ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Sinem FETULLAHOĞLU MALT İÇECEĞİ ÜRETİMİ ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MALT İÇECEĞİ ÜRETİMİ ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA Sinem FETULLAHOĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 15/06/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza. İmza. İmza. Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Doç. Dr. Hakan ÖZKAN Yrd. Doç. Dr. Sertaç ÖZER DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod no: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2007YL42 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bilgilerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ MALT İÇECEĞİ ÜRETİMİ ÜZERİNE BİR ARAŞTIRMA Sinem FETULLAHOĞLU ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Yıl : 2009, Sayfa: 41 Jüri : Doç. Dr. Hüseyin ERTEN Doç. Dr. Hakan ÖZKAN Yrd. Doç. Dr. Sertaç ÖZER Bu çalışmada Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus rhamnosus laktik asit bakterileri kullanarak şerbetçiotu içermeyen malt şırasından malt içeceği üretimi amaçlanmıştır. Laktik asit bakterileri ilave edilen % 6 ve % 10 şeker yoğunluklu steril malt şıraları 25C de laktik asit fermantasyonuna terk edilmiştir. Fermantasyon sırasında toplam asit, ph ve toplam canlı laktik asit bakterisi analizleri yapılmıştır. Fermantasyon sonunda malt içecekleri aktarılarak tortusundan uzaklaştırılmış ve şişelenmişlerdir. Üretilen malt içeceklerinin kimyasal ve duyusal analizleri yapılmıştır. Fermantasyon sırasında toplam asitlik artmış, buna bağlı olarak ph azalmıştır. % 6 şeker içeren malt şırasına aşılanan Lactobacillus delbrueckii dışında, diğer denemelerde toplam canlı laktik asit bakteri sayıları önemli oranda artmış, 8.84-8.89 log kob/ml ile en yüksek sayıya ulaşmışlardır. Daha sonra laktik asit bakterisi sayılarında yavaşça azalma gözlenmiştir. Kimyasal analiz sonuçlarına göre, % 6 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde toplam asit, laktik asit cinsinden, 4.37-7.89 g/l, ph 3.13-3.23, laktik asit 3.17-5.56 g/l arasında değişmiştir. % 10 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceğinde ise toplam asit, laktik asit cinsinden, 7.36-9.70 g/l, ph 3.02-3.33, laktik asit 5.55-7.87 g/l arasında değişmiştir. Malt içeceklerinde fermente edilmemiş şeker de bulunmuştur. Duyusal analiz sonuçlarına göre, % 6 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinden en çok Lactobacillus fermentum ve % 10 şeker yoğunluklu şıradan üretilenlerde ise en çok Lactobacillus rhamnosus ile elde edilen beğenilmiştir. Anahtar kelimeler: Malt İçeceği, Laktik asit fermantasyonu, Laktik asit bakterileri I

ABSTRACT MSc THESIS A STUDY THE PRODUCTION OF MALT BEVERAGE Sinem FETULLAHOĞLU DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF BASIC AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Assoc. Dr. Hüseyin ERTEN Year : 2009., Page: 41 Jury : Assoc. Prof. Dr. Hüseyin ERTEN Assoc. Prof. Dr. Hakan ÖZKAN Asst. Prof. Dr. Sertaç ÖZER In this study, the production of malt beverage from unhopped malt wort using lactic acid bacteria of Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus was aimed. Sterile malt worts with sugar gravity of 6 % and 10 % inoculated by lactic acid bacteria were left for lactic acid fermentation. Total aciditiy, ph and total viable lactic acid bacteria were analysed during fermantation. At the end of the fermentation, malt beverages were racked to remove the lees and chemical and sensory analyses were perfomed. During fermentation, ph decreased with a concomitant increase of the total acidity. The counts of total viable lactic acid bacteria rised significantly with the maximum numbers of 8.84-8.89 log kob/ml, with the exception of the level of malt beverage made by malt wort containing 6 % sugar inoculated by Lactobacillus delbrueckii. Then, the numbers of lactic acid bacteria slowly dropped. According to the results of chemical analyses, in malt beverages, obtained from 6 % sugar gravity wort the total acidity (as lactic acid), ph and lactic acid contents were in the range of 4.37-7.89 g/l, 3.13-3.23 and 3.17-5.56 g/l, respectively total acidity as lactic acid, ph and lactic acid varied from 7.36-9.70 g/l, 3.02-3.33, 5.55-7.87 g/l in malt beverages obtained from 10 % sugar gravity wort. Unfermented sugars were also determined in malt beverages. According to the results of sensory analyses, the most preferred malt beverages were the sample produced by Lactobacillus fermentum from 6 % sugar gravity wort and the one made by Lactobacillus rhamnosus from 10 % sugar gravity wort. Keywords: Fermented malt beverages, Lactic acid fermentation, Lactic acid bacteria II

TEŞEKKÜR Yüksek Lisans öğrenimimin süresince çalışma olanağı sağlayan danışmanım Doç. Dr. Hüseyin ERTEN e, Tezimin ilk aşamasından son aşamasına gelinceye kadar tüm aşamalarında emeği geçen ve manevi desteğini hep gördüğüm hocam Ar. Gör. Hasan TANGÜLER e, İstatiksel analizlerde yardımcı olan ve değerli bilgilerinden yararlandığım Ar. Gör. Adnan BOZDOĞAN a, Şıra temininde yardımcı olan Efes Pilsen Bira İşletmesine ve özellikle Mehmet AKŞİN e ve Aytaç BAŞARAN a, L. rhamnosus bakterisi temininde yardımcı olan Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA ya, Çalışmamın çeşitli aşamalarında yardımcı olan Gıda Mühendisliği Yüksek Lisans ve Lisans öğrencilerine ve değerli arkadaşım Eray GÜLEŞ e, Tez aşamam süresince maddi ve manevi desteğini esirgemeyen dayım Yrd. Doç. Dr. Güray KILINÇÇEKER e ve sevgili kardeşim makine mühendisi Vedat FETULLAHOĞLU na, Çalışmamın gerçekleşmesinde maddi desteklerinden dolayı Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi Birimi ne teşekkür ederim. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.Ι ABSTRACT... ΙΙ TEŞEKKÜR. ΙΙΙ İÇİNDEKİLER.ΙV ÇİZELGE DİZİNİ....VΙ ŞEKİLLER DİZİNİ VΙΙ 1.GİRİŞ.1 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.2 3.MATERYAL VE METOD 7 3.1. Materyal...7 3.1.1. Bakteriler.... 7 3.1.2. Hammadde.7 3.1.3. Denemelerde ve Analizlerde Kullanılan Araç ve Gereçler 7 3.2. Metod...7 3.2.1. Denemelerde Kullanılan Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması.7 3.2.2. Denemelerin Düzenlenmesi...7 3.2.2.1. Malt İçeceği Üretimi...8 3.2.2.1.(1). Aşılama Kültürünün Hazırlanması...8 3.2.2.1.(2). Laktik Asit Fermantasyonu...8 3.2.3. Analiz Metodları. 10 3.2.3.1. Laktik Asit Bakterisi Sayımı...10 3.2.3.2. Malt Şıraları Üzerinde Yapılan Analizler...10 3.2.3.2.(1). Yoğunluk Tayini...10 3.2.3.2.(2). Toplam Asit Tayini..10 3.2.2.2.(3). ph Tayini.10 3.2.3.3. Malt İçeceklerinde Yapılan Analizler...11 3.2.3.3.(1). ph Tayini 11 3.2.3.3.(2). Toplam Asit Tayini.11 3.2.3.3.(4). Yoğunluk Tayini.11 3.2.3.3.(5). Organik Asitlerin Tayini. 11 IV

3.2.3.4. Duyusal Analizler.12 3.2.3.5. İstatiksel Analizler...12 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1. Denemelerde Kullanılan Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması 14 4.2. Denemelerde Kullanılan Şıraların Bileşimi.14 4.3. Laktik Asit Fermantasyonun Gidişi.15 4.4. Laktik Asit Fermantasyonunda Bakterilerin Gelişimi. 17 4.5. Malt İçeceğinin Genel Bileşimi...20 4.5.1. Yoğunluk... 21 4.5.2. ph...22 4.5.3. Toplam Asit...22 4.5.4. Organik Asitler...23 4.5.5. Şekerler..25 4.6.Duyusal Analizler.26 5. SONUÇLAR..29 KAYNAKLAR..30 ÖZGEÇMİŞ..34 V

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. % 6 ve % 10Şeker Yoğunluklu Malt Şırasının Bileşimi....14 Çizelge 4.2. % 6 Şeker Yoğunluklu Şırayla Laktik Asit Bakterileri Kullanılarak Elde Edilen Malt İçeceklerinin Genel Bileşimi...20 Çizelge 4.3. % 10 Şeker Yoğunluklu Şırayla Laktik Asit Bakterileri Kullanılarak Elde Edilen Malt İçeceklerinin Genel Bileşimi..21 Çizelge 4.4. % 6 lık Malt Şırasından Elde Edilen Malt İçeceklerinin Tercih Testine Göre Duyusal Analiz Sonuçları..26 Çizelge 4.5. % 6 lık Malt Şırasından Elde Edilen Malt İçeceklerinin Aldığı Puanların Varyans Analizine Göre Kıyaslanması... 27 Çizelge 4.6. % 10 luk Malt Şırasından Elde Edilen Malt İçeceklerinin Tercih Testine Göre Duyusal Analiz Sonuçları...27 Çizelge 4.7. % 6 lık Malt Şırasından Elde Edilen Malt İçeceklerinin Aldığı Puanların Varyans Analizine Göre Kıyaslanması.....27 VI

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. Homofermantatif Laktik Asit Fermantasyonu..5 Şekil 2.2. Heterofermantatif Laktik Asit Fermantasyonu.6 Şekil 3.1. Malt İçeceği Üretimi...9 Şekil 3.2. Duyusal Analiz Formu 13 Şekil 4.1. % 6 Şeker Yoğunluklu Şıranın Kullanıldığı Denemelerde Laktik Asit Fermantasyonun Sırasında Toplam Asit Miktarı ve ph Değeri Değişimi..15 Şekil 4.2. % 10 Şeker Yoğunluklu Şıranın Kullanıldığı Denemelerde Laktik Asit Fermantasyonun Sırasında Toplam Asit Miktarı ve ph Değeri Değişimi..16 Şekil 4.3. Laktik Asit Fermantasyonu Sırasında % 6 Şeker Yoğunluklu Şıranın Kullanıldığı Denemelerde Laktik Asit Bakterilerinin Gelişimi.. 18 Şekil 4.4. Laktik Asit Fermantasyonu Sırasında % 10 Şeker Yoğunluklu Şıranın Kullanıldığı Denemelerde Laktik Asit Bakterilerinin Gelişimi...19 VII

1.GİRİŞ Sinem FETULLAHOĞLU 1. GİRİŞ Malt geniş anlamıyla çimlendirilmiş, kurutulmuş tahıl demektir. Ancak tahıllar içerisinde normal olarak hemen yalnız arpadan malt yapılır. Bu bakımdan malt denilince yöntemlerine göre çimlendirilmiş ve kurutulmuş arpa anlaşılır (Türker ve Canbaş, 1995). Malttan şıra elde etmek için önce maltın öğütülmesi ve sonra bunun su ile mayşelenmesi gerekir. Bunun için malt valsli değirmenlerden geçirilerek öğütülür. Maltın öğütülerek sıcak su ile karıştırılmasına ve belli derecelerde tutularak içindeki maddelerin enzimler tarafından parçalanıp suda çözünür hale getirilmesine mayşeleme denir. Enzimlerden özellikle α- ve β-amilazların etkili olması yani nişastanın parçalanması en önemli olanıdır. Böylece nişasta şekerlenmiş olur. Mayşeleme bitince mayşe süzülür ve şıra elde edilir (Türker ve Canbaş, 1995; Palmer, 2006). Dünyada ve ülkemizde üretilen maltın tamamına yakın bir kısmı bira ve az bir kısmı da viski üretiminde kullanılır. Bira üretiminin fazla olduğu ülkelerde, özellikle Avrupa ülkelerinde bira tüketiminde son zamanlarda bir azalma söz konusudur (Tenge ve Geiger, 2003; Idler ve ark., 2005). Tüketimdeki bu azalma değişen tüketim alışkanlıklaı, trafik yasası ve fazla miktarda alkol tüketiminin sağlık üzerine yarattığı olumsuz etkilerden kaynaklanabilir (Kulandai ve ark., 1994; Scott ve Huxtable, 1995; Kunze, 1999). Bu nedenle biranın önemli bir hammaddesi olan maltın değişik ve yeni ürünlere işlenmesi konusunda araştırmalar yapılmaktadır. Bu ürünler arasında malt içeceği (Tenge ve Geiger, 2001,2003; Idler ve ark., 2001), malt kahvesi, malt ekstraktları, malt sirkesi ve diastaz enzimleri (Briggs, 1999) gibi ürünler sayılabilir. Bu ürünlerden malt içeceği, malt şırasının laktik asit fermantasyonu ile elde edilen ve ticari düzeyde üretilen bir üründür. Bu çalışmada malt şırasından farklı laktik asit bakterileri kullanarak malt içeceği yapma olanağı amaçlanmıştır. 1

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sinem FETULLAHOĞLU 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Türk Gıda Kodeksi Bira (Anon., 2006) ve Alkolsüz İçecekler (Anon., 2007) tebliğlerinde malt içeceği ile ilgili bir tanımlama bulunmamaktadır. Bu konu ile ilgili ulusal ve uluslararası çalışmalar da sınırlıdır. Malt geniş anlamıyla çimlendirilmiş, kurutulmuş tahıl demektir. Fakat tahıllar içerisinde normal olarak hemen yalnız arpadan malt yapılır. Bu bakımdan malt denilince belli yöntemlerine göre çimlendirilmiş ve kurutulmuş arpa anlaşılır. Arpa, en eski zamanlardan beri bira hammaddesi olarak kullanılmaktadır. Bunun başlıca nedeni kavuzlu olmasıdır. Kavuz, malt yapımı sırasında karıştırmada yaprakçığı korur ve mayşeleme sonunda şıranın süzülmesine yardım eder. Bundan başka arpa maltı gerekli enzimleri yeterli miktarda içerir ve ekstraktı biracılık bakımından diğer tahıllar göre daha uygundur. Arpa dünyada geniş bir yetiştirme alanına sahiptir (Türker ve Canbaş, 1995; Briggs, 1999). Arpa (Hordeum) Gramineae familyasından tek yıllık bir bitkidir. İki ve altı sıralı olmak üzere iki tipi vardır. Arpada başak ekseninin her bir boğumunda birer çiçekli üç başakçık bulunur. İki sıralılarda (Hordeum distichum = Hordeum vulgare convar. distichum) ortadaki başakçık ürün verir yanlardaki sterildir. Altı sıralılarda ( Hordeum hexastichum = Hordeum vulgare convar. hexastichum) ise her üç başakçık dane bağlar. Bu nedenle 2 veya 6 sıralı olarak görünür. Avrupa da ve ülkemizde biracılıkta iki sıralı yazlık arpalar kullanılır. İki sıralı arpalar daha fazla ekstrakt verir ve kavuzu incedir. Malt yapılması başlıca; Arpanın hazırlanması (muhafazası, temizlenmesi ve sınıflara ayrılması); arpanın su alması (ıslatılması), çimlendirme ve Kurutmakavurma safhalarını içerir (Türker ve Canbaş, 1995; Briggs 1999). Arpalar dormant devreyi geçirmeden çimlenmezler. Dormant devrede danenin çimlenmemesinin nedeni oksijen alınışının ve CO2 atılışının yetersiz oluşu ile ilgilidir. Malt üretiminde başlangıçta arpa daneleri temizlenir ve sınıflandırılır, daha sonra üretim tipine göre (açık maltta % 42-44, koyu maltlarda % 44-47 oranlarında) ıslatılır. Daneler, istenilen miktarda su aldıktan sonra mayşelemede gerekli enzimlerin oluşması ve danedeki yedek besin maddelerinin hidrolize uygun hale gelmesi için uygun sıcaklık 2

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sinem FETULLAHOĞLU ve oksijen sağlanarak çimlendirilmeye bırakılır. Arpada bulunan enzimler nişastayı hidrolize edemez. Çimlenme sırasında bütün enzim sistemleri oluşur, çoğalır ve böylece mayşelemede belirli sıcaklıklarda nişasta, maltoz ve dekstrine, çabucak hidrolize olur. Proteinler de daha küçük moleküllere kolayca parçalanır (Türker ve Canbaş, 1995; Kunze, 1999; Lewis ve Young, 2002). Çimlenmiş arpaya yeşil malt denir. Çimlenme sırasında danede morfolojik, biyokimyasal (enzimatik) ve kimyasal değişmeler olur. Çimlendirmede erime istenilen düzeye gelince çimlendirmeyi durdurmak ve yapılacak bira tipine göre malta karakteristik tat ile kokuyu vermek amacıyla yeşil malt, kurutma ve kavurma işlemlerine tabi tutulur. Elde edilen malt endospermi un haline gelecek ve kavuzları iri parçalar halinde kalacak şekilde valsli değirmenlerden geçirilerek öğütülür. Öğütme işlemi sonrasında maltın bileşimindeki maddelerin enzimlerle parçalanarak suya geçirilmesi amacıyla mayşeleme işlemi yapılır. Enzimlerden özellikle α- ve β-amilazların etkili olması yani nişastanın parçalanması en önemlidir. Mayşelemede, enzimlerin cinsi ve miktarı, uygulanan sıcaklık ve mayşeleme süresi şıranın bileşimine etki eder. Mayşelemede nişastanın özellikle maltoza parçalanması ile proteinlerin parçalanması büyük önem taşır. (Lewis ve Young, 1995). Mayşelemede nişasta şekerlenmiş olur. Mayşeleme bitince mayşe süzülür ve mayşe şırası elde edilir (Türker ve Canbaş, 1995; Leiper ve Miedl, 2006). Malt içeceği üretiminde mayşe sırası kullanılır. Bira üretiminde bira mayası Saccharomyces cerevisiae kullanılırken, malt içeceği üretiminde homofermantatif laktik asit bakterileri, özellikle Lactobacillus (L.) cinsine giren bakteriler kullanılır. Laktik asit bakterilerinin yanında çeşitli küfler, fermantasyon yeteneği az olan mayalar ve glikonik asit üreten bakteriler de bu amaçla kullanılan mikroorganizmalardır (Tenge ve Geiger, 2001). Laktik asit bakterileri, homo- ve heterofermantatif laktik asit bakterileri olmak üzere ikiye ayrılır. Homofermantatif LAB (Bazı Lactobacilluslar, Pediococcus, Lactococcus vb.) Embden-Meyerhof Parnas yolunu (Şekil 2.1) kullanarak şekerlerden esas ürün olarak laktik asit oluştururken, heterofermantatif LAB (Bazı Lactobacilluslar, Leuconostoc, Oenococcus, Weissella vb.) heksoz 3

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sinem FETULLAHOĞLU monofosfat (pentoz fosfat yolunu) (Şekil 2.2) kullanarak birincil ürün olarak laktik asit yanında, etil alkol, asetik asit, diasetil ve karbondioksit gibi ikincil ürünleri de üretirler (Priest, 2003; Erten ve ark., 2008). Malt içeceği üzerine az sayıda çalışma yapılmıştır. Malt içeceği üretiminde daha çok homofermantatif Lactobacillus cinsine ait bakteriler tercih edilir. Çünkü bu bakteriler yalnızca laktik asit üretirler ve özellikle de asetik asit oluşturmazlar (Tenge ve Geiger, 2001). Tenge ve Geiger (2001) L. delbrueckii, L. crispatus, L. intestinalis ve farklı ortamlardan izole ettikleri bazı laktik asit bakteri ile malt içeceği üretiminin mümkün olduğunu belirtmişlerdir. Arslantaş ve ark. (2002) farklı malt şıralarına zeytin salamurası ilave ederek malt içeceği üretmişler ve malt şırasının fermente edilerek tek başına tüketilebilecek bir laktik asit ürünü olabileceğini bildirmişlerdir. Charalampopoulos ve ark. (2002) malt, arpa ve buğday şıralarına probiyotik özelliğe sahip laktik asit bakteri kültürlerini ilave etmişler ve L. plantarum ve L. fermentum bakterilerinin asit oluşturma ve asidik koşullara dayanma yeteneklerinin L. acidophilus ve L. reuteri bakterilerinden daha iyi olduğunu ileri sürmüşlerdir. Lactobacillus lar bira işletmelerinde yaygın olarak bulunurlar ve biranın bozulmasına neden olurlar (Türker ve Canbaş, 1995; Priest, 2003). Öte yanda, bu bakteriler Belçika Lambic birasının üretiminde rol oynarlar. Fusarium küfünün neden olduğu aşırı köpürme (gushing) problemini önleyebilmek için malt yapımı sırasında asitliği artırmak amacıyla laktik asit bakterileri kullanılabilir (Haikara ve ark., 1993; Tenge ve Geiger, 2001). Malt içeceği üretimi kullanılacak mikroorganizmanın suşunun seçimi, fermantasyon parametreleri, süzme ve dayandırma gibi fermantasyon sonrası işlemleri temel alır (Tenge ve Geiger, 2003). 4

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sinem FETULLAHOĞLU Glikoz Glikokinaz ATP ADP Glikoz-6-P Fruktoz-6-P ATP. ADP Fruktoz-1.6-DP Fruktoz-1.6-difosfat aldolaz 2 Gliseraldehit-3-P Dihidroksi-aseton-P 2Pi 2 NAD Gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz 2 NADH+2H + 2 1.3-difosfogliserat 2 ADP 2 ATP 2 3-fosfogliserat 2 2-fosfogliserat H 2 O 2 Fosfoenolpirüvat Pirüvat kinaz 2 ADP 2 ATP 2 Pirüvat Laktat dehidrogenaz 2 NADH+2H + 2 NAD + 2 Laktat Şekil 2.1. Homofermantatif laktik asit fermantasyonu (Axelsson, 1998). 5

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sinem FETULLAHOĞLU Glikoz Glikokinaz ATP ADP Glikoz-6-P NAD + Glikoz-6-fosfat dehidrogenaz NADH + H + 6-fosfo-glukonat CO 2 NAD + 6-fosfo-glikonat dehidrogenaz NADH+H + Ribuloz-5-fosfat Ksiluloz -5-fosfat Pi Fosfoketolaz Gliseraldehit-3-P Asetik asit NAD + Gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz CoA NADH+H + Pi 1,3-difosfogliserat Asetil-CoA ADP CoA NADH+H + ATP Asetaldehit dehidrogenaz NAD + 3-fosfogliserat Asetaldehit Alkol dehidrogenaz NADH+H + NAD + 2-fosfogliserat Etil alkol H 2 O Fosfoenolpirüvat Pirüvat ADP kinaz ATP Pirüvat Laktat NADH+H + dehidrogenaz NAD + Laktat Şekil 2.2. Heterofermantatif laktik asit fermantasyonu (Axelsson, 1998). 6

3. MATERYAL ve METOT Sinem FETULLAHOĞLU 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal 3.1.1. Bakteriler Çalışmada, L. delbrueckii, L. fermentum, L. plantarum ve L. rhamnosus bakterileri kullanılmıştır. Bunlardan L. rhamnosus Danisco (Danimarka) firmasından, diğerleri bölümümüz Biyoteknoloji Laboratuarından temin edilmiştir. 3.1.2. Hammadde Denemelerde kullanılan şerbetçiotu içermeyen malt şırası Adana Efes Pilsen İşletmesi nden temin edilmiştir. 3.1.3. Denemelerde ve Analizlerde Kullanılan Araç ve Gereçler Malt şırasının sterilizasyonu amacıyla Hirayama Japonya marka otoklav kullanılmıştır. Bakterilerin çoğaltılması ve fermantasyonu, sıcaklığı ayarlanabilen Sanyo ve Velp Scientifica FTC 90E marka inkübatörlerde gerçekleştirilmiştir. Örneklerin santrifüjünde Eppendorf Centrifuge 5810 marka santrifüj, yoğunluk ve değişimin belirlenmesinde Mettler Toledo marka otomatik yoğunluk ölçer kullanılmıştır. ph tayininde İnolab marka ph metre kullanılmıştır. 3.2. Metot 3.2.1. Denemelerde Kullanılan Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması Denemelerde kullanılan L. delbrueckii, L. plantarum, L. fermentum, ve L. rhamnosus bakteri kültürleri API 50 CHL (BioMérieux, Fransa) galerileri yardımı ile tekrardan tanımlanarak doğrulanmıştır. Bu testte bakterilerin çeşitli karbon 7

3. MATERYAL ve METOT Sinem FETULLAHOĞLU bileşiklerini özümleme testleri gerçekleştirilmiş ve izolatların tanıları API Lab software (API system, BioMérieux, Fransa) de belirlenmiştir (Tamminen ve ark., 2004; Tamang ve ark., 2005; Randazzo ve ark., 2005). Daha sonra içerisinde 49 adet karbon bileşiği bulunan kuyucuklar, tanımlanacak bakteri ile doldurulmuş ve inkübasyona bırakılmıştır. 48 saatlik inkübasyon sonucunda karbonhidratları kullanıp bulanıklık oluşturmaları ve renk değişimleri dikkate alınarak sonuçlar (-) veya (+) olarak değerlendirilmiştir. API Lab Software (API system, Biomeriux, Fransa) sistemine sonuçlar girilerek laktik asit bakterileri belirlenmiştir. 3.2.2. Denemelerin Düzenlenmesi Denemeler Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Biyoteknoloji Laboratuarında gerçekleştirilmiştir. 3.2.2.1. Malt İçeceği Üretimi 3.2.2.1.(1). Aşılama Kültürünün Hazırlanması Aşılama için, de Man, Rogosa ve Sharp (MRS) agarda geliştirilen laktik asit bakterilerinden iki koloni, steril erlenmayer içerisinde bulunan steril şıraya aşılanmış ve 25 C de 48 saat bırakılmıştır. Daha sonra bakteriler %5 oranında şıralara aşılanmıştır. 3.2.2.1.(2). Laktik Asit Fermantasyonu Malt içeceği üretimi Şekil 3.1 de verilmiştir. Tortusundan ayrılıp, 2 litrelik erlenmayerlere 1500 ml şıra konulmuş, ağızları pamuk ve alimunyum folyo ile kapatıldıktan sonra 121 o C de 15 dak steril edilmiştir. Soğutulan şıraya çoğaltılmış kültürden % 5 oranında, aşılanmıştır. Fermantasyonlar paralelli olarak 25 o C lik bir odada yürütülmüştür. 8

3. MATERYAL ve METOT Sinem FETULLAHOĞLU Fermantasyonun gidişi toplam asit ve ph tayinleri yapılarak izlenmiştir. Fermantasyon tamamlandıktan sonra elde edilen malt içeceği sıcaklığı 4 o C olan bir odaya alınmış, aktarılarak tortusundan uzaklaştırılmıştır. Daha sonra kimyasal ve duyusal analizler için 1000 ml lik cam şişelere alınmış ve +4 o C de depolanmıştır. Örneklerin bir kısmı ise daha sonraki bazı analizler için derin dondurucuda saklanmıştır. Malt şırası (% 6 veya % 10 şeker yoğunluklu) Sterilizasyon Soğutma L. delbrueckii L. plantarum L. fermentum L. rhamnosus ilavesi ilavesi ilavesi ilavesi Fermantasyon Fermantasyon Fermantasyon Fermantasyon Tortu alma Tortu alma Tortu alma Tortu alma Şişeleme Şişeleme Şişeleme Şişeleme Malt içeceği Malt içeceği Malt içeceği Malt içeceği Şekil 3.1. Malt içeceği üretimi 9

3. MATERYAL ve METOT Sinem FETULLAHOĞLU 3.2.3. Analiz Metotları 3.2.3.1. Laktik Asit Bakterisi Sayımı Bakteri sayımı için örnekler aseptik koşullarda alınmış ve alınan örnekten 1 ml %0.85 lik steril fizyolojik su kullanılarak gerektiği kadar seyreltilmiştir. Daha sonra seyreltilmiş örnek (0.1 ml), MRS agar üzerine yayma yöntemi ile yayılmış ve petri kutuları içerisinde oksijeni uzaklaştıran gaz paketleri (anaerocult) bulunan kavanozlarda 30 C de 3-4 gün inkübe edilmiş ve oluşan koloniler sayılmıştır (Baker, 1991; Anon., 1997). 3.2.3.2. Malt Şıraları Üzerinde Yapılan Analizler Malt şıralarında yoğunluk, titrasyon asitliği, ph, etil alkol, organik asit analizleri yapılmıştır (Baker, 1991; Anon., 1997). 3.2.3.2.(1). Yoğunluk Tayini 1997). Malt şırasında yoğunluk, digital bir yoğunluk ölçerle ölçülmüştür (Anon., 3.2.2.3.(2). Toplam Asit Tayini Toplam asit miktarı, şırada belirteç olarak fenolftalein eşliğinde N/10 luk NaOH ile titre edilmesi suretiyle belirlenmiştir. Sonuçlar, laktik asit cinsinden, verilmiştir (Anon., 1997). 3.2.2.3.(3). ph Tayini ph, doğrudan ph metre kullanılarak ölçülmüştür (Anon., 1997). 10

3. MATERYAL ve METOT Sinem FETULLAHOĞLU 3.2.3.3. Malt İçeceklerinde Yapılan Analizler Malt içeceklerinde yoğunluk, titrasyon asitliliği, ph, organik asit, şeker ve etil alkol tayinleri yapılmıştır (Anon., 1997). 3.2.3.3.(1). ph Tayini Malt içeceklerinin (A.O.A.C., 1990). ph sı doğrudan ph metre kullanılarak ölçülmüştür 3.2.3.3.(2). Toplam Asit Tayini Toplam asit miktarı, şırada belirteç olarak fenolftalein eşliğinde N/10 luk NaOH ile titre edilmesi suretiyle belirlenmiştir. Sonuçlar, laktik asit cinsinden verilmiştir (Anon., 1997). 3.2.3.3.(3). Yoğunluk Tayini Malt içeceğinde yoğunluk, digital bir yoğunluk ölçerle g/cm3 cinsinden ölçülmüştür (Anon., 1997). 3.2.3.3.(5). Organik Asit ve Şekerlerin Tayini Organik asit (laktik, asetik, sitrik, okzalik asit, tartarik asit, malik asit, süksinik asit ve şekerlerin (glikoz, fruktoz, maltotrioz, sükroz+maltoz) tayinleri HPLC ile Erten (1998) e göre yapılmıştır. Malt içeceği örnekleri önce 0.45 μm lik filtreden, daha sonra 0.22 μm lik filtreden geçirilmiş ve Shimadzu LC-20AD model, SPD-20AUV ve RID 10A refraktif indeks dedektörlü HPLC cihazına enjekte edilmiştir. Taşıyıcı faz 5 mm lik sülfirik asit çözeltisi kullanılarak akış hızı 0.6 ml/dak olarak ayarlanmıştır. 11

3. MATERYAL ve METOT Sinem FETULLAHOĞLU Örneklerdeki şeker miktarının belirlenmesinde dış standart yöntemi kullanılmıştır. Bu amaçla şeker ve organik asit standartlarından 5 farklı konsantrasyonlarda kalibrasyon çözeltileri hesaplanıp HPLC de analiz edilerek elde edilen verilere doğrusal regrasyon analizi uygulanarak eğriyi tanımlayan eşitlik hesaplanmıştır. Bu eşitlik kullanılarak örneklerdeki şeker miktarları hesaplanmıştır. 3.2.3.4. Duyusal analizler Malt içeceğinin duyusal analizi Şekil 3.2 de görüldüğü gibi tercih testi ne göre yapılmıştır (Altuğ, 1993). Bu testte örnekler, en fazla tercih edilen en başta olmak üzere sıralanmıştır. 3.2.3.5. İstatistiksel analizler Malt içeceklerinde yapılan kimyasal ve duyusal analizlerden elde edilen veriler tek yönlü varyans analizine göre değerlendirilmiş ve önemli çıkan gruplar arasındaki farklılık Duncan çoklu karşılaştırma testine tabi tutulmuştur (Özdamar, 1999). 12

3. MATERYAL ve METOT Sinem FETULLAHOĞLU TERCİH TESTİ Adı Soyadı : Tarih : SIRALAMA : Örnekleri en fazla tercih ettiğiniz başta olmak üzere sıralayınız (En iyi örnek 1 sırada yer alacak) 1 2 3 4 Şekil 3.2. Duyusal analiz formu (Altuğ, 1993). 13

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1. Denemelerde Kullanılan Laktik Asit Bakterilerinin Tanımlanması Laktik asit bakterileri denemelerde kullanılmadan önce tanımlanmışlardır. Tanımlamalarda 49 adet karbonhidrat içeren API 50 CHL (BioMérieux, Fransa) galerileri kullanılmış ve elde edilen veriler API Lab software (API system, BioMérieux, Fransa) yardımıyla değerlendirilmiştir. Elde edilen verilere göre bakterilerin doğrulanma oranları, L. plantarum için %97.3, L. fermentum için %99.9, L. delbrueckii için %91.9 ve L. rhamnosus için %85.9 olarak belirlenmiştir. 4.2. Denemelerde Kullanılan Şıraların Bileşimi Denemelerde kullanılan şıraların genel bileşimleri Çizelge 4.1 de verilmiştir. Çizelge 4.1. % 6 ve % 10 Şeker yoğunluklu malt şıralarının bileşimi Bileşim %6 yoğunluklu malt şırası %10 yoğunluklu malt şırası ph 5.00 5.40 *Toplam asitlik (g/l) 0.650 1.20 Yoğunluk (g/cm 3 ) 1.0220 1.0380 *Laktik asit cinsinden Çizelge 4.1 den de görüldüğü gibi denemelerde kullanılan % 6 yoğunluklu malt şırasının ph sı 5.00 ve toplam asitlik miktarı, laktik asit cinsinden, 0.650 g/l olarak bulunmuştur. Yoğunluk ise 1.0220 g/cm 3 olarak belirlenmiştir. % 10 yoğunluklu malt şırasının ph sı 5.40, toplam asitlik miktarı, laktik asit cinsinden, 1.20 g/l ve yoğunluk 1.038 g/cm 3 olarak bulunmuştur. 14

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU 4.3. Laktik Asit Fermantasyonun Gidişi Şeker yoğunluğu % 6 olan şırada L. delbrueckii, L. fermentum, L. plantarum ve L. rhamnosus bakterilerini kullanarak yürütülen denemelerde laktik asit fermantasyonlarının gidişi ph ve toplam asitlik ölçümleri yapılarak izlenmiş ve sonuçlar Şekil 4.1 de verilmiştir. Şekil 4.1 den de görüldüğü gibi % 6 şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde laktik asit cinsinden toplam asit miktarı fermantasyon başında 7.89 g/l ile 1.17 g/l arasında bulunmuştur. Fermantasyon boyunca toplam asitlik artmış ve 7 günlük fermantasyon sonunda en yüksek toplam asitlik değeri, laktik asit cinsinden, 7.89 g/l ile L. rhamnosus ve en düşük değer L. fermentum bakterisinin kullanıldığı denemede, 4.37 g/l olarak elde edilmiştir. Toplam asitlik (laktik asit cinsinden, g/l) - ph değişimi 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ld, ph Ld, Toplam asitlik Lf, ph Lf, Toplam asitlik Lp, ph Lp, Toplam asitlik Lr, ph Lr, Toplam asitlik 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fermantasyon süresi (gün) Şekil 4.1. % 6 Şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde laktik asit fermantasyonu sırasında toplam asit miktarı ve ph değeri değişimi Ld: L. delbrueckii, Lf: L. fermentum, Lp: L. plantarum, Lr: L. rhamnosus 15

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU Şekil 4.1 den de görüldüğü gibi % 6 şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde ph değeri fermantasyon başında 4.23-4.97 arasında bulunmuştur. Gerçekleştirilen tüm denemelerde fermantasyon boyunca ph değerlerinde azalma gözlenmiş olup fermantasyon sonunda ph değerleri 3.13 ile 3.23 arasında değişmiştir. En yüksek değer L. delbrueckii nin kullanıldığı denemede elde edilmişken, en düşük değer ise L. plantarum un kullanıldığı denemede belirlenmiştir. Şeker yoğunluğu % 10 olan şırada L. delbrueckii, L. fermentum, L. plantarum ve L. rhamnosus bakterilerini kullanarak yapılan denemelerde laktik asit fermantasyonlarının gidişi ph ve toplam asitlik ölçümleri yapılarak izlenmiş ve sonuçlar Şekil 4.2 de verilmiştir. Toplam asitlik (laktik asit cinsinden, g/l) - ph değişimi 12 10 8 6 4 2 Ld, ph Lf, ph Lp, ph Lr, ph Ld, Toplam asitlik Lf, Toplam asitlik Lp, Toplam asitlik Lr, Toplam asitlik 0 0 2 4 6 8 10 12 Fermantasyon süresi (gün) Şekil 4.2. % 10 Şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde laktik Asit fermantasyonu sırasında toplam asit miktarı ve ph değeri değişimi Ld: L. delbrueckii, Lf: L. fermenrum, Lp: :L. plantarum, Lr: L. rhamnosus 16

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU Şekil 4.2 den de görüldüğü gibi % 10 şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde laktik asit cinsinden toplam asit miktarı fermantasyon başında 1.1 g/l ile 1.18 g/l arasında bulunmuştur. Denemelerde fermantasyon boyunca asitlik artmış ve 10 günlük fermantasyon sonunda en yüksek asitlik değeri, laktik asit cinsinden 9.70 g/l ile L. rhamnosus türünün kullanıldığı denemede elde edilmiştir. Bununla beraber, en düşük değer L. fermentum un kullanıldığı denemede 7.2 g/l olarak elde edilmiştir. L. plantarum ve L. delbrueckii bakterileri ise fermantasyon sonunda sırasıyla 9.21 g/l ve 9.29 g/l toplam asit, laktik asit cinsinden oluşturmuşlardır. Şekil 4.2 den de görüldüğü gibi % 10 şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde fermantasyon başında ph 5.08-5.41 arasında değişmiştir. En yüksek değer L. plantarum un ve en düşük değer de L. delbrueckii nin kullanıldığı denemede bulunmuştur. Öte yandan, gerçekleştirilen tüm denemelerde fermantasyonun 8. gününe kadar azalma gözlenmiş ve bu günden itibaren ph değerleri fermantasyon sonuna kadar sabit kalmıştır. Fermantasyon sonunda en yüksek ph değeri 3.33 ile L. fermentum un ve en düşük değer ise 3.02 ile L. rhamnosus un kullanıldığı denemede elde edilmiştir. 4.4. Malt İçeceği Fermantasyonunda Laktik Asit Bakterilerinin Gelişimi % 6 şeker yoğunluklu şırada L. delbrueckii, L. fermentum, L. plantarum ve L. rhamnosus bakterilerinin kullanıldığı denemelerde laktik asit bakterisi sayısındaki değişim Şekil 4.3 te verilmiştir. Şekil 4.3 ten de görüldüğü gibi laktik asit fermantasyonunun başlangıcında laktik asit bakteri sayısı 6.99 log kob/ml ile 7.46 log kob/ml arasında değişmiştir. En yüksek değer L. plantarum ve en düşük değer ise L. fermentum ile gerçekleştirilen denemelerde belirlenmiştir. Denemelerde L. plantarum ve L. rhamnosus sayılarında fermantasyonun dördüncü gününe kadar önemli bir artış gözlenmiştir. L. plantarum 8.95 log kob/ml ve L. rhamnosus 8.97 log kob/ml ile en yüksek değere ulaşmıştır. Dördüncü günden sonra bakteri sayılarında fermantasyon sonuna kadar azalma gözlenmiştir. Öte 17

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU yandan, L. fermentum türünün kullanıldığı denemede laktik asit bakteri sayısı fermantasyonun beşinci gününe kadar artmış ve en yüksek değer 8.81 log kob/ml olarak belirlenmiştir. Daha sonra fermantasyonun sonuna kadar azalma gözlenmiştir. Öte yandan, L. delbrueckii bakterisi diğer laktik asit bakterilerinin gerçekleştirdiği gibi gelişmeyi gösterememiştir. 9.5 9 Laktik asit bakteri sayısı (Log kob/ml) 8.5 8 7.5 7 6.5 6 5.5 Ld Lf Lp Lr 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Fermantasyon süresi (gün) Şekil 4.3. Laktik asit fermantasyonu süresince %6 şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde laktik asit bakterilerinin gelişimi Ld: L. delbrueckii, Lf: L. fermenrum, Lp: L. plantarum, Lr: L. rhamnosus % 10 şeker yoğunluklu şırada laktik asit bakterisi sayısındaki değişim Şekil 4.4 te verilmiştir. Şekil 4.4 ten de görüldüğü gibi fermantasyonunun başlangıcında laktik asit bakteri sayıları 7.54 log kob/ml ile 8.16 log kob/ml arasında değişmiştir. % 10 şeker yoğunluğunun olduğu şıralarda gerçekleştirilen denemelerde en yüksek laktik 18

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU asit bakterisi sayıları fermantasyonun üçüncü günü bulunmuştur. Üçüncü gün elde edilen değerler, 8.84 log kob/ml ile 8.89 log kob/ml arasında değişmiştir. Fermantasyonun üçüncü gününden sonra bakteri sayılarında fermantasyon sonuna kadar yavaş bir azalma gözlenmiştir. 9.5 9 Laktik asit bakteri sayısı (Log kob/ml) 8.5 8 7.5 7 6.5 6 Ld Lf Lp Lr 5.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fermantasyon süresi (gün) Şekil 4.4. Laktik asit fermantasyonu sırasında %10 şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemelerde laktik asit bakterilerinin gelişimi Ld: L. delbrueckii, Lf: L. fermenrum, Lp: L. plantarum, Lr: L. rhamnosus Öte yandan, Lactobacillus fermentum un kullanıldığı denemede laktik asit bakteri sayısı, %6 şeker yoğunluklu şıranın kullanıldığı denemede olduğu gibi fermantasyonun beşinci gününe kadar artmış ve 8.84 log kob/ml olarak elde edilmiştir. Daha sonra fermantasyonun sonuna kadar azalmıştır. 10 günlük fermantasyon sonunda en yüksek laktik asit bakteri sayısı 8.56 log kob/ml olarak L. delbrueckii nin kullanıldığı denemede belirlenmiştir. Öte yandan, en düşük laktik asit bakteri sayısı ise 7.92 log kob/ml olarak L. fermentum un kullanıldığı denemede bulunmuştur. 19

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU 4.5. Malt İçeceğinin Genel Bileşimi L. delbrueckii, L. fermentum, L. plantarum ve L. rhamnosus bakterileri kullanılarak elde edilen malt içeceklerin genel bileşimi aşağıda verilmiştir (Çizelge 4.2. ve Çizelge 4.3.). Çizelge 4.2. % 6 Şeker yoğunluklu şırayla laktik asit bakterileri kullanılarak elde edilen malt içeceklerin genel bileşimi L. L. L. L. *S delbrueckii fermentum plantarum rhamnosus Yoğunluk 1.0196 d 1.0205 c 1.0212 b 1.0216 a ** ph 3.23 a 3.19 b 3.13 d 3.15 c ** Toplam asit* (g/l) 6.85 c 4.37 d 7.16 b 7.89 a ** Organik asitler (g/l) Laktik asit 5.01 b 3.17 c 5.46 a 5.56 a ** Asetik asit 0.509 ab 0.721 a 0.705 a 0.453 b öd Süksinik asit 0.350 a 0.012 c 0.160 b 0.174 b ** Malik asit 0.405 a 0.219 c 0.303 b 0.216 c ** Oksalik asit 0.060 a 0.061 a 0.063 a 0.056 a öd Şekerler (g/l) Maltoz+sükroz 40.050 a 31.919 b 42.465 a 40.655 a ** Maltotrioz 8.457 a 8.437 a 7.236 ab 4.634 b öd Glikoz 0.015 c 6.454 a 0.256 b 0.014 c ** Fruktoz (g/l) 0.320 bc 0.838 a 0.527 b 0.116 c ** *laktik asit cinsinden, S: İstatistiksel değerlendirmede önem seviyesi. Çizelgede aynı satırda soldan sağa doğru aynı harf ile gösterilen değerler istatistiksel açıdan önemsizdir. Duncan testine göre istatistiksel olarak; *: %5, **: %1 önem seviyesinde, öd: önemsiz 20

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU Çizelge 4.3. % 10 Şeker yoğunluklu şırayla laktik asit bakterileri kullanılarak elde edilen malt içeceklerin genel bileşimi L. L. L. L. *S delbrueckii fermentum plantarum rhamnosus Yoğunluk 1.0346 b 1.0351 a 1.0349 a 1.0345 b ** ph 3.13 b 3.33 a 3.13 b 3.02 c ** Toplam asit* (g/l) 9.24 b 7.36 c 9.20 b 9.70 a ** Organik asitler (g/l) Laktik asit 7.87 a 5.55 b 6.81 ab 7.46 a ** Asetik asit 0.800 1.099 0.847 0.762 ** Süksinik asit 0.220 b 0.299 b 0.273 b 0.796 a ** Malik asit 0.513 a 0.324 b 0.385 b 0.353 b ** Oksalik asit 0.084 a 0.122 a 0.103 a 0.088 a öd Şekerler (g/l) Maltoz+sükroz 54.809 b 53.727 b 56.548 b 69.605 a * Maltotrioz 10.856 ab 7.336 bc 11.137 a 7.077 c öd Glikoz 0.016 b 10.504 a 0.035 b 0.019 b ** Fruktoz 1.352 c 0.622 b 0.141 a 0. 57 a öd *laktik asit cinsinden, S: İstatistiksel değerlendirmede önem seviyesi. Çizelgede aynı satırda soldan sağa doğru aynı harf ile gösterilen değerler istatistiksel açıdan önemsizdir. Duncan testine göre istatistiksel olarak; *: %5, **: %1 önem seviyesinde, ö.d.:önemsiz, 4.5.1. Yoğunluk Aynı şeker yoğunluklu şıradan elde edilen örneklerin yoğunluk değerleri birbirine yakın bulunmuştur. %6 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinin yoğunluk değerleri 1.0196 1.0216 (Çizelge 4.2) ve % 10 şeker yoğunluklu olandan üretilenlerde ise 1.0345 1.0351 (Çizelge 4.3) arasında değişmiştir. % 6 ve % 10 şeker yoğunluklu şıra ile üretilen malt içeceklerinde, yoğunluk bakımından, kullanılan laktik asit bakterileri arasındaki farklılık istatistiksel olarak % 1 önem seviyesinde bulunmuştur. %6 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde, yoğunluk bakımından tüm bakteri türleri arasında fark bulunmuşken, % 10 şeker yoğunluklu malt şıralarından elde edilenlerde, L. fermentum ve L. 21

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU plantarum un ve L. delbrueckii ve L. rhamnosus un kendi aralarında istatistiksel olarak fark yokken, L. fermentum ve L. plantarum ile L. delbrueckii ve L. rhamnosus arasında istatistiksel olarak fark bulunmuştur. Öte yandan, elde edilen yoğunluk değerleri bakımından bakteri türü ve şıra konsantrasyonu arasındaki interaksiyon istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 4.5.2. ph Malt içeceklerinin ph değerleri 3.02 3.33 arasında bulunmuştur (Çizelge 4.2, Çizelge 4.4.). en düşük ph değeri 3.02 L. plantarum un kullanıldığı % 10 şeker yoğunluklu şırada elde edilmiştir. Tenge ve Geiger (2001, 2003) malt içeceklerinin ph değerlerini 2.90 olarak bildirmişlerdir. Arslantaş ve ark., (2002) malt şıralarında ph değerlerini 3.16 3.20 arasında belirlemişlerdir. % 6 ve % 10 şeker yoğunluklu şıra ile gerçekleştirilen denemelerde ph bakımından kullanılan bakteri türleri arasında istatistiksel olarak fark vardır (p< 0.01). Öte yandan, % 10 yoğunluklu şıradaki denemelerde L. delbrueckii ve L. plantarum arasında istatistiksel olarak fark bulunmamışken, bu bakteriler ile L. fermentum ve L. rhamnosus arasında ph bakımından istatistiksel olarak fark bulunmuştur. Öte yandan, elde edilen ph değerleri bakımından bakteri türü ve şıra konsantrasyonu arasındaki interaksiyon istatistiksel olarak %1 önem seviyesinde önemli bulunmuştur. 4.5.3. Toplam Asit Toplam asitlik, titrasyon yoluyla belirlenir ve serbest halde bulunan asitlerin miktarını verir (Canbaş, 2009). Bu çalışmada malt içeceklerinin toplam asit içerikleri, laktik asit cinsinden, % 6 şeker yoğunluklu şıradan elde edilende 4.37 g/l ile 7.89 g/l arasında değişmiştir (Çizelge 4.2). En fazla asitlik değeri 7.89 g/l ile L. rhamnosus tarafından 22

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU oluşturulmuş, bunu sırasıyla 7.16 g/l ile L. plantarum ve L. delbrueckii 6.85 g/l izlemiş en az asitlik değeri 4.37 g/l ile L. fermentum tarafından üretilmiştir. % 10 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde toplam asitlik değeri, laktik asit cinsinden, 7.36 ile 9.70 g/l arasında bulunmuştur. Bu denemelerde L. rhamnosus 9.70 g/l ile en fazla asit oluşturmuştur. L. plantarum ve L. delbrueckii birbirine yakın sırasıyla 9.20 ve 9.24 g/l asit üretmişlerdir. L. fermentum ise 7.36 g/l ile en az asit oluşturan bakteri olmuştur. Arslantaş ve ark., (2002) malt şırasına, zeytin salamurası kullanarak ürettikleri malt içeceklerinde toplam asit değerlerini, laktik asit cinsinden, 3.3 5.1 g/l arasında olduğunu bildirmişlerdir. % 6 şeker yoğunluklu şıra ve % 10 şeker yoğunluklu şıra ile gerçekleştirilen denemelerde toplam asit bakımından kullanılan bakteri türleri arasında istatistiksel olarak fark vardır (p< 0.01). Öte yandan, % 10 yoğunluklu şıradaki denemelerde L. plantarum ve L. delbrueckii arasında istatistiksel olarak fark bulunmamıştır. Öte yandan, elde edilen toplam asitlik miktarları bakımından bakteri türü ve şıra konsantrasyonu arasındaki interaksiyon istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.01). 4.5.4. Organik Asitler Laktik asit fermantasyonunda en önemli ve baskın asit laktik asittir. Homofermantatif laktik asit bakterileri yalnızca laktik asit oluştururken, heterofermantatif laktik asit bakterileri esas ürün laktik asit yanında, asetik asit, etil alkol, CO 2 gibi yan ürünlerde oluşturur (Bergqvist ve ark., 2005, Erten ve ark., 2008). Bu çalışmada % 6 şeker yoğunluklu şıradan üretilen malt içeceklerinde (Çizelge 4.2) L. plantarum 5.46 g/l, L. rhamnosus 5.56 g/l, L. delbrueckii 5.01 g/l ve L. fermentum 3.17 g/l laktik asit üretmişlerdir. % 10 şeker yoğunluklu şırada (Çizelge 4.3) L. delbrueckii 7.87 g/l, L. rhamnosus 7.46 g/l, L. plantarum 6.81 g/l ve L. fermentum 5.55 g/l laktik asit oluşturmuşlardır. Tenge ve Geiger (2003), % 6 ve % 10 şeker yoğunluklu şıralardan elde ettikleri malt içeceklerinde laktik asit miktarını sırasıyla 11.3 g/l ve 17.4 g/l olarak 23

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU bildirmişlerdir. Bu çalışmada elde edilen değerler Tenge ve Geiger (2003) in elde ettikleri değerlerden düşüktür. Yapılan çalışmada her iki şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde laktik asit bakımından istatistiksel olarak fark vardır (p<0.01). Bunun yanı sıra, % 6 şeker yoğunluklu şıradan gerçekleştirilen denemelerde L. plantarum ve L. rhamnosus bakterileri arasında ve % 10 şeker yoğunluklu şıradan gerçekleştirilenlerde de L. plantarum ile diğer bakterilerin arasında laktik asit bakımından fark bulunmamıştır. Bu çalışmada, elde edilen malt içeceklerinde diğer organik asitlerin (asetik asit, oksalik asit, malik asit ve süksinik asit) miktarları düşüktür. Lactobacillus cinsine giren laktik asit bakterilerinden L. delbrueckii zorunlu heterofermantatif, L. plantarum ve L. rhamnosus fakültatif heterofermantatif ve L. fermentum zorunlu heterofermantatiftir ( Stiles ve Holzapfel, 1997). Zorunlu homofermantatif laktobasiller, EMP yolunu kullanarak heksozların en az % 85 ini fermente ederek yalnızca laktik aside dönüştürürler. Bu bakteriler fosfoketolaz enzimi içermezler bu nedenle, glikonat ve pentozları fermente edemezler. Fakültatif heterofermantatif laktobasiller heksozları EMP yoluyla yalnızca laktik aside dönüştürürler. Bunlar aldolaz ve fosfoketolaz enzimlerini içerirler, bu nedenle hem heksozları hem pentozları ve glikonatı fermente edebilirler. Ancak glikoz varlığında, fosfoglikonat (heksozmonofosfat) yolu enzimleri baskılanır. Zorunlu heterofermantatif laktobasiller, heksozları fosfoglukonat yolunu kullanarak eşit oranlarda laktik asit, etil alkol, asetik asit ve CO 2 e dönüştürürler. Bunlar yalnızca fosfoketolaz enzimi içerirler. (Hammes ve Vogel, 1995). Bu çalışmada heterofermantatif L. fermentum diğer bakterilere göre daha fazla asetik asit oluşturmuştur. Charalampopoulos ve ark. (2002) malt, arpa ve buğday şıralarında probiyotik L. fermentum, L. acidophilus, L. reuteri ve L. plantarum laktik asit bakterilerini kullanarak tahıl içeceği üretimi üzerine çalışmışlar ve bu bakterilerin esas ürün laktik asit yanında asetik asidi de ürettiklerini bildirmişlerdir. Bu çalışmada, laktik asit ve asetik ait dışındaki asitler bakteriler tarafından üretilmemiş, malt şırası ortamında bulunan asitler olabilir. 24

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU 4.5.5. Şekerler Malt şırasında en fazla bulunan fermente edilebilir şekerler maltoz ve maltotriozdur (Munroe, 2006). HPLC analizlerinde maltoz ve sükrozun beraber salınmaları nedeniyle aynı piki vermişlerdir. Bu nedenle sonuçlar, maltoz + sükroz olarak verilmiştir. Maltoz + sükroz miktarları % 6 şeker içeren şıradan elde edilen malt içeceklerinde 31.919 g/l ile 42.465 g/l (Çizelge 4.2) ve % 10 şeker içerenden üretilenlerde ise 53.727 g/l ile 69.605 g/l (Çizelge 4.3) arasında belirlenmiştir. Maltotrioz değerleri ise 4.634 g/l ile 11.137 g/l (Çizelge 4.2 ve Çizelge 4.3) arasında bulunmuştur. L. fermentum tarafından üretilen örnekte 6.454 g/l (Çizelge 4.2) ve 10.504 g/l (Çizelge 4.3) glikoz belirlenmiştir. Fruktoz miktarı her iki içecekte de oldukça düşük miktarda saptanmıştır. Elde edilen verilere göre denemelerde kullanılan laktik asit bakterilerinin şekerleri, özellikle maltoz + sükroz ve maltotriozu, tam olarak fermente edip, laktik asite dönüştüremedikleri söylenebilir. Charalampopoulos ve ark. (2002), L. fermentum, L. reuteri, L. plantarum ve L. acidophilus bakterilerini kullanarak malt, arpa ve buğday şıralarından elde edilen ürünlerde fermente olmamış maltoz, sükroz glikoz ve fruktoz belirlemişlerdir. % 6 şeker yoğunluğundaki şıradan elde edilen malt içeceklerinde maltoz+sükroz bakımından, % 5 önem seviyesinde belirlenirken; % 10 şeker yoğunluğundaki şıradan elde edilenlerde, % 1 önem seviyesinde belirlenmiştir. Öte yandan, % 6 şeker yoğunluklu örneklerde, L. delbrueckii, L. plantarum ve L. rhamnosus bakterileri ve % 10 şeker yoğunluklu örneklerde de, L. delbrueckii, L. fermentum ve L. plantarum bakterileri arasında bir farklılık bulunmamıştır. İstatistiksel açıdan gerçekleştirilen her iki denemede de maltotrioz bakımından bir farklılık bulunmamıştır. Glikoz bakımından her iki denemede de kullanılan laktik asit bakterileri arasında istatistiksel açıdan fark bulunmuşken (p<0.01), fruktoz bakımından % 6 şeker yoğunluklu denemede istatistiksel açıdan fark belirlenmiş (p<0.01), % 10 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen denemede bir farklılık bulunamamıştır. 25

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU Öte yandan, maltotrioz dışındaki şekerler bakımından bakteri türü ve şıra konsantrasyonu arasındaki interaksiyon istatistiksel olarak önemli bulunmuşken (p<0.01), maltotrioz miktarları istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur. 4.6. Duyusal Analizler %6 ve %10 luk malt şıralarından elde edilen malt içeceklerinin tercih testine göre duyusal analiz sonuçları Çizelge 4.4 ve Çizelge 4.6 da verilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, % 6 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde, en çok beğenilen L. fermentum ile elde edilen malt içeceği olurken, en az beğenilen örnek ise L. plantarum un kullanıldığı denemede elde edilmiştir. Öte yandan, % 10 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde, en çok beğenilen örnek L. rhamnosus un kullanıldığı deneme olurken, en az tercih edilen örnek ise L. plantarum ve L. delbrueckii nin kullanıldığı denemede bulunmuştur. Çizelge 4.4. %6 lık malt şırasından elde edilen malt içeceklerinin tercih testine göre duyusal analiz sonuçları Panelist no L. delbrueckii L.fermentum L.plantarum L.rhamnosus 1 3 1 3 5 2 2 1 2 4 3 2 1 2 4 4 2 2 4 3 5 3 2 3 5 6 2 1 3 5 7 4 2 4 3 8 2 2 4 3 9 4 2 4 3 10 2 1 3 5 Toplam 26 15 33 26 %6 ve %10 luk malt şırasından elde edilen malt içeceklerinin tercih testine göre elde edilen verileri, Varyans Analizine göre (Roessler ve ark., 1978; Barillere ve 26

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU Benard, 1986) istatistiksel olarak değerlendirilmiş ve elde edilen sonuçlar Çizelge 4.5. ve Çizelge 4.7 de verilmiştir. Çizelge 4.5. %6 lık malt şırasından elde edilen malt içeceklerinin aldığı puanların Varyans Analizine göre kıyaslanması * Örnekler Sıralama puanları arasındaki fark (%1 güven sınırında) L. fermentum L. delbrueckii L.rhamnosus L. plantarum 15 26 26 33 Çizelge 4.6. %10 luk malt şırasından elde edilen malt içeceklerinin tercih testine göre duyusal analiz sonuçları Panelist no L. delbrueckii L.fermentum L.plantarum L.rhamnosus 1 4 3 2 1 2 1 2 4 3 3 4 3 2 1 4 4 2 3 1 5 4 2 3 1 6 4 2 3 1 7 4 2 3 1 8 4 3 2 1 9 3 2 4 1 10 3 2 4 1 Toplam 35 23 30 12 Çizelge 4.7. %10 luk malt şırasından elde edilen malt içeceklerinin aldığı puanların Varyans Analizine göre kıyaslanması * Örnekler Sıralama puanları arasındaki fark (%1 güven sınırında) L rhamnosus L. fermentum L.plantarum L. delbrueckii 12 23 30 35 Malt içecekleri örnekleri tercih testine göre duyusal olarak değerlendirilmiştir. 10 panelist tarafından yapılan değerlendirmede, panelistler örnekleri en beğendiklerinden beğenmediklerine doğru sıralamışlardır. 27

4.ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Sinem FETULLAHOĞLU Yapılan duyusal analizler sonucunda Çizelgelerden de görüldüğü gibi panelistlerin % 6 lık ve % 10 luk malt şıralarından elde edilen malt içeceklerini değerlendirmeleri sonucu veriler arasında istatistiksel olarak % 1 önem seviyesinde fark belirlenmiştir. Öte yandan, Varyans Analizine göre % 6 yoğunluktaki şıradan elde edilen malt içeceklerinde, L. delbrueckii ile L. rhamnosus arasında istatistiksel olarak fark belirlenememişken, L. fermentum ve L. plantarum arasında istatistiksel olarak fark bulunmuştur (p<0.01). % 10 luk malt şıralarından elde edilen malt içeceklerinin tercih testine göre duyusal değerlendirmeleri sonucu L. plantarum ve L. delbrueckii arasında istatistiksel olarak fark yokken, bu bakteriler ile L. rhamnosus ve L. fermentum arasındaki fark önemli bulunmuştur. Öte yandan, gerçekleştirilen duyusal analizi sonuçları bakımından bakteri türü ve şıra konsantrasyonu arasındaki interaksiyon istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05). 28

5. SONUÇLAR Sinem FETULLAHOĞLU 5.SONUÇLAR Bu çalışmada L. delbrueckii, L. fermentum, L. plantarum ve L. rhamnosus laktik asit bakterilerini kullanarak şerbetçiotu içermeyen %6 ve %10 şeker yoğunluklu malt şıralarından malt içeceği üretme olanakları araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre; Fermantasyon süresince toplam asitlik değerleri artmış ve en fazla toplam asidi L. rhamnosus ve en düşük toplam asidi de L. fermentum bakterisi oluşturmuştur. Malt içeceği üretiminde fermantasyon sırasında örneklerde; genel olarak laktik asit bakterisi sayısı artmış ve en yüksek değerlere (8.84-8.97 log kob/ml) ulaştıktan sonra fermantasyon sonuna doğru sayılarında azalma gözlenmiştir. Elde edilen verilere göre kullanılan laktik asit bakterileri, malt içeceklerinin kimyasal bileşimi ve duyusal özellikleri üzerinde etkili olmuşlardır. Organik asitlerden laktik asit en fazla üretilen asit olmuştur. Diğer organik asitlerin miktarı 1 g/l nin altında bulunmuştur. Malt şırasında bulunan fermente olabilir şekerler fermantasyon sırasında laktik asit bakterileri tarafından tamamen kullanılamamıştır. Duyusal değerlendirmede tercih tesit uygulanmış ve en çok beğenilen örnek % 6 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde L. fermentum ve % 10 şeker yoğunluklu şıradan elde edilen malt içeceklerinde L. rhamnosus ile elde edilen içecek olmuştur. 29