemeklik yağların kırılma indisleri belirlenecektir. DENEYİN YAPILIŞI Analizi yapılacak olan yağ örneklerinin sıcaklığı 20 ⁰C ye getirilir ya da kırılma indisinin okunduğu sıcaklığa göre aşağıdaki formül kullanılır. Cihaz gün ışığına yönlendirilir. Prizmaların temiz olup olmadığı kontrol edilir. Temiz değilse su veya alkolle ıslatılmış yumuşak bez ile temizlenir ve kurulanır. Aletin 0 (sıfır) ayarı saf su ile yapılır. Saf suyun kırılma indisi 1.33 dür. Alttaki prizmaya birkaç damla su damlatılarak üstteki prizma yavaşça kapatılır ve suyun prizmanın tüm yüzeyini kaplaması ve hava kabarcığı oluşmaması sağlanır. Eğer kırılma indisi 1.33 değilse cihazın skalası bu değere ayarlanır. Okülerden bakıldığında Aşağıdaki şekilde görüldüğü gibi aydınlık ve karanlık bölgelerin net olarak görülmesi ve eşit olması gerekmektedir. Değil ise cihazın sağındaki ayar düğmeleri kullanılarak gerekli ayarlamalar yapılmalıdır. http://chemlab.truman.edu/chemlab_backup/pchemlabs/chem324labs/liquidvapor 13
Su ile sıfır ayarı yapıldıktan sonra prizmalar temiz ve yumuşak bir bez ile kurulandıktan sonra alttaki prizmaya birkaç damla örnek damlatılarak üst prizma yavaşça kapatılır. Okülerden bakıldığında karanlık alanın yukarıda olduğu gözlenir. Sağda bulunan ayarlama düğmeleri yardımı ile aydınlık ve karanlık bölgelerin eşitlenmesi sağlanır. Yukarıdaki şekilde görüldüğü gibi bir görüntü oluştuğunda skaladan kırılma indisi okunur. Okunan değer ölçülen maddeye ait kırılma indisidir. Örnek sıcaklığı 20 C de değil ise aşağıdaki formül yardımı ile sıcaklık düzeltmesi yapılır. n 20 D = n T D + 0.00035 (T 20) n D T : cihazdan okunan kırılma indisi T: örneğin sıcaklığı Okuma işleminden sonra prizmalar etil alkol ile temizlenir ve kurulanır. Sonuçların değerlendirilmesi: Refraktometre ile belirlenen zeytinyağı, ayçiçek yağı ve mısır yağlarının kırılma indisleri standartlarla belirtilen aynı sıcaklıktaki kırılma indisleri ile karşılaştırılarak yorumlanacaktır. 14
UYGULAMA NO: 5 UYGULAMANIN ADI: POLARİMETRE İLE ŞEKER TAYİNİ UYGULAMANIN AMACI: Polarimetre kullanımını öğrenerek çeşitli şekerlerin optik çevirme açısını belirlemek Yapısında asimetrik karbon atomu bulunduran maddeler polarize ışık düzlemini çevirme özelliği gösterirler. Böyle maddelere optikçe aktif maddeler denir. optikçe aktif madde veya bileşiklerin polarize ışığı çevirme derecesini tayin etmek amacıyla kullanılan aletlere de polarimetre denilir. Optikçe aktif olan her bir maddenin kendine has bir çevirme açısı vardır. Optikçe aktif bir maddenin 100 gramının, 100 cm 3 suda eritilerek, 1 dm lik polarizasyon tüpüne doldurulduktan sonra 20 C de sodyumun sarı ışığında (λ: 589 nm, D hattı) polarimetre ile verdiği sapma miktarına o maddenin spesifik çevirme derecesi denir. Bir maddenin optik çevirme açısı konsantrasyonu ile orantılıdır. Konsantrasyon arttıkça çevirme açısı da artar. Polarimetreler özellikle şeker endüstrisinde şeker tayininde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu deneyde bazı şeker çözeltilerinin konsantrasyonları polarimetre ile belirlenecektir. Örnek ve saf su 20 o C ye getirilir. DENEYİN YAPILIŞI Cihazın sıfır (0) ayarı saf su ile yapılır. Bunun için 20 C deki saf su örnek tüpüne tüpün kenarlarındaki vidalı kapaklardan herhangi biri açılarak konulur. Tüpün tamamen su ile dolması sağlanmalıdır. Eğer tüpte hava kabarcığı kalmış ise tüpün uç kısmındaki bombeye alınmalıdır. Kapak kapatılarak tüp cihaza yerleştirilir. Okülerden bakıldığında aşağıdaki gibi bir görüntünün oluşması gerekmektedir. Eğer şekildeki gibi bir görüntü varsa ZERO SET düğmesine basılarak cihazın sıfır ayarı yapılır. Göstergede 0.00 değeri görülmelidir. Eğer görüntüde aydınlık ve karanlık bölgeler var ise R(+) veya L(-) tuşlarına basılarak görüntü rengi eşitlenene kadar basılır. Görüntü rengi eşitlendiği anda ZERO SET düğmesine basılarak sıfırlanır. 15
Eğer sağ yarım daire parlak ise görüntü eşitlenene kadar R(+) tuşuna basılır Eğer sol yarım daire parlak ise görüntü eşitlenene kadar L(+) tuşuna basılır Örneğin çevirme açısının ölçülmesi Örnek yukarıda açıklandığı gibi hiç hava kalmayacak şekilde tüpe doldurularak cihaza yerleştirilir. Okülerden bakıldığında yarım dairenin sağ tarafı aydınlık ise örnek polarize ışığı sağa çeviriyor demektir. R(+) tuşuna basılarak tüm görüntü eşitlendiğinde cihazın göstergesinde çevirme açısı okunur. Bu değer örneğin çevirme açısıdır. Çevirme açısının okunduğu görüntü Okülerden bakıldığında yarım dairenin sol tarafı aydınlık ise örnek polarize ışığı sola çeviriyor demektir. L(-) tuşuna basılarak tüm görüntü eşitlendiğinde cihazın göstergesinde çevirme açısı okunur. Bu değer örneğin çevirme açısıdır. Çevirme açısının okunduğu görüntü 16
Örneğin konsantrasyonunun hesaplanması Eğer okunan örneğin spesifik çevirme açısı biliniyorsa aşağıdaki formül yardımı ile örneğin konsantrasyonu belirlenebilir. [ t ] 100 lc l: Polarimetre tüpünün uzunluğu (dm) t: Sıcaklık ( o C) c: Optikçe aktif maddenin konsantrasyonu (g/100ml) : Işığın dalga boyu α: Okunan çevirme açısı (derece) Bazı şekerlerin spesifik çevirme açıları: Glukoz: +52.5 Sakkaroz :+ 66.5 Fruktoz: - 92.4 17
UYGULAMA NO:6 UYGULAMANIN ADI: SPEKTROFOTOMETRİK İNDİRGEN ŞEKER TAYİNİ (DNS YÖNTEMİ İLE) UYGULAMANIN AMACI: Spektrofotometrenin kullanımını öğrenerek spektrofotometrik indirgen şeker tayini yapmak. 3,5 Dinitrosalisilik asit (DNS), indirgen şekerler ile reaksiyona girerek 3-amino-5- nitrosalisilik asite indirgenen aromatik bir bileşiktir. Reaksiyon yüksek sıcaklıkta ve alkali koşullarda gerçekleşmektedir. İndirgenme reaksiyonu sonucunda oluşan bileşik 540 nm dalga boyundaki ışığı absorbe etmektedir. Reaksiyon öncesinde sarı olan renk turuncu-kırmızıya dönüşmektedir. Oluşan renk yoğunluğu ortamdaki indirgen şeker konsantrasyonu ile orantılıdır. 3,5 Dinitrosalisilik asit İndirgen şeker 3-amino,5-nitrosalisilik asit Şeker asidi (Sarı) (turuncu-kırmızı) Reaksiyon öncesinde sarı olan renk turuncu-kırmızıya dönüşmektedir. Oluşan renk yoğunluğu ortamdaki indirgen şeker konsantrasyonu ile orantılıdır. DENEYİN YAPILIŞI Kullanılan çözeltiler DNS (3,5-dinitrosalisilik asit): 10 g NaOH, 10 g DNS (Sigma D-1510) destile suda çözündürülüp litreye tamamlanır. Bu çözeltinin 100 ml sine kullanılmadan önce 1 ml % 10 luk sodyum sülfit ilave edilir. Rochelle tuzu çözeltisi: 400 g sodyum potasyum tartarat (Merck) 1 L destile suda çözündürülerek hazırlanır. 18
İşlem Bir tüp içinde bulunan ve yeterli oranda seyreltilmiş 1 ml örnek üzerine 2 ml DNS ilave edilerek 90 o C deki su banyosunda 15 dakika bekletilir. (Not: örneğin seyreltilmesi işlemi maksimum absorbans değeri 0.9 olacak şekilde yapılmalıdır. Eğer hazırlanan örnek absorbansı bu değerden daha yüksek ise dilüsyon oranı arttırılmalıdır). Sonra 1 ml Rochelle tuzu çözeltisi ilave edilip vorteks ile karıştırılır. Tüpler oda sıcaklığına soğutulduktan sonra 5 ml saf su ilave edilip vortekslenir Spektrofotometrede 540 nm dalga boyunda absorbans değeri, tanığa karşı okunur. Kör (tanık) deneme: örneğe uygulanan işlemlerin tümü örnek yerine aynı miktarda saf su kullanılarak yapılır. Standart eğri hazırlanması: 0-1 g/l konsantrasyonlarda glukoz çözeltileri hazırlanır. Yukarıda açıklandığı şekilde analiz yapılarak spektrofotometrede 540 nm de okunan değerler ile standart eğri oluşturulur. Eğrinin denklemi belirlenerek örnek konsantrasyonlarının hesaplanmasında kullanılır. Glikoz kons (g/l) (x-ekseni) Absobans (540 nm) (y-ekseni) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Meyve suyunda indirgen şeker konsantrasyonunun belirlenmesi: Örnek işlem sonunda maksimum absorbansı 0.9 olacak şekilde seyreltilir. Okunan absorbans değerinden standart eğri yardımı ile örnekteki indirgen şeker konsantrasyonu belirlenir. Bulunan değer seyreltme faktörü ile çarpılarak örnekteki indirgen şeker miktarı bulunur. KAYNAKLAR 19
1. Hışıl, Y., 2008, Enstrümental Gıda Analizleri, Güncellenmiş Genişletilmiş 5. Baskı, Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Ders Kitapları Yayın No: 48, Bornova, İzmir 2. Yetim H., Çam M. 2009. Enstrümental Gıda Analizleri. Erciyes Üniversitesi Yayınları. No:175, Kayseri. 3. http://chemlab.truman.edu/chemlab_backup/pchemlabs/chem324labs 4. Atago- POLAX 2I polarimetre- el kitabı. 5. Avcı, A. 2010. Bazı Thermoanaerobacter suşları ile siklodekstrin glikoziltransferaz (SGTaz) enzimi üretimi, karakterizasyonu ve siklodekstrin üretiminin optimizasyonu. Dokora Tezi. Ankara, 2010. 20
Adı Soyadı: 5 puan No: ENSTRÜMANTAL ANALİZ DERSİ UYGULAMASI DENEY RAPORU (ŞABLON) Tarih: 5 puan Deney No: 5 puan Deneyin adı: Uygulamada yapılan deneyin adı (örn. Lane Eynon yöntemi ile balda indirgen şeker tayini) 5 puan Deneyin amacı: Birkaç cümle ile ne amaçla deneyin yapıldığını anlatılmalı 15 puan Deneyin ilkesi: Deneyde kullanılan yöntemin hangi prensibe dayandığı birkaç cümle ile özetlenmeli 15 puan Deney sonuçları: Deney ile elde edilen bütün değerler yazılmalı, hesaplamalar ayrıntılı olarak gösterilmeli ve sonuçlar verilmeli. Sonuçların birimleri asla unutulmamalı. 30 puan Tartışma: Elde edilen sonuçların yorumlanması. Standartlar varsa karşılaştırılmalı. Deney sırasında sonucu etkileyen herhangi bir hata olmuşsa bunlar da tartışılmalı. 20 puan 21
Rapor yazımında dikkat edilmesi gereken noktalar Raporlar tek sayfaya yazılmalı. Eğer ikinci bir sayfa kullanımı gerekirse sayfanın arkası kullanılabilir. Kapak sayfası hazırlanmamalı. Raporlar uygulamanın yapıldığı tarihten sonra en geç 15 gün içerisinde teslim edilmeli. Bu tarihlerden sonra gelen raporlar kabul edilmeyecektir. Birbirinin aynı olan raporlar değerlendirilmeyecektir. Raporlar bilgisayar ile (MS Word) veya el ile hazırlanabilir. 22