Echinops orientalis Trautv. BİTKİSİNDEKİ SEKNDER METABLİTLERİN İZLASYNU, YAPI TAYİNİ, ANTİKSİDAN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ Sakine YILMAZ Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Doç. Dr. Ramazan ERENLER 2012 Her hakkı saklıdır
GAZİSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ Echinops orientalis Trautv. BİTKİSİNDEKİ SEKNDER METABLİTLERİN İZLASYNU, YAPI TAYİNİ, ANTİKSİDAN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ Sakine YILMAZ TKAT 2012 Her hakkı saklıdır
TEZ BEYANI Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan beyan ederim. Sakine YILMAZ
ÖZET Yüksek Lisans Tezi Echinops orientalis Trautv. BİTKİSİNDEKİ SEKNDER METABLİTLERİN İZLASYNU, YAPI TAYİNİ, ANTİKSİDAN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ Sakine YILMAZ Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Ramazan ERENLER Bu çalışmada, Echinops rientalis Trautv. bitkisindeki sekonder metabolitler izole edildi, yapıları aydınlatıldı ve elde edilen sekonder metabolitlerin antioksidan aktiviteleri incelendi. Bitki, Gaziosmanpaşa Üniversitesi kampüsünden 2010 yılında toplandı ve gölgede kurutuldu. Kurutulan bitkinin yaprakları ve tohumları ayrı ayrı metanol-kloroform (2:1) çözücü sistemi ile ekstrakte edildi. Elde edilen ekstraktlar kolon kromatografisi ile apolar çözücü sistemden polar çözücü sistemine doğru fraksiyonlara ayrıldı. Sekonder metabolitleri ayırma işlemi kolon kromatografisi ile yapıldı. Echinops rientalis Trautv. bitkisinin yaprak kısmından iki ve tohum kısmından iki olmak üzere dört bileşik izole edildi. İzole edilen bileşiklerin yapıları; tek boyutlu NMR ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, APT, DEPT-90, DEPT-135), iki boyutlu NMR (HETCR, HMBC) ve LC/MS-TF analiz teknikleri ile aydınlatıldı. Ayrıca saflaştırılan bileşiklere ve bitki ekstraktlarına antioksidant aktivite testleri uygulandı. İzole edilen tüm bileşiklerin antioksidan aktiviteleri Folin-Ciocalteu ayıracı ile toplam fenolik madde içeriği, DPPH serbest radikali giderme aktivitesi, ABTS katyon radikali giderme aktivitesi ve indirgeme kapasitesini içeren çeşitli metotlarla test edildi. Elde edilen sonuçlar, BHT, BHA ve trolox standart maddeleriyle mukayese edildi. İzole edilen flavonların katyon radikali giderme aktiviteleri oldukça yüksek gözlendi. 2012, 66 sayfa Anahtar kelimeler: Echinops rientalis Trautv., Sekonder metabolit, NMR, Antioksidan aktivite i
ABSTRACT M.Sc. Thesis ISLATIN AND IDENTIFICATIN F THE SECNDARY METABLITES FRM THE Echinops orientalis Trautv. PLANT, INVESTIGATIN F ANTIXIDANT ACTIVITIES Sakine YILMAZ Gaziosmanpasa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ramazan ERENLER In this study, the secondary metabolites from the Echinops orientalis Trautv. plant were isolated and identified and antioxidant properties of the obtained secondary metabolites were investigated. The plant had been collected from Gaziosmanpaşa University campus in 2010 and was dried in shadow. The dried leaves and seeds were extracted separately with methanol-chlorofom (2:1). Crude extracts of leaves and seeds parts were separated into its fractions by using column chromatography from nonpolar solvent to polar solvent systems. The separation processes of secondary metabolites were carried out by using the column chromatography. Four secondary metabolite compounds from the leaves and seeds of Echinops rientalis Trautv. plant were isolated. Two compounds were isolated from the leaves and two compouns from the seeds. Structure of isolated compounds were determinated by one dimensional NMR ( 1 H-NMR, 13 C- NMR, APT, DEPT-90, DEPT-135), two dimensional NMR (HETCR, HMBC) and LC/MS-TF analysis techniques. Also isolated compounds and plant extracts were applied to antioxidant activity tests. The antioxidant activities of all isolated compounds were tested with the various methods including total phenolic compound contents by Folin-Ciocalteu reagent (FCR), DPPH free radical scavenging activity, ABTS cation radical scavenging activity, and reducing power. The obtained results were compared by using BHT, BHA and trolox as standards. The isolated flavones exhibit the hight cation radical scavenging activities. 2012, 66 pages Keywords: Echinops rientalis Trautv., Secondary metabolite, NMR, Antioxidant activity ii
ÖNSÖZ Çalıştığım süre boyunca çalışmamın planlanması ve yürütülmesinde bilgisi ve tecrübesinden yararlanmamı sağlayan, sorularımı sabır ve güler yüzle cevaplayan, ufkumu genişleten, her türlü maddi ve manevi desteğini esirgemeyen danışman hocam Sayın Doç. Dr. Ramazan ERENLER e, İzole edilen moleküllerin yapılarının aydınlatılmasında ve LC/MS-TF analizlerinin yapılmasındaki katkılarından dolayı Çankırı Karatekin Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Başkanı Prof.Dr. İbrahim Demirtaş a Laboratuar çalışmalarımızda yardımcı olan başta Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ olmak üzere Uzman Özkan ŞEN e, Uzman Hüseyin AKŞİT e ve Kimya Bölümü hocalarıma, Antioksidan aktivitelerinin ölçülmesinde emeği geçen Uzman Nusret GENÇ e ve bitkinin adlandırılmasında yardımcı olan Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. Aşkın AKPULAT a Yüksek lisans çalışmalarım süresince her zaman yanımda olan ve desteğini esirgemeyen arkadaşım Ayşe DEMİR e teşekkürü borç bilirim. Sadece yüksek lisans tezim süresince değil hayatımın her anında bana verdikleri destek ve güvenle kendimi iyi hissetmemi sağlayan, hep daha iyisini yapabileceğime inandıran aileme ve nişanlım Ali KARAİPEKLİ ye sonsuz teşekkür ederim. Sakine YILMAZ Haziran 2012 iii
İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ... iii İÇİNDEKİLER... iv SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ.....vi ŞEKİLLER DİZİNİ....vii ÇİZELGELER DİZİNİ.... ix 1. GİRİŞ... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ... 3 2.1. Bitkilerin Tedavi Amaçlı Kullanılması... 3 2.2. Bitkilerde Bulunan Primer ve Sekonder Metabolitler... 4 2.2.1. Flavonoidler... 5 2.2.2. Terpenler... 7 2.2.3. Steroidler... 8 2.2.4. Fenoller... 10 2.2.5. Bitkilerdeki Fenolikler... 10 2.3. Bitkinin Familyası ve Tanıtımı... 11 2.3.1. Asteraceae (Papatyagiller)... 11 2.3.2. Echinops orientalis Trautv. Cinsinin Genel Özellikleri... 12 2.4. Echinops Türleri Alanında Yapılan Çalışmalar... 14 2.5. Serbest Radikaller ve Genel Özellikleri... 16 2.6. Antioksidanlar... 18 3. MATERYAL VE METT... 20 3.1. Bitkisel Materyal... 20 3.1.1. Bitkinin Toplanması ve Tür Teşhisi... 20 3.1.2. Bitkinin Kurutulması ve Depolanması... 20 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler... 20 3.3. Kullanılan Cihazlar... 20 3.4. Metot... 21 iv
3.4.1. Echinops orientalis Trautv. Bitkisinin Yaprak ve Tohum Kısmının Özütlenme (Ekstraksiyonu) İşlemi... 21 3.4.2. Bitki Özütlerini Ayırma ve Saflaştırma İşlemi... 21 3.4.3. Kolon Kromatografisi... 21 3.4.4. İnce Tabaka Kromatografisi (İTK)... 23 3.5. İzole Edilen Bileşenlerin Yapılarının Tayinleri İçin Uygulanan Analizler... 24 3.5.1. ¹H-NMR ve ¹³C-NMR Analizleri... 24 3.6. Antioksidan Aktivite Testleri... 24 3.6.1. Serbest Radikal (DPPH ) Giderme Aktivitesi... 25 3.6.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi... 26 3.6.3. ABTS Katyon Radikali Giderme Aktivitesi... 27 3.6.4. Total Fenolik Bileşik Miktarı Tayini... 27 4. BULGULAR VE TARTIŞMA... 29 4.1. İzole Edilen Bileşiklerin Yapı Analizi... 29 4.1.1. Metil-1H-indol-1-karboksilatın (34-38.fr) Yapı Tayini... 29 4.1.2. Steroid Bileşiğinin (42.fr) Yapı Tayini... 33 4.1.3. Flavon (Apigenin-7--[6 " -(p-kumaroil)- -D-glukozit]) (128-136.fr) Yapı Tayini... 38 4.1.4. Flavon (Apigenin-7--glikozit) (156-158.fr) Yapı Tayini... 48 4.2. Antioksidan Aktivite Çalışmaları.....54 4.2.1. İndirgenme Gücü Aktivitesi.....55 4.2.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme... 56 4.2.3. ABTS Katyon Radikali Giderme Aktivitesi Tayini Bulguları... 57 4.2.4. Toplam Fenolik Bileşik Miktarı Tayini Bulguları... 59 5. TARTIŞMA ve SNUÇ... 62 KAYNAKLAR... 63 ÖZGEÇMİŞ... 66 v
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama d dd ddd J s brs t Dublet Dubletin dubleti Dubletin dubletin dubleti Etkileşme Sabiti Singlet Geniş singlet Triplet Kısaltmalar Açıklama ABTS APT BHA BHT DEPT CSY DPPH İTK NMR TCA UV-VIS HETCR LC/MS -TF TCA FCR GAE 2,2-azino-bis-3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid Attached Proton Test Bütillenmiş Hidroksi Anisol Bütillenmiş Hidroksi Toluen Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Correlated Spectroscopy 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil İnce Tabaka Kromatografi Nükleer Manyetik Rezonans Trikloroasetik asit Ultraviyole-Görünür Bölge Heteronuclear Corralation Liquid Chromatography Mass Spectrometry Time-of-Flight Trikloroasetik asit Folin-Ciocalteu reaktifi Gallik Asite Eşdeğer vi
ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. Kromon (benzo-γ-piron, (a)) ve 2-fenil benzopiron (b)....5 Şekil 2.2. Bazı flavonoid bileşiklerin iskelet yapıları....6 Şekil 2.3. İzopren birimleri....7 Şekil 2.4. Steroid iskeleti....8 Şekil 2.5. β-sterol (17) ve Ergosterol (18)....9 Şekil 2.6. Sterol iskeleti... 10 Şekil 2.7. Fenolik bileşiklerin sınıflandırılması... 11 Şekil 2.8. Papatyagiller familyasından 12 alt tür... 12 Şekil 2.9. Echinops orientalis Trautv. bitkisi... 13 vii Sayfa Şekil 2.10. Echinops ritro L. bitki türünden izole edilen seskitrepen bileşiklerin yapısı... 14 Şekil 2.11. Echinopines A ve B bileşiklerinin yapısı... 15 Şekil 2.12. Echinops latifolius bitkisinden izole edilen tiyofenlerin yapıları... 15 Şekil 2.13. Antioksidanların sınıflandırılması... 19 Şekil 3.1. Kolon kromatografisinden elde edilen fraksiyonların İTK görünümü... 24 Şekil 3.2. Fenol (a), DPPH radikal formu (b), Fenoksi radikali (c), DPPH nötr formu (d)... 25 Şekil 3.3. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ilk reaksiyon... 26 Şekil 3.4. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ikinci reaksiyon... 26 Şekil 4.1. Echinops orientalis Trautv. dan izole edilen metil-1h-indol-1-karboksilat molekülü... 29 Şekil 4.2. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın 400 MHz 1 H-NMR spektrumu... 30 Şekil 4.3. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın 13 C, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları... 31 Şekil 4.4. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın HETCR NMR spektrumu... 32 Şekil 4.5. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın LC/MS-TF spektrumu... 33 Şekil 4.6. Echinops orientalis Trautv. dan izole edilen steroid bileşiği... 34 Şekil 4.7. Steroid bileşiğinin 400 MHz 1 H-NMR spektrumu... 34 Şekil 4.8. Steroid bileşiğinin APT, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları... 35 Şekil 4.9. Steroid bileşiğinin HETCR NMR spektrumu... 37 Şekil 4.10. Steroid bileşiğinin LC/MS-TF spektrumu... 38
Şekil 4.11. Echinops orientalis Trautv. dan izole edilen flavon (Apigenin-7--[6"-(pkumaroil)- -D-glukozit]) (128-136.fr)... 39 Şekil 4.12. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un 1 H-NMR spektrumu... 40 Şekil 4.13. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un 13 C-NMR spektrumu... 41 Şekil 4.14. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un DEPT-90, APT ve DEPT-135 spektrumları... 42 Şekil 4.15. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un HETCR NMR Spektrumu... 45 Şekil 4.16. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un HMBC NMR spektrumu... 46 Şekil 4.17. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un Coesy 90 NMR spektrumu... 47 Şekil 4.18. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un LC/MS-TF spektrumu... 47 Şekil 4.19. Echinops orientalis Trautv. den izole edilen flavon(apigenin-7--glikozit) molekülü... 48 Şekil 4.20. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un 400 MHz 1 H-NMR spektrumu... 49 Şekil 4.21. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un 400 MHz 13 C-NMR spektrumu... 50 Şekil 4.22. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un DEPT-90, APT ve DEPT-135 spektrumları... 51 Şekil 4.23. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un HETCR NMR spektrumu... 54 Şekil 4.24. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un LC/MS-TF spektrumu... 54 Şekil 4.25. Echinops orientalis Trautv. bitkisinin tohum, yaprak ve gövde kısımlarının ham ekstreleri ve kolon kromatografisi ile elde edilen fraksiyonların Fe +3 ü Fe +2 ye indirgeme kapasitesi.....55 Şekil 4.26. Echinops orientalis Trautv. bitki ekstraktlarının ve kolon kromatografisi ile elde edilen fraksiyonların DPPH radikali giderme aktivite % si... 57 Şekil 4.27. Echinops orientalis Trautv. bitki ekstrelerinin ve kolon kromatografisi ile elde edilen fraksiyonların serbest katyon radikali giderme aktivitelerinin birer standart antioksidan olan BHA, BHT ve trolox ile karşılaştırması... 59 Şekil 4.28. Standart bir fenolik bileşik olan ve aynı zamanda kuvvetli antioksidan olan gallik asitin açık yapısı... 59 Şekil 4.29. Toplam fenolik bileşik miktarı tayini için hazırlanan standart grafik... 60 Şekil 4.30. Echinops orientalis Trautv. bitkisinin tohum, yaprak ve gövde kısımlarından elde edilen metanol ekstrelerinin kg başına bulunan toplam fenolik bileşik miktarı... 61 viii
ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Terpenlerin sınıflandırılması... 8 Çizelge 2.2. En sık karşılaşılan serbest radikaller ve serbest radikal üreten türlerin bazı özellikleri... 17 Çizelge 3.1. Bitkinin yaprak kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri... 22 Çizelge 3.2. Bitkinin tohum kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri... 23 Çizelge 4.1. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın 1 H-NMR ve 13 C-NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 )... 31 Çizelge 4.2. Steroid bileşiğinin 1 H-NMR ve 13 C-NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 )... 36 Çizelge 4.3. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un 1 H-NMR ve 13 C NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 )... 43 Çizelge 4.4. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un 1 H-NMR ve 13 C-NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 )... 52 ix
1 1. GİRİŞ Bitkilerin ilaç, yiyecek ve kozmetik amaçlı kullanımı insanın varlığıyla başlamış günümüze kadar süregelmiştir. Hastalıkların varlığı ve bunların tedavi edilmesi amacıyla bu geçen zaman içerisinde bitkilerin kullanımı, her bir bitkiye ait özellikler keşfedilerek geliştirilmiştir. Dünya üzerinde 750.000 ile 1.000.000 arasında bitki türü olduğu tahmin edilmekte ve bunların 500 bin kadarı tanımlanmış olup her yıl 2000 kadar yeni bitkinin tanımlanması yapılmaktadır. Günümüzde 20000 den fazla bitki alternatif tedavi amaçlı kullanılmaktadır. Bu nedenle hastalıklara karşı ilaç veya etken madde keşfi için tıbbi bitkilere ve bu bitkilerden çeşitli maddelerin izole edilerek insanlığın hizmetine sunma çalışmaları da son derece önem kazanmıştır (Çalışkan, 2006). Modern bilimlerin gelişmesiyle birlikte biyoloji, farmakoloji, kimya, toksikoloji gibi birimlerin disiplinler arası çalışmalarıyla, şifalı bitki olarak kullanılan birçok bitkinin, yapısında bulunan doğal bileşiklerin, kimyasal yapıları aydınlatılmakta ve izole edilen bileşiklerin biyolojik aktiviteleri saptanabilmektedir (Dülger ve ark., 1999; Tadeg ve ark., 2005). Bitkiler üzerinde yapılan araştırmalarda bitkilerin, ekosistemle olan ilişkisinde, savunma, korunma, ortama uyum, hayatta kalma ve nesillerini devam ettirme gibi önemli olaylarda çeşitli avantajlar sağlayan, sekonder metabolit olarak tanımlanan oldukça karmaşık mekanizmaların ürünleri olan kimyasal maddeler içerdikleri saptanmıştır (Bourgaud ve ark., 2001). Bugüne kadar yaklaşık 100.000 sekonder metabolit bitkilerden izole edilerek tanımlanmıştır ve her yıl bu sayıya 4.000 kadar yeni bileşik eklenmektedir (Verpoorte, 1999). Bunlar arasında bitkiyi, patojenlere karşı koruyan antibakteriyel, antifungal, antiviral maddeler (fitoaleksinler), çimlenmeyi önleyici maddeler, doğal yaşamda rekabet gücünü (allelopati) artıran ve toksik maddeler; UV ışınlar, tuzluluk, kuraklık gibi zararlı çevresel etmenlerin neden olduğu stres koşullarında direnç arttırıcı metabolitler; zararlı hayvanlar ve otlara karşı korunmayı sağlayan insektisit, herbisitler; tozlaşma ve tohum dağılımını sağlamak üzere hayvanları cezbedecek renkli ve güzel
2 kokulu metabolitler bulunmaktadır (Charwood, 1990). Bitkilerin yapılarında bulunan sekonder metabolitlerin çoğu bir bitki cinsine ve hatta bazen tek bir bitki türüne özgüdür, diğer bitkiler tarafından üretilmezler (Ramachandra, 2002; Gül, 2011). Çok büyük yapısal çeşitliliğe sahip olan sekonder metabolitler, bitkide sekonder metabolizma yollarının ara ürünlerinden, özel yollarla üretilmektedirler. Sekonder metabolitler üzerinde yapılan araştırmalarda bu bileşiklerin bitkiler tarafından çok az miktarlarda üretildiğide belirlenmiştir. Buna karşılık doğal gıda ve ilaç ham maddeleri (farmasötikler, gıda katkı maddeleri, tatlandırıcılar, boyalar, koku vericiler, yapıştırıcılar, insektisitler, pestisitler vb.) bulmak üzere bu metabolitler üzerinde yapılan araştırmalar gün geçtikçe artmakta ve bunun sonucunda da ekonomik olarak önem kazanmaktadırlar (Başer, 1990; Baytop, 1999;Ahıskalıoğlu, 2007). Yapılan bu çalışmanın amacı; Echinops orientalis Trautv. bitkisindeki sekonder metabolitlerin izole edilip, yapıları aydınlatıldıktan sonra aktioksidan aktivite özelliklerini ortaya çıkarmaktır.
2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1. Bitkilerin Tedavi Amaçlı Kullanılması Geleneksel ve tıbbi amaçlı bitkilerin kullanımı olarak adlandırılan etnobotanik hakkındaki yazılı bildiler M.Ö. 3000 li yıllara kadar eski Mısır, Hitit, Grek ve Roma dönemlerinde papirus ve diğer kaynaklardan tespit edilmiştir (Yen ve Chen, 1995). Anadolu da insanlar yontma taş devrinden beri bitkilerden tedavi amaçla yararlanmış olup Anadolu da yaklaşık 200 yıl süren Selçuklu döneminde kullanılan bitkisel droglar ve ilaçlar hakkında özgün araştırmalar bulunmaktadır. Bu alandaki en önemli kaynaklar Dineveri, Ebu Reyhan Buruni, ve İbn Baytar ın eserleridir. Ayrıca 9. yüzyılda Yakup bin İshak El Kindi tarafından yazılan uçucu yağ taşıyan droglar önemli eserlerdendir. smanlılar döneminde tibbi bitkileri konu alan dersler Sultan 2. Mahmut zamanında 1839 yılında Mekteb-i Tibbiye-i Şahane döneminde tıp ve eczacılıkta okutulmaktaydı. Bitkisel, hayvansal veya madensel olan ve eczacılık, kimya ve boya endüstrisinde kullanılan etkin maddeler daha çok drog olarak adlandırılırlar. Bitkisel kökenli droglar çok eski devirlerden beri hastalıklara karşı kullanılırken bitkilerde bulunan etkin bileşikler ve etki mekanizmaları hakkındaki bilgiler XIX. yüzyılın ortasından sonra araştırılmaya başlandı. Bitkilerdeki hastalıkları tedavi edici özellik taşıyan etken maddeler bitkilerin, çiçek, yaprak, tohum, meyve, kök, gövde, kabuk gibi bölümlerinde bulunabilir. Bazı bitkilerin belirli kısımları kullanılırken bazılarının tümünden yararlanılır. Örneğin ıhlamur ve papatyanın sadece çiçekleri kullanılırken nane ve kekiğin tümü kullanılmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (WH) yaklaşık 4 milyar insanın bitkisel tıbbı kullandığını bildirmektedir. Bitkisel ilaçlar daha çok bitki çayı, ham tabletler ve konsantreler olarak kullanılmaktadır. Bitkisel ilaçların kullanımı daha çok uzak doğuda, Hindistan, Çin ve Japonya da yaygın olmakla birlikte Avrupa da bitkisel ilaçları araştırma ve destekleme dernekleri European Societies Cooperation of Phtotherapy (ESCP) birliği mevcuttur. Dünyada son yıllarda bitkisel amaçlı yapılan çalışmaların yayımlandığı bilimsel dergilerin sayısı da hızla artmaktadır (Baytop, 1999; Baytop, 2001; Ahıskalıoğlu, 2007).
4 2.2. Bitkilerde Bulunan Primer ve Sekonder Metabolitler Sekonder ve pirimer metabolitler bitkilerde bulunan doğal bileşiklerdir. Primer metabolitler; lipitler (trigliserit, fosfolipit), karbonhidratlar (nişasta, selüloz vb.), proteinler, mineraller (tuzlar, anyonlar, katyonlar vb.) ve hormonlar gibi yapısal büyüme, gelişme ve çoğalmalar için gerekli olan metabolitlerdir. Sekonder metabolitler ise bitkilerin çevreyle adaptasyonunu sağlamak, koruma, taşınma üreme gibi faaliyetlerden sorumlu olan organik moleküllerdir. Bitkilerde bulunan sekonder metabolitler fitosteroller, terpenler, terpenoidler, alkaloidler, fenolikler ve flavonoidlerdir. Günümüzde birçok sektörde hammadde olarak kullanılan sekonder metabolitler bitkinin temel yaşamsal işlevleriyle doğrudan ilişkisi olmamasına karşılık en az primer metabolitler kadar önemlidir. Önceleri herhangi bir işlevi olmayan atık maddeler olarak kabul edilen sekonder metabolitlerin, bitki bünyesinde önemli roller taşıdığının belirlenmesinden sonra, söz konusu bileşiklere verilen önem gün geçtikçe artmıştır. Bu maddelerin bitkideki önemli görevleri şunlardır; 1. Kuraklık, tuzluluk, UV ışınları vs. gibi değişik çevre faktörlerinin oluşturduğu stres ortamına karşı koyma. 2. Herbivorlara (böcek, sürüngen vb.) karşı savunma. 3. Mikroorganizmalara (bakteri, mantar vb.) karşı savunma. 4. Bazı metabolik ve daha gelişmiş ekolojik işlevler. (örn: Tohum dağılımını sağlamak için hayvanları ve diğer taşıyıcıları cezbettirme gibi) Sekonder metabolitlerin bitki bünyesindeki işlevlerinin oldukça karmaşık olması, araştırıcıların bu bileşikler üzerinde yoğunlaşmasına neden olmuştur. Bu alanda yapılan çalışmalar, hem bu bileşiklerin elde edilme metotlarının geliştirilmesine, hem de etki mekanizmalarının belirlenmesine yönelik olarak sürdürülmektedir. Özellikle sekonder metabolitler içinde yer alan fenolik bileşikler ile tokoferollerin, insan sağlığı üzerindeki olumlu etkilerinin belirlenmesi ile bu yönde yapılan çalışmaların son yıllarda büyük bir
5 önem kazandığı görülmektedir (Bourgaud ve ark., 2001; Sökmen ve Gürel, 2001; Zarate ve ark., 2003). 2.2.1. Flavonoidler Genellikle sarı renkli olmaları nedeniyle, latince sarı anlamına gelen flavus sözcüğünden türetilerek flavonoid adını alan bileşiklerdir. Flavonoid bileşikleri, flavon (2-fenilkromon) un bitkiler aleminde yaygın olarak bulunan türevleridirler. Bunlardan 3-H içerenlere flavonoller, 2,3-çift bağı indirgenmiş olanlara flavanlar, fenil grubu 3- yerinde olanlara izoflavonlar denilmektedir. Genellikle bu bileşikler sarı renkli bitkisel pigmentlerdir. Flavonoid kromon türevi maddelerdir. Kromon; benzo-γ-pirondur (Ayhan, 2008) (Şekil 2.1.). Doğal olarak birçok flavonoid bulunmaktadır. Bu flavonoid, fenil grubunun kromon halkasında bulunan hidroksil gruplarının sayısı ve konumu, ayrıca metil eterlerinin bulunması ile birbirinden ayrılmaktadır. Bitkilerde birçok renkli bileşiği oluşturan bu maddelerin renkleri, hidroksil grubu ve ortamın ph sına bağlı olarak koyu sarı renk içermektedir. 7 6 8 A 5 9 10 1 4 2 3 7 6 8 A 5 9 10 4 2' 1' 2 3 3' B 6' 4' 5' (a) (b) Şekil 2.1. Kromon (benzo-γ-piron, (a)) ve 2-fenil benzopiron (b) Flavonoidler bitkilerin ikincil metabolitleri olup bitkilerin kök, sap, çiçek, polen, meyve ve tohum gibi her bölümünde bulunabilirler. Şekil 2.2. de Bazı flavonoid bileşiklerin iskelet yapıları verilmiştir.
6 H 1 2 3 Flavonlar İzoflavonlar Flavonoller H 4 5 6 Dihidroflavonoller Flavononlar Kalkonlar 7 8 9 Flavanlar Antosiyanidler İzofalvonlar 12 ronlar C H 10 Biflavanoitler 11 Neoflavonoitler 13 Kumaranlar Şekil 2.2. Bazı flavonoid bileşiklerin iskelet yapıları
7 2.2.2. Terpenler Şekil 2.3. de gösterilen izopren iskelet birimleri içeren bütün bileşiklere terpenler adı verilir. Terpenlerin izoprenle ilişkisini belirtmek amacıyla izoprenoidler de denmektedir. Terpenler iki ya da daha çok izopren birimi içerebilirler. Molekülleri açık zincir ya da halkalı olabilir. Çift bağlar, hidroksil grupları, karbonil grupları ve daha başka işlevsel grup içerebilirler. C ve H den başka elementleri içeren bileşiklere de terpenoid denir. Terpenoidler, bitkiler ve hayvanlarda bulunan doğal bileşiklerin en önemli ve en geniş sınıflarından birisidir. Bitkilerde serbest halde bulunabildikleri gibi, glikozitleri, organik asit esterleri ve bir kısmı da proteinlerle birlikte bulunur. H 2 C CH 3 C C H CH 2 veya 14 izopren 15 Şekil 2.3. İzopren birimleri Terpenler izopren birimlerinin sayısına göre sınıflandırılır. Terpenler fiziksel özelliklerine göre iki grupta incelenirler. 1) Uçucu terpenler: Su buharı destilasyonu ile sürüklenebilen küçük moleküllü monoterpenler ve seskiterpenlerdir. 2) Uçucu olmayan terpenler: Büyük moleküllü seskiterpenler, diterpenler, triterpenler ve politerpenlerdir. Terpenler uygun kromatografik yöntemlerle saflaştırılırlar. Saflaştırmada genellikle kolon ve preperatif ince tabaka kromatografisi yöntemleri kullanılabildiği gibi pek çok kromatografik yöntemlerde kullanılabilir (Boiteu ve ark., 1964).
8 Çizelge 2.1. Terpenlerin sınıflandırılması İzoprensayısı Sınıfı Karbon sayısı 1 Hemiterpenler 5 2 Monoterpenler 10 3 Seskiterpenler 15 4 Diterpenler 20 5 Seskiterpenler 25 6 Triterpenler 30 8 Tetraterpenler (Karotenoidler) 40 N Politerpenler (5)n Diterpenler, dört izopren ünitesinden oluşan 20 karbonlu moleküllerdir. Diterpenler, steroidlerden ve triterpenlerden daha kolay oksitlenir. Bu nedenle diterpenler de kimyasal reaksiyonlarda farklılıklar gözlenir (Akşit, 2008). 2.2.3. Steroidler Steroid, birbiriyle kaynaşmış dört halkadan oluşmuş karbon iskeletli bir lipittir. Steroitler asetil KoA biosentez yolundan oluşurlar. Farklı steroidler bu halkalara bağlı olan fonksiyonel gruplar bakımından birbirlerinden ayrılırlar. 16 Şekil 2.4. Steroid iskeleti
9 Bitkiler, hayvanlar ve mantarlarda yüzlerce çeşit steroid tanımlanmıştır. Steroitlerin canlılarda genel olarak en önemli işlevi hormon olmalarıdır. Steroid hormonlar, steroid hormon reseptör proteinlere bağlanarak fizyolojik etkilerini gösterirler. Bu reseptörlere bağlanınca gen transkripsiyonu ve hücre fonksiyonunda değişimlere neden olurlar (Berg ve ark., 2002; Bakla, 2010). Fitosteroller Bitkilerde bulunan steroidler fitosterollerdir. Fitosteroller bir grup steroid alkoldür. Beyaz renklidirler, karakteristik kokuları vardır, suda çözünmezler, alkollerde çözünürler. Gıda katkı maddesi olarak, ayrıca tıp ve kozmetiklerde de kullanılırlar. Şekil 2.5. de başlıca fitosteroller gösterilmiştir. 17 18 Şekil 2.5. β-sterol (17) ve Ergosterol (18) Şekil 2.6. da gösterilen karbon 24 2 olmazsa kampesterol elde edilir. Karbon 24 1 ve 24 2 çıkartılırsa kolesterol ortaya çıkar. Karbon 22 ve 23 ten hidrojenler alınırsa stigmasterol (stigma-5,22-dien-3β-ol) elde edilir. Karbon 24 2 ve Karbon 22 ve 23 ten hidrojenler alınırsa brasikasterol (ergosta-5,22-dien-3β-ol) elde edilir. Brakikasterolden karbon 7 ve 8 deki hidrojenler alınırsa ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) elde edilir. Bitkilerde çeşitli fitosteroller vardır ve hücre zarında yapısal bir rol oynarlar. Bu rol memeli hücrelerinde kolesterolünkine denktir. Toprak bitkilerinde bulunması, tek hücreli yosunlarda ise ender bulunmasından dolayı bir numunede toprak kökenli organik maddelerin varlığının bir işareti olarak kullanılırlar. Bu steroller genelde suda çözünmedikleri için süspansiyondaki ve çökeltideki katı parçacıklarının üzerine çökelirler. Taneciklerin yüzey alanı daha büyük olduğu için çamurda kuma kıyasla daha
10 fazla fitosterol bulunur. Bu etkinin üstesinden gelmek için organik maddenin kaynağını belirtmek adına her bir sterolün toplam sterole veya kolesterole oranı belirtilir. 19 Şekil 2.6. Sterol iskeleti Fitosteroller gıda muhtevası veya katkı maddesi olarak bağırsaklarda kolesterol emilmesini azalttıklarından kolestrerol azaltıcı etkiye sahiptirler(stlund ve ark., 2003). Fitosteroller bitkisel yağlarda özellikle iğdegillerin yağında, mısır yağı ve soya yağında bulunurlar. Bitki yağından elde edilen bir fitosterol kompleksi olan kampesterol, stigmasterol ve brassikasterol karışımıdır, kolestatin olarak adlandırılır ve bir gıda katkı maddesi olarak satılır. Fitosteroller insanlarda kolesterolu 15 oranında azaltabilirler (Bakla, 2010). 2.2.4. Fenoller Fenolik bileşikler bir aromatik halkaya direk olarak bağlı bir veya daha fazla hidroksil grubu içeren bileşiklerdir. Fenoller birçok yönden bir karbon zincirine bağlı hidroksil grubu içeren alifatik yapılı alkollere benzerdir. Ancak fenoksi anyonu kararlı olduğu için, fenoller alifatik alkollere göre daha asidik özelliktedirler. 2.2.5. Bitkilerdeki Fenolikler Fenolik bileşikler bitki aleminde yaygın bir şekilde dağılım göstermektedir. Bitki dokuları kg başına birkaç grama kadar fenolik bileşik içermektedir. UV ışınları, mikrobiyal enfeksiyonlar ve strese sebep olan kimyasallar gibi dış etkiler onların
11 sentezini uyarmaktadır. Fenolik bileşiklerin bazı meyveler ile onlardan elde edilen içeceklerde ve tıbbi bitkilerde fazla miktarlarda bulundukları bilinmektedir (Haslam, 1996; Tanaka, 1999). Şekil 2.7. de bitkilerde bulunan fenolik bileşiklerin sınıflandırılması gösterilmiştir. Fenolikler Polifenoller Basit Fenoller Tanninler Flavonoidler Fenolik asitler Diğerleri Gallik asit ve Kateşin/Epikateşin Polimerleri Flavon Kalkon Flavonol Flavonon Hidroksi Sinnamik ve Hidroksi Benzoik asitler Kumarinler Stilbenler Lignanlar İsoflavonon Antosiyanidin Şekil 2.7. Fenolik bileşiklerin sınıflandırılması (Gül, 2011) 2.3. Bitkinin Familyası ve Tanıtımı 2.3.1. Asteraceae (Papatyagiller) Asteraceae, çiçekli bitkilerin en büyük familyası olarak bilinir. İki çenekliler sınıfından olup genellikle otsu, çok azı çalı, ağaç ve lian şeklindedirler (odunsu sarılıcı bitkiler). Familyanın ismi yıldız şeklinde çiçekleri bulunan bir cins olan Aster türünden gelmektedir. Bu bitkilerin çiçek durumunun kompozit yapısı, taksonomistlerin bu familyayı Compositae olarak anmasına yol açmıştır. Yapraklar basit veya bileşik, stipulsuz, alternat, rozet şeklindedir. Çiçekler baş veya kapitulum durumlarındadır.
12 Şekil 2.8. Papatyagiller familyasından 12 alt tür Dünyada 1100 cins ve 25000 civarında türle temsil edilen kozmopolit bir familyadır. Türkiye'de 133 cins ve bunlara ait 1156 dan fazla türü bulunmaktadır (Simpson, 2006). 2.3.2. Echinops orientalis Trautv. Cinsinin Genel Özellikleri Echinops orientalis Trautv. papatyagiller familyasındandır(şekil 2.9.). Bitki halk arasında Topuz, Topuzbaşı, Dikenbaşı, Gökdiken, Serteş, Kirpidikeni, Kirpibaşı, Eşek dikeni olarak bilinir. Echinops, Yunancada kirpi görünüşlü demek olan echinos sözcüğünden gelir. 80-120 cm boylarında, beyazımsı dik ve dalsız gövdeli; tabanda 20 cm ye ulaşan uzunlukta, yukarıda küçülen, ait yüzleri gümüşi, üstleri koyu yeşil, yüreksi, almaşık dizilişli, dişli ve kıvrık kenarlı, parçalı yaprakları olan; temmuz-eylül aylarında uzun bir sapın ucunda, çelik mavisi, 3 cm çapında kömeç şeklinde tek çiçekler açan, iki, ya da çok yıllık, dikenli, otsu bir bitkidir. Kanatlı meyveleri zehirli (toksik) diye bilinir. Çiçekler dikenli olmalarına rağmen hoş görünüşünden dolayı kesme ve kuru çiçekçiliğe de uygundur. Ayrıca bu devedikeni kadar sert dikenli de değildir. Eğer bütün çiçekler açılır ve kesilirse yaz içinde yeni bir çiçeklenme yaşayabilir. Bitkinin toprak üstü kısımları kışın yok olur. 1500 metreye kadar bol güneşli, kurak ve taşlık alanlarda bulunur. Echinops orientalis Trautv.Türkiye de başlıca Amasya, Tokat, Ankara, Giresun, Kars, Kahramanmaraş, Erzincan, Bitlis, Adana, Hatay illerinde yetişmektedir.
13 Şekil 2.9. Echinops orientalis Trautv. bitkisi Sistematik Latince Adı Alem Bölüm Sınıf Altsınıf Takım Familya Cins Tür : Echinops orientalis Trautv. : Plantae : Kapalı Tohumlu : Çift Çenekli : Asteridae : Asterales : Asteraceae : Echinops : Echinops orientalis Trautv. Genel Takson Bilgisi Ömür : Çok veya İki yıllık Yapı : ot Çiçeklenme : 6-8 Habitat : stepte, taşlık ve şali yamaçlar, kireçtaşı kayalığı, mağmatik kayalık, nadas tarla, Quercus Yükseklik : 0-1980 Endemik : Endemik değil Element : İran-Turan Türkiye dağılımı : G. ve Karasal Anadolu Genel Dağılımı : Transkafkasya, KB. ve K. İran, Horasan (Davis, 1975).
14 2.4. Echinops Türleri Alanında Yapılan Çalışmalar Chaudhuri (1992) tarafından Echinops echinatus üzerinde yapılan çalışmada glikozitler, alkaloidler, triterpenoidler, etil palmitat bileşikleri izole edildi. Ayrıca yapraklarından da alkaloid,7-hydroxy-3-(2-hydroxyethyl)-(3h)-quinazolin-4-one(1) molekülü elde edildi. Li ve ark., (2010) Echinops ritro L. türü üzerinde yaptıkları çalışamalarda üç tanesi yeni olmak üzere toplam onbir tane seskiterpen yapısındaki bileşikleri izole ettiler. İzole edilen yeni bileşikler: (3α,4α,6α)-3,13-dihydroxyguaia-7(11),10(14)-dieno-12,6-lactone (20), (3α,4α,6α,11β)-3-hydroxyguai-1(10)-eno-12,6-lactone (21), (11α)-11,13- dihydroarglanilic acid methyl ester (22) dir (Şekil 2.10.). H HH 2 C H H H CH 2 H H H H H CMe H H 20 21 22 23 H H H H H H H H H H H H 24 25 26 27 H H H 28 H 29 30 Şekil 2.10. Echinops ritro L. bitki türünden izole edilen seskiterpen bileşiklerin yapısı Dong ve ark., (2007) yaptıkları çalışmada Echinops spinosus bitkisinin köklerinden echinopane olarak adlandırılan iskelete sahip iki yeni seskiterpen olan Echinopines A ve B bileşiklerini izole ettiler (Şekil 2.11.).
15 H 5 6 H 15 H 1 7 13 14 10 9 8 4 2 3 31 R=H 32 R=CH 3 11 12 R R 33 R=H 34 R=CH 3 Şekil 2.11. Echinopines A ve B bileşiklerinin yapısı Wang ve ark., (2006) Echinops latifolius türünün köklerinin etanol ekstraksiyonu ile altı tiyofen bileşiği elde ettiler (Şekil 2.12.). Elde edilen bileşiklerin yapılarını spectral verilere dayanarak belirlediler. İzole edilen tiyofen bileşikleri içerisinde 5-(3- hydroxmethyl-3-isovaleroyloxyprop-1-ynyl)-2,20-bithiophene (40) bileşiğinin yeni bir bileşik olduğunu ve 5-(3-hydroxy-4-isovaleroyloxybut-1-ynyl)-2,20-bithiophene (39) bileşiğinin ise bu bitkiden ilk kez izole edildiğini belirlediler. S S C C C CH 2 H S S 35 36 S C C C S C S S S S S C 38 C 37 S S C C H S S C C H 39 40 Şekil 2.12. Echinops latifolius bitkisinden izole edilen tiyofenlerin yapıları
16 Singh ve ark., (1988) yaptıkları çalışmada Echinops echinatus Roxb. bitkisinden dört fenolik bileşik (apigenin, apigenin-7--glucoside, echinacin, ve echinaticin) izole ettiler. Son iki bileşik ilk kez bu çalışmada izole edildi. Echinacin permethyl ether ve apigenin-5,4 -dimethyl etherin iki türevi sırasıyla echinacin ve apigenin-7--glucoside permethylate ın metilasyonu ile elde edildi. İzole edilen bileşiklere antifungal aktivite testleri uygulandı ve 150 μg ml 1 Echinacin in Alternaria güvercin bezelye yanıklığına karşı ümit verici olduğu belirlendi. Rudrappa ve Mohmoud, 2010; Echinops echinatus Roxb. bitkisinin köklerinden elde edilen ekstraktların DPPH, nitrik oksit ve süperoksit rakidali giderme aktivitelerini incelediler. Echinops echinatus Roxb. kökünün etanol ekstraktlarının standart askorbik aside kıyasla yüksek radikalik aktivite gösterdiğini belirlediler. Gözlenen aktivitenin ekstraktlar içinde bulunan flavanoid ve yüksek fenolik içeriğinden kaynaklanabileceği sonucuna vardılar. Yukarıda verilen literatür bilgilerine bakıldığında Echinops un diğer türleri üzerinde birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen Echinops orientalis Trautv. türü üzerinde kayda değer bir çalışma yoktur. Bu bağlamda yapılan bu çalışmada Echinops orientalis Trautv. bitkisindeki sekonder metabolitler izole edilerek yapıları belirlendi ve elde edilen bileşiklerin antioksidan aktiviteleri incelendi. 2.5. Serbest Radikaller ve Genel Özellikleri Serbest radikaller, bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron içeren atom veya moleküllerdir. Bu atom veya moleküller en dış elektron kabuğundan bir elektron kaybetmiş olduklarından bu elektron açığını kapatabilmek için başka atomların elektronlarını paylaşma eğilimindedirler (Halliwell ve ark., 1992). Serbest radikal oluşturan kaynaklar radyasyon, virüsler, UV ışınları, X-ışınları, ozon kozmik ışınlar, hava kirliliğini yaratan fosil kökenli yakıtların yanma sonundaki ürünleri, sigara dumanı, otomobil egzoz gazları, sanayi atıkları, enfeksiyonlar, stres, hücre metabolizmasının toksik ürünleri, bazı tahrip edici kimyasallar, haşere kontrol ilaçları ve birçok başka etkenlerdir.
17 Radikal tepkimeleri biyoloji ve tıpta yaşamsal bir öneme sahiptir ve yaşayan her canlıda her an oluşmakta ve kaybolmaktadır. Çünkü radikaller, metabolizmanın normal işleyişi sırasında sürekli olarak üretilmektedir. Moleküler oksijen ( 2 ) kendisi bir diradikaldir. Temel haldeki moleküler oksijen, oksijen atomlarının her ikisinde de birer çiftleşmemiş elektron bulundurur. Radikaller, oksijen içerip içermediğine göre iki kısımda toplanırlar. ksijen içeren radikaller serbest oksijen radikalleri (SR) olarak adlandırılırlar. Biyolojik sistemlerde sıklıkla kullanılan ve serbest oksijen radikalleri Çizelge 2.2. de verilmektedir (Sies, 1991). Çizelge 2.2. En sık karşılaşılan serbest radikaller ve serbest radikal üreten türlerin bazı özellikleri (Halliwell, 1994) Adı Simge Etkisi Hidrojen radikali H Bilinen en basit radikal Süperoksit 2 - ksijen metabolizmasının ilk ara ürünü radikali Hidroksil H En toksik (reaktif) oksijen metaboliti radikali radikali Hidrojen H 2 2 Reaktivitesi çok düşük, moleküler hasar yeteneği zayıf peroksit Singlet oksijen 1 2 Yarılanma ömrü kısa, güçlü oksidatif form Perhidroksi H 2 Lipidlerde hızlı çözünerek lipid peroksidasyonunu artırır radikali Peroksil radikali R - Perhidroksile oranla daha zayıf etkili, lipidlere lokalize olur Triklorometil radikali CCl 3 CCl 4 metabolizması ürünü, karaciğerde üretilen bir radikal Tiyil radikali RS Sülfürlü ve çiftlenmemiş elektron içeren türlerin genel adı Alkoksil radikali R rganik peroksitlerin yıkımı ile üretilen oksijen metaboliti Azot monoksit N L - argininden in vivo üretilir Azot dioksit N 2 N'in oksijen ile reaksiyonundan üretilir
18 2.6. Antioksidanlar ldukça aktif moleküller olan radikallerin çoğalması canlı sistemlerde kontrol edilemeyen hasarlara yol açabilirler. Antioksidanlar, serbest radikalleri nötralize ederek oksidasyonunu engelleyen, yavaşlatan, durduran bileşiklerdir. Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek ve/veya reaktif oksijen türlerini toplayarak lipid oksidasyonunu inhibe ederler (Halliwel ve ark., 1992; Halliwell, 1994). Antioksidan savunma mekanizmaları oldukça çeşitli olup bunlardan bazılarını şöyle özetlemek mümkündür: 1. Radikal metabolit üretiminin önlenmesi, 2. Üretilmiş radikallerin temizlenmesi (detoksifikasyon) 3. Hücre deformasyonunun onarılması 4. Sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması 5. Endojen antioksidan kapasitesinin artırılması. Antioksidanlar, doğal (endojen kaynaklı) ve eksojen kaynaklı antioksidanlar olmak üzere başlıca 2 gruba ayrılırlar. Doğal antioksidanlar etki mekanizmalarına göre enzimatik ve nonenzimatik olarak da iki sınıfa ayrılır. Şekil 2.13. de antioksidanların sınıflandırılması verilmektedir.
19 Şekil 2.13. Antioksidanların sınıflandırılması (Ahıskalıoğlu, 2007) Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlayabilecek bir çizgide tutmaya çalışır. ksidanlar ve antioksidanlar arasındaki bu dengenin özellikle oksidanlar lehine bozulması membran lipitleri, proteinler ve DNA gibi hücrenin önemli yaşamsal yapılarında bütünlüğün bozulmasına ve canlıda patolojik olayların gelişmesine yol açar. Antioksidan savunma; radikal metabolit üretiminin önlenmesi, üretilmiş radikallerin temizlenmesi, oluşan hücre deformasyonunun onarılması, sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması ve endojen antioksidan kapasitenin artırılması olarak tanımlanan beş değişik şekilde yürür (Akkuş, 1995; Ahıskalıoğlu, 2007).
3. MATERYAL ve METT 3.1. Bitkisel Materyal 3.1.1. Bitkinin Toplanması ve Tür Teşhisi Tez çalışması kapsamında Echinops orientalis Trautv. bitkisi Gaziosmanpaşa Üniversitesi Kampüs çevresinden Ekim 2010 tarihinde toplandı. Tür teşhisi Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. Aşkın Akpulat tarafından gerçekleştirildi (No:4580AA). 3.1.2. Bitkinin Kurutulması ve Depolanması Echinops orientalis Trautv. bitkisi gövde, kök, yaprak ve tohum olarak ayrılıp ince ince kıyıldı. luşan bitki parçaları baskısız kağıtların üstüne serpiştirilerek gölgeli, havadar ve sıcak bir yerde kurumaya bırakıldı. 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler Çözücüler: Kloroform, diklorometan, etilasetat, metanol, etanol, heksan, DMS. Deneysel çalışmalarda kullanılan çözücüler literatürdeki destilleme prosedürlerine göre destillendikten sonra kullanıldı. Reaktifler: DPPH, FeCl 3, ferrozin (Sigma), K 3 Fe(CN) 6, TCA, KH 2 P 4, Na 2 C 3, Folin- Ciocalteu Reaktifi (Sigma-Aldrich), BHA, BHT, Vitamin E, Gallik asit (Merck), Amonyum seryum sülfat (Sigma). Dolgu maddeleri; Silika jel (Merck 60-230 mesh), Alimüna ince tabaka kromatografi (İTK) tabakları (20x20) (Merck). Belirteçler: Serik sülfat (12 g amonyum seryum(iv) sülfat + 50 ml derişik sülfürik asit + 450 ml su şeklinde hazırlandı). 3.3. Kullanılan Cihazlar 1 H-NMR (Bruker 400 MHz Spektrometre), 13 C-NMR (Bruker 100 MHz Spektrometre) LC/MS-TF (Agilent 6210 Time of Flight LC/MS), UV spekrometresi (PerkinElmer LS 55 spectrophotometer), Döner buharlaştırıcı (IKA), Manyetik karıştırıcı (IKA) Vakum pompası, UV lambası (Camag)
21 3.4. Metot 3.4.1. Echinops orientalis Trautv.Bitkisinin Yaprak ve Tohum Kısmının Özütlenme (Ekstraksiyonu) İşlemi Kurutulmuş bitkinin yaprak kısmı metanol-kloroform (2/1) karışımında 5 gün oda sıcaklığında bekletildi. Beşinci günün sonunda adi süzgeç kağıdı yardımıyla bitki kalıntıları süzülerek, kalıntılar tekrar aynı çözücü karışımında 5 gün süreyle tekrar ekstraksiyona bırakıldı. 6 kez ekstraksiyon işleminden sonra ekstraktlar birleştirilerek çözücü döner buharlaştırıcı yardımıyla uzaklaştırıldı. Tohum kısmının ekstraksiyonu için de aynı işlemler yapıldı. 3.4.2. Bitki Özütlerini Ayırma ve Saflaştırma İşlemi 3.4.3. Kolon Kromatografisi Echinops orientalis Trautv. bitkisinden elde edilen moleküllerin izolasyonu ve yapı tayininde ve gerekirse de izole edilen bileşenlerin antioksidan aktivite testlerinde kullanılması ve bazı spektroskopik analizlerde numune tahribatından dolayı bu çalışmada mümkün olan en yüksek miktarda ham ekstrakt ile ayırma saflaştırma işlemine başlandı. Bundan dolayı, 110 cm uzunluğunda 3.5 cm çapında ve 50 cm uzunluğunda 4 cm çapında vakum pompası destekli özel yapım cam kolonlar kullanıldı. Kolonların alt kısmına pamuk konduktan sonra hekzan ile bulamaç haline getirilmiş silikajel yavaş yavaş dolduruldu. Her ilaveden sonra silika jelin çökmesi beklendi ve çözücü alt kısımdan alındı. Bu şekilde kolonun 2/3 ünden fazlası dolduruldu. Bu işlemlerden sonra kolonlara ham ekstraklar ilave edildi. Bunun üzerine ham ekstrakların dağılmasını engellemek amacıyla bir miktar silikajel ilave edildi ve kolon kromatografisi işlemlerine başlandı. Düşük polariteli çözücü sistemi ile başlanarak ve belli oranlarda polarite yükseltilerek en yüksek polarite ile ayırma işlemleri tamamlandı. Fraksiyonlar 25 ml lik hacimlerle toplanarak İTK kontrollü olarak birleştirildi. Birleştirilen fraksiyonlar kristallenmeye bırakılarak saflaştırıldı. Kolon kromatografisi işlemi süresince hekzan çözücüsünden başlanarak sırasıyla hekzan-diklorometan, diklorometan, diklorometan-etil asetat, etil asetat, etil asetat-
22 metanol gradienti kullanılarak çözücü polaritesi sürekli olarak artırıldı. Fraksiyonlar derişimine bağlı olarak 250mL-400mL olarak toplandı. Kolon kromatografileri kolondan metanol geçirilerek sonlandırıldı. Kolon kromatografisinde elde edilen fraksiyonlar Rf (yürüme hızı) değerlerine göre birleştirildi. Çizelge 3.1. ve Çizelge 3.2. de birleştirilen fraksiyonlar çözücü sistemleri ve fraksiyonlara uygulanan işlemler toplu halde verilmektedir. Çizelge 3.1. Bitkinin yaprak kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri Fraksiyonlar Uygulanan Çözücü Sistemi Yapılan İşlemler 1 15 Diklorometan - 16-47 Diklorometan-etilasetat(9:1) - 48-59 Diklorometan-etilasetat(8:2) - 60-73 Diklorometan-etilasetat (7:3) - 74-110 Diklorometan-etilasetat (1:1) - 111-127 Etil asetat - 128-136 Etil asetat Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı. 137-140 Etil asetat - 141-155 Etil asetat-metanol (9.5:0.5) - 156-158 Etil asetat-metanol (8:2) Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı. 159-175 Etil asetat-metanol (7:3) - 176-197 Etil asetat-metanol (1:1) - 198-220 Metanol -
23 Çizelge 3.2. Bitkinin tohum kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri Fraksiyonlar Uygulanan Çözücü Sistemi Yapılan İşlemler 1 2 Diklorometan - 3-5 Diklorometan-etilasetat(9:1) - 6-10 Diklorometan-etilasetat(8:2) - 11-15 Diklorometan-etilasetat(7:3) - 16-22 Diklorometan-etilasetat(6:4) - 23-28 Diklorometan-etilasetat (1:1) - 29-33 Diklorometan-etilasetat (4:6) - 34-38 Etil asetat Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı. 39-41 Etil asetat - 42 Etil asetat Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı. 43-57 Etil asetat - 58-73 Etil asetat-metanol (9:1) - 74 Etil asetat-metanol (8:2) - 75 Etil asetat-metanol (8:2) - 76-83 Etil asetat-metanol (8:2) - 84-92 Etil asetat-metanol (7:3) - 93-97 Etil asetat-metanol (6:4) - 98-107 Etil asetat-metanol (1:1) - 108-112 Etil asetat-metanol (4:6) - 113-120 Etil asetat-metanol (3:7) - 121-138 Metanol - 3.4.4. İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) Kolon kromatografisi deneyi sonucunda 220 adet fraksiyon toplandı ve elde edilen fraksiyonlar İTK işlemine tabi tutuldu. Çözücü sistemlerinde yürütülen İTK plakalarındaki spotlar UV ışığında incelendi. UV ışığında görülemeyen spotlar ise plakalardaki maddeler ile kompleks oluşturarak görünür hale getirilmek için plakalara
24 serik sülfat belirteci püskürtüldü ve plakalar hafif ısıtılarak renkleri gözlemlendi (Şekil 3.1.). Şekil 3.1. Kolon kromatografisinden elde edilen fraksiyonların İTK görünümü İTK incelenerek Rf (yürüme hızı) değerine göre aynı madde içeren fraksiyonlar birleştirildi. Birleştirilen fraksiyonlar kristallenmeye bırakılarak saflaştırıldı. 3.5. İzole Edilen Bileşenlerin Yapılarının Tayinleri İçin Uygulanan Analizler 3.5.1. 1 H-NMR ve 13 C-NMR Analizleri Kolon kromatografisi ve ekstraksiyon ile saflaştırılan ve saflığı İTK ile teyit edilen maddelerin kimyasal yapılarının aydınlatılması için bir ve iki boyutlu NMR tekniklerinden yararlanıldı. Bu amaçla fakültemiz bünyesinde bulunan Bruker marka 400 MHz cihazı kullanıldı. Ayrıca saflaştırılan maddelerin molekül kütlelerini belirlemek için LC/MS-TF analiz tekniğinden yararlanıldı ve söz konusu analizler Çankırı Karatekin Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü ndeki LC/MS-TF cihazı kullanılarak yapıldı. 3.6. Antioksidan Aktivite Testleri Bitki türevli yenilebilir/yenilemez ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu bileşiklerin antioksidan özellikleri temelde onların hidrojen atomu vericisi veya indirgeme ajanı olarak davranmalarından dolayı
25 indirgeyebilme yeteneklerinden kaynaklanır. Bu doğal antioksidanlar; serbest radikal toplayıcısı, zincir kırıcı, proantioksidant metal iyonlarını kompleksleştiri olarak davranır. Meyvelerin, sebzelerin ve diğer bitki türevli ürünlerin antioksidan aktivitesini bir tek testle kesin olarak tespit etmek zordur. Doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini değerlendirmek için birçok test önerilmiştir. Doğal ürünlerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi için en azından iki test uygulanmalıdır (Tüfekçi, 2010). Antioksidan aktivite çalışmalarında; toplam fenolik madde, total indirgeme gücü, serbest radikal giderme (DPPH testi) aktivitesi ve ABTS katyon radikali giderme aktivitesi testleri yapıldı. 3.6.1. Serbest Radikal (DPPH ) Giderme Aktivitesi Bitki ekstraktlarının ve elde edilen moleküllerin serbest radikal giderme aktivitesi Blois metoduyla 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH. ) kullanılarak ölçüldü. Bu metot, koyu menekşe renkli olan DPPH çözeltisinin, sistem içindeki herhangi bir molekül tarafından elektron transferi olduğunda rengin açılması ve bu renk değişikliğinin UV spektrofotometre ile ölçülmesi esasına dayanır. Renk ne kadar açılır ve çözeltinin absorbansı ne kadar düşük çıkarsa serbest radikali giderme gücü o oranda artar diye yorumlanabilir. Z + AH = ZH + A tepkimesinde Z, DPPH molekülünü, AH ise elektron donörü olan molekülü temsil eder. Tepkime sonunda oluşan ZH (Difenilpikrilhidrazin) molekülü oluşur ki bu molekül artık bir serbest radikal değildir. Şekil 3.2. Fenol (a), DPPH radikal formu (b), Fenoksi radikali (c), DPPH nötr formu (d)
26 İlk olarak 0,25 mm lık DPPH nin etanol çözeltisinden 1mL alındı ve üzerine farklı derişimlerdeki (20, 40, 80 ve 160 µl) stok çözeltileri eklenerek hacim etanol ile 4 ml ye tamamlandı. Çözeltiler vortekslenerek karanlıkta 30 dk. inkübe edildi. DPPH radikal formunun maksimum absorpsiyon gösterdiği dalga boyu olan 517 nm de çözeltilerin absorbansları ölçüldü. Spektroskopik ölçümler (PerkinElmer LS 55 model spektrometre) UV cihazı ile yapıldı ve analitlerin serbest radikal giderme aktivitesi aşağıdaki formül ile hesaplandı. % SRG= [(A kontrol -A numune )/A kontrol ]x100 A kontrol = (Etanol + DPPH) absorbansı A numune = (Etanol + DPPH + Ekstrakt) absorbansı Sonuçlar diğer aktivite testlerinde olduğu gibi % aktivite olarak hesaplandı. 3.6.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi İndirgeme gücü aktivitesi K 3 [Fe(CN) 6 bileşiğindeki Fe 3+ iyonunun numunedeki 4- moleküller ile tepkimeye girerek Fe(CN) 6 anyonundaki Fe 2+ ye indirgenmesi temeline dayanmaktadır. K 3 [Fe(CN) 6 ] + numune Fe(CN) 6 4- Şekil 3.3. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ilk reaksiyon luşan Fe(CN) 6 4- anyonu sonradan eklenen FeCl 3 bileşiğindeki Fe 3+ iyonu ile renkli Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 kompleksini oluşturur ve UV de 700 nm de bu renkli kompleksin absorbansı ölçülmektedir. FeCl 3 +Fe(CN) 6 4- Fe 4 [Fe(CN) 6 ] Şekil 3.4. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ikinci reaksiyon Dolayısıyla çözeltideki saf madde veya maddeler ne kadar güçlü antioksidant ise Fe 3+ iyonu o kadar Fe 2+ ye indirgenir ve böylece oluşan renkli kompleksin konsantrasyonu daha yüksek olacağı için 700 nm de okunan absorbans değeri daha büyük olur.
27 İndirgeme gücü aktivitesi için daha önce hazırlanan stok çözeltilerinden 20, 40, 80 ve 160 µl tüplere alındı ve toplam hacim fosfat tamponu (ph= 6,6 0,2 M) ile 1,25 ml ye tamamlandı. Üzerine %1 lik 1,25 ml K 3 [Fe(CN) 6 eklendi. Karışım 50 o C 30 dk inkübe edildi. Bu süre sonunda karışıma %10 luk 1,25 ml TCA (Trikloroasetik asit), % 0,1 lik 0,25 ml FeCl 3. 6H 2 ilave edildi ve karışımlar vortekslenerek homojenize edildi. Elde edilen karışımlar 700 nm de maksimum absorpsiyon gösteren Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 kompleksinin absorbansları ölçüldü ve sonuçlar bu ölçülen absorbans değerlerine göre değerlendirildi. 3.6.3. ABTS Katyon Radikali Giderme Aktivitesi Bir erlen içerisinde (alüminyum folyoya sarılmış) 2 mm ABTS çözeltisi hazırlandı. Daha sonra ABTS çözeltisi içerisine 2,45 mm sodyum persülfat çözeltisi ilave edildi ve oda sıcaklığında 6 saat bekletildi. Çözeltinin 734 nm de absorbans değeri 0,750 ± 0,025 olacak şekilde fosfat tamponu ile seyreltme yapıldı. Dört farklı derişimde (20, 40, 80 ve 160 µl) hazırlanan numune çözeltileri deney tüplerine ilave edilerek tampon çözelti ile 3 ml ye tamamlandı. Deney tüplerine 1 ml ABTS çözeltisi eklenerek vorteks yapıldı ve 30 dakika beklemeye bırakıldı. Daha sonra çözeltilerin 734 nm de absorbans değerleri okundu. 3.6.4. Total Fenolik Bileşik Miktarı Tayini Bitkinin metanol-kloroform ekstraktlarındaki toplam çözünebilen fenolik maddeler Folin-Ciocalteu reaktifi (FCR) ile tayin edildi (Singleton ve Rossi, 1965). FCR, fosfotungustik (H 3 PW 12 40 ) ve fosfomolibdik (H 3 PMo 12 40 ) asitlerin karışımı olup fenol oksidasyonu sırasında bu oksitler mavi renkli bileşiklere indirgenir. Bu renk değişimi polifenolik bileşik miktarı ile orantılı olup 760 nm de spektofotometrede takip edilir. Polifenol miktarı genellikle gallik asit veya kateşol ekivalenti olarak ifade edilir. Bitkinin 100-1000 μg/ml konsantrasyonlarında hazırlanan metanol-kloroform ekstraktlarından 0,1 ml alındı. Destile su ile hacimler 4,6 ml ye tamamlandıktan sonra 0,1 ml FCR eklendi. 3 dakika sonra 0,3 ml % 2 lik Na 2 C 3 çözeltisi katılarak oda koşullarında 2 saat bekletildi. Daha sonra 760 nm de absorbanslar ölçüldü.
28 Değişik konsantrasyonlarda (50mg/50mL) hazırlanan gallik asit çözeltilerine FCR ile toplam fenolik madde tayini uygulandı. Bitki ekstraktlarında bulunan toplam fenolik bileşiklerin konsantrasyonları gallik asitten hazırlanan standart çözeltilerin kalibrasyon eğrilerinden elde edilen grafik denklemlerinden gallik asite eşdeğer (μg GAE/g ekstrakt) olarak hesaplandı.
4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. İzole Edilen Bileşiklerin Yapı Analizi 4.1.1. Metil-1H-indol-1-karboksilatın (34-38.fr) Yapı Tayini Echinops orientalis Trautv. bitkisinin tohum kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri esnasında %100 etil asetat fazında elde edilen ilk bileşik 34-38 nolu fraksiyon aralığında gelen metil-1h-indol-1- karboksilat tır. 34-38 nolu fraksiyonlar TLC kontrolü ile birleştirildikten sonra toplanam fraksiyonların çözücüsü, 40 C de döner buharlaştırıcıda uzaklaştırıldı. Elde edilen çökelek yapı tayini amacıyla DMS-d 6 ile çözülerek 1 H, 13 C, DEPT-90, DEPT- 135, APT ve HETCR spektrumları kaydedildi. Elde edilen NMR spektrumları Şekil 4.2.-4.4. de ve spektrumlardan elde edilen datalar Çizelge 4.1. de verilmiştir. 6 7 8 N CH 3 10 11 2 5 4 9 3 41 Şekil 4.1. Echinops orientalis Trautv. dan izole edilen metil-1h-indol-1-karboksilat molekülü Şekil 4.2. de verilen metil-1h-indol-1-karboksilat bileşiğinin 1 H NMR spektrumu incelendiğinde toplam 6 tane aromatik ve metoksi protonlarının olduğu belirlenmiştir. Ayrıca azot atomuyla uzaysal olarak etkileşen protonların daha aşağı alanda rezonans olduğu ve etkileşme sabitlerinin diğer protonlardan daha büyük olduğu görüldü.
1.07 0.94 1.15 1.11 1.01 0.95 3.00 sakine tohum kolon 34-38 6.038 6.057 7.374 7.382 7.400 7.419 7.637 7.659 7.686 7.722 7.726 7.740 7.743 7.761 7.765 7.965 7.984 8.172 8.176 8.192 8.196 3.811 30 8.2 8.0 7.8 7.6 ppm 6.10 6.05 ppm 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Şekil 4.2. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın 400 MHz 1 H NMR spektrumu
31 Şekil 4.3. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın 13 C, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları Çizelge 4.1. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın 1 H-NMR ve 13 C-NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 ) C/H DEPT(90-135) δ C ppm (Hz) δ H ppm (Hz) HMBC Eşleşme sabitleri (J) 2 CH 2. 145,48 7,98 d J= 7,5 Hz 3 CH 3. 109,07 7,09 d J = 7,5 Hz H 2 4 CH 4. 117,12 7,65 d J = 8,53 Hz H 6 5 CH 5. 132,47 7,74 H 7 6 CH 6. 123,80 7,40 ddd H 4 7 CH 7. 125,98 8,18 dd J = 8 Hz J = 1,8 Hz H 3, H 4 8 C 8. 141,04 H 2, H 7 9 C 9. 126,96 H 3, H 5 10 C 10. 176,86 H 2 11 CH 3 11. 40,46 3,71
32 Şekil 4.3. incelendiğinde 13 C-NMR spektrumlarında olduğu halde DEPT-90 ve DEPT- 135 spektrumunda görülmeyen diğer pikler yapıdaki kuarterner karbon atomlarına aittir ve bu veriler ile yapıda 3 tane kuarterner atom olduğu tespit edildi. Bileşikte 176,86 ppm de ki 10 nolu karbonil karbonu olup 8 ve 9 nolu diğer kuarterner karbonları sırasıyla 141,04 ve 126,96 ppm de gözlendi. Daha elektronegatif azot atomuna komşu olan 2 ve 8 nolu karbonlarda sırasıyla 145,48 ve 141,04 ppm de sinyal verdi. Ayrıca karbonil grubuna komşu metoksi karbonun 13 C-NMR spektrumunda dötero DMS pikinin altında kaldığı ancak DEPT-135 NMR spektrumundan 40,46 ppm de sinyali gözlendi. Sonuç olarak Şekil 4.3. de verilen 13 C-NMR, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları incelenerek 3 tane C, 6 tane CH ve 1 tane CH 3 olmak üzere bileşiğin 10 karbonlu olduğu tespit edilmiştir ve bu öngörülen yapıyı doğrulamaktadır. Şekil 4.4. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın HETCR NMR spektrumu Şekil 4.4. de verilen metil-1h-indol-1-karboksilat bileşiğinin HETCR spektrumunda bileşikteki proton karbon eşleşmeleri tespit edilmektedir. Spektrum incelendiğinde 145,48, 109,07, 117,12, 132,47, 123,80 ve 125,98 ppm de gözlenen protonlara sahip 2,
33 3, 4, 5, 6 ve 7 nolu karbonların sırasıyla 7,98, 7,09, 7,65, 7,74, 7,40, 8,18 ppm deki protonlarla korele olduğu görüldü ve 141,04 ve 126,96 ppm deki proton korelasyonu olmayan karbonların kuarterner karbon olduğu belirlendi. Ayrıca 40,46 ppm deki metoksi karbonunun 3,71 ppm deki protonlarla korele olmakta bu da öngörülen yapıyı doğrulamaktadır. Ayrıca LC/MS-TF spektrumunda gözlenen molekül ağırlığı yapı ile uyum içindedir (Şekil 4.5.). Şekil 4.5. Metil-1H-indol-1-karboksilat ın LC/MS-TF spektrumu [M-H] 173,0543 C 10 H 9 2 N % 95 eşleşme [M] 174.0543 4.1.2. Steroid Bileşiğinin (42.fr) Yapı Tayini Kolon kromatografisi işleminde %100 etil asetat çözücüsünde gelen 42 nolu fraksiyon İTK kontrolü ile birleştirildikten sonra toplanan fraksiyonların çözücüsü, 40 C de döner buharlaştırıcıda uzaklaştırıldı Kristal kısmı metanol ile süzgeç kağıdından geçirilerek yıkandı ve daha sonra döner buharlaştırıcıda çözücüsü iyice uzaklaştırıldı. Elde edilen kristal, yapı tayini için DMS-d 6 ile çözünerek 1 H, 13 C, DEPT-90, DEPT- 135, APT ve HETCR NMR spektrumları kaydedildi.
1.35 1.45 1.37 1.35 1.00 1.12 12.50 2.18 1.48 4.08 4.57 4.32 5.01 5.11 13.56 14.71 5.91 5.08 9.19 sakine tohum kolon 42 fr 0.656 0.675 0.791 0.809 0.827 0.843 0.898 0.914 0.935 0.961 0.992 1.008 1.079 1.104 1.143 1.162 1.179 1.197 1.210 1.230 1.247 1.264 1.281 1.328 1.352 1.388 1.418 1.472 1.503 1.790 1.813 1.947 1.995 2.360 2.509 2.897 2.917 3.015 3.037 3.055 3.068 3.103 3.125 3.173 3.352 3.388 3.428 3.468 3.635 3.662 3.822 4.024 4.042 4.213 4.233 4.904 5.335 34 2 1 11 19 9 10 12 8 21 22 18 20 17 13 16 14 15 23 24 25 26 28 27 29 H 2' 1' 3 4 5 6 7 H 3' 4' 5' 6' H H 42 Şekil 4.6. Echinops orientalis Trautv. dan izole edilen steroid bileşiği 2 1 11 19 9 10 12 8 21 22 25 26 18 20 17 23 24 27 29 13 16 28 14 15 H 1' 3 4 5 6 7 2' H 3' 4' 5' 6' H H 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Şekil 4.7. Steroid bileşiğinin 400 MHz 1 H NMR spektrumu
35 Şekil 4.7. de steroid bileşiğine ait 1 H-NMR spektrumu incelendiğinde, anomerik karbona bağlı anomerik proton ( 1 H ) δ H = 4,22 ppm de dublet olarak sinyali gözlendi. Yapıda aromatik halkanın olmamasına rağmen 3 tane çift bağın olduğu gözlendi. C3 konumunda bağlı olan protonu (H3) δ H = 4,93 ppm de pentede rezonans olduğu belirlendi. δ H = 0,5-1 ppm arasında rezonans olan singlet pikleri moleküldeki metil gruplarının varlığını belirtmektedir. Şekil 4.8. Steroid bileşiğin APT, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları Moleküle ait APT, DEPT-135 ve DEPT-90 spektrumlarından elde edilen veriler moleküldeki 3 adet kuarterner karbon (APT de pozitif DEPT-135 ve DEPT-90 spektrumlarında sinyal yok), 6 adet CH 3 karbonu (APT de negatif, DEPT-135 de pozitif DEPT-90 da sinyal yok) 8 adet CH 2 karbonu ve 18 adet CH karbonunun
36 varlığı tespit edildi. δc = 140,94 ppm deki C5 kuarterner karbon atomunu göstermek üzere yapıda toplam 35 tane karbon atomu olduğu tespit edildi. Çizelge 4.2. Steroid bileşiğinin 1 H NMR ve 13 C NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 ) C/H DEPT(90-135), APT δ C (ppm) δ H (ppm) 1 CH 2 37,37 1,81 2 CH 2 31,81 1,91 3 CH 79,00 4,93 4 CH 2 39,97 1,97 5 C 140,90 6 CH 121,68 5,34 7 CH 2 24,31 1,63 8 CH 31,87 1,55 9 CH 50,10 0,91 10 C 36,66 11 CH 125,99 8,19 12 CH 132,57 7,78 13 C 42,33 14 CH 56,75 0,99 15 CH 2 23,09 1,24 16 CH 2 29,73 1,51 17 CH 55,89 1,06 18 CH 3 12,12 0,63 19 CH 3 19,54 0,96 20 CH 35,95 1,34 21 CH 3 19,4 0,80 22 CH 123,92 7,41 23 CH 109,10 6,06 24 CH 45,63 0,93 25 CH 2 29,19 1,79 26 CH 3 19,59 0,81 27 CH 19,58 0,95 28 CH 3 20,19 0,81 29 CH 3 12,25 0,83 1' CH 101,25 4,22 2' CH 73,95 3,41 3' CH 77,41 3,35 4' CH 70,59 3,41 5' CH 77,25 3,35 6' CH 2 61,58 4,16
37 Şekil 4.9. Steroid bileşiğinin HETCR NMR spektrumu Şekil 4.9. da steroid bileşiğinin HETCR spektrumunda bileşikteki karbon proton etkileşmeleri tespit edilmektedir. Spektrum incelendiğinde (Şekil 4.9) moleküle bağlı olan şeker grubuna ait C1 anomerik karbonunun (δc = 101,25 ppm) 4,22 ppm deki anomerik protonla korele olduğu görülmektedir. Molekülde yer alan vinilik C6 karbonunun (δc = 121,67 ppm) 5,37 ppm deki H6 protonu ile etkileşimi tespit edilmektedir. Şekil 4.9. da 3,35 ile 4,22 ppm arasındaki şeker halkalarındaki 6 tane protonun, 61,58 ile 101,25 ppm arasındaki 6 tane karbon atomuyla etkileşimi görülmektedir. LC/MS-TF spektrumundan elde edilen molekül ağırlığı yapı ile uyum içerisindedir (Şekil 4.10.).
38 Şekil 4.10. Steroid molekülünün LC/MS-TF spektrumu [M-H] 572,4136 C 35 H 56 6 % 96 eşleşme [M] 573,4136 4.1.3. Flavon (Apigenin-7--[6 " -(p-kumaroil)- -D-glukozit]) (128-136.fr) Yapı Tayini Vakum kromatografisinde %100 etil asetat çözücüsünde gelen 128-136 nolu fraksiyonların, İTK da yürütülüp serik sülfat belirteci ile 100-120 ºC de sarı renk oluşturduğu gözlendi. Saflık kontrolü İTK ile yapıldı. Kristal kısmı metanol ile süzgeç kağıdından geçirilerek yıkandı ve daha sonra döner buharlaştırıcıda çözücüsü iyice uzaklaştırıldı. Elde edilen kristal, yapı tayini için DMS-d 6 ile çözünerek 1 H, 13 C, DEPT-90, DEPT-135, APT, HETCR, HMBC, CESY 90 NMR spektrumları kaydedildi.
39 9''' 8''' 7''' H H 3''' 4''' 5''' 6''' 1''' H H 4'' 2''' H 6'' 5'' 3'' 2'' H 1'' 7 6 6' 8 9 1' 2 5 10 4 3 H 5' 2' 3' 4' H H 43 Şekil 4.11. Echinops orientalis Trautv. dan izole edilen flavon (Apigenin-7--[6"-(pkumaroil)- -D-glukozit]) (128-136.fr)
1.03 0.88 1.16 1.07 0.99 2.07 2.15 2.16 1.94 1.14 2.00 1.08 2.40 1.11 1.11 1.11 16.54 1.70 12.981 3.818 3.836 3.859 4.451 4.481 5.156 5.174 6.312 6.352 6.476 6.481 6.656 6.678 6.809 6.815 6.839 6.910 6.932 7.356 7.378 7.475 7.514 7.934 7.956 40 7.5 7.0 ppm 5.6 5.4 5.2 ppm 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Şekil 4.12. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un 1 H-NMR spektrumu
Kedi Nanesi yeni kolon 2 fr 114 coken 182.427 145.378 157.347 160.240 161.604 161.832 163.149 164.700 166.898 95.133 99.920 103.463 105.825 114.159 116.103 116.434 121.419 125.329 128.976 130.529 63.883 65.388 70.409 73.390 74.272 74.570 76.688 41 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm Şekil 4.13. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un 13 C-NMR spektrumu
42 Şekil 4.14. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un DEPT-90, APT ve DEPT-135 spektrumları
43 Çizelge 4.3. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un 1 H-NMR ve 13 C- NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 ) C/H DEPT(90-135) δ C ppm (Hz) δ H ppm (Hz) HMBC Eşleşme sabitleri (J) 2 C 2. 164,70 3 CH 3. 103,46 6,83 s 4 C 4. 182,42 H 3 5 C-H 5. 161,82 12,98 H 6 6 CH 6. 99,92 6,47 d J 6'8' = 2,12 Hz 7 C 7. 163,15 H 6, H 8 8 CH 8. 95,13 6,81 d J 6'8' = 2,12 Hz 9 C 9. 157,34 H 8 10 C 10. 105,82 1' C 1'. 121,42 H 2 ', H 6 ' 2' CH 2'. 128,97 7,94 d j 8,84 Hz H 3 ' 3' CH 3'. 116,83 6,92 d J 2'3' = 8,84 Hz H 2 ' 4' C-H 4'. 161,60 H 3 ', H 5 ' 5' CH 5'. 116,83 6,92 d J 5'6' = 8,84 Hz H 6 ' 6' CH 6'. 128,97 7,96 d J 5'6' = 8,84 Hz H 5 ' 1'' CH 1'' 99,87 5,16 d J 1''2'' = 7,28 Hz H 2 '' 2'' CH-H 2'' 76,68 3,33 t J 1''2'' = 7,28 Hz H 1 '', H 3 '' 3'' CH-H 3'' 73,39 3,34 t H 2 '', H 4 '' 4'' CH-H 4'' 70,42 3,18 brs H 3 '', H 5 '' 5'' CH 5'' 74,27 3,83 brs H 4 '', H 6 '' 6''a CH-H 6''a 63,87 3,46 dd H 6b '', H 5 '' 6''b CH-H 6''b 61,05 4,19 dd H 6a '', H 5 '' 1''' C 1''' 166,89 H 2 ''',H 6b ''',H 3 ''' 2''' CH 2''' 114,16 7,49 d J 2'''3''' = 15,8 Hz H 3 ''' 3''' CH 3''' 145,37 6,33 d J 2'''3''' = 15,8 Hz H 2 ''' 4''' C 4''' 125,33 H 5 ''', H 9 ''' 5''' CH 5''' 116,10 6,66 d J 5'''6''' = 8,60 Hz H 6 ''' 6''' CH 6''' 130,54 7,36 d J 5'''6''' = 8,60 Hz H 6 ''' 7''' C-H 7''' 160,24 H 6 ''', H 8 ''' 8''' CH 8''' 130,54 7,36 d J 8'''9''' = 8,60 Hz H 9 ''' 9''' CH 9''' 116,10 6,66 d J 8'''9''' = 8,60 Hz H 8 '''
44 Şekil 4.11. de verilen bileşikte 6 ve 8 nolu karbon atomuna bağlı protonlar 1 H-NMR spektrumunda 6,47 ve 6,81 ppm de ve bu protonların bağlı olduğu karbon atomlarının pikleri Şekil 4.13. deki 13 C-NMR spektrumunda 99,92 ve 95,13 ppm de gözlenmiştir. 1 H ve 13 C-NMR spektrumlarına bakıldığında bileşiğin bir tane şeker grubuna sahip olduğu tespit edilmiştir. Şekil 4.14. de 13 C-NMR ve DEPT-135 spektrumlarında olduğu halde DEPT-90 spektrumunda görülmeyen diğer pikler ise yapıdaki kuarterner karbon atomlarına aittir ve bu veriler ile yapıda 11 tane kuarterner atom olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak Şekil 4.13. ve Şekil 4.14. deki 13 C-NMR, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları incelenerek 11 C, 18 CH ve 1 CH 2 olmak üzere bileşiğin 30 karbonlu olduğu belirlendi ve bu öngörülen yapıyı doğrulamaktadır. Şekil 4.15. de 3,18 ile 5,16 ppm arasındaki şeker halkalarındaki 5 tane protonun, 61,05 ile 99,87 ppm arasındaki 5 tane karbon atomuyla etkileşimi görülmektedir. Ayrıca, flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) bileşiğinin HETCR spektrumunda bileşikteki proton karbon eşleşmeleri tespit edilmektedir. Spektrum incelendiğinde moleküle bağlı olan şeker grubuna ait 1' anomerik karbonunun (δ C = 100,34 ppm) 5,06 ppm deki anomerik protona ait olduğu görülmektedir. Aynı spektrumda 6,45, 6,84, 6,91 ve 6,93 ppm deki protonların sırasıyla 99,93, 95,58, 103,81 ve 116,53 ppm deki karbon atomlarına bağlı olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca 1''' deki karbonil karbonunun 166,89 ppm de olduğu 7'''H pikinin 160,24 ppm de gözlendiği, 2''' ve 3''' protonlarının sırasıyla 114,16 ve 145,37 ppm de 15,8 Hz etkileşme sabitleriyle birbirlerine trans konumda olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak Şekil 4.15. de flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un HETCR spektrumu incelenerek protonların hangi karbon atomuna bağlı olduğu tespit edilmiştir.
45 Şekil 4.15. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un HETCR NMR spektrumu
46 ppm 20 40 60 80 100 120 140 160 180 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm Şekil 4.16. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un HMBC NMR spektrumu Şekil 4.16. daki HMBC spektrumun flavon halkasındaki 163,15 ppm deki 7 nolu karbonun 5,16 ve 7,28 ppm deki 1'' nolu protonun şeker protonları ile etkileştiği böylece flavon halkasının şeker halkasına 1 '' konumundan bağlı olduğu anlaşılmıştır. Ayrıca 166,89 ppm deki 1''' nolu karbonil karbonunun 6''a nolu 3,46 ppm deki şeker protonlarıyla etkileştiği böylelikle karbonil grubunun şeker halksına 6'' konumundan bağlandığı görülmüştür.
47 ppm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm Şekil 4.17. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un Coesy 90 NMR spektrumu Şekil 4,17. deki CSY spektrumu incelendiğinde 6,33 ppm deki 3''' protonun 6,66 ppm deki 9''' nolu proton ile etkileşimi görülmektedir. HMBC spektrumun 125,33 ppm deki 4''' nolu karbonun 6,33 ppm deki 3''' nolu protonla etkileşmesi yapıyı doğrulamaktadır. LC-MS-TF spektrumunda gözlenen molekül ağırlığı yapı ile uyum içerisindedir. Şekil 4.18. Flavon (Apigenin-7--[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) un LC/MS-TF spektrumu
48 [M-H] 577,1376 C 30 H 27 12 % 98 eşleşme [M] 578,1668 4.1.4. Flavon (Apigenin-7--glikozit) (156-158.fr) Yapı Tayini Echinops orientalis Trautv. bitkisinin yaprak kısmından elde edilen ikinci flavon Apigenin-7--glikozittir (Singh ve ark., 1988; Svehliková ve ark., 2004). Kolonda mobil faz olarak % 80 etil asetat % 20 metanol kullanıldı. Toplanan fraksiyonlardan 156-158 nolu fraksiyonlar TLC kontrolü ile birleştirildi. Çözücüsü, 40 C de döner buharlaştırıcıda uzaklaştırıldı. Elde edilen sarı renkli çökelek yapı tayini amacıyla DMS-d 6 ile çözülerek 1 H, 13 C, DEPT-90, DEPT-135, APT ve HETCR spektrumları kaydedildi. Elde edilen NMR spektrumları Şekil 4.20-4.22 de verilmiştir. H 4'' H H 6'' 5'' 2'' 3'' H 1'' 6 7 8 5 9 10 4 5' 6' 2 1 ' 2' 3 H 4' 3' H H 44 Şekil 4.19. Echinops orientalis Trautv. dan izole edilen flavon (Apigenin-7--glikozit) molekülü Şekil 4.20. de flavon (Apigenin-7--glikozit) un 1 H-NMR spektrumu incelendiğinde 5,08 ppm de görülen pik 4' karbonuna bağlı H protonuna aittir. Fenolik protonlardan C-5 karbonuna bağlı olan hidroksil grubunun protonu C-4 karbonundaki karbonil oksijeni ile hidrojen bağı yaparak 12,99 ppm e kaydığı görülmektedir.
1.13 2.00 2.02 2.08 1.10 1.07 1.36 1.88 1.48 3.71 1.85 3.99 1.44 1.95 0.83 sakine kolon 158-156 fr cokelekl 12.984 6.451 6.840 6.877 6.935 6.956 6.993 7.955 7.976 3.171 3.207 3.242 3.269 3.291 3.314 3.708 3.732 4.018 4.036 5.062 5.080 49 8.0 7.8 7.6 7.4 7.2 7.0 ppm 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Şekil 4.20. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un 400 MHz 1 H-NMR spektrumu
sakine kolon 158-156 fr cokelekl 182.464 157.404 161.563 161.872 163.402 164.744 129.078 116.479 121.434 95.291 99.976 100.346 103.530 105.791 60.242 61.051 69.998 73.541 76.863 77.611 50 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm Şekil 4.21. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un 400 MHz 13 C-NMR spektrumu
Şekil 4.22. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un DEPT-90, APT ve DEPT-135 spektrumları 51
52 Çizelge 4.4. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un 1 H-NMR ve 13 C-NMR verileri (400 MHz, DMS-d 6 ) C/H DEPT(90-135) δ C ppm (Hz) δ H ppm (Hz) 2 C 2. 164,74 3 CH 3. 103,52 6,87 s 4 C 4. 182,46 5 C-H 5. 163,40 13 6 CH 6. 95,29 6,84 t brs 7 C 7. 161,56 8 CH 8. 99,97 6,46 brs 9 C 9. 157,40 10 C 10. 105,79 1' C 1'. 121,43 Eşleşme sabitleri (J) 2' CH 2'. 129,07 7,96 d j 8,36 Hz 3' CH 3'. 116,47 6,97 d J 2'3' = 8,36 Hz 4' C-H 4'. 161,87 5' CH 5'. 116,47 6,97 d J 5'6' = 8,36 Hz 6' CH 6'. 129,07 7,96 d J 5'6' = 8,36 Hz 1'' CH 1''. 100,34 5,06 d J 1''2'' = 7,00 Hz 2'' CH-H 2''. 73,54 3,27 t J 1''2'' = 7,00 Hz 3'' CH-H 3''. 76,86 3,30 t 4'' CH-H 4''. 69,98 3,18 brs 5'' CH 5''. 77,61 3,44 brs 6''a CH-H 6''a. 61,05 3,48 dd 6''b CH-H 6''b. 61,05 3,72 dd Şekil 4.20. de verilen 1 H-NMR spektrumunda bileşiğin 6 ve 8 nolu karbon atomuna bağlı protonlar 6,46 ve 6,81 ppm de ve bu protonların bağlı olduğu karbon atomlarının pikleri Şekil 4.21. deki 13 C-NMR spektrumunda 95,29 ve 99,97 ppm de gözlenmiştir. 1 H ve 13 C-NMR spektrumlarına bakıldığında bileşiğin bir tane şeker grubuna sahip olduğu tespit edilmiştir.
53 Şekil 4.21. ve Şekil 4.22. incelendiğinde 13 C-NMR ve DEPT-135 spektrumlarında 61,05 ppm deki sinyalin DEPT-90 spektrumunda olmaması, yapıda bir tane CH 2 olduğunu göstermektedir. 13 C-NMR ve DEPT-135 spektrumlarında olduğu halde DEPT-90 spektrumunda görülmeyen diğer pikler ise yapıdaki kuarterner karbon atomlarına aittir ve bu veriler ile yapıda 8 tane kuarterner atom olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak 13 C-NMR, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları incelenerek 8 C, 12 CH ve 1 CH 2 olmak üzere bileşiğin 21 karbonlu olduğu tespit edilmiştir ve bu öngörülen yapıyı doğrulamaktadır. Şekil 4.9. da verilen flavon (Apigenin-7--glukozit) bileşiğinin HETCR spektrumunda bileşikteki proton karbon eşleşmeleri tespit edilmektedir. Spektrum incelendiğinde moleküle bağlı olan şeker grubuna ait 1'' anomerik karbonunun (δ C = 100,34 ppm) 5,06 ppm deki anomerik protona ait olduğu görülmektedir. Aynı spektrum incelendiğinde 6,46, 6,84, 6,87 ppm deki protonların sırasıyla 99,97, 95,29, 103,52 ppm deki karbon atomlarına bağlı olduğu tespit edilmiştir. Şekil 4.23. incelendiğinde 7,96 ppm deki 6' nolu protonun 129,07 ppm deki karbon atomuna, 3,48 ve 3,72 ppm deki diasterotopik CH 2 protonlarının 61,05 ppm deki 6'' nolu karbon atomuna bağlı olduğu görülmektedir. Şekil 4.9 da 3,18 ile 5,06 ppm arasındaki şeker halkalarındaki 5 tane protonun, 61,05 ile 100,34 ppm arasındaki 5 tane karbon atomuyla etkileşimi görülmektedir. Sonuç olarak Şekil 4.23. de flavon (Apigenin-7--glikozit) in HETCR spektrumu incelenerek protonların hangi karbon atomuna bağlı olduğu tespit edilmiştir. LC/MS- TF spekrumunda gözlenen molekül ağırlığı yapı ile uyum içerisindedir.
54 Şekil 4.23. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un HETCR NMR spektrumu Şekil 4.24. Flavon (Apigenin-7--glikozit) un LC/MS-TF spektrumu [M-H] 431.1160 C 21 H 20 10 % 98 eşleşme [M] 432.1223 4.2. Antioksidan Aktivite Çalışmaları Echinops orientalis Trautv. bitkisinin yaprak kısmına uygulanan kolon kromatografisinde elde edilen fraksiyonlardan 128-136 ve 156-158, tohum kısmına uygulanan kolon kromatografisinde elde edilen fraksiyonlardan 34-38 ve 42 numaralı fraksiyonların antioksidan aktivitelerine bakıldı. Bütün fraksiyonların metanol (10