REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen izole edilen DNA örneği Polimerase Chain Reaction (PCR): Son yıllarda Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) yöntemi gıda patojenlerinin genetik tanısında kullanılmaktadır. PCR, DNA amplifikasyon için güçlü ve hassas bir yöntemdir ve temel olarak üç aşamalı bir işlemden oluşarak çoklu döngü tekrarları ile hedef DNA dizilerini katlayarak çoğaltır. İlk aşamada Kalıp DNA (template DNA), 92 95 o C de tutularak çift sarmal DNA birbirlerinden ayrılmaktadır. İkinci aşamada ise sıcaklığının, 37 65 o C ye düşürülmesiyle primerlerinin DNA zincirinin üzerinde kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye bağlanır. PCR reaksiyonu Son aşamasında, DNA polimeraz enzimi yapışan primerler aracığıyla 72 o C sıcaklıkta DNA çoğaltılması yapılır. Yeni sentezlenen DNA bölgesi bir sonraki döngü için kalıp olarak görev yapar ve bu şekilde her döngüde hedef bölge logaritmik bir artış gösterir. Normalde, hedef bölgesinin bulunmadığı DNA örneklerinde PCR ile çoğalma gerçekleşmez. Flüoresan İle Tespit Yöntemi: TaqMan probe ları bir uçlarında flüoresan ışınma özelliği olan Reporter boyası ve diğer uçlarında Reporter boyasının flüoresan ışınmasını baskılayan özelliğe sahip Quencher taşımaktadırlar. Hedef gen bölgesinin reaksiyonun içeriğinde bulunduğu durumda probe hedef bölgesine bağlandıktan sonra parçalanarak, Reporter boyasının flüoresan ışını ortaya çıkar. PCR cihazı ışınma miktarını ölçerek çoğalan DNA miktarını belirlemektedir. Artan flüoresan ışını sadece hedef bölgesine yapışan probe dan kaynaklandığı için spesifik olmayan bir bölgenin tespiti mümkün değildir.
İnternal Pozitif Kontrol (IPC): Olası PCR reaksiyonunu engelleyen maddelerin (PCR inhibitor) varlığını belirlemek için 2X Salmonella sp. probe Mix, primer ve probe seti ile Internal Pozitif Kontrol (IPC) template içermektedir. GİRİŞ Escherichia coli O157:H7 "koli basili" tabir edilen E. coli bakterisinin en zararlı tipi sayılmaktadır ve hemorajik kolit olarak adlandırılan gıda zehirlenmesine sebep olmaktadır. Bu bakteri genelde az pişirilmiş kıyma etin yenmesiyle hastalığa neden olunur. Ayrıca Bakteri ayrıca kişiden kişiye dokunma yoluyla, pastörize edilmemiş süt içmekle, bakterini karıştığı suyla sulanmış sebze veya meyvelerin yenmesiyle, böyle suda yüzmek veya onu içmek yoluyla da bulaşır. BM E.coli O157:H7 Real time PCR Tespit Kiti bütün O157:H7 serotiplerinin tespiti için rfbe ve FliC (flagella) olarak iki gen bölgesini kullanarak, E.coli O157:H7 türlerinin spesifik ve hassas tespiti için tasarlanmıştır. Kitte kullanılan primer seti gelişmiş biyoinformatik analizler ile geniş kapsamlı referans DNA dizileri ile %100 benzerlik göstermektedir. KİTİN İÇERİĞİ: E.coli O157:H7 Real Time PCR tespit Kiti 40 örneğin testi için tasarlanmıştır. Bileşen Hacim (µl) Tüp Sayısı 5X qpcr Master Mix (PMM) 350 1 2X E.coli O157:H7 probe Mix (HPM) 300 1 Negatif Kontrol PCR Grade Water 1000 1 Kullanım ve Saklama Koşulları: Kitin tüm bileşenleri 20 C sıcaklığında saklanmalıdır. Mümkün olduğunca çözme/dondurma sayısı en aza indirilmesi tavsiye edilmektedir.
PROSEDÜR: Ön zenginleştirme: Aseptik şartlarda 25 gram gıda stomacher poşetlerine tartılarak üzerlerine 225 ml mtsb Broth eklenerek 37 o C derecede 18 24 saat tutulur Ertesi gün her numuneden 1 ml alınarak bakteri DNA izolasyon kiti veya kaynatma yöntemleri ile DNA ekstraksiyonu yapılır. Kaynatma yöntemiyle DNA izolasyonu: Ön zenginleştirme örneğinden 1 ml alınarak mikrosantrifüj tüpünde 10 dakika süreyle 14,000 RPM de santrifüj yapılır. Hücrelerin çökmesiyle üstte kalan sıvı atılır. Pellet in üzerine 300 µl steril saf su eklenip vorteks yaparak tekrar çözülür. Tüp 5 dakika 14,000 RPM de santrifüj edilerek üstteki sıvı dikkatlice atılır. Pellet in üzerine 200 µl steril saf su eklenip vorteks yaparak çözülür. Tüp 15 dakika 100 o C sıcaklıkta inkübe edildikten sonra hızlıca buz üzerine kaldırılır. Tüp 5 dakika 14,000 RPM de santrifüj edilerek üstteki sıvı dikkatlice alınarak yeni bir tüpe aktarılır. Tüp 10 dakika 100 o C sıcaklıkta inkübe edildikten sonra hızlıca buz üzerine kaldırılır. PCR çalışmaları için elde edilen örnekten 3 5 µl kullanılır. PCR UYGULAMASI: 1. DNA kontaminasyon riskini azaltmak için pipetleme işlemlerinin özel kabin veya PCR a uygun temiz ortamda ve filtreli pipet uçları ile yapılması tavsiye edilmektedir. 2. PCR cihazında uygun programın ayarlanması için döngü sayısı, sıcaklıklar ve süreleri altta verilen tablodaki gibi düzenlenmelidir. Sıcaklık Süre Döngü 95 C 15 dk. 1 95 C 15 sn 60 C 1 dk 40
3. PCR cihazı programında her örneğin iki hedef gen bölgesi için FAM, Cy5 ve JOE olarak üç boya tipi işaretlenmelidir. Passive Reference Dye olarak ROX boyası seçilmelidir. 4. Kitteki solüsyonlar 20 C çıkarılarak çözülür. 5. PCR mikisinin hazırlanması için bir tüp alınarak hedef gen adı ile işaretlenir. 6. Alttaki tablo örnek alınarak PCR master miksi hazırlanır: Bileşen Bir Örnek için NTC Örneği için 5X qpcr Master Mix (PMM) 7 µl 7 µl 2X E.coli O157:H7 probe Mix (HPM) 6 µl 6 µl DNA (5 100 ng/µl) 1 10 µl PCR Grade Water 25 µl ye tamlanır 10 µl Not: Pipetleme sırasında PMM ve HPM için ayrı pipet uçları kullanılmalıdır. Not: Tabloda verilen hacimler bir örnek içindir. Pipetleme hatası göz önüne alarak, Master miksi hazırlarken toplamda %10 daha fazla Miks harcı için hesaplama yapılmalıdır. 7. Tekrarlı çek boşalt pipetleme ile hazırlanan miksin karışımı yapılır. 8. Hazırlanan master miskten alınarak optik kapaklı tüplere veya real time PCR plate kuyucuklarının dibine dağıtılır. 9. DNA örneğinden 3 5 µl alınarak miksin içerisine eklenir. Tekrarlı çek boşalt pipetleme ile örneğin miks ile karışması sağlanır. Not: Her örnek için ayrı pipet ucu kullanılmalıdır. 10. NTC örneği için DNA yerine PCR Grade Su eklenir. 11. Tüplerin kapağı kapatılır veya plate in özel filmi üzerine yapıştırılır. 12. Örnekler real time PCR cihazına yerleştirilir ve önceden hazırlan uygun program çalıştırılır.
SONUÇLARIN ANALİZİ: PCR programı sona erdikten sonra çıktıların saklanması için çalışma dosyası kayıt edilerek sonuçların analizi için altta verilen prosedür izlenilir: 1. Oluşan amplifikasyon eğrileri bütün örnekler için görüntülenir. 2. Base Line ve Threshold (C t ) değerleri belirlenir. 3. Hedef gen boyaları (FAM vecy5) ve IPC (JOE) ile elde edilen amplifikasyonlar belirlenir. Amplifikasyon oluşma durumuna bağlı olarak hedef gen ve IPC sonuçları pozitif (+) veya negatif ( ) olarak değerlendirilir. Elde edilen sonuçların analizi için alttaki tablo temel olarak kullanılabilir: Cy5 Boyası ile elde edilen Sinyal (hedef gen) FAM Boyası ile elde edilen Sinyal (hedef gen) JOE Boyası ile elde edilen Sinyal (IPC) Sonuç, Pozitif Negatif,, O157:H7 olmayan farklı bir E.coli alt türü O157:H7 olmayan farklı bir E.coli alt türü PCR reaksiyonu çalışmamıştır İlgili Ürünler BCD165: E. COLI O157 BROTH (BASE, see L) to UNE EN ISO 16654:2002 Selective enrichment of V.T.E.C. (E.coli Verotoxigénicos) with TSB base with Novobiocine (Use 33 g/l)