Poster Bildiriler
Deneysel Hematoloji/ Gen Tedavisi / Rejeneratif Tıp/ Hücresel Tedaviler Bildiri: 0280 Poster No: P001 İNSÜLİN BENZERİ BÜYÜME FAKTÖRÜ BAĞLANMA PROTEİNİ 3 PROMOTOR HİPERMETİLASYONU, KRONİK MYELOSİTER LÖSEMİ VE KRONİK LENFOSİTİK LÖSEMİ HASTALARINDA YENİ BİR BELİRTEÇ Mİ? Kamile Öztürk 1, Haluk Değirmenci 2, Ferit Avcu 3, Ali Uğur Ural 3. 1 Aksaray Üniversitesi, Fen ve Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji Ana Bilim Dalı, Aksaray, 2 Hacettepe Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Biyomühendislik Ana Bilim Dalı, Ankara, 3 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Hematoloji Bilim Dalı, Tıbbi ve Kanser Araştırma Kısmı, Ankara Amaç: İnsülin benzeri büyüme faktörü bağlanma proteini 3 (IGFBP3), p53 tümör baskılayıcı protein tarafından uyarılan, IGF lerin biyolojik fonksiyonunu düzenlemesi yanında, IGF lerden bağımsız olarak hücre büyümesi ve ölümünü düzenleyen bir proteindir. IGFBP3 antiproliferatif ve proapoptotik özelliğinden dolayı tümör baskılayıcı bir gen olarak kabul edilmektedir. Tümör baskılayıcı genlerin promotor bölgelerindeki CpG adalarındaki sitozinlerin metillenmesi, genlerin transkripsiyonel olarak inaktive olmasına neden olup, kanser oluşumundaki önemli epigenetik mekanizmalardan birisini oluşturur. Bu nedenle IGFBP3 genindeki metilasyon analizinin hastalığın ilerlemesi ve erken tanısı için bir belirteç olabileceği önerilmektedir. Hematolojik kanserlerde IGFBP3 geni metilasyonunun değerlendirildiği literatürdeki bu ilk çalışmada, kronik miyelositer lösemi (KML) ve kronik lenfositer lösemi (KLL) hastalarında, IGFBP3 geninin promotor bölgesindeki metilasyon durumunu saptayarak metilasyonun gen ifade düzeyine etkisi araştırılmıştır. Yöntemler: Yerel etik kurul kararı alınmasını takiben 20 KML, 26 KLL hastası ve yaş-cinsiyet uyumlu 20 sağlıklı bireyden alınan periferik kan örnekleri kullanıldı. Kan örneklerinden Fikoll metodu ile hücre izolasyonu yapıldı. Metilasyon analizi için, tüm örneklerden genomik DNA izole edildi ve ardından EpiTect Bisülfit kit kullanılarak DNA lar sodyum bisülfitle modifiye edildi. Metilasyon durumu; IGFBP3 promotorunun metilli ve metilsiz formlarına uygun primerler kullanılarak metilasyon spesifik PCR (MSP) metodu kullanılarak saptandı. Ayrıca metilasyon paterninde farklılık gösteren PCR ürünleri ABI 3100 Genetic Analyser (BigDye 3.1 version) sekans cihazı kullanılarak nükleotid dizisi saptandı. Genin promotor bölgesideki 20 CpG adası metilasyon açısından tarandı. Metilasyonun gen ifade düzeyine etkisi RT-PCR yöntemi kullanılarak saptandı. IGFBP3 mrna düzeyi, β-aktine oranlanarak hesaplandı. Sonuçlar: Bu çalışma sonucunda, IGFBP3 promotor metilasyonunu KML hastalarının %45 inde (9/20), KLL hastalarının ise %73 inde (19/26) saptandı. Sağlıklı bireylerin ise hiçbirisinde metilasyon saptanmadı. Hipermetilasyon, KLL hastalarında KML hastalarına göre daha anlamlı idi (p=0,047). Metilasyonun gen ifadesine etkisi KML hastalarında %15 (3/20) oranında gözlenirken, IGFBP3 ifadesindeki azalma, IGFBP3 metilasyonundaki artış ile ilişkili bulundu. Tartışma: Bu çalışmada IGFBP3 ifade düzeyinin metilasyona bağlı epigenetik olarak baskılanması KML ve KLL hastalarında gözlemlendi. Mutant p53 e sahip hücrelerde metilasyon oranında artışların olduğu rapor edildiği için KML ve KLL arasındaki metilasyon farkının p53 bağımlı bir fark olduğu düşünüldü. Ancak, IGFBP3 ifade düzeyinin metilasyona bağlı epigenetik olarak baskılanmasının hastalığın sebebi mi sonucu mu olduğu açık değildir. Bu nedenle, bu ilişkinin ortaya konacağı ve hipometile edici ajanların da klinik kullanıma girebileceği klinik çalışmalara ihtiyaç vardır. Bildiri: 0203 Poster No: P002 STAT3, STAT5A VE STAT5B EKSPRESYONLARININ K 562 LÖSEMİ HÜCRE DİZİSİNDE MODİFİYE SİRNA LARLA BASKILANMASI VE APOPTOZUN İNDÜKLENMESİ. Burçin Tezcanlı Kaymaz 1, Nur Selvi 1, Cumhur Gündüz 1, Çağdaş Aktan 1, Ayşegül Dalmızrak 1, Ezgi İnalpolat 1, Fahri Şahin 2, Güray Saydam 2, Buket Kosova 1. 1 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı, İzmir, 2 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hematoloji Bilim Dalı, İzmir Amaç: JAK/STAT sinyal yolağında görevli STAT3, 5A, 5B genleri sinyal iletiminde ve malinitede ekspresyonu artan genlerin aktivasyonunda görevli nükleer transkripsiyon faktörleridir ve hematolojik hastalıklarda aktifleşerek lösemi gelişiminde rol alırlar. sirna lar, hedef bir genin mrna sını yok ederek susturabilen RNA lardır. Çalışmamızda K 562 de anti-kanser hedefi olan STAT ların modifiye edilmemiş, kolesterol konjigasyonu ve 2 -FU/FC değişimiyle modifiye edilmiş sirna larla muamele edilmesi, mrna-protein düzeyinde ekspresyonlarının baskılanarak apoptozlarının indüklenmesi ve JAK/STAT yolağı elemanlarının ekspresyon değişimlerinin array yöntemiyle belirlenmesi amaçlanmıştır. Yöntemler: K 562 de ekspresyonu artmış olan STAT3,5A ve 5B genlerine özgül tasarlanmış sirna lar hücrelere uygulanmış ve gen baskılama analizleri 24-96 saatler/6-12 gün için mrna, 72-96 saatler/6-12 gün için protein düzeylerinde belirlenmiştir. sirna (100nM) ve transfeksiyon ajanı (6μl)konsantrasyonlarının sitotoksisitesi XTT, apoptoz TUNEL metoduyla değerlendirilmiştir. JAK/STAT yolağı elemanlarının ekspresyon değişimleri 6. günde arrayle belirlenmiş, istatistiksel analiz Student T testiyle yapılmıştır(p<0,05) Sonuçlar: XTT sonuçlarımıza göre kullanılan konsantrasyonların sitotoksik olmadığı saptanmıştır. mrna seviyesinde gen baskılama sonuçlarımıza göre STAT3 ekspresyonu S3-FU/FC sirna yla 10.-12. günde sırasıyla %20,60 (p=0,001) ile %16,51 e (p=0,041), STAT5A ekspresyonu S5A-FU/FC-siRNA yla 8.-10. günde sırasıyla %45,26 ya (p=0,041) ve %23,75 e (p=0,000), 12. günde S5A-CHL-siRNA yla %17,33 e (p=0,038), STAT5B ekspresyonu S5B-FU/FC-siRNA yla 8.-12. günde sırasıyla %59,05 e (p=0,009), %44,47 ye (p=0,005), %14,06 ya (p=0,001) düşmüştür. Western Blot sonuçlarımıza göre STAT3,S5A,S5B ekspresyonları 10.-12. günde modifiye sirna larla çok yüksek oranda baskılanmış, modifiye edilmemiş sirna lar etkinliğini kaybetmiştir. Apoptoz sonuçlarımıza göre 72. 96. saatte apoptotik hücre oranı modifiye sirna uygulanan gruplarda yüksekken (%29- %98), modifiye edilmemiş sirna ların düşük oranda apoptoza neden olduğu (%2-%12), 96. saatten sonra apoptotik hücrenin kalmadığı belirlenmiştir. Array sonuçlarımıza göre STAT3 için Transkripsiyon Faktörleri nden A2M ve CEBPB ekspresyonlarının düştüğü, STAT5A için Sinyal İleticileri nden STAM, STAT İnhibitörleri nden SOCS4 ekspresyonlarının düşerken SOCS1 in arttığı, STAT5B için Sitokin/Sitokin Taşıyıcıları ndan IL20, Sinyal İleticilerinden STAM, STAT İnhibitörlerinden 33
SOCS4 ve SOCS5 in ekspresyonları düşerken, PIAS2 nin arttığı belirlenmiştir. Tartışma: Çalışmamızda lösemide yüksek ekspresyon sergileyen bu proteinlerin modifiye sirna larla mrna ve protein seviyesinde baskılanmasıyla hücrelerin apoptoza uğradığı saptanmış, JAK/STAT yolağı genlerinin ekspresyon değişimleri belirlenmiştir. Böylece modifiye edilmiş/ edilmemiş sirna ların uzun vadede tümör hücre ölümü üzerindeki etkileri belirlenmiş, JAK/STAT yolağından yeni olası ilaç/terapotik ajan belirlenmesi hedeflenmiştir. Bildiri: 0126 Poster No: P003 KEMİK HASARLARININ TEDAVİSİNDE MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN TERAPÖTİK POTANSİYELLERİ; TAVŞAN TİBİASINDA DENEYSEL ÇALIŞMA. Yusuf Baran 1, Özgür Sunay 2, Zeynep Çakır 1, Geylani Can 1, Ziya Denek 3, İlknur Kozanoğlu 4, Mustafa Yılmaz 2. 1 İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Urla, İzmir, 2 Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Anabilim Dalı, Balçova İzmir, 3 Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Balçova, İzmir, 4 Başkent Üniversitesi, Adana Uygulama ve Araştırma Hastanesi, Kemik İliği Transplantasyon Ünitesi Hücre İşleme Laboratuvarı, Adana Amaç: Mezenkimal kök hücreler (MKH), yüksek çoğalma kapasitesine ve birçok hücre türüne farklılaşma yeteneğine sahiptirler. Bu potansiyelleri dolayısı ile rejeneratif tıpta kullanılabilmektedirler. Farklı nedenlerle oluşan kemik hasarlarının tedavisinde kullanılan en yaygın yöntem distraksiyon osteogenezistir (kemik uzatma). Ancak, iyileşme süresinin uzun olması ve bu dönemde oluşabilen kallus çöküşü, uzama kaybı gibi durumlar tedavide başarıyı kısıtlayabilmektedir. Bu çalışmanın amacı, yağ dokudan elde edilen ve kemik hücrelerine farklılaştırılan MKHların yeni kemik oluşumun/süresine olası katkılarının araştırılmasıdır. Yöntemler: Çalışmamızda 21 adet 2.5-3.0 kg erkek Yeni Zelanda tavşanı kullanılmış ve 3 gruba ayrılmıştır (1; negatif kontrol (serum fizyolojik), 2; MKH, 3; kemik hücresine farklılaştırılmış MKH). Elde edilen hücrelerin, MKH olduğu akım sitometresi ile gösterilmiştir. 2 ve 3. Gruptaki hücreler yeşil floresan proteini (YFP) ile işaretlenerek distraktör takılmış tavşanların kallus alanına enjekte edilmiştir. Denekler haftalık A/P ve lateral grafileri çekilerek takip edilmiş ve sekizinci haftanın sonunda sakrifiye edilerek histopatolojik, biyomekanik ve radyolojik açıdan değerlendirilmiştir. Sonuçlar: Histopatolojik ve immunohistokimyasal analizler, yağ dokudan elde edilen MKHların kemik dokuya entegre olduğunu göstermiştir. Deney gruplarında kemik kalınlıkları ve milimetrekaredeki osteosit, osteoblast ve osteoklast değerleri kontrol grubundan anlamlı derecede farklı bulunmuştur. Radyolojik değerlendirme sonuçları, 3. gruptaki tavşanların 1 ve 2. gruptaki tavşanlara göre kallus alanı oranları ve proksimal-distal kısımlardaki köprüleşme oranlarının daha fazla olduğunu göstermiştir. Biyomekanik değerlendirmede ise, maksimum yüklenme ile güç uygulandığında 3. grubun 1 ve 2. gruplara göre daha dayanıklı olduğunu göstermiştir. 2. Gruptaki tavşanlarda tüm değerlendirmelerin negatif kontrol grubundakilerden daha iyi olduğu belirlenmiştir. Tartışma: Elde edilen sonuçlar, kemik hücresine farklaştırılmış MKHların kemik hasarlarının daha etkili tedavisinde iyi bir alternatif yaklaşım olacağı öngörülebilir. Bildiri: 0195 Poster No: P004 MEZENKİMAL KÖK HÜCRE KULLANIMININ KEMİK KIRIĞI KONSOLİDASYON FAZI ÜZERİNE ETKİLERİNİN KOYUN MANDİBULA MODELİNDE BİYOMEKANİK TESTLERLE DEĞERLENDİRİLMESİ. Ferit Avcu 1, Andaç Aykan 2, İsmail Şahin 2, Serdar Öztürk 2, Senih Gürses 3, Pınar Elçi 4, Ali Uğur Ural 1. 1 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Hematoloji Bilim Dalı, Ankara, 2 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Plastik Cerrahi Anabilim Dalı, Ankara, 3 Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara, 4 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Tıbbi ve Kanser Araştırma Kısmı, Ankara Amaç: Kemik kırığı sonrası yeni oluşan kemik segmentin yeterli mekanik sağlamlığa ulaşıncaya kadar gerekli süre olan konsolidasyon fazı 12 haftaya kadar uzamaktadır. Bu süre zarfında hastalar distraktörü üzerlerinde taşımakta ve enfeksiyon riski veya psikolojik streslerle karşılaşmaktadırlar. Zengin farklılaşma özelliği gösterebilen mezenkimal kök hücrelerin (MKH) yeni kemik oluşumu ve konsolidasyon fazının kısaltılması üzerine etkileri hakkındaki çalışmalar kısıtlıdır. Amaç koyun mandibulasında distraksiyon osteogenez sonrası uygulanan MKH lerin yeni kemik oluşumu ve konsolidasyon fazı üzerine etkilerini biyomekanik testlerle araştırmaktır. Yöntemler: Etik kurul onayı sonrası 8 koyunun sağ ve sol angulus mandibula bölgelerine osteotomi yapıldı ve distraktörler yerleştirildi. Her iki tarafta 1mm/gün hızında distraksiyona başlandı. 20 gün süren aktivasyon süresi sonunda sol alana 8x106 MKH uygulanırken, sağ alana aynı miktarda fosfat tamponlu su verildi. Konsolidasyon periyodu başlangıcından itibaren 3 ve 6. haftalarda toplam koyunlar sakrifiye edildi. Mandibula yarımlarına Universal Testing Machine ile yükleme yapıldı. Elde edilen veriler 2-yollu nonparametrik ANOVA testi ve Tukey-Kramer testleri ile değerlendirildi. Biyomekanik testlerle mandibula yarımlarının aksial planda alınan tomografik kesitleri 3 boyutlu rekonstrükte edilerek distraksiyon bölgelerinden geçen kesit alanı değerlendirildi. Ölçülen total kesit alanından boş kemik alanları çıkarıldı, bulunan sonuç total alana oranlanarak doluluk oranına ulaşıldı. Sonuçlar: Onaltı mandibula yarısına uygulanan testlerle, iki farklı davranış şekli gözlendi. Bunlardan ilki oblik kırılan ve kırık hattının distraksiyon bölgesinden geçtiği, kesit alanının trabeküler yapıda olduğu O(+)T tip davranış; diğeri ise kırılma şeklinin horizontal olduğu ve kırık hattının distraksiyon bölgesinden geçmediği, distraksiyon hattı kesit özelliğinin kompakt kemik olduğu H(-)K tip davranıştır. Sol mandibula H(-)K tip davranış gösterirken, sağ mandibula O(+)T tip davranış gösterdi ve iki grubun karşılaştırılması sonucunda istatistiksel olarak anlamlı ölçüde fark bulundu (p<0.04). Bu iki farklı tip davranış için yapılan istatistiksel analiz ile (Tukey-Kramer) farklı süre uygulamalarında anlamlı bir fark ortaya çıkmadığı gösterildi. Kesitlerin doluluk oranı incelendiğinde 3 haftalık grubun deney taraf mandibulalarında kontrol tarafına göre daha fazla ve kompakt yapıda kemik oluştuğu izlenmekle beraber doluluk oranı açısından istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı. 6 haftalık grupta sağ ve sol mandibulalarda doluluk oranı arasında istatistiksel olarak anlamlı fark görüldü (p<0.05). Tartışma: Bu çalışma ile klinik uygulamalarda tek dozda dahi MKH kullanımının distraksiyon bölgesindeki mukavemeti arttırdığı, kemikleşme hızı ve kalitesinde olumlu etki gösterdiği ortaya konulmuştur. Böylece 34
MKH lerin konsolidasyon periyodunu azaltabileceği, kemik kalitesi ile ilgili sorunlu distraksiyon osteogenezi uygulamalarında kullanılabileceği gösterilmiştir. Bildiri: 0279 Poster No: P005 LÖSEMİ HÜCRE HATLARINDA KAEMFEROL VE SİLİMARİN İN HÜCRE DÖNGÜSÜ VE APOPTOZ SİNYAL İLETİM YOLAKLARI ÜZERİNE ETKİLERİ. Zeynep Özlem Doğan Şığva 1, Sunde Yılmaz 1, Çığır Biray Avcı 1, Müsteyde Yücebaş 1, Tuğçe Balcı 1, Güray Saydam 2, Cumhur Gündüz 1. 1 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İzmir 2 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Hematoloji Bilim Dalı,. İzmir Amaç: Kanserin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılmasındaki ilerlemeler, kanserin tanısında ve tedavisinde gelişmelere yol açmakta; bu durum da daha efektif terapötik etki ve azalmış toksik tedavi ile sonuçlanmaktadır.silimarin; (Silybum marianum L. (meryem ana dikeni) den izole edilen flavolignan yapısındaki bileşik), ortak adıyla bilinen silibin, silidianin ve silikristin isimli flavonolignanlardır.silimarin in hem hücre kültürü hem de çeşitli epiteliyal kanserlerin hayvan modellerinde antikanser ve kemopreventif etkinliğinin varlığı gösterilmiştir.kaemferol, Epilobium parviflorum (yakı otu) dan izole edilmiş flavonoid yapısındaki bileşiktir.hem kronik hem de akut toksisite çalışmalarda kaemferol ün kanseri önlemedeki önemi vurgulanmıştır.çalışmamızda; kronik miyeloid lösemi modeli olarak seçilen K562 de kaemferol ve silimarin in apoptoz yolaklarındaki gen ekspresyonları üzerine etkilerinin ve hücre döngüsü genlerinin ekspresyon değişimleri üzerine etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir. Yöntemler: Silimarin için; 300,00, 150,00, 75,00, 37,50, 18,78, 9,38, 4,69 μm, Kaemferol için; 30, 25, 20, 15, 12,5, 10, 6 μm doz ve 24., 48. ve 72.saatlerde K562 hücre hattındaki sitotoksisiteleri araştırılmıştır.bitkisel etken maddelerinin sitotoksisite analizi XTT metodu ile çalışılmıştır.bitkisel etken maddelerin IC50 dozlarına maruz bırakılan K562 hücre hatlarından total RNA izole edilmiş ve 45 apoptotik yolak ve 45 hücre döngüsü kontrol genlerinin ekspresyonları real-time online Revers Transkriptaz PCR (RT-PCR) yöntemi ile çalışılmıştır.gen ekspresyon değişimleri bitkisel etken madde verilmeyen kontrol K562 hücre hatlarıyla karşılaştırılmıştır. Sonuçlar: K562 hücre hattında, Silimarin IC50 dozu 72.saate 29,02 μm ve Kaemferol için 9,84 μm olarak saptanmıştır.silimarin IC50 dozu hücre döngüsü kontrol genlerinden G2/M geçişinde sorumlu olan genlerin ekspresyonlarında belirgin bir artış ve apoptoz yoğalındaki apoptozu indükleyen gen ekspresyonlarında da artış saptanmıştır.kaemferol ün IC50 dozu hücre döngüsü kontrol genleri ve apoptoz yolağındaki genlerin ekspresyonunda belirgin bir artış saptanmamıştır. Tartışma: Hematolojik malinitelerde hücre döngüsü kontrol genlerinin ve apoptotik yolak genlerinin kapsamlı olarak araştırılması ile kanser fenotipinin anlaşılmasında gen düzeyinde önemli bir katkıda bulunulmuştur.gen ekspresyonları değerlendirildiğinde; silimarin in 29,02μM dozu K562 hücre hattında apoptozu indüklediği ve hücre döngüsününün G2/M evresinde durdurduğu şeklinde değerlendirilmiştir.apoptozun gen ürünleri, tanı ve tedavi için potansiyel hedeflerdir ve geniş bir alana yayılan hastalıklar için yeni tedavi ve davranış biçimleri geliştirme umudu sunmaktadır.bitki ekstrelerinin bu gen profili üzerine olumlu etkileri lösemi tedavisinde yeni klinik açılımlar getirebilecektir.saptanan gen ekspresyon değişimlerinin daha geniş hücre serilerinde çalışılarak desteklenmesi ve sonuçların olumlu çıkması halinde lösemi tedavisinde yeni bir yaklaşım getirebileceğini düşünmekteyiz. Bildiri: 0123 Poster No: P006 RESVERATROL UYGULANAN HL60 AKUT MİYELOİD LÖSEMİ HÜCRELERİNDE KANSER YOLAĞI GENLERİNİN EKSPRESYON PROFİLLERİ. Zeynep Çakır 1, Geylani Can 1, Güray Saydam 2, Fahri Şahin 2, Yusuf Baran 1. 1 İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Urla, İzmir 2 Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Hematoloji Bölümü, Bornova, İzmir Amaç: Resveratrol (3,5,4 -trans-trihidroksistilben), bitkilerde özelllikle kırmızı üzüm çekirdeğinde bulunan antioksidan bir moleküldür. Resveratrol normal şartlar altında, bitkilerde enfeksiyon, radyasyon ve strese karşı sentezlenerek bitkinin zarar görmesini engeller. Resveratrolün antioksidan etkilerinin yanı sıra antitümör aktivitesine sahip olduğu tarafımızca ve farklı gruplarca yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Akut miyeloid lösemi (AML) tumör hücrelerinin klonal olarak hematopoietik progenitör hücrelerinden çoğalması ile karakterize edilen hematolojik bir kanserdir. Bu çalışmada, resveratrolün HL60 hücrelerinde etkilediği kanser yolağı genlerinin ekspresyon düzeyleri belirlenerek resvetarolün anti-tümör potansiyelinin moleküler mekanizmaları ortaya konacaktır. Yöntemler: Resveratrolün HL60 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri XTT hücre proliferasyon yöntemi ile belirlenmiştir. 72 saat boyunca 10 ve 50 μm resveratrol uygulanan HL60 hücrelerinden izole edilen mrna lar cdna ya dönüştürülmüştür. Kanser sinyal ileti yolağında (Human Cancer Pathway Finder) görevli 84 genin ekspresyon düzeylerinde meydana gelen değişimler PCR Array yöntemiyle belirlenmiştir. Sonuçlar: XTT sonuçları resveratrolün HL60 hücreleri üzerine doz-bağımlı olarak sitotoksik etkileri olduğu belirlenmiştir. PCR array sonuçları değerlendirilirken olası deneysel hataları elimine edilmesi amacıyla ekspresyonunda 4 kat ve üzerinde artış/azalış gösteren genler dikkate alınmıştır. 10 ve 50 μm Resveratrol uygulanan HL60 hücrelerinde sırasıyla 20 ve 30 genin ekspresyon düzeylerinde 4 kat ve üzerinde artış belirlenmiştir. Aynı dozların 3 ve 6 genin ekspresyonunu ise 4 kat ve üzerinde baskıladığı hesaplanmıştır. Resveratrol, kontrol grubunda sentezlenmeyen 3 genin ekspresyonunu yüksek oranlarda tetiklerken, kontrol grubunda sentezlenen 4 genin ekspresyonun ise tümüyle baskılamıştır. Ekspresyonunda en yüksek artış gözlenen genler apoptotik (örn. Bax), en fazla düşüş gözlenen genler ise anti-apoptotik (örn. Bcl2) genler olmuştur. Öte yandan, bazı büyüme faktörlerinin de mrna miktarlarında anlamlı artışlar belirlenmiştir. Büyüme faktörlerinin ekspresyonundaki artışlara karşın, hücre ölümünü tetikleyen yolaklardaki daha yüksek artışlar AML hücrelerinin ölümünü tetiklemektedir. Tartışma: Resveratrolün AML hücreleri üzerine apoptotik ve antiproliferatif etkileri mekanizmaları ile beraber belirlenmiş ve antikanser ajan olma potansiyeli tarafımızca ortaya konmuştur. Teşekkür: Bu çalışma Türk Hematoloji Derneği tarafından THD 2008-01YB/051 numaralı proje ile desteklenmiştir. 35
Bildiri: 0125 Poster No: P007 MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN TAKİBİNDE KULLANILAN YEŞİL FLORESAN PROTEİN GENİNİN HÜCRELERE AKTARIMININ OPTİMİZASYONU. Yusuf Baran 1, Geylani Can 1, Zeynep Çakır 1, İlknur Kozanoğlu 2. 1 İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Urla, İzmir 2 Başkent Üniversitesi, Adana Uygulama ve Araştırma Hastanesi, Kemik İliği Transplantasyon Ünitesi Hücre İşleme Laboratuarı, Adana Amaç: Embriyonik ve erişkin kök hücrelerin organ yetmezliği, merkezi sinir sistemi hastalıkları, kanser gibi çok farklı hastalıkların tedavisinde kullanım potansiyelleri vardır. Özellikle rejeneratif uygulamalarda hasarlı bölgelere uygulanan kök hücrelerin takibi ve iyileştirilen/oluşturulan yeni dokunun uygulanan kök hücrelerden kaynaklanıp kaynaklanmadığının belirlenmesi son derece önemlidir. Canlı dokuya uygulanan kök hücrelerin takip edilebilmesi amacıyla floresan ışıma yapabilen yeşil floresan protein geninin kök hücrelere aktarılması son dönemlerde yoğun olarak kullanılan yöntemlerden biridir. YFP proteininin yaydığı yeşil ışıma immünfloresan mikroskop veya konfokal mikroskop yardımı ile görülebilmekte, akım sitometresi yardımı ile de kantitatif olarak hesaplanabilmektedir. Bu çalışmada, YFP geninin tavşandan elde edilen mezenkimal kök hücrelere (MKH) aktarılmasında kullanılan farklı transfeksiyon kitlerinin karşılaştırılarak en iyi yöntemin ortaya konması amaçlanmıştır. Yöntemler: Tavşandan yağ dokusudan MKHlar izole edilmiş ve bu hücrelerin MKH olduğu akım sitometresi yardımıyla gösterilmiştir. MKHlara YFP geni içeren pegfp-c1 plazmid vektörün aktarılması amacıyla beş farklı firmanın yedi ayrı lipid temelli transfeksiyon kiti kullanılmış ve etkinlikleri değerlendirilmiştir. Sonuçlar: Akım sitometresi ile elde edilen kantitatif sonuçlar, kullanılan transfeksiyon kitlerinin hücreleri transfekte etme etkinliklerine göre sırasıyla Metafectene-pro (%65), Exgen-500 (%64), Metafectene (%60), Lipofectamine (%59), Polyfect (%47), Turbofect (%40) ve Effectene (%10) şeklinde olduğunu göstermiştir. Öte yandan, transfeksiyon amacı ile kullanılan kit içerisindeki kimyasalların hücreler üzerine olası toksik etkileri açısından değerlendirildiğinde, Metafectene-pro nun diğerlerine göre anlamlı derecede daha az olduğu belirlenmiştir. Tartışma: Bu sonuçlar MKHların in vitro ve in vivo takibinde kullanılan YFP geninin veya moleküler düzeydeki araştırmalarda gen aktarımı için en uygun yöntemin metafectene-pro olduğunu göstermiştir. Bildiri: 0127 Poster No: P008 RESVERATROLÜN KRONİK MİYELOİD LÖSEMİ HÜCRELERİNDE KANSER SİNYAL İLETİ YOLAĞI GENLERİ ÜZERİNE ETKİLERİ. Melis Kartal 1, Geylani Can 1, Güray Saydam 2, Fahri Şahin 2, Yusuf Baran 1. 1 İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Urla, İzmir. 2 Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Hematoloji Bölümü, Bornova, İzmir. Amaç: Resveratrol, çeşitli bitkilerin çevresel stres koşulları altında kendilerini korumak amacıyla oluşturdukları doğal bir antioksidan maddedir. Resveratrolün birçok kanser hücresi üzerinde sitotoksik etkiye sahip olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte resveratrol, prostat kanseri gibi kanser hücrelerini radyoterapiye karşı daha hassas hale getirmekte ve ayrıca imatinibe direnç gösteren kronik miyeloid lösemi (KML) hücrelerinin imatinibe karşı duyarlılıklarını arttırmaktadır. Bu ve daha birçok özelliğinden dolayı resveratrol son zamanlarda birçok araştırmacının ilgisini çekmektedir. Tarafımızca gerçekleştirilen çalışmalarda resveratrolün KML hücreleri üzerine apoptotik etkileri olduğu belirlenmiştir. Ancak güçlü bir antikanser ajan olma potansiyeline sahip resveratrolün hücresel ölümleri hangi mekanizmalarla gerçekleştirdiği henüz ayrıntılı olarak açıklanamamıştır. Bu çalışmada, resveratrolün K562 KML hücrelerinde kanser oluşumu, gelişimi, yayılması ve dirençliliğini etkileyen 84 genin ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi ve dolayısı ile mekanizmaların aydınlatılması amaçlanmıştır. Yöntemler: K562 hücreleri, artan dozlarda resveratrole maruz bırakılarak resveratrolün bu hücreler üzerindeki sitotoksik etkileri XTT hücre proliferasyon kiti ile belirlenmiştir. Ayrıca, 10 ve 50 μm resveratrolün K562 hücrelerinde etkilediği moleküler mekanizmalar Human Cancer Pathway Finder PCR Array ile belirlenmiş ve bu yolla çeşitli moleküler yolaklarda görevli 84 genin ekspresyon analizi yapılmıştır. Sonuçlar: Resveratrolün K562 hücreleri üzerine doza bağımlı olarak proliferasyonu baskılayıcı etkileri olduğu belirlenmiş ve IC50 değeri (hücrelerin %50 sinin çoğalmasını baskılayan doz) 85 μm olarak hesaplanmıştır. Resveratrolün etkilediği genlerin ekspresyon profillerinin tespit edilmesi amacı ile IC50 değerinin altında dozlar (10- ve 50 μm) belirlenmiştir. PCR Array sırasında olası deneysel hataların elimine edilmesi amacıyla 4 kat ve üzerinde artış/azalış gösteren genler seçilmiştir. Elde edilen bulgular, 10- ve 50 μm resveratrole 72 saat boyunca maruz bırakılan K562 hücrelerinde, sırasıyla 25 ve 52 genin ekspresyon düzeylerinde 4 kat ve üzerinde artışlar olduğu hesaplanmıştır. Öte yandan, 50 μm resveratrol uygulanan K562 hücrelerinde 1 genin ekspresyon düzeyinde 4 katın üzerinde bir azalma belirlenmiştir. Ekspresyon düzeylerinde anlamlı farklılıklar belirlenen bu genlerin tümör baskılayıcı, apoptoz, metastaz ve/ veya anjiogenez ile ilişkili genler olduğu belirlenmiştir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ekspresyon düzeylerinde en anlamlı artışlar belirlenen genler, tümör baskılayıcı SERPINB5 geni, apoptotik TNFRSF25, FAS ve GZMA genleri olmuştur. Tartışma: Resveratrolün KML hücrelerinde önemli bir antikanser ajan olma potansiyeli mekanizmal düzeyde ortaya konmuş ve tedaviyi destekleyici bir ajan olarak kullanılabileceği belirlenmiştir. Teşekkür: Bu çalışma Türk Hematoloji Derneği tarafından THD 2008-01YB/051 numaralı proje ile desteklenmiştir. Bildiri: 0190 Poster No: P009 İNSAN VE SIÇAN KEMİK İLİĞİ KAYNAKLI MEZENKİMAL KÖK HÜCRELERİN İMMUNOFENOTİPİK, GENOTİPİK VE İNCE YAPI ÖZELLİKLERİNİN KARŞILAŞTIRMALI OLARAK İNCELENMESİ. Ayça Aksoy, Özlem Sağlam, Cansu Subaşı, Gülay Erman, Erdal Karaöz. Kocaeli Üniversitesi Kök Hücre Anabilim Dalı Amaç: Tıp ve yaşam bilimleri alanında yapılan bilimsel deneylerin çoğu geçmişten günümüze kadar sıçanlar üzerinde yapılmaktadır.sıçanların fizyolojik olarak insanlara yakın olması,kolay barınma ve hızlı üreme potansiyelleri,deneylerin neredeyse aynı genotip ve fenotipe sahip hayvanlar üzerinde yapılabilme kolaylığı ve 36
hastalık modellerinin kısa sürelerde oluşturulabilmesi sayesinde tıp dünyasının vazgeçilmez deney hayvanlarıdır.kök hücre ve yenileyici tıp alanında klinik insan çalışmaları günümüzde çok sınırlıdır ve sıklıkla sıçanlar kullanılmaktadır.bununla birlikte,insanlardan elde edilen kök hücreler sıçanlarda oluşturulan kalp hastalıkları,kanser,alzhaimer veya Parkinson gibi birçok deneysel hastalık modelinde kullanılmaktadır.kolay elde edilebilmeleri,farklılaşma,kendilerini yenileme ve proliferasyon potansiyelleri,hem otolog ede edilebilmeleri hem de allojenik transplantasyon başarıları sayesinde mezenkimal kök hücreler (MKH) yenileyici tıp alanında vazgeçilmez kaynaklardır.çalışmamızda sıçan (ski-) ve insan (iki-) kemik iliği kaynaklı MKH lerin çoğalım,immunofe notipik,transkriptik,ince yapı ve farklılaşma özelliklerini karşılaştırmalı olarak incelemeyi amaçladık. Yöntemler: ski-mkh (n=5)ve iki-mkh (n=5) gradiyent yöntemiyle izole edildi ve alt-kültür 3 (P3) e kadar çoğaltıldı.tüm deneyler P3 de gerçekleştirildi.çoğalım indeksini belirlemek amacıyla MTT testi uygulandı.mkh lerin immünohistokimyasal özelliklerinin belirlenmesi için; CD31,CD34,CD45,CD71,CD105,CD44,CD105,aktin,SSE A4,tipIIkollajen,GFAP, MyoD,miyozinIIa,miyogenin,nesti n,vimentin,osteokalsin,osteonektin ve Ki67,fibronektin,αdüz kas aktin,desmin,nestin,beta tubulin,osteokalsin ve vimentin antikorları ile inkübe edilmiştir.akım sitometrik olarak CD29,CD45 ve CD90 antikorları için analiz edildi. Ayrıca,gen ekspresyon profilleri RT-PCR ile desteklendi. ski-mkh ve iki-mkh de osteojenik,adipojenik,nörojenik ve damar endoteliyal farklılaştırma çalışmalarının yanı sıra elektron mikroskopisi ile ince yapı özellikleri incelendi.telomeraz aktiviteleri karşılaştırmalı olarak incelendi. Sonuçlar: Tüm hücreler akım sitometrik analizlerde CD29 ve CD90 pozitif CD45 negatif idi.elektron mikroskobik olarak her iki grupta da ekzantirik,düzensiz şekilli,ökromatik çekirdek mevcuttu ve dilate düz ER sisternaları izlendi.gen ekspresyon profilleri birçok gen bakımından benzerdi.her iki hücre dizisi ekto-(nöronal),endo- (endotel) ve mezoderm(kemik,yağ) germ yapraklarına ait doku hücrelerine farklılaştılar.ski-mkh nin iki- ne oranla telomeraz enzim aktiviteleri yaklaşık 10 kat fazla olarak tespit edildi. Tartışma: Geçmiş yıllarda yapılan çalışmalar sonucunda iki-mkh e göre ski-mkh nin genomik olarak stabilitesinin erken ve geç pasajlarda daha düşük olduğu gösterilmiş olsa da farklılaşma potansiyelleri,ince yapı özellikleri,gen ekspresyon profilleri ve immunofenotipik özelliklerinin büyük oranda benzerlik göstermesi ve tüm bunların yanı sıra etik olarak uygunluğu MKH çalışmalarında uzun yıllar boyunca sıçanların kullanılacağını göstermektedir. Bildiri: 0372 Poster No: P010 ENDEMİK BİR BİTKİ PHLOMİS NİSSOLİİ İN K562 LÖSEMİ HÜCRELERİNDE COREST TRANSKRİPSİYONEL BASKILAMASI ÜZERİNE ETKİSİ. Müsteyde Yücebaş, Çığır Biray Avcı, Sunde Yılmaz, Zeynep Özlem Doğan Şığva, Tuğçe Balcı, Cumhur Gündüz. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Bornova İzmir Amaç: Phlomis [Labiatae, (Ballıbabagiller)] 21 i endemik olmak üzere 34 türü Türkiye de bulunmaktadır. Phlomis nissolii (Çalba) Türkiye ye endemiktir. Phlomis türleri tonik ve diüretik olarak ülser ve hemoroit tedavisinde Anadolu halk tıbbında kullanılmaktadır. Uçucu yağlar, flavonoitler, iridoitler ve fenetil alkol glikozitlerini sekonder metabolit olarak içeren Phlomis türleri sitotoksik, sitostatik ve antioksidan aktivite göstermektedir. Histon H3 kuyruklarının metilasyonu transkripsiyonel olarak aktif kromatin ile koreledir ve metil rezidule, histon demetilaz ve lizis spefisik de demetilaz (LSD1) ile enzimatik olarak uzaklaştırılır. Repressor element-1 susturucu transkripsiyon korepressörü (CoREST) LSD1 in 4 subünitinden biridir. Lösemide sıklıkla yeniden düzenlenmiş olarak bulunduğundan dolayı LSD1 lökomogenez gibi kanser gelişiminde potansiyel olarak sorumlu olmaktadır. Bu çalışmada Phlomis nissolii in KML grubunda yer alan ve myeloid seri hücre hattı olan K562 de CoREST transkripsiyonel baskılaması üzerine etkisini kromatin immunopresipitasyonu yöntemi (ChIP) araştırılması amaçlanmıştır. Yöntemler: P. nissolii infüzyon ekstresinin 7,81, 15,63, 31,25, 62,50, 125,00, 250,00 ve 500,00 μg/ml dozlarının K562 hücreleri üzerine sitotoksik etkileri XTT yöntemi ile çalışıldı. ChIP analizleri Q-PCR ile gerçekleştirildi. CoREST, Non-immun Serum ve RNA Polimeraz II antikorları Millipore dan sağlandı. Sonuçlar: K562 hücre hattında P. nissolii infüzyon ekstresinin IC50 dozu 250 μg/ml olarak saptandı. IC50 dozuna maruz bırakılan K562 hücre hattında CoREST ChIP rölatif oranı 5,26 olarak bulunurken maruz bırakılmayan kontrol grubunda 3,96 olarak bulundu. P. nissolii infüzyon ekstresinin IC50 dozu CoREST transkripsiyonel baskılaması yaklaşık % 133 kat arttırdığı saptandı. Tartışma: P. nissolii Türkiye ye endemik bir bitkidir ve kansere yönelik bir çalışma yapılmamıştır. Lösemi hücrelerinde CoREST in transkripsiyonel baskılamasını %133 oranında arttırması oldukça önemlidir ve aktif olan genlerin susturulmasında korepressörü olduğu LSD1 ve diğer repressor faktörlerin etkisini arttırabileceği şeklinde yorumlanmıştır. Bu bulgu geniş hücre serileri ile çalışılarak doğrulandığı takdirde lösemi tedavisine yeni bir yaklaşım getirebilecektir. Bildiri: 0349 Poster No: P011 TİROZİN KİNAZ İNHİBİTÖRLERİNE DUYARLI KRONİK MİYELOİD LÖSEMİ HÜCRE HATTI K562 DEN DİRENÇLİ ALT KLONLARIN OLUŞTURULMASI VE KARAKTERİZASYONU. Seda Baykal 1, Halil Ateş 2, Zeynep Sercan 1. 1 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı, İzmir, 2 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hematoloji/Onkoloji Bilim Dalı, İzmir Amaç: Kronik miyeloid lösemi (KML) biyolojisi en fazla çalışılmış kanserlerden birisidir. Bu çalışmalar sonucunda, ilk tirozin kinaz inhibitörü imatinib mesilat ın 2002 yılında kullanıma girmesi KML tedavisinde bir dönüm noktası olmuştur. İmatinib, hastaların büyük bir çoğunluğunda sitogenetik ve moleküler remisyonu sağlamaktadır. Ancak bir kısım hastada tedaviye karşı birincil ve ikincil direnç gelişimi izlenmektedir. İkincil direnç gelişimi sıklıkla Bcr-Abl tirozin kinaz proteinindeki mutasyonlarıyla ilişkilendirilmiştir. Buna karşın birincil direncin altında yatan nedenler tam anlaşılabilmiş değildir. Bunda in-vitro modellerin bulunmayışı da etkilidir. Tirozin kinaz inhibitörlerine dirençli bir hücre hattı, KML ve tedavisi ile ilgili laboratuar araştırmalarına büyük katkı sağlayacaktır. Direnç araştırmaları, mutasyon içeren bir BCR-ABL klonunun daha çok fare hücre hatlarına transfeksiyonu ile yapılmaktadır. Temel ilaç araştırmalarında büyük yarar sağlayacağından; karşılaştırılabileceği 37