AKCİĞER TÜBERKÜLOZUNUN AKTİVİTE TAYİNİNDE, BRONKOALVEOLER LAVAJ SIVISINDA ADENOZİN DEAMİNAZ İZOENZİM DÜZEYLERİNİN ROLÜ

T.C. Sağlık Bakanlığı Yedikule Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Eğt. ve Arş. Hastanesi 7. Göğüs Hastalıkları Kliniği Şef: Doç.Dr. Sedat Altın AKCİĞER TÜBERKÜLOZUNUN AKTİVİTE TAYİNİNDE, BRONKOALVEOLER LAVAJ SIVISINDA ADENOZİN DEAMİNAZ İZOENZİM DÜZEYLERİNİN ROLÜ (UZMANLIK TEZİ) DR. GÜLŞAH ŞAFAK GÜNLÜOĞLU İSTANBUL 2004

TEŞEKKÜR Her zaman asistanı olmaktan gurur duyacağım, sevgisini, güler yüzünü bizden eksik etmeyen, engin bilgi ve tecrübelerinden hayatımın her döneminde yararlanacağım Klinik Şefim, Doç.Dr. Sayın Sedat Altın a, Çalışma azmine hayran olduğum, eğitimime yaptığı büyük katkılarından dolayı minnet duyduğum Uzman Dr. Sayın Erdoğan Çetinkaya ya, Eğitimime katkı sağlayan klinik şefleri; Sayın Dr. Saadettin Çıkrıkçıoğlu, Sayın Dr. Güngör Çamsarı, Sayın Dr. Arman Poluman, Sayın Dr. Veysel Yılmaz, Sayın Dr. Emel Çağlar, Sayın Dr. Filiz Koşar, Sayın Dr. Esin Tuncay ve tüm kliniklerin uzman doktorlarına, Dostluk ve sevgi ortamı içinde çalıştığım 7. Klinik asistan doktor arkadaşlarıma, hemşire ve çalışanlarına, Sevgi ve desteğiyle bana güç veren değerli eşime, Teşekkür ederim.. 2

İÇİNDEKİLER KISALTMALAR 3 GİRİŞ VE AMAÇ 4 GENEL BİLGİLER 5 -TÜBERKÜLOZ 5 -İMMÜNPATOGENEZ 6 -TÜBERKÜLOZA KARŞI GELİŞEN İMMÜNİTE PATOGENEZİ 9 -TÜBERKÜLOZ LEZYONLARININ HÜCRESEL KOMPONENTLERİ 11 -TÜBERKÜLOZDA TANI 17 -BAKTERİYOLOJİK OLGU TANIMLARI 21 -ADENOZİN DEAMİNAZ 22 HASTALAR VE YÖNTEM 25 BULGULAR 28 TARTIŞMA 34 SONUÇ 40 KAYNAKLAR 41 3

KISALTMALAR ADA... :Adenozin Deaminaz APC... : Antijen Sunan Hücre (Antigene Presenting Cell) ARB... :Aside Rezistan Basil BAL... :Bronkoalveoler lavaj BCG... :Bacillus Calmette Guerin CD... :Cluster of Differantiaton CDC... : Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (Center of Disease Control and Prevention) E.H.N.A... :Erytro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine EKG... :Elektrokardiyografi FOB... :Fiberoptik Bronkoskopi GAD... :Gecikmiş aşırı duyarlılık HİD... :Hücre aracılı immün direnç IgG... :Immünglobulin G INF... IL... :Interferon :Interlökin LT... :Lenfotoksin MGIT... :Mycobacterium Growth Indicator Tube MHC... :Major Histocompatibility Complex MCP... :Monosit Kemotaktan Protein NK... :Natural Killer PGE... :Prostoglandin E TNF... :Tümör Nekroz Faktör 4

GİRİŞ VE AMAÇ: Tüberküloz, tanı ve tedavideki gelişmelere rağmen, ülkemizde olduğu gibi, tüm dünyada önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Dünyada her yıl yaklaşık 2 milyon insan, bu hastalık nedeniyle ölmektedir (1). Etken olan Mycobacterium tuberculosis in bakteriyolojik yöntemlerle izole edilmesi, hastalığın tanısında altın standart tır (2). Ancak hastaların bir kısmında, klinik ve radyolojik olarak tüberküloz düşünülmekle birlikte, tüm gayretlere rağmen bakteriyolojik tanıya ulaşılamamaktadır. Bu hastalarda, antitüberküloz tedaviye başlama kararını vermek, klinisyenler için önemli bir problemdir. Tüberkülozun çeşitli formlarında, Adenozin Deaminaz (ADA) enzim düzeyinin yüksek olduğu gösterilmiştir (2-6). Akciğer tüberkülozu hastalarında, BAL da ADA enzim düzeyinin yükseldiği de son yıllarda bildirilmektedir (6-8). Ancak bu düzeyler, tüberküloz için yeterince spesifik bulunmamıştır. ADA enzimi, ADA-1 ve ADA-2 olmak üzere iki izoenzimden oluşmaktadır. ADA-2 izoenziminin, bazı granulomatöz akciğer hastalıklarında yükseldiği bildirilmektedir (7). Bu çalışmada, yayma negatif akciğer tüberkülozu hastalarında, Bronkoalveoler lavaj (BAL) da ölçülen ADA izoenzim düzeylerinin, aktif tüberküloz hastalığı varlığını destekleme ve tedaviye başlama kararını verdirmedeki rolü araştırıldı.. 5

GENEL BİLGİLER TÜBERKÜLOZ Tüberküloz, kayıtlı tarihin başlangıcından önce insanlığı etkilediği bilinen bir hastalıktır. M.Ö. 5000 yılına ait iskeletlerde dahi hastalığın izlerine rastlanmıştır. Tüberküloz hakkındaki ilk yazılı bilgiye MÖ.700 yılına ait Hint kaynaklarında rastlanmıştır. Hipokrat ise, hastalığı tanımlamakla kalmamış, hastalığa eriyip bitmek anlamına gelen phthisis ismini vermiştir. Aristo, hastalığın bulaşıcı natürünü farketmiş olmasına rağmen bulaşıcı ajanın tüberküloz basili olduğu ancak 1882 de Koch tarafından ispat edilmiştir (7). Tüberküloz, olguların %98 inde Mycobacterium tuberculosis tarafından oluşturulmakla birlikte Mycobacterium africanum ve Mycobacterium bovis cinsi mycobacteri ler tarafından da oluşturulan kronik, granülomatöz bir enfeksiyon hastalığıdır. Tüm organları tutmakla birlikte en sık (%85) tutulan organ akciğerdir (10). Hastalığın ve etkenin tanımlanması ve 1950 lerde etkili kemoterapinin gelişmesine rağmen Mycobacterium tuberculosis halen majör bir pulmoner patojen olmaya ve tüberküloz, yetişkinlerde infeksiyöz hastalık kaynaklı ölümlerin en önemli nedeni olmaya devam etmektedir. Bugün dünya nüfusunun %32 si Mycobacterium tuberculosis ile enfektedir, her yıl yaklaşık 8 milyon kişi tüberküloz hastalığına yakalanmakta ve yaklaşık 2 milyon insan bu hastalıktan ölmektedir (1). İMMÜN PATOGENEZ 6

Normal immün fonksiyonu olan bireylerin çoğunda basille ilk enfeksiyon, hücre aracılıklı immünitenin oluşumuyla durdurulur. Primer enfeksiyonun tek belirtisi çoğu zaman tüberkülin deri testinin pozitifleşmesidir. Normal immüniteye sahip enfekte bireylerin %10 unda, hayatlarının bir döneminde aktif tüberküloz hastalığı gelişir. Hücre aracılı immünitenin basille oluşan enfeksiyonu kontrol altına alamadığı bazı bireylerde ise, primer enfeksiyonun devamında aktif hastalık gelişebilir. Tüberkülozun bu masif yayılımı, yalnızca, yetersiz immüniteye sahip kişilerde ortaya çıkar. Tüberküloz ile oluşan primer enfeksiyon sırasında gelişen hematojen yayılım akciğer apekslerinde basillerin yerleşmesi ile sonuçlanır. Bundan aylar ve yıllar sonra bu odaklarda basillerin yeniden üreyerek hastalık oluşturmasına reaktivasyon tüberkülozu denir (24). Mycobacterium tuberculosis basilinin inhalasyonundan sonra vücutta gelişen olayları anlamak için, öncelikle immün reaksiyonları açıklayalım; Hücresel İmmün Direnç (HİD): Hücre içi bakteriye karşı başlıca koruyucu immün yanıttır. HİD, parazit, mantar, virüs, bakteri gibi mikroorganizmaları öldürmek, tümör hücrelerini parçalamak, graft rejeksiyonu gibi sonuçlara neden olabilir (11). Bu reaksiyon, antijen varlığında, lokal olarak sitokin oluşturabilen, geniş bir spesifik T lenfosit populasyonu oluşumuyla karakterize, yararlı bir konak yanıtı olarak tanımlanabilir (12). 1960 larda Mackaness (14), kazanılmış hücresel direncin, başlangıçta non-spesifik olduğunu gösterdi. Aktive makrofajlar, yalnız aktivasyonlarına neden olan tipi değil, birçok fakültatif intrasellüler bakteriyi inhibe yada harab edebilir. Bununla beraber, primer enfeksiyonun iyileşmesiyle, aktive makrofajların kaybolmasından sonra yalnızca spesifik bakteriler aktive makrofajların yeniden ve hızla oluşmasını sağlayabilir. Bu hızlı hatırlatma cevabı spesifik antijen için reseptör taşıyan Th1 lenfositlerin (hafıza hücreleri) varlığına bağlıdır (15). Non-aktive makrofajlarda gelişmekte olan tüberküloz basilinden sağlanan antijenler, bu uzun ömürlü spesifik Th1 lenfosit populasyonunun stimulasyonuna neden olur. Böylece IL-2 ve INF-γ salgılanır. IL-2, bu spesifik Th1 hücrelerinin artışını sağlarken (16,17), INF-γ, makrofajları aktive eder (15). Reenfeksiyon alanında lokal makrofajların birikimi ve aktivasyonu, genellikle yeni lezyonların ilerlemesini önler. Diğer bir deyişle, artan spesifik Th1 lenfosit populasyonu, basil yerleşim alanında, hızla ve fazla miktada aktive makrofaj üretimini sağlar. 7

CD 4 T hücreler, hücresel ve humoral her iki spesifik immüniteyi de, APC(antijen sunan hücre) yüzeyindeki kendi MHC Class II moleküllerine bağlanan protein antijenlerini tanıyarak başlatır. Spesifik antijenle aktive olan T hücreleri sitokinler sekrete eder. Bunların çoğu konakçı defansının diğer hücre grupları üzerinde etki gösterir. Örneğin, TNF ve lenfotoksin (LT), nötrofil ve vasküler endotelyel hücreleri, IL-5 eozinofilleri, INF-γ mononükleer fagositleri, IL-2 T ve B lenfositlerin her ikisini olduğu kadar NK(Natural Killer) hücrelerini de aktive eder. T hücreleri, sitokin sekresyonu aracılığı ile doğuştan olan immünitenin nonspesifik efektör hücrelerinin fonksiyonlarını uyarır, böylece bu hücreleri spesifik immünitenin ajanlarına çevirir. Antijenle aktive olan T hücrelerinin ürettiği sitokinlerin çok sayıda olması, her biri farklı fakat hücresel hedefte üst üste yerleşmesi akla bazı tür antijenler bazı tip immün reaksiyonları nasıl seçer sorusunu getirmektedir. T hücreleri aynı paternde sitokinler üretip farklı fonksiyonlar gösteren altgruplara farklılaşır. Farklı antijenlerin farklı T hücre alt gruplarını nasıl aktive ettiği ve genişlettiği henüz tam olarak anlaşılmış değildir. HİD paterni, doğuştan olan immün sistem üzerine mikropların etkileri tarafından belirleniyor olabilir. Mikroplar makrofajları, CD 4 T hücrelerinin Th1 hücre farklılaşmasına katkıda bulunarak ve NK hücre üzerine bu sitokinlerin direkt etkileri yoluyla, Gecikmiş tipte aşırı duyarlılık (GAD) ve sitolitik hücre yanıtının tetikleyicisi olan IL-12 sekrete etmek üzere uyarmaktadırlar (20). IL12, Th1 populasyonunun spesifik olarak genişlemesini ve fonksiyonların düzenlenmesini sağlayan major sitokindir. Makrofajlar ve NK hücreler, özellikle Mycobacterium tuberculosis ve bazı bakteriler tarafından aktive edildiği zaman IL-12 nin başlıca üreticisidir. Böylece IL-12 tüberkülozun patogenezini kontrol eden HİD ve GAD oluşmasında major rol oynar. Gecikmiş Tipte Aşırı Duyarlılık (GAD): Hücre içi bakteri, aktive olmamış fagositler tarafından fagosite edilir ancak öldürülemezse ve hatta onların stoplazması ya da fagozomları içinde yaşamayı tercih ederse, bu non-aktive makrofajların yok edilmesi gerekir. GAD, bunu sağlar (18). Bu reaksiyonun kontrolünü, HİD de olduğu gibi, bir CD 4 T lenfosit alt grubu olan Th1 lenfositler oluşturur (19). Non- aktive makrofajlarda logaritmik olarak çoğalan basili kontrol etmenin tek yolu, basil yüklü makrofajların öldürülmesidir. GAD, basillerin yerleştiği yerde non-aktive makrofajları öldürecek sitotoksik lenfosit ve makrofajların birikimine neden olur. 8

GAD yanıtının fazları (11,20) 1. Tanıma/aktivasyon fazı: Th1-CD 4 ve bazen CD 8 hücreler, antijen sunan hücrenin yüzeyinde sunulan yabancı protein antijenlerini tanır ve sitokinler oluşturarak yanıt verir. 2. İnflamasyon: Aktive T hücreleriyle kontakt sayesinde ve sitokinler tarafından vasküler endotelyal hücreler aktive edilir, bu da, dolaşan lökositlerin dokuda toplanmasına neden olur. 3. Rezolüsyon: Sitokinler tarafından aktive edilen makrofajlar, yabancı antijenin ortadan kaldırılmasına çalışır. Bu proçese doku hasarı eşlik edebilir. GAD de sitokinler GAD reaksiyonu geliştirmede birçok sitokinler rol oynar. T hücreleri tarafından üretilen sitokinlerin bir kısmı makrofajları aktivasyon yerine yaklaştırır ve aktive eder. IL3 ve GM-CSF(granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör), granülosit-monosit kökenli lokalize hemopoezi uyarır. INF-γ ve TNF-β (makrofaj kökenli TNF-α ve IL-1 ile birlikte) yakınındaki endotel hücreleri üzerine etkili olarak monosit ve diğer nonspesifik inflamatuar hücrelerin damar dışına çıkmasını kolaylaştıracak bir takım değişiklikleri uyarır. Nötrofiller reaksiyonda erken görülmesine rağmen, 24 saat sonra makrofaj ve lenfositler hakim olur. Monosit infiltrasyonu antijenik karşılaşmadan sonraki 24-48 saat arasında gelişir (11). GAD, çok efektif bir savunma mekanizmasıdır çünkü, makofajların öldürülmesi sırasında oluşan solid kazeöz nekrotik dokuda basil çoğalamaz. Tüberküloz basili aslında kendi başına non-toksik tir ve dokuda harabiyete neden olmaz. Dokuda harabiyete neden olan, vücudun kendi savunma mekanizmasıdır. Eğer çok fazla lokal antijen varsa, GAD, doku nekrozuna neden olur, bu nedenle aşırı duyarlılık olarak adlandırılır (20). Aynı nekroz, standart (azaltılmamış) konsantrasyonda tüberkülin, yüksek sensitiviteli hastaya enjekte edildiğinde, ciltte gözlenebilir (13). Konakçı tarafından oluşturulan hem HİD hem GAD yanıtları, tüberküloz basillerinin çoğalmasını eşit düzeylerde inhibe ederler. HİD bunu, fagosite ettikleri basilleri öldürmeleri için makrofajları aktive ederek yapar. GAD ise basil yüklü aktive makrofajları ve komşu dokuları harap edip, basillerin üremesi için uygun hücre içi ortamı ortadan kaldırarak sağlar (24). Sonuç olarak, HİD i güçlü olan konaklar basil üremesini durdurabilir ancak HİD i kötü olan konaklar basil büyümesini kendi dokularının çok daha fazlasını heba ederek durdurabilir (12). 9

TÜBERKÜLOZA KARŞI GELİŞEN İMMÜNİTE PATOGENEZİ Pulmoner tüberküloz gelişimi, işgalci basil ile ev sahibi vücut arasındaki bir savaşlar zincirine benzetilebilir (19,21,22). Bir odaktaki savaş diğerinden bağımsız olarak devam eder. Dokunun çeşitli yerlerindeki her savaşın kazanılması vücut için gittikçe daha zorlaşır. Vücudun silahları şunlardır; a. Aktive makrofajlar; yutulan basili öldürebilir yada inhibe edebilirler (19,21,22). b. Sitotoksik hücreler; stoplazmalarında aktif olarak çoğalan tüberküloz basili taşıyan nonaktive makrofajları direkt yada indirekt olarak öldürürler (21,22). Non-aktive makrofajların ölümü sonucunda basiller gelişimleri için daha uygun bir ortam olan intrasellüler alandan, basil gelişimini inhibe eden ekstrasellüler solid kazeöz (nekrotik) dokuya geçerler. Basilin silahları ise şunlardır; a. Kandan infeksiyon alanına yeni göç etmiş monositler ve non-aktive makrofajlar içinde logaritmik olarak çoğalabilme yeteneği, b. Likefiye kazeöz materyal içinde bazen muazzam bir hızda çoğalabilme yeteneği (19,21,22). Bu savaş, Dannenberg (23) tarafından 5 evrede modellenmiştir; Evre1 (Başlangıç evresi): İnfeksiyonun ilk haftasını kapsar. Alveole, 3 ten fazla basil içeren inhale partiküller ulaşamaz ve atılır. 1-3 basil içeren partiküller ise, havada asılı kalabilir ve bunların 1/3 ü alveoler boşluğa ulaşabilir. Alveoler boşlukta partikül ekshale edilebilir, lenfatikler yoluyla drene edilebilir, ya da genellikle alveolar makrofaj tarafından yutulur. Alveoler makrofajlar, fagosite ettikleri basilleri %90 oranında öldürürler. Enfeksiyonun bundan sonraki seyri makrofajların kalıtsal mikrobisidal gücüne ve basilin genetik virulansına göre değişir (24). Evre 2 [Ortak yaşam (symbiosis) ve basillerin logaritmik çoğalma evresi]: İnfeksiyondan sonraki 2-3. haftalarda, yok edilemeyen 1-3 basil taşıyan makrofajlar parçalanır ve basiller, alveoler boşluğa salınır. Ortaya çıkan antijenler ve salınan kemotaktik faktörler yardımıyla dolaşımdaki non-aktive makrofajlar infeksiyon alanında toplanır. Basilleri fagosite eden ancak yok edemeyen bu makrofajlarda basiller çoğalır ve akciğerdeki basil sayısı 20-30 katına ulaşır. Basiller, makrofajlarca, bölgesel lenf bezlerine, burada kontrol altına alınamazlarsa, hematojen yolla diğer organlara taşınırlar.hid in gelişmediği bu evrede, nonspesifik savunma, basillerin çoğalmasını önleyememektedir (24). Evre 3 (HİD ve GAD gelişimiyle enfeksiyonun kontrolü): 3. haftadan sonra, hem HİD hem de GAD gelişir. HİD sayesinde infeksiyon alanında aktive makrofajlar devreye girerken, 10

GAD sayesinde, çevre doku ile birlikte, basil yüklü makrofajlar harap edilir. Böylece, oluşan kazeöz nekroz alanında, basilin logaritmik çoğalması durdurulur. Aynı dönemde, konakçının tüberkülin deri testi de pozitifleşir (24). Kazeöz nekrotik ortamda, anoksik koşullar, düşük ph, toksik yağ asitlerinin varlığı gibi nedenlerle basillerin bir kısmı ölür bir kısmı dormant (canlı ancak çoğalamayan) halde kalır. Evre 4 (HİD ve GAD arasında karşılıklı etkileşim): İmmün sistemi güçlü kişilerde, granulomların ortasında oluşan kazeöz alanlardan kaçabilen basiller, HİD sayesinde, bu odağı çevreleyen aktive olmuş makrofajlarca fagosite ve yok edilecektir. Öldürülemeyen ve makrofaj içinde yaşayan basil varlığında, GAD devreye girecektir. İmmün sistemi zayıf kişilerde ise HİD yetersiz olduğundan, aktive olmuş makrofaj sayısı daha az olacak, bu nedenle, GAD daha şiddetli gelişecektir (24). Bu da daha fazla nekroz demektir. Evre 5 (Erime ve kavitasyon): İmmün sistemi sayıf kişilerde nekroz ilerlemeye devam edecektir. İmmünitesi yeterli kişilerde dahi, HİD yeterice güçlü olsa bile, hastalığın ilerlemesi devam edebilir ve sonuçta, kazeöz odaklarda, erime (liquefaction) ile kavitasyon gelişebilir (19,24). Likefiye materyal içinde basil ilk kez olarak ekstrasellüler ortamda, hızla çoğalır. Oluşan büyük antijenik yük geniş doku nekrozuna neden olur, böylece bronş duvarlarında erozyon ile kavite formasyonu oluşur ve basiller hava yollarına dağılır. Aslında basilin kendisi nontoksiktir. Basil, konak dokusunu, konağın kendi immün yanıtı (GAD) sayesinde harap eder. Basil, bundan sonra, kaviteden, akciğerin diğer alanlarına yayılır ve dışarı atılır. İlk küçük tüberküloz lezyonu ortaya çıktıktan (evre 2) sonraki savaşların hepsi hücresel immünite ve doku hasarlayıcı gecikmiş tipte hipersensitivite sayesine sürdürülür. Hücresel immünite, lokal makrofajları aktive ederek onların, yutulan tüberküloz basilini yok edebilmesini sağlarken, doku hasarlayıcı gecikmiş tipte hipersensitivite(gad), nonaktive makrofajlar içindeki tüberküloz basillerinin intrasellüler gelişimini durdurur. Bu her iki immün yanıt T lenfositlerine bağımlıdır. Tüberküloz immün yanıtlarında ana rol oynayan T lenfositleri, ADA üretiminin de kaynağı olduklarından, tüberküloz lezyonlarının diğer hücresel komponentleri ile birlikte, özellikle T lenfositler ile ilgili kısa bilgi sahibi olunması gereklidir.. TÜBERKÜLOZ LEZYONLARININ HÜCRESEL KOMPONENTLERİ Mononükleer hücreler: 11

Mononükleer hücreler, tüberküloz lezyonlarının major komponentleridirler. Bu terim, makrofaj ve lenfositleri tanımlamak için kullanılır. Oluşan tüberküloz lezyonuna giren makrofaj ve lenfositler orada kalmazlar (25). 10 gün içinde %90 ından fazlası yenilenir (ya ölürler yada lenfatikler yoluyla lezyonu terk ederler). Bu, lezyona giriş ve aktivasyona uğrayan hücre oranı, hücresel immünite ve gecikmiş tip hipersensitivite gelişimi sırasında artar. Hücre girişindeki artış, aynı anda gerçekleşen hücre kaybını kompanse eder. Yüksek oranda aktive makrofajların, fazla sayıda lokal birikimi sayesinde basillerin inhibe ya da harab edilmesiyle hastalığın ilerlemesi kontrol edilir. Makrofajlar: Mononükleer fagosit hücreleri, periferik kan monositleri ile doku makrofajlarıdır. Uzun ömürlü hücrelerdir. Aylarca hatta yıllarca yaşarlar. Bu hücrelerin kaynağı kemik iliğidir. Kemik iliğinde oluşan monoblast kök hücreleri, öncü monositlere ve daha sonra monositlere dönüşürler. İnterlökin-3(IL-3) ve granülosit-makrofaj koloni sitimülan faktör(gm-csf) tarafından, doku makrofajları şeklinde farklılaşmaktadır. Monositler periferik kanda, makrofajlar bağ dokusu, karaciğer, akciğer, sinir sistemi, seröz boşluklar, lenfoid organlar, kemik ve eklemlerde bulunmaktadır. İmmün cevapta önemli görevleri olan makrofajlar çok sayıda intrasitoplazmik bakterisid etkili lizozim içerirler (118). Non-aktive makrofajlar tüberküloz basilinin intrasellüler gelişimi için uygun bir ortam oluştururlar. Aktive makrofajlar ise, lizozom, mitokondri ve organellerindeki enzimler açısından zengindirler (26). Aktive makrofajlar yüksek oranda fagositiktirler, bazıları da reaktif oksijen ve nitrojen metabolitleri taşıdığından yüksek oranda mikrobisidaldir. Bazıları digestive enzimler açısından zenginken bazıları sitokin ve diğer ürünleri üretir. Başkaları ise tüberküloz basilinden antijen hazırlar ve sunarlar. Aktive terimi genellikle bu özelliklerinden bazıları güçlendirilmiş olan makrofajlar anlamında kullanılır. Makrofajlar tüberküloz basiliyle karşılaşmadan önce aktive edilmiş olmalıdırlar (14,21,26,27). Yutma ve sindirme fonksiyonlarına ek olarak makrofajların tüberkülozda önemli olan bazı ekstrasellüler fonksiyonları da vardır. Aktivasyon sonrası, elastaz, kollajenaz, plazminojen aktivatör, lizozim gibi substanslar, pıhtılaşma faktörleri, interferonlar, GM-CSF (Kemik iliğin nde monosit ve granülosit yapımını artıran faktör), çeşitli sitokinler (IL ler, kemokinler ve fibroblast stimüle edici faktörler) salgılarlar (28). Bazı sitokinler lenfosit ve makrofajları alana çeker, aktive ve prolifere eder. Böylece sitokinler tüberküloz granülomunun oluşumu ve rezolusyonunda majör rol oynarlar. 12

Kemokinler, kemotaktik ve aktive edici sitokinler olup inflamasyon alanındaki birçok hücre tarafından üretilirler. Örneğin, MCP-1 (monocyte chemotactant protein-1), tüberkülozda, makrofaj akümülasyon ve aktivasyonda rol oynuyor gibi görünmektedir. Epiteloid hücreler, aktivasyonun çeşitli aşamalarındaki makrofajlar olup bazen epitel benzeri şekilde organize olurlar. Büyük veziküller içerdiklerinden, DNA transkripsiyon ve sentez fonksiyonlarının aktif olduğu düşünülmektedir. Tüberküloz lezyonlarında görülen matür epiteloid hücreler, yüksek oranda aktive hücrelerdir. Bunlar, enzimler ve mikrobisidinler açısından zengin olup, immatür epiteloid hücrelerden daha efektiftirler (21,22, 26,27). Bazı epiteloid hücreler sekretuar makrofajlardır. Langhans dev hücreleri multinükleer epitel hücreler olup genellikle kazeöz materyal etrafında birbirleriyle birleşirler. Çekirdek, yabancı cisim dev hücrelerindekinin aksine hücrenin periferinde yerleşir. Bu hücrelerin varlığı, kronikleşme göstergesidir. Tüberküloz patogenezinde rolleri küçüktür. Natural Killer Hücreler ve Sitotoksik T lenfositler Konakta oluşabilecek neoplastik hücreleri yok etmekte görevli olan Natural Kiler(NK) hücrelerinin bundan başka, virusla enfekte hücreler ve IgG1 ve IgG3 antikorlarıyla kaplı hedef hücreler üzerinde öldürücü etkisi vardır. Bu litik aktiviteye Natural Killer aktivitesi veya antikora bağımlı hücresel sitotoksisite denmektedir (118). Tüberkülozda, çoğalan basil taşıyan, zayıf aktive makrofajların öldürülmesi, konağın, hastalığın yayılmasını engelleyen major defans mekanizmasıdır. Bu fonksiyonu, Natural Killer hücreler(nk) ve Sitotoksik T lenfositler(ctc) yapar. Kan mononükleer hücrelerinin %10-15 ini NK hücreler oluşturur. Bu hücreler, T lenfosit yüzeyel marker ları taşımazlar (29). Sitotoksiktirler. İntraselüler bakteri içeren ve IL-12 ya da TNF-α üreten makrofajlarca aktive edilirler. NK hücreler, daha sonra, IFN-γ ve diğer sitokinleri salgılayarak, erken enfeksiyon döneminde bir yandan makrofajları non-spesifik aktive ederler, öte yandan Th1 spesifik immün yanıtını, Th2 immün yanıtının üzerine çıkarırlar (30). Ayrıca, bakteri taşıyan hücreleri direkt olarak lizis e uğratabilirler. NK hücreler böylece, spesifik immün yanıt oluşmadan önceki erken enfeksiyon döneminde, antijenden bağımsız (non-spesifik) konak direnci oluştururlar. Antijen bağımlı (spesifik) konak direnci, makrofaj aktive edici Th1 lenfositler ve basil içeren makrofajları öldüren CTC (genellikle Th1) tarafından oluşturulur. 13

Lenfosit ve sitokinler (13) T ve B lenfositler konağın, tüberküloz basiline karşı hafıza ve çabuk cevabını da içeren HİD ve GAD den oluşan immünolojik spesivitesini oluşturur. T ve B hücrelerinin içerdiği reseptörler, antijenle karşılaştığında, hücreler buna, klonal proliferasyon ile cevap verirler. B hücreleri antikor üretirler. Bu üretim plazma hücrelerine dönüşmek suretiyle güçlendirilir. Plazma hücreleri tüberküloz lezyonlarında sıklıkla görülür ancak fonksiyonları yeterince açıklanamamaktadır. Tüberkülozda T lenfositler iki ana fonksiyon gösterirler; a. Zayıf aktive makrofajları öldürmek(içlerinde basiller çoğalmaktadır) ve b. Makrofaj aktive edici sitokinler üretmek. Sitokinler lokal hormonlar olup, inflamatuar proseste rol oynayan hücrelerden salınırlar. Tüberküloz lezyonlarında sitokinler, basilin çeşitli antijenlerine karşı spesifik reseptörler içeren T lenfositler tarafından üretilir ve salınır. Bu antijenlere maruz kaldığında, bu T hücreleri, kemotaktik sitokinler, INF-γ gibi makrofaj aktive edici faktörler, lenfosit sayısını artıran IL-2 ve diğer çeşitli faktörler üretir. Tüberküloz immün patogenezindeki önemleri nedeniyle T lenfositlerini, daha ayrıntılı olarak inceleyebiliriz; T Lenfositler İmmatür T hücrelerinin proliferasyonu ve farklılaşması timusta olmakta ve hücre yüzeyinde pek çok reseptör kazanmaktadırlar. Timositlerin ancak %2 si reseptör kazanarak perifere salınmakta diğerleri ölmektedir. Timusun kontrolünde olgunlaşarak ikincil lenfoid organlarda yerini alan T lenfositler, hücresel immün cevaptan sorumlu hücrelerdir (118). Bu küçük lenfositler kısa ömürlü olup, bir kısmı timus medullasına geçerek timus epitelyal hücre ve timus hormonlarının etkisi ile farklılaşmakta ve kısaca CD ile gösterilen(cluster of Differantiation), glikoprotein yapısında birtakım yüzey antijeni kazanmaktadırlar (31). Böylece, CD 4 antijeni taşıyan T 4 lenfositleri (helper T lenfositleri) ve CD 8 antijeni taşıyan T 8 lenfositleri (supressör sitotoksik T lenfositleri) olmak üzere iki ayrı T lenfosit grubu oluşur. Periferik kandaki küçük lenfositlerin %70-80 i T lenfositlerdir. T lenfositlerinin de 2/3 ü CD 4, 1/3 ü CD 8 yüzey antijeni taşıyan lenfositlerdir. Helper T(CD4) lenfositler T helper(cd 4 ) lenfositler, tüberküloz immünitesinde merkezi rol oynayan hücrelerdir. CD 8 lenfositlerin ve B lenfositlerin olgunlaşma ve aktivitelerine de yardımcı olurlar. Antijen, antijen sunan hücreler tarafından işlendikten sonra, bu hücrelerin yüzeyinde bulunan doku 14

grubu antijenlerinden MHC Class-II ile beraber CD 4 hücrelerine sunulur. Antijen sunan hücreler, aynı zamanda IL-12 salgılayarak CD 4 lenfositleri aktive ederler CD4 lenfositler, ürettikleri sitokinlere dayanılarak, Th1 ve Th2 olmak üzere iki major alt gruba ayrılırlar (12,31). Th1 ve Th2 altgruplarının sitokin profilleri Tablo 1 de görülmektedir. Tablo 1: CD 4 Lenfositlerin Th1 ve Th2 Altgruplarının Sitokin Profilleri Sitokin Th1 Th2 IL-2 ++ - INF-γ ++ - Lenfotoksin ++ - IL-4 - ++ IL-5 - ++ IL-6 - ++ IL-10 - ++ GM-CSF ++ + TNF ++ + IL-3 ++ ++ INF-γ, IL-2 ve TNF-β üreten Th1 alt grubu, tüberküloz immünütesinin esasını teşkil eden, GAD reaksiyonuna da neden olur. IL-4, IL-5 ve IL-10, Th2 alt grubu tarafından salgılanır. IL-3, TNF-α ve GM-CSF ise her iki alt grup tarafından üretilir (12,32). Th1 in ürettiği INF-γ, Th2 klonlarının sitokin sentezini, Th2 nin ürettiği IL-10 ise, Th1 klonlarının sitokin sentezini inhibe eder. Makrofaj ve B lenfositler tarafından üretilen IL-12 ise, Th1 hücrelerinin proliferasyonunu hızlandırır. IL-12, spesifik olarak Th1 sayısını artıran ve fonksiyonlarını regüle eden major sitokindir. Ana kaynağı, özellikle, Mycobacterium tuberculosis ya da diğer bakterilerce aktive edilmiş makrofaj ve NK hücreleridir. Bu nedenle IL-12, tüberküloz patogenezini kontrol eden HİD ve GAD oluşumunda major rol oynar. Makrofajlar, fibroblastlar ve dendritik hücrelerden salgılanan PGE1 ve PGE2 ise, INF-γ üretimini inhibe edebilir (33). Th hücresi, antijen tarafından uyarıldığında Th1 ya da Th2 fenotipi oluşturacak şekilde farklılaşır. Th1 alt grubu, selüler immünite oluşumunda, Th2 alt grubu ise, humoral immün yanıt oluşumunda etkin rol oynar (31). CD 4 lenfositlerin iki alt grubu (Th1 ve Th2), makrofaj aktivasyonu konusunda birbirleriyle karşıt etki göstermektedir. Th1 lenfositler, aktivasyonları ve klonal genişlemeleri sonucu INF-γ, IL-2 ve TNF-β gibi lenfokinler salgılamaktadırlar. Bu lenfokinler sinerjistik etki gösterek antijenin bulunduğu yerde makrofajları toplar ve aktive ederler. Böylece aktive olmuş makrofajların içlerinde taşıdıkları basilleri yok edebilmelerini sağlarlar. Th2 lenfositler 15

ise, makrofaj aktivasyonunu suprese eden IL-10 ve diğer lenfokinleri(il-4,5,6) üretirler. Th1/Th2 oranı, sunulan antijenin tipinden ve miktarından etkilenir. Makrofajların basil antijenlerini, Th2 değil de Th1 lenfositlere sunmalarının, makrofajlarca üretilen IL-12 nedeniyle gerçekleştiğini ileri süren görüşler vardır. Çünkü IL-12, Th1 lenfositlerin farklılaşması ve çoğalmasını sağlamaktadır. Th1 lenfositlerden salgılanan IL-2, T lenfositler için bir büyüme faktörüdür ve hücrelerin klonal genişlemesini sağlar. Buna ek olarak, makrofajların mikrobisidal gücünü de artırır. Tüberkülozda HİD için makrofajları aktive eden esas hücreler Th1 hücrelerdir. Th2 lenfositler daha çok B lenfositlerin antikor üretimine yardımcı olmaktadır (24). Th1 lenfositlerden salgılanan INF-γ, makrofajlarda bulunan 1-α hidroksilaz enzimini uyarır. Bu enzim, inaktif olan 25-hidroksilaz vitamin D3 ü, aktif 1,25 hidroksi vitamin D3 e (kalsitriol) dönüştürür. Kalsitriol, hem makrofajların hücre içi basil çoğalmasını önleme yeteneklerini artırır, hem de hücrelerden TNF-α ve diğer sitokinlerin salgılanmasını sağlar. TNF-α, makrofajların mikrobisidal aktivitesini artırma işlevi yanında granülom oluşumunda da rol oynar (24). Sitotoksik-Supressör T(CD 8 ) lenfositler (Tk) MHC Class I reseptörleri taşıyan CD 8 lenfositlerin, insan tüberküloz immünütesinde CD 4 hücrelerinden daha sınırlı bir rol oynadıkları düşünülmektedir (34). Bununla birlikte, CD 8 lenfositlerin, INF-γ üretmek yanında, en büyük katkılarının, patojenlere yeterince cevap veremeyen hatta destek olan immatür, aktive olmamış fagositlerin yıkımını uyarma yetenekleri olduğu kabul edilir. Bu lenfositler, virüs, parazit ve bakteri ile enfekte hücreler, tümör hücreleri, doku ve organ transplant hücreleri gibi organizmaya zararlı ya da yabancı hücrelere doğrudan saldırırlar. Uyarılan CD 8 lenfositler, ürettikleri sitokinler arcılığıyla, hedef hücreleri tahrip edebilirler. Ayrıca, sitotoksik ve helper T hücre etkinliğini sınırlamak suretiyle immün sistemi suprese ederek immün reaksiyonların aşırı kaçmasını önlerler. Son yapılan araştırmalarda, CD 8 lenfositlerin, tüberküloz immünitesinde sanıldığından daha etkin olabileceğini düşündürmektedir (35,36). Bu çalışmalarda aktif tüberküloz hastalarında serum ve BAL örneklerinde lenfosit profilleri analiz edilmiş, sonuçta, CD 8 lenfositlerin belirgin şekilde temsil edildikleri düşünülmüştür. Bu nedenle CD 8 lenfositlerin de tüberküloza karşı insan immünitesinde önemli rol oynadıkları iddia edilmektedir. Hastalığın yaygınlığına, zamanlamaya ve bireysel genetik faktörlere bağlı olarak, bu hücreler, infekte hücrelerin yıkımını(lizis ini), apoptozis ini ya da mikobakterilerin sitokin aracılı hücre içi inhibisyonunun artışını sağlıyor olabilir (37). 16

İmmün denge açısından, CD 4 /CD 8 oranı büyük önem taşır. Çünkü bu hücreler, birbirlerinin fonksiyonlarını kontrol ederek, optimal düzeyde yanıt oluşmasını sağlarlar. Normalde bu oran 1-2 civarındadır (31). Serumda lenfositler üzerine baskılayıcı etki yapan çeşitli faktörlerin bulunduğu gösterilmiştir(spesifik antikorlar, antijen-antikor kompleksleri, serum albumin, CRP, kronik enfeksiyon ve malign olaylarda artan alfa-globulin, kortikosteroidler ve klorokin gibi ilaçlar). Kortikosteroidler, lenfositleri başka kompartmanda tutarak kandaki sayılarını azaltır. Yine HIV, cytomegalovirus ve Ebstein Barr virüsü gibi bazı enfeksiyon etkenlerinin de T süpresör hücre popülasyonunu artırarak CD 4 /CD 8 oranını düşürmek suretiyle ve sitokin sentezini bozarak immün baskılama yaptıkları gösterilmiştir (31). TÜBERKÜLOZDA TANI Tüberküloz tanısında altın standart yöntem, basilin bakteriyolojik olarak üretilmesidir. Şunun hatırlanması önemlidir; ARB pozitif yayma, Mycobacterium tuberculosis için spesifik değildir. Saprofit ya da potansiyel patojen diğer mycobacteri ler de asido rezistan boyanabilir. 17

Bunun yanında, ARB negatif yayma da klinisyeni tüberkülozdan uzaklaştırmamalıdır. Balgam kültürleri pozitif olan hastaların yaklaşık %50 sinde yayma negatif tir. Sonuç olarak, tanıyı doğrulamanın tek mutlak yolu Mycobacterium tuberculosis in in-vitro kültürüdür (9). Boyama ve kültür için en iyi örnek, taze çıkarılmış balgamdır. Eğer hasta spontan balgam çıkaramıyorsa, ikinci tercih edilen örnek indükte balgamdır. Bu amaçla hastalara, izotonik ya da hipertonik salin, 5-15 dakika solutulabilir. Eğer hasta, spontan balgam örneği verecek kooperasyonda değilse, yutulan balgamı elde etmek amacıyla, gastrik aspirat alınabilir. Bu örnek, sabah, hasta yemek yemeden ve yatağından hareket etmeden önce alınmalıdır. Hastaların çoğunda, bu yöntemlerle kültür için yeterli materyal elde edilebilir. Gastrik içeriğin ARB için yayması, yutulan saprofit non-tüberküloz mikobakterilerin varlığından dolayı sınırlı değere sahiptir ve önerilmez. Bununla beraber, infantlarda tüberküloz tanısında, balgam elde edilemediği için gastrik aspirat çok önemlidir. Akciğer tüberkülozlu infantların % 75 inde gastrik aspirat ARB açısından pozitif olabilir (38). Bazı hastalarda örnek elde etmek için bronkoskopi yapılması gerekebilir. Bronkoskopi sırasında kullanılan lokal anestezikler Mycobacterium tuberculosis için öldürücü olabilir. Bu nedenle kültür örnekleri, minimal lokal anestezik verilerek alınmalıdır. Wallace in çalışmasında, tüberküloz olduğu ispatlanmış 41 olgunun 39 unda bronkoskopi ile elde edilen örnek kültürü pozitif bulunmuştur (39). Bu çalışmada, 14 hastada boyanabilen bakteri saptanmışken, sadece 8 hastanın biyopsisinde granulom tespit edilmiştir. Danek in çalışmasında da, mycobacterial hastalığı ispat edilen, bronkoskopi öncesi yayma negatif 22 hastada benzer sonuçlar saptanmıştır (40). Bronkoskopi sırasında, bronşial ağacın iritasyonuyla oluşan prodüktif öksürük nedeniyle hastaların çıkaracağı post bronkoskopik balgam(pbb), değerli bir tanısal materyal olabilir. Danek in çalışmasında, hastaların % 13 ünde tek pozitif materyal PBB olmuştur. Tüm bu alternatiflere rağmen, tanısal kültür materyali elde etmek her zaman mümkün olmayabilir. ABD nde 1994 te CDC (Centers of Disease Control and Prevention Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi) verilerine göre, tüberküloz nedeniyle tedavi edilen hastaların sadece %80.2 sinde tanı kültür ile doğrulanmıştır (41). Hastaların ek %1 inde yalnız yayma pozitif bulunmuştur. %11.5 inde ise, hem kültür hem de yayma negatif rapor edilmiştir. O halde, önemli sayıda vakada, tüberküloz tanısı, bakteriyolojik doğrulama olmadan konmaktadır. Bu vakalarda tanı, pozitif cilt testi, uygun akciğer grafisi ve başarılı deneme tedavisi şartlarının yerine getirilmesiyle tüberküloz olarak kabul edilmektedir. 18

Kültür için uygun örnek elde edilmesine rağmen, etkenin yavaş üreme hızı, erken tanıya ulaşmayı genellikle engellemektedir (42). Mycobacterium tuberculosis, çeşitli kültür besiyerlerinde üretilmektedir. Bunları aşağıdaki şekilde sıralayabiliriz; 1. Yumurtalı besiyerleri: Bunlar arasında, Löwenstein-Jensen besiyeri, Petragnani besiyeri ve ATS besiyeri sayılabilir. Mycobacterium tuberculosis kültürü olarak en sık kullanılan besiyeri, Löwenstein-Jensen besiyeridir. Bunda, en erken 18-24 günde basil üremesi görülebilir. 2. Agarlı besiyerleri; Bunlar arasında, Middlebrook 7H10 ve 7H11 besiyerleri sayılabilir. 10 gün kadar bir sürede basil üremesi gösterilebilir. 7H11 besiyeri, duyarlılık testlerinde kullanılmaktadır. 3. Sıvı besiyerleri; Bunlar arasında Middlebrook 7H9 bulunmaktadır. 4. Seçici besiyerleri; Yukarıdaki besiyerlerine, antibiyotik, vitamin ve bazı kimyasal maddeler eklenerek, Mycobacterium tuberculosis için seçici besiyerleri elde edilir. Bu besiyerleri dışında, bazı hızlı kültür teknikleri de kullanılmaktadır. Bunlardan biri, BACTEC olarak adlandırılmıştır. Bu besiyeri, Middlebrook 7H12 besiyerine 14 C işaretli palmitik asit eklenmesiyle elde edilir. İncelenen örnekte mikobakteri varsa, bu bakteriler ürerken, ortama 14 C0 2 açığa çıkar. Radyometrik olarak ölçülen 14 C0 2 in miktarındaki artışa göre, üremenin var olup olmadığına karar verilir. Bu sistem ile mikobakteri varlığı, 4-25 gün içinde saptanabilmektedir. Bir başka hızlı kültür yöntemi, MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) olarak adlandırılmaktadır. Selektif 7H9 buyyonu içeren tüplerin dibinde, silikona emdirilmiş, oksijene duyarlı bir fluoresan madde bulunmaktadır. Ekim yapılan tüplerde üreme sonucunda oksijen konsantrasyonunda oluşan azalmanın neden olduğu fluoresans, Wood lambası altında incelenmektedir. Tüberküloz basilinin üretilmesi için geçen ortalama süre, 9 gündür (43). DİĞER TANI YÖNTEMLERİ Moleküler Biyolojik Teknikler Nükleik Asit Amplifikasyonu(DNA çoğaltma) 19

Ribotyping (Çoğaltılmış Mycobacterium Direkt Testi=MTD=Gen Probe): Çok sayıda tipik kopyası bulunan Mycobacterium tuberculosis için tanımsal olan ribozomal RNA parçalarını tanıyan probe ları kullanır. Ticari adıyla MTD sistemi, sadece mikroskopik incelemede yayma pozitif olan balgam örneklerinde kullanılmak üzere onaylanmıştır. Eğer test, yayma negatif örneklerde tüberküloz basilini saptama yeteneğine sahip olsaydı, seçilmiş, yüksek risk taşıyan olgularda akılcı kullanımı, belirgin klinik yarar sağlayabilirdi (42). PCR:Polymerase Chain Reaction:Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Tanısal örneklerde bulunan basil DNA sının tanısal parçalarının çoğaltılması tekniğine dayanır (44). Ticari olarak kullanılmakta olan şekli AMPLICOR sistemidir. Bu test, solunum yolu örnekleri için önerilmekte ve genel olarak duyarlılığı, %66.7 ile %85.2 arasında, özgüllüğü, %98.8 ile %99.7 arasında bildirilmektedir. Mikroskopi pozitif örneklerde, duyarlılık %92.6-96.1 e çıkmakta, mikroskopi negatif olanlarda ise, %48-71.7 ye düşmektedir (45). Yüksek oranda yalancı pozitif sonuçlar verebildiği yayınlar da bildirildiğinden, nükleik asit çoğaltma tekniklerinin yalnızca yayma pozitif vakalarda kullanılması önerilmektedir (42). Belki de ileride tüberküloz tanısında kültürün yerini alabilirler. Serolojik Yöntemler Bu amaçla pek çok parametre incelenmektedir. 38 kilodaltonluk antijen, 88 kilodaltonluk antijen, Antijen 5, Antijen A60, çoklu antijen analizi, Lipoarbinomannan, Kord faktörü ve Antijen-Antikor kompleksi testleri bunlardan bazılarıdır. Klinik bakış açısıyla, tüberküloz tanısı için basit bir kan testi çok çekici olmakla birlikte, bu testlerden hiçbiri, aktif tüberküloz olgularının saptanmasında birinci sırada bir test olma duyarlılık ve özgüllüğüne sahip değildir. Özgüllük ile ilgili temel sorun, infekte olma ile hasta olma ayrımının yapılamamasıdır. Daha önce yapılmış olan BCG aşısına bağlı serolojik reaksiyon da sorun yaratmaktadır. Bir başka önemli sorun da, tüberküloz dışı mikobakterilere bağlı infeksiyondan tüberküloz infeksiyonunu ayıramamalarıdır. Sonuç olarak, serolojik testler, aktif tüberkülozun olmadığını desteklemek amacıyla kullanılabilir ancak varlığını göstermek amacıyla kullanılamaz (42). Destekleyici Tanı Yöntemi Olarak Tüberkülin Cilt Testi 20

Bu test, GAD göstergesidir. Sadece, geçirilmiş primer enfeksiyon varlığını, organizmanın Mycobacterium tuberculosis ile karşılaşıp karşılaşmadığını gösterir. İnfeksiyondan 6-8 hafta sonra, deride ortaya çıkan geç aşırı duyarlılık reaksiyonunun saptanması esasına dayanır (46). Testin pozitif sonuçlanması, klinik olarak aktif hastalık varlığını ispatlamaz (47). Bununla birlikte çok büyük reaksiyon (25 mm den büyük endurasyon) sıklıkla aktif tüberküloz ile ilişkilidir. Negatif tüberkülin testi, tanıyı dışlamaz. Hasta anerjik ya da tüberküline karşı spesifik anerji taşıyor olabilir (48). Duyarlı CD 4 lenfositlerin, büyük oranda enfeksiyon alanında toplanıp, test alanında bulunmamasından kaynaklanan anerjiden dolayı, test negatif sonuçlanabilir. Yaşlılar, gençlere göre daha düşük (%86 ya karşı %67.6) tüberkülin pozitifliği oranına sahiptir (48). BAKTERİYOLOJİK OLGU TANIMLARI(49) 21

Yayma Pozitif Akciğer Tüberkülozu: -En az iki balgam (açlık mide suyu, indükte balgam, bronkoskopik lavaj da olabilir) örneğinde yayma ile aside rezistan basil (ARB) gösterilen hastalar ya da, -Balgam yaymasında bir kez ARB pozitif bulunan ve radyolojik bulguları akciğer tüberkülozu ile uyumlu olan ve bir hekim tarafından, tüberküloz tedavisi kararı verilen hastalar ya da, -Balgam yaymasında, bir kez ARB pozitif bulunan ve kültürü de pozitif gelen hastalar. Yayma Negatif Akciğer Tüberkülozu -İki hafta ara ile balgam örnekleri alınan ve her seferinde yayma negatif olan, fakat radyolojik olarak tüberküloz ile uyumlu lezyonları olan ve en az bir hafta geniş spektrumlu antibiyotik kullanılmasına rağmen klinik yanıt alınamayan ve ayırıcı tanı olanakları olan bir hastanede tüberküloz tedavisine karar verilen hastalar, -Balgam yaymaları negatif olan fakat kültürde üreme olan hastalar 22

ADENOZİN DEAMİNAZ (ADA)=(Adenosine Aminohydrolase=E.C.3.5.4.4.) Vücuttaki tüm hücrelerde bulunan polimorfik bir enzim olan ADA, adenin nükleotidlerin metabolizmasında aktif rol oynar (50,51). Pürin metabolizmasının bir adımı olan adenosine in inosine e ve deoxyadenosine in deoxyinosine e irreversible ve hidrolitik deaminasyonunu katalizler (52-55). İnsanda ADA, farklı optimal ph, substrat spesivite paterni ve molekül ağırlıklarına sahip 3 izoenzimden oluşmuştur (55-57). Bu izoenzimler, ADA-1, ADA1+CP ve ADA-2 olarak adlandırılmıştır. ADA-1 in monomerik bir protein olduğu ve 20 numaralı kromozom tarafından kontrol edildiği anlaşılmıştır. ADA-1+CP nin bir bağlayıcı protein (CP:Compounding Protein) ile birleşen iki ADA-1 molekülünden oluştuğu, 2 ve 6 numaralı kromozomlarca kontrol edildiği düşünülmektedir. ADA-2 ise ayrı bir protein olup, hangi kromozom tarafından kontrol edildiği bilinmemektedir. ADA aktivite düzeyi, elektroforetik ya da spektrofotometrik yöntemlerle saptanabilir. İzoenzim aktivitelerinin tayini için ise, ortama, sadece ADA-1 i inhibe eden, ADA-2 yi inhibe etmeyen E.H.N.A. [erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine] ayıracı eklenir.yeniden ölçüm yapılarak yalnızca ADA-2 aktivitesi, bu aktivitenin total ADA aktivitesinden çıkarılmasıyla da ADA-1 aktivitesi elde edilir (56). Vücut dokularında total ADA aktivitesi miktarı ve izoenzimlerinin aktivite oranları birbirinden farklıdır. Bazı dokularda ADA aktivitesi düzeyi ve izoenzim aktivite oranları Tablo 2 de görülmektedir (56). Tablo 2: İnsan Doku ve Hücrelerinde total ADA düzeyi ve izoenzim aktivite oranları 23

DOKU/ ADA ADA 1 ADA 1+CP ADA2 HÜCRE U/g protein % % % MONOSİTLER 50 82 0 18 LENFOSİTLER 55 84 16 0 NÖTROFİLLER 7 70 30 0 ERİTROSİTLER 8 100 0 0 AKCİĞER 5 17 83 0 KARACİĞER 7 20 80 0 DALAK 84 54 46 0 BÖBREK 3 0 100 0 KAS 4 28 72 0 PANKREAS 9 34 66 0 En yüksek total ADA aktivitesine lenfositler, özellikle aktive olmuş T lenfositler (58) ve monositler (56,59) sahiptir. ADA aktivitesi, T 4 lenfositlerde, T 8 lenfositlere oranla daha yüksek düzeyde bulunur (52). Aktivite düzeyi, lenfositlerin ve monosit-makrofaj sistemi hücrelerinin mitojenik cevabı sürecinde aktivitesi artar (60-63). Bu nedenle lenfosit ve monositlerde temel fizyolojik aktivitesinin, bu hücrelerin diferansiasyon ve proliferasyonu ile ilgili olduğu düşünülmektedir (56). Bu teoriye dayanılarak, ADA nın hücresel immünitenin bir belirleyicisi olabileceğine inanılmıştır (64-66). Nitekim, hücresel immünite oluşturan çeşitli hastalıklarda serumda, romatoid artrit te sinovyal sıvıda, tüberküloz meninjit te BOS ta yüksek ADA düzeyi saptanmıştır (65,67-70). İzoenzim aktiviteleri incelenecek olursa(tablo 2), normal serumda ADA-1 aktivitesine rastlanmaz, yalnızca ADA-1+CP ve ADA-2 aktivitesi saptanır. Serumda, ADA aktivitesini oluşturan dominant izoenzim, ADA-2 dir (56). Karaciğer, pankreas ve kas dokusunda olduğu gibi, akciğer dokusunda da dominant ADA izoenzimini, ADA-1+CP nin oluşturduğu görülmektedir. Vücutta en yüksek oranda ADA aktivitesine sahip olan lenfosit, monosit ve nötrofillerde, dominant izoenzim ADA-1 iken ADA-2 aktivitesine yalnızca monositlerde ve yalnızca %18 oranında rastlanmıştır. Bu nedenle, ADA-2 nin tek başına monosit-makrofaj sisteminden kaynaklandığı düşünülmektedir (71). ADA-2, yalnızca monositlerde ve sadece %18 oranında aktivite gösteriyorken, serumdaki major izoenzim aktivitesini oluşturuyor olmasını açıklamak güç gibi görünmektedir. Bu durum, ADA-2 nin monositler tarafından aktif olarak sekrete ediliyor olabileceği veya serumda ADA-2 yarı ömrünün ADA-1 den daha uzun olabileceği teorileri ile açıklanmaktadır (56). Serumda ADA1+CP aktivitesine rastlanıyor iken, hiç ADA-1 aktivitesine rastlanmıyor olması ise, serumda bol miktarda bulunan CP nedeniyle, ADA-1 in bağlanması teorisiyle açıklanmaktadır. 24

Tablo 3 de görüldüğü gibi, ALL dışındaki çeşitli patolojik durumlarda, serumda, dominant izoenzim ADA-2 olarak tespit edilmiştir. Tablo 3: Sağlıklı insanda ve çeşitli hastalık durumlarında bildirilen serum ADA ve izoenzim düzeyleri HASTALIK ADA (U/L) ADA 1+CP (%) ADA 2 (%) SAĞLIKLI (72) 16 30 72 ALL (73) 64 73 27 TÜBERKÜLOZ (74) 52 28 72 PNÖMONİ (75) 36 29 71 ROMATOİD ARTRİT (76) 34 22 78 ENFEKSİYÖZ MONONÜKLEOZ (77) 120 37 63 HEPATİT (78) 56 37 63 ALL de hızla çoğalan lenfoblastlardan, seruma bol miktarda ADA-1 salgılandığı, bunun serumda ADA-1+CP ye dönüştüğü ileri sürülmektedir. ALL dışındaki diğer hastalıklarda ise, monositlerin aktif rol aldığı hücresel immünite gelişmektedir. Artan monositlerden de seruma ADA-2 salınmaktadır. Sonuç olarak, ADA-2 nin, hücresel immünitenin, total ADA düzeyinden daha spesifik bir belirleyicisi olduğu ileri sürülmektedir. HASTALAR VE YÖNTEM: 25

Çalışma, Yedikule Göğüs Hastalıkları ve Göğüs Cerrahisi Merkezi, 7. Göğüs Hastalıkları Kliniği nde, prospektif olarak, Ocak 2002 Mart 2004 tarihleri arasında yürütüldü. Klinik ve radyolojik olarak aktif akciğer tüberkülozu düşünülen, yayma negatif hastalar çalışmaya dahil edildi. Çalışmaya dahil edilmek için, hastaların aşağıdaki kriterleri taşıyor olması şartı arandı; 1. Hastanın 10 yaş altı ya da 60 yaş üstü olmaması (immünite etkilendiğinden dolayı), 2. Ek herhangi bir sistemik hastalık ya da immünite bozukluğu bulunmaması, 3. Daha önce tüberküloz tanı ve tedavi öyküsü olmaması. Bu kriterleri taşıyan toplam 26 hasta aktif akciğer tüberkülozu çalışma grubunu oluşturdu. Bu hasta grubunda minimum yaş 14, maksimum yaş 36 olup, grup yaş ortalaması 24 olarak tespit edildi. Hastaların 18 ini(%69) erkek, 8 ini(%31) kadınlar oluşturmaktaydı. Bu gruptaki hastaların aktif tüberküloz hastası oldukları, elde edilen solunum sistemi sekresyonlarında (balgam, indükte balgam, postbronkoskopik balgam, bronşial lavaj), kültürde, Mycobacterium tuberculosis üretilmesi, materyal elde edilemeyen ya da kültürde üreme saptanamayan hastalarda antitüberküloz tedaviye klinik ve radyolojik yanıt alınmasıyla ispat edildi. Klinik ve radyolojik olarak sekel akciğer tüberkülozu bulguları düşünülen, özgeçmişinde tüberküloz tanı ve tedavi öyküsü olan ve ayrıca, çalışmaya dahil edilme kriterlerinin ilk ikisini taşıyan 10 hasta da kontrol olarak alınarak, sekel akciğer tüberkülozu çalışma grubunu oluşturdu. Bu grupta minimum yaş 22, maksimum yaş 48 olup ortalama yaş 38 olarak hesaplandı. Hastaların 5 ini(%50) erkek, 5 ini(%50) kadınlar oluşturmaktaydı. Bu gruptaki hastaların hiçbirinden spontan yada indükte balgam elde edilemedi. Bu hastalarda aktif tüberküloz hastalığı bulunmadığı, bronkoskopik BAL ve PBB materyallerinde mikrobiyolojik olarak ARB saptanmaması, kültürde üreme olmaması, klinik ve radyolojik olarak aktif hastalık bulgusu olmaması ve takipte aktif hastalık bulgusu gelişmemesiyle ispat edildi. Tüm hastalar, semptomatoloji yönünden sorgulandı, ayrıntılı fizik muayene yapıldı. İki yönlü direkt akciğer grafileri ve Bilgisayarlı Toraks Tomografileri çekildi. Klinik ve radyolojik bulgular sınıflandırılarak kaydedildi. Hastaların tümünün tam kan sayımı ve biyokimyasal analizleri yapıldı, EKG leri çekildi. Rutin olarak, sol önkol iç yüzüne, 5TU (Tüberkülin Ünitesi) standart ppd ile tüberkülin cilt testi uygulandı. Balgam çıkarabilen hastaların balgamlarında 3 kez direkt ve yayma yöntemleriyle Asido-rezistan basil arandı ve aynı anda balgamdan Löwenstein - Jensen besiyerine ekim yapılarak Mycobacterium tuberculosis kültürü çalışmasına başlandı. 26

Aktif tüberküloz grubunda, tedaviye başlamadan önce, Sekel tüberküloz grubunda tanısal işlemlerden sonra, hastalara fiberoptik bronkoskopi (FOB) uygulandı. İşlem öncesi, hastalara, yapılacak işlem hakkında ayrıntılı bilgi verildi ve yazılı izin alındı. Bronkoskopi öncesi hastaların damar yolu açıldı. İşlemden 30 dakika önce premedikasyon amacıyla 0,5mg atropin sülfat, intramuskuler yoldan uygulandı. Lokal anestezi amacıyla, nazofarinks, glottis ve larinkse, vokal kordların üzerine, %2 lik lidokain solüsyonu minimum miktarda püskürtülerek topikal anestezi oluşturuldu. İşlemden hemen önce, 0,07mg/kg midazolam intravenöz yolla verilerek sedasyon sağlandı. Erişkin tip fiber bronkoskop, transnazal yolla ilerletildi. Bronkoskopi sırasında, hücre viabilitesini azaltmamak amacıyla, yalnızca minimum miktarda lokal anestezik uygulandı. Hastanın oksijen saturasyonu, pulse oksimetre ile monitorize edildi ve saturasyonu %90 ın üzerinde tutmak amacıyla oksijen inhale ettirildi. Radyolojik olarak infiltrasyonun yoğun olduğu, aktivite alanı düşünülen segmetten Bronko-alveoler Lavaj (BAL) alındı. Bu amaçla, bronkoskopun ucu, ilgili segment ya da subsegment bronşunu tama yakın tıkayacak şekilde wedge pozisyonuna getirildi. Oda ısısındaki steril serum fizyolojik, 20 ml lik porsiyonlar halinde 5 kez verilmek ve yavaşça aspire edilmek suretiyle toplam 100ml miktarla lavaj yapıldı. İşlem sırasında yalnız polibikarbonat materyal kullanıldı. Verilebilen ve alınabilen serum fizyolojik miktarları kaydedildi. Alınan sıvı miktarı 25 ml nin altında ise, işlem başarısız olduğu için, hasta çalışmadan çıkarıldı. Materyaller buz içinde saklanarak, 1 saatte laboratuvara ulaştırıldı. Sıvı, mukustan arındırılmak üzere, gazlı bezden süzüldü. Numune ikiye ayrıldı, bir porsiyondan hücre sayımı ve diferansiyel sitolojik değerlendirme yapıldı. CELL-DYN 3500R (Abbott) cihazı ile total hücre sayımı yapıldı. Numune süzüldükten sonra Immufuge II santrifüjü ile 45 saniye santrifüj edilip supernatantı atıldı. Dipte kalan hücreler PBS (ph 7.4) ile iki defa yıkandıktan sonra Becton Dickinson dan elde edilmiş FITC veya PE konjuge monoklonal antikorlar, CD45/14, CD3/4, CD3/8, CD64 için ayrı tüplere ayrılmış hücrelere eklendikten sonra PBS ile resuspende edildi. 30 dakika karanlıkta ve oda sıcaklığında inkubasyonla boyanma işlemi tamamlandıktan sonra eritrosit içeren numuneler aynı firmadan elde edilen lysing solüsyonu ile lyse işlemine maruz bırakıldı. Ardından 3 kez PBS ile yıkanan hücreler 488 nm de argon-ion lazer ayarlı FACS Calibur (Becton Dickinson) ile Cell Quest software i kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar, spesifik monoklonallerle boyanmış lenfosit alt gruplarının, lenfosit total sayısına oranı olarak ifade edildi. Aynı örnekten ayrıca modifiye Bromcresol Green yöntemiyle Cobas Integra 800(ROCHE) cihazıyla, albumin düzeyi ölçüldü. BAL numunesinin ikinci porsiyonu, ADA ve izoenzimlerinin analizi için 10 dakika, 1500rpm de santrifüje edildi ve analiz yapılıncaya dek, -20C de bekletildi. ADA aktivitesinin 27