Mycobacterium 01. Genel Bilgiler 02. Etiyoloji 03. Epidemiyoloji 04. Hastalık belirtileri 05. Laboratuvar Tanısı 05.01. Bakteriyoskopi 05.02. Kültür 05.03. Hayvan Deneyi 05.04. Serolojik Testler 05.05. Alerjik Testler 05.06. Bakteriyofaj Duyarlılık Testi 05.07. Moleküler Teknikler 06. Tedavi 07. Korunma 08. Kullanılan Besiyerleri 08.01. Löwenstein Jensen Medium 01. Genel Bilgiler Mycobacterium genusuna bağlı bakterilerin oluşturduğu tüberküloz, gerek hayvan ve gerekse insan sağlığını olumsuz yönde etkileyen, akciğer, diğer organ ve dokularda kazeöz ve kazeökalseröz karakterde tüberkellerin oluşması ile beliren kronik, bulaşıcı ve zoonotik bakteriyel bir hastalıktır. Klinik mikrobiyoloji bölümünde M. tuberculosis, M. leprae ve diğer Mycobacterium larla ilgili bilgiler ayrı ayrı verilmiştir. 02. Etiyoloji Mycobacterium tuberculosis insan, Mycobacterium bovis sığır, Mycobacterium avium kanatlı ve Mycobacterium marinum kökenli tüberkulozun başlıca etkenleridir. Diğer patojen mikobakteriler (M. leprae, M. paratuberculosis) yanında doğada saprofitik karakterde birçok mikobakteri vardır. Sığır tüberkülozunun etkeni olan M. bovis Gram pozitif, asidorezistans karakterde aerobik, sporsuz bir bakteridir ve dört mikobakteri türünü içeren Mycobacterium tuberculosis complex olarak adlandırılan grup içinde yer alır. Bu grupta kendisi dışında M. tuberculosis, M. africanum ve M. microti yer alır. M. bovis 0.2-0.6 x1.4.0 mikrometre boyutlarındadır. Gerçek bir kapsülü yoktur. Tüberküloz etkenlerinin hücre duvarlarında diğer bakterilere göre çok daha fazla bulunan lipoidal maddeler bu bakterilerin normal laboratuvar boyaları ile boyanmamasına neden olur. Bu nedenle Ziehl-Neelsen boyama yöntemi ile boyanırlar. M. bovis laboratuvarlarda genel amaçla kullanılan besiyerlerinde üremez koagule serum, koagule yumurta veya patates üzerinde ve diğer özel besiyerlerinde yavaş bir şekilde ürer. Etkenin jenerasyon süresi 15-24 saattir. Optimal üreme sıcaklığı 37-37.5 o C dir. M. bovis i üretmek için katı ve sıvı besiyerlerinden yararlanılmaktadır. Katı besiyerlerinden Loewenstein-Jensen (Merck 1.05400), Stonebrink, Dorset, Petragnani, vs. sıvı
besiyerlerinden, Dubos, Proskauer-Beck, vs, yarı sentetiklerden, Middlebrook-Cohn ve sentetiklerden de Souton ve Lockman besiyerleri izolasyonda kullanılmaktadır. M. bovis insan ve kuş tipi tüberküloz etkenlerinin aksine besiyerlerinde gliserine gereksinim göstermez. Katı besiyerlerinde kuru-kabarık veya yayvan, kenarları düzensiz veya oval koloniler meydana getirir. Üreme süresi 4-5 haftayı bulur. Ancak bu süre pasajlarla 3-4 haftaya inebilir. M. tuberculosis ise daha kısa sürede daha bol üreyerek, kuru, kabarık, üzeri girintili ve pembe oranj renkte koloniler oluşturur. M. avium 39-40 o C de daha iyi ve bol ürer. Buna karşın insan ve sığır tipi etkenler bu sıcaklıkta zayıf bir üreme gösterirler. M. bovis gliserinli sıvı besiyerlerinde üstte ürer. Buruşuk ve kalınca bir zar oluşturur. Bu zar zamanla dibe çökerek bir tortu meydana getirir. İnsan ve kuş tipi etkenlerde de bu özellik vardır. M. bovis i diğer tüberküloz etkenlerinin ayırımında bazı biyokimyasal farklılıklarından yararlanılır (Tablo-1). İnsan tipi (M. tuberculosis) niasin oluşturması yönünden (+) dir. Hastalık olaylarından yeni izole edilen veya virulent insan ve sığır tipi etkenlerinin bazıları sıvı besiyerlerinde üretildikleri zaman, birbirlerine paralel ve uzun zincirlerden oluşan kord lar meydana getirirler. Avirulent suşlarda kord formasyonuna genellikle rastlanmaz. Tablo-1 M. bovis in biyokimyasal özellikleri Biyokimyasal Testler Sonuç Üremeyi Baskılayıcı Maddeler Sonuç Üreaz + Pikrik asit, 2 mg/ml - Pirazinamidaz (agarda) - p-nitrobenzoik asit - Nitrat redüksiyon - Hidroksilamin HCl =0.5 mg/ml - Asid fosfataz + İsoniazid, 10 µg/ml - Katalaz, >45 mm kabarcık - Thiasetazon 10 µg/ml - Tween hidroliz (10 gün) - T-2-H 1 µg/ml - α-esteraz + NaCl, %5 - Niasin akkumulataz - Fotokromojenite - Skotokromojenite - 25 o C de üreme - 45 o C de üreme - Tüberküloz etkenlerinin sıvı ortamda üretilmesi, pürifiye ve konsantre edilmesi sonu hazırlanan tüberkülin infekte bireyleri oryaya koymada önemli yararlar sağlar. Etkene ait proteinleri içeren PPD tüberkülin (avian ve mamalian PPD tüberkülin) Türkiye de tüberkülozun alerjik tanısında kullanılmaktadır. Fransız bilim adamlarından Dr. Calmette ve Dr. Vet. Med. Guerin, sığır tipi tüberküloz etkenlerini 13 yıl, safralı-gliserinli-patatesli ortamlarda üreterek, insanlar için virulensi azalmış ve bu karakteri sabit olan bir suş haline getirmişlerdir. İnsanların immunizasyonunda başarı ile kullanılan ve BCG (Bacille Calmette Guerin) diye adlandırılan bu suş, aynı amaçla hayvanlarda kullanıldığında başarılı olmamaktadır.
Tüberküloz etkenlerinin ekzotoksin ve endotoksinleri yoktur. Fiziksel ve kimyasal maddelere karşı oldukça dirençlidirler. Fenol (%2), Formalin (%3) ve NaOH (%5) içinde 4 saatte ölebilirler. Kraşe içinde 3 ay, merada, toprakta ve gübrede 2-6 ay canlı kalabilirler. Kurumaya karşı dayanıklıdırlar. Kurumuş insan kraşesinde aylarca infektif kalırlarlar. Pastörizasyon işlemi ile genellikle ölmelerine karşın 75-80 o C de 5-10 dakika dayanabilirler. Direk güneş ışını veya ultraviyolet ışınlarına dayanıksızdırlar. Absolut alkol (%70-90) 5-10 dakikada bu mikroorganizmaları öldürür. 03. Epidemiyoloji Tüberküloz sığırlarda kongenital, sindirim, solunum, genital ve deri yolu ile bulaşabilir. Sığırlarda en çok solunum sistemine özellikle de akciğerlere yerleşerek solunum sistemi ile ilgili bozukluklar meydana getirir. Kalabalık ve havasız ahırlarda bulunan infekte hayvanlar öksürük ve tıksırık yolu ile sağlamları bulaştırarak hastalığın hızla yayılmasına yol açarlar. Endojen yolla oluşan tüberkülozik mastitisler halk sağlığı ve buzağı beslenmesinde büyük tehlike kaynağıdır. 04. Hastalık Belirtileri Klinik bulgular infeksiyonun yerleştiği yere göre değişir ve genellikle kronik bir seyir takip eder. Hayvanlarda ilerleyen bir zayıflama görülür. Akciğer tüberkülozunda zayıf, kısa, kuru ve ağrılı öksürük ile inip çıkan ateş, prescapular, boyun ve mandibular ve lenf yumrularının şişmesi görülür. Hastalığın jeneralize olması durumunda karaciğer, dalak böbrek gibi iç organlarda da lezyonlar görülebilir. Meme tüberkülozunda mastitis meydana gelir. Sütün renginde ve kıvamında değişiklikler oluşur. Boğalarda tüberkülozdan ileri gelen epididimitis infeksiyonlarına sıkça rastlanmaktadır. Dişilerde de vaginada nodül ve ülserler meydana gelebildiği gibi metritis olaylarına da rastlanır. Hayvanlarda hiçbir nedene bağlı olmayan ishal ve mezenteriyel lenf yumrularının şişmesi barsak tüberkülozunun belirtisidir. Böbrekler etkilendiği taktirde idrar bulanık, irinli ve bazen de kanlı olabilir. 05. Laboratuvar Tanısı Laboratuvar muayeneleri için laboratuvara canlı hayvanlardan idrar, süt, kraşe, uterus akıntıları, deri kazıntıları, sperma gönderilebileceği gibi ölü hayvanlardan da lezyonlu doku ve organlar alınarak bakteriyolojik muayene için soğuk zincirde ulaştırılabilir. Patolojik muayene için doku ve organlar %10 formollü kavanozda gönderilmelidir. 05.01. Bakteriyoskopi Marazi maddelerden hazırlanan preparatlar Ziehl-Neelsen yöntemi ile boyanarak mavi zemin üzerinde kırmızı asidorezistans etkenler aranır. Ancak, saprofitik karakterde olan etkenler de aynı görüntüyü verebilirler. Fluoresan antikor tekniği de bakteriyoskopi amacıyla kullanılabilir.
05.02. Kültür Etkenin kültürü amacıyla, laboratuvara gelen marazi maddelerden ekim için inokulum hazırlamak gerekmektedir. Bunun için, organ materyali mekanik olarak ezilir ve FTS ilave edildikten sonra homojenize edilir. Sıvı materyal, 3000 devirde 15-20 dakika santrifüj edilir. Diğer kontaminantları engellemek için marazi maddeler NaOH, oksalik asit, trisodyum fosfat gibi bazı maddelerle prosedürlerine uygun olarak muamele edilirler. Bu amaçla, homojenize edilmiş materyal veya sediment, kendi hacminin 4-6 katı kadar asit (Örneğin: %3-6 H 2 SO 4 ) ile karıştırılır ve 10-15 dakika bekletilir, sonra tekrar 10-15 dakika santrifüj edilir. Daha sonra Hohn un yumurta besiyeri, Petragnani veya Löwenstein-Jensen (Merck 1.05400) besiyeri gibi gliserinsiz tüberküloz besiyerlerine ekimler yapılır ve 37 o C de 8-12 hafta inkubasyona kaldırılır. Patojen mikobakterilerin bulunduğu gruptaki etkenler 5 günden daha uzun bir sürede üreme gösterirler. 05.03. Hayvan Deneyi Deneme hayvanı olarak kobaylar kullanılır. Bu amaçla marazi maddelerden hazırlanan inokulumdan kobayların inguinal lenf yumruları yakınına subkutan olarak enjeksiyonlar yapılır ve 6-8 hafta süre ile gözlem altında tutulurlar. Süre sonunda hayvanlar otopsi yapılarak incelenirler. İliakal ve subiliakal lenf yumrularından bakteriyoskopi ve kültür yapılır. 05.04. Serolojik Testler Serolojik testler yeterli spesifite ve sensitiviteye sahip değillerdir. İnsan tüberkülozunun tanısında hemaglutinasyon ve aglutinasyon gibi testler kullanılmışsa da bu testler özellikle sığır tüberkülozunda tanı için pek uygun değildirler. Ancak, son zamanlarda FAT, RIA, ELISA, gamma interferon gibi tekniklerle daha spesifik ve sensitiv sonuçlar alınmaktadır. 05.05. Alerjik Testler Tüberkülozun tanısında kullanılan en önemli metotlardan birisi de allerjik testlerdir. Bu amaçla tüberküloz basilinin ekstratları (PPD- Purifiye protein derivatı) sulandırılarak deri içi yolla uygulanır ve 72 saat sonra uygulama yerinde, birkaç gün sonra ortadan kalkan ağrı, sıcaklık, kızarıklık ve şişme gibi lokal reaksiyonlar görülür. Bu reaksiyon tüberkülin reaksiyonu olarak bilinir. Uygulanan tüberkülin tipleri (memeli, kuş, Johnin) ve derideki kalınlaşmanın derecesi hasta hayvanın belirlenmesini sağlar. Yanlış pozitif ya da negatif durumlara da rastlanmaktadır. 05.06. Bakteriyofaj Duyarlılık Testi M. tuberculosis ve M. avium un faj tiplendirmesi mümkündür. 05.07. Moleküler Teknikler
Son yıllarda, insan ve hayvan tüberkülozunun tanısında moleküler yöntemlerden yararlanılmaktadır. Spesifik DNA bölgesinin çoğaltılarak tanımlanmasını sağlayan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve ilgili teknikler M. tuberculosis ve M. bovis in tanısında yaygınlık kazanmaktadır. Klinik materyallerden (balgam, idrar, kan, lenf düğümü, süt vs) yapılan PCR çalışmaları insan ve sığır kökenli tüberkülozun tanısında kullanılmaktadır. 06. Tedavi Hasta hayvanlarda sağaltıma gidilmez. Türkiye de Sağlık Zabıtası Kanunu na göre ihbarı mecburi ve mücadelesi zorunludur. Bu nedene kesin ve erken tanısı önem taşımaktadır. Alerjik test olan tüberkülin uygulaması sonucu pozitif çıkan hayvanlar kesime gönderilir ve etleri düşük değerli olarak değerlendirilir. Mezbahalarda da postmortem muayenede, tüberküloz şüpheli hayvanların etleri şarta tabi olarak değerlendirilir. Kıymetli pet hayvanlarda insanlarda uygulananlara benzer preparatlarla sağaltım yoluna gidilebilmektedir. 07. Korunma Hastalıktan korunmak için alerjik testler ve kesimin birlikte uygulanması en ideal yöntemdir. Ayrıca, bulaşmaya neden olabilecek çevre ve beslenme şartları düzeltilmelidir. 08. Kullanılan Besiyerleri 08.01. Löwenstein Jensen Medium (Merck 1.05400) TB Medium olarak da adlandırılan bu besiyerinin hazırlanması diğer pek çok besiyerinden oldukça farklıdır. Dehidre besiyeri 37,5 g/600 ml olacak şekilde destile su içinde çözülür, gerekirse 600 ml besiyeri için 12 ml gliserol (Merck 1.04094) ilave edilip, otoklavda 121 o C da 15 dakika sterilize edilir. 50 o C a soğutulup üzerine 1 litre taze yumurtadan hazırlanmış tam yumurta (sarı ve beyaz karışık) homejenizatı ilave edilir. Bu homojenizatın hazırlanmasında gereken asepsi kurallarına uyulmalıdır. Yumurta ilavesinden sonra hava kabarcıkları oluşmayacak şekilde iyice karıştırılır ve steril tüplere 7 ml olacak şekilde dağıtılır. Tüpler yatık olarak 85 o C da 45 dakika su buharında tutularak koagülasyon sağlanır. Steriliteden emin olmak için bu işlem 24 saat sonra bir kez daha tekrarlanır. Yoğun inokülümden sonra 35 o C da 2 hafta boyunca inkübasyona bırakılan tüplerde koloni gelişimi izlenir. Gliserol ilave edilmiş besiyerinde iyi gelişen, kabarık, kırıntılı, kuru görünümlü ve genellikle yeşilimsi koloniler M. tuberculosis (R tipi) olarak tanımlanır. Bu üreme biçimi gliserolsüz besiyerlerinde daha zayıf olarak görülür. M. bovinus (S tipi) ise gliserollü besiyerinde zayıf gelişir ya da gelişmez. Gliserolsüz besiyerinde düz, nemli, parlak ve renksiz koloni oluşturur. 500 g olan bir kutu dehidre besiyeri ile yumurta homojenizatı dahil edilmek üzere gliserollü olarak 3070 adet 7 ml tüp, gliserolsüz olarak 3047 adet 7 ml tüp hazırlanır.