HASTANE KÖKENLİ ESCHERİCHİA COLİ İZOLATLARINDA GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZLAR

T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ MİKROBİYOLOJİ VE KLİNİK MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Prof. Dr. Metin OTKUN HASTANE KÖKENLİ ESCHERİCHİA COLİ İZOLATLARINDA GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZLAR (Uzmanlık Tezi) Dr. Şermin MERİÇ YAPAR EDİRNE-2007

TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimimde ve tez çalışmamda yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı başkanı sayın hocam Prof. Dr. Metin Otkun a, sayın hocalarım Prof. Dr. Murat Tuğrul a, Doç. Dr. Müşerref Otkun a, Doç. Dr. Nermin Şakru ya, Doç. Dr. Şaban Gürcan a, Doç. Dr. Neşe Akış a, Doç. Dr. Figen Kuloğlu na, Doç. Dr. Muzaffer Eskiocak a, laborant Metin Alkan ve diğer laboratuvar personeli arkadaşlarımın tümüne, Dr. Çiğdem Karagöl ve diğer asistan arkadaşlarıma teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER... 3 GRAM NEGATİF BAKTERİLERDE BETA-LAKTAM DİRENCİ... 3 BETA-LAKTAMAZLAR.. 3 GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZLAR DNA DİZİ ANALİZİ.. 8 17 GEREÇ VE YÖNTEMLER... 20 BULGULAR... 32 TARTIŞMA... 45 SONUÇLAR... 55 ÖZET... 57 SUMMARY... 59 KAYNAKLAR... 61 EKLER 3

SİMGE VE KISALTMALAR bp CLSI ÇDST DNA dntp EDTA GSBL Hİ IRT IEF MHA MHB MİK PZR pi TBE TE : Base pair : Clinical and Laboratory Standarts Institute : Çift disk sinerji testi : Deoksiribonükleik asit : Deoksinükleotid trifosfat : Etilen diamin tetra asetik asit : Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz : Hastane infeksiyonları : Inhibitor resistant TEM : Isoelectric focusing : Müller-Hinton agar : Müller-Hinton broth : Minimum inhibitör konsantrasyonu : Polimeraz zincir reaksiyonu : İzoelektrik nokta : Trizma baz-borik asit-etilen diamin tetra asetik asit : Trizma baz-etilen diamin tetra asetik asit 4

GİRİŞ VE AMAÇ Hastane infeksiyonları (Hİ) nın, yol açtığı mortalite ve morbidite ile hasta, toplum ve sağlık ekonomisi açısından önemli bir sorun olduğu bilinmektedir (1). Hastaların hastaneye başvurduğu dönemde inkübasyon döneminde olmayan, hastaneye başvurularından 48-72 saat sonra gelişen veya taburcu olduktan sonraki 10 gün içinde ortaya çıkabilen infeksiyonlar Hİ olarak adlandırılırlar. Değişik çalışmalarda Hİ görülme sıklığının %3,1-14,1 arasında değiştiği tespit edilmiştir (2). Ülkemizde de total sürveyans yapılan az sayıda hastanede %5 civarında oranlar saptanmıştır (3). Hİ etkenleri ve direnç profilleri ülkeler, hastaneler ve hatta aynı hastanenin değişik birimleri arasında bile farklılıklar gösterebilmektedir (4). Escherichia coli Hİ de önemli bir etkendir. Üriner sistem infeksiyonlarının en sık ve nozokomiyal sepsislerin %15 inin etkenidir. E.coli nin neden olduğu diğer infeksiyonlar arasında cerrahi alan infeksiyonları, intraabdominal abseler, peritonit ve pnömoni sayılabilir (5). Hastane kökenli E.coli izolatlarında direnç problemi giderek büyümektedir. Betalaktam antibiyotiklere karşı direnç gelişmesinde beta-laktamaz enziminin yapımı, penisilin bağlayan proteinlerin yapısında değişiklik ile antibiyotiklerin bağlanmasının engellenmesi ve bakteri içine antibiyotik girişinin azalması önemli rol oynamaktadır (5). Klinikte gram negatif bakteriler arasında beta-laktam antibiyotiklere karşı direncin en yaygın nedeni beta-laktamaz yapımıdır. Bu enzimler kromozomal, plazmid ve transpozonlar aracılı olabilir (6). Günümüzde 350 yi aşan değişik beta-laktamazlar mevcuttur. Yeni beta-laktam antibiyotiklerin geliştirilerek klinik kullanıma sunulması ve yaygın kullanımını takiben yeni beta-laktamaz varyantları ortaya çıkmıştır (7). Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) lar sefuroksim, sefotaksim, seftriakson, seftizoksim, seftazidim, sefpirom ve sefepim gibi oksiimino-sefalosporinleri hidrolize 1

edebilen ve genellikle klavulanik asit, sulbaktam veya tazobaktam gibi beta-laktamaz inhibitörleri ile inhibe olan beta-laktamazlardır. Bu tür enzimlerin tamamına karbapenemler, TEM-52 ve TEM-88 dışındaki enzimlere de sefoksitin ve sefotetan gibi sefamisinler dayanıklıdırlar. Çoğu kez GSBL üreten mikroorganizmalar aminoglikozidler, kloramfenikol, sulfonamid ve florokinolonlar gibi diğer gruplardaki antibiyotiklere de dirençlidirler (8). İlk olarak 1983 te Almanya da saptandıktan sonra GSBL ler dünya çapında tanımlanmaya devam etmiştir (9). Klebsiella spp. ve E.coli izolatlarında daha sık bulunmakla birlikte Salmonella spp. ve Shigella flexneri de dahil olmak üzere birçok enterik bakteride bildirilmiştir. Ülkemizde 1992 den beri GSBL ler araştırılmakta ve bildirilmektedir (8). Taşlı ve Bahar (10) tarafından yapılan bir çalışmada ampisiline dirençli Enterobacteriaceae izolatlarında GSBL yapımı araştırılmış, izolatların %38 inde GSBL saptanmış, izoelektrik nokta saptanması, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ve deoksiribonükleik asit (DNA) dizi analizi sonucunda izolatların beşinde SHV-2, yedisinde SHV-5 ve beşinde SHV-12 tespit edilmiştir. Jeong ve ark. ın (11) Kore de yaptıkları bir çalışmada E.coli ve Klebsiella pneumoniae izolatlarında TEM ve SHV tipi enzimler araştırılmış, beş farklı TEM tipi ve iki farklı SHV tipi beta-laktamaz tespit etmişlerdir. Ülkemizde GSBL ler ile ilgili moleküler çalışmalar sınırlı sayıdadır. Hastanemizde ilk kez yapılacak olan bu çalışmanın amacı, GSBL üreten hastane kökenli E.coli izolatlarında GSBL türlerini ve bunların antibiyotiklerle direnç ilişkisini araştırmaktır. 2

GENEL BİLGİLER GRAM NEGATİF BAKTERİLERDE BETA-LAKTAM DİRENCİ Beta-laktam antibiyotikler günümüzde en sık kullanılan antibiyotik türevlerinin başında gelir ve penisilin bağlayan proteinler adı verilen enzimlere bağlandıktan sonra bakterilerin hücre duvar sentezini inhibe ederek etki gösterirler. Çok yaygın kullanılmalarının sonucu olarak da beta-laktam antibiyotiklere karşı direnç giderek artmaktadır. Bakterilerde beta-laktamlara direnç gelişmesine neden olan mekanizmalar ilacın beta-laktamazlarca parçalanması, penisilin bağlayan proteinlerde oluşan değişiklikler ile ilacın hedefine etkin konsantrasyonda ulaşmasını engelleyen porin değişikliklerine bağlı geçirgenlik azalması ve/veya aktif pompa (efluks) sistemleridir (12). BETA-LAKTAMAZLAR Beta-laktamazların Sınıflandırılması ve İsimlendirilmesi Enterobacteriaceae ailesi arasında beta-laktam antibiyotiklere karşı direncin en yaygın nedeni beta-laktamaz üretimidir. Beta-laktamazlar, beta-laktam halkasını hidrolize ederek beta-laktam antibiyotiklerin etkisine karşı mikroorganizmaları korurlar (13). Bu enzimler gram negatif bakterilerde periplazmik boşluk içinde yer alırlar; beta-laktam halkasındaki siklik amid bağını parçalayan enzimlerdir (12). Beta-laktamazların sayısının artması sonucu farklı zamanlarda birçok sınıflandırma şeması önerilmiştir. Yaygın kabul gören ilk şema 1960 larda Richmond ve Sykes tarafından önerilmiştir (14). Bu şema 1976 yılında Sykes ve Matthew tarafından izoelektrik odaklamayla beta-laktamazların ayrımı vurgulanarak genişletilmiştir. Zamanla hatalar ve eksiklikler 3

görülünce şema 1989 da Karen Bush tarafından değiştirilmiş ve 1995 te güncelleştirilmiştir. Hem plazmid hem de kromozomal özellikli enzimlerin olduğu bu sınıflandırmada önceki sınıflandırmalarda kullanılan substrat profili, inhibitör profili, moleküler ağırlığı, hidroliz hızı, bağlanma afinitesi ve izoelektrik nokta gibi özelliklere oksasilin, sefoksitin ve nitrosefinin substrat profiline ve tazobaktamın inhibisyon profiline katılmasıyla enzimler dört grupta toplanmıştır (Grup 1-4). Grup 1 sefalosporinazlar klavulanik asit ile iyi inhibe olmazlar. Grup 2 genellikle klavulanat tarafından inhibe edilen en geniş grubu oluşturur (15). Bu enzimler penisilinleri, sefalosporinleri, kloksasilini, karbenisilini, karbapenemleri ve monobaktamları hidrolize etmelerine göre altı alt gruba ayrılır (12). Grup 3 metallo-beta-laktamazlar etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) ve p-kloromerkuribenzoat ile inhibe olurlar, klasik betalaktamaz inhibitörleriyle inhibe olmazlar. Grup 4 beta-laktamazlar penisilinazlardır ve yine klavulanik asit ile inhibe olmazlar. Moleküler düzeydeki mekanizmalara dayanan sınıflamanın ilk temellerini ise 1980 yılında Ambler atmıştır (15). Bu sınıflandırmada betalaktamazlar A, B, C ve D olmak üzere dört grupta toplanmaktadır. A, C ve D grupları serin enzimlerini içerirken B grubunda çinko enzimleri bulunmaktadır (12,16,17). Sınıf A serin penisilinazları, sınıf B metalloenzimleri, sınıf C serin sefalosporinazları ve sınıf D oksasilini hidrolize eden serin beta-laktamazları içerir (18). Beta-laktamazların sınıflandırılmasında olduğu gibi isimlendirilmesinde de önemli bir karışıklık vardır. Bazı enzimler tercih ettikleri substratlara (CARB, OXA, IMP, FUR), bazıları biyokimyasal özelliklerine (SHV), bazıları izole edildikleri bakterilere (PSE), bazıları genlerine (AmpC, CepA), bazıları dirençli bakterinin izole edildiği hastanın ismine göre (TEM, ROB), bazıları eyaletlere (OHIO), bazıları enzimi bulan kişilerin isimlerine (HMS) göre isimlendirilmiştir (19). Bugün için ulaşılan bilgilerle bu isimlendirmeler geçersiz durumdadır. Örneğin ismini biyokimyasal özelliği olan sülfidril variable nedeniyle alan SHV enziminin aktif bölgesinin serin hidroksil olduğu anlaşılmıştır. Sefotaksime karşı dirence yol açtığı için CTX-1 olarak isimlendirilen enzimin nükleotid dizi analizi sonucu TEM beta-laktamazları kodlayan genlerde nokta mutasyonlarının birikiminden köken aldığı anlaşılmıştır. Sonuç olarak CTX-1 TEM-3 olarak isimlendirilmiştir. Benzer şekilde SHV-1 de 1972 de ilk olarak Pitton tarafından PIT-2 olarak isimlendirilmişti. Bu nedenle artık aynı enzimden köken alanların numaralandırılması (TEM 1-36, SHV 1-12 gibi) yöntemi kullanılmaktadır (15,20,21). 4

Beta-laktamazların Belirlenmesi 1) Beta-laktamazları tespit eden testler: Direkt beta-laktamaz testleridir. Zor üreyen gram negatif türleri, Staphylococcus spp. ve gram negatif basiller için uygulanır. Sadece enzimin var olup olmadığını gösterir. Tedavi seçeneğini etkilediği için en çok Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis ve Neisseria spp. de kullanılır. Bu gruptaki testlerin hepsi beta-laktam hidrolizine bağlı son ürünlerin saptanması temeline dayanır ve renk değiştirme reaksiyonudur. Kromojenik sefalosporin testleri (Nitrosefin testi, 7 (tienil-2-asetamido)-3-[2- (4-N,N-dimetilaminofenilazo) piridinium metil]-3-sefem-4-karboksilik asid testi), iyodometrik testler ve asidometrik testler en çok kullanılan testlerdir (6). Nitrosefin testi: Nitrosefin kromojenik bir sefalosporindir, ticari olarak çözücüleriyle birlikte pudra şeklinde veya nitrosefin emdirilmiş kağıt disk şeklinde temin edilebilir. Nitrosefin hidrolize olduğunda sarıdan kırmızıya renk değişimi olur. Beta-laktamazların çoğu için en duyarlı test nitrosefin testidir. Ancak bu test Staphyloccus spp. nin penisilinazlarını ve Haemophilus spp. nin ender görülen ROB-1 enzimini saptamada yetersizdir (6). 7 (tienil-2-asetamido)-3-[2-(4-n,n-dimetilaminofenilazo) piridinium metil]-3-sefem- 4-karboksilik asid testi: Teste adını veren kimyasal madde yine kromojenik sefalosporindir, ancak temini güçtür (22). İyodometrik testler: Beta-laktamların yıkım ürünleri iyodu iyodüre indirger ve bakteri beta-laktamaz üretiyorsa iyodin-nişasta kompleksinin oluşumu engellenir, renksizleşme görülür (6). Hazırlanan penisilin süspansiyonuyla tüpte test edilebileceği gibi filtre kağıdına önceden penisilin ve nişasta emdirilerek hazırlanan disklerle de test edilebilir. Diskin üzerine iyot solüsyonu damlatılıp bakteri kolonileri sürülür, 5 dk içerisinde rengin giderilmesi betalaktamaz varlığını gösterir (22). Asidometrik testler: Beta-laktam halkasının hidrolizi bir karboksil grubunu oluşturur ve tamponsuz ortamda ph düşer. Bu da ph indikatörlerinde renklenmeyle ölçülür. Fenol kırmızısı solüsyonu üzerine penisilin ilave edilir, ph: 8,5 e ayarlanır. Alınan bakteri lam üzerinde veya tüpte solüsyona ilave edildiğinde 5-10 dk içerisinde sarı renk oluşumu betalaktamaz aktivitesini gösterir (22). Bu yöntem nitrosefin testinden daha ucuzdur. Duyarlılığı yüksek olmakla birlikte yanlış pozitiflik oranı da yüksektir (6). Biyolojik metodlar: İndikatör bir mikroorganizmanın (beta-laktamaz negatif) kullanıldığı Masuda Çift Disk Yöntemi bunlardan biridir. İndikatör organizma Müller- Hinton agar (MHA) besiyerine ekilir. Test edilecek antibiyotik besiyerinin ortasına yerleştirilir. Beta-laktamaz yapımı araştırılacak bakteri veya hücre ekstraktı filtre kağıdına emdirilip antibiyotik diskinin 1,5 cm uzağına yerleştirilir. Bir gece 37 Cº de inkübasyondan 5

sonra antibiyotik diskinin bakteri ekstraktı tarafında çentik oluşması beta-laktamaz varlığını gösterir. Kalitatif olmasına rağmen oldukça duyarlıdır (23). 2) Beta-laktamazları tiplendiren testler: Kromozomal beta-laktamazlar (AmpC beta-laktamazlar) için indüksiyon testleri ve GSBL için olan testler (Sayfa 13 te ayrıntılı olarak bahsedilecektir) dir (22). AmpC beta-laktamaz için indüksiyon testi: Direnç Enterobacteriaceae ailesi üyelerinde basit olarak sefoksitin direnciyle tespit edilir. Disk difüzyon testinde sefotaksim gibi zayıf bir indükleyici yanına sefoksitin gibi güçlü bir indükleyici içeren disk yerleştirilmelidir. Sefoksitine komşu sefotaksim zonunda kesilme indüksiyonu göstermektedir (24). Dikkat edilmesi gereken sınırda bir sefoksitin direnci değil hiç inhibisyon zonu olmaması ve minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) 128 mg/l olacak şekilde ileri derecede direncin kesin kriter olarak alınmasıdır. Sefoksitin etrafında inhibisyon zonu olan ancak zon çapı dirençli olarak değerlendirilen sınırlar içinde olan kökenler Enterobacter spp., Serratia spp. ya da Citrobacter spp. olarak tanımlanırsa AmpC direnç riski yönünden klinisyene bildirilmelidir (17). Beta-laktamazlar direnç geninin kromozom ya da plazmid üzerinde bulunmasına göre iki gruba ayrılırlar: Kromozomal beta-laktamazlar ve plazmid aracılı beta-laktamazlar. Kromozomal Beta-laktamazlar Bu gruptaki enzimlerin bazı türleri sınıf A enzimlere sahip iken esasen çok sayıdaki tür sınıf C sefalosporinazlardır ve klavulanik asit ile iyi inhibe olmazlar. Salmonella spp. dışında hemen tüm gram negatif bakterilerde bulunur. Ancak miktar, sentez yolu ve dirençteki rolleri açısından farklılık gösterir. İndüklenebilir, yüksek düzeyde yapısal (stabil derepresyon) ve düşük düzeyde yapısal enzimler olarak bulunabilirler. E.coli ve Shigella spp. de düşük düzeyde sentezlenen yapısal enzimler vardır ve miktarları ampisilin ve dar spektrumlu sefalosporinlere karşı direnç oluşturmayacak kadar düşük düzeydedir. Buna karşın E.coli izolatlarının %2 sinde AmpC enzimlerinin aşırı sentezi sonucu yüksek düzeyde direnç oluşabilmektedir. Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Serratia spp., Morganella morganii, Providencia stuartii ve Providencia rettgeri de sentezlenen kromozomal beta-laktamazlar indüklenebilen türdedir (6). Ampisilin ve dar spektrumlu sefalosporinler enzim hidrolizine dayanıksız olup genel olarak MİK değerlerinin altında güçlü indükleyicilerdir. Sonuç olarak hem indüklenebilir hem de stabil dereprese organizmalar bu antibiyotiklere dirençlidir. Geniş spektrumlu 6

sefalosporinler, üreidopenisilinler ve karboksipenisilinler bu enzimler tarafından hidrolize dayanıksız, ancak MİK değerlerinin altında zayıf indükleyici olduklarından indüklenebilir beta-laktamazı olan organizmalar duyarlı, stabil dereprese olanlar ise dirençlidir. Karbapenemler güçlü indükleyiciler olup enzim hidrolizine de dayanıklıdırlar ve hem indüklenebilir hem de stabil dereprese organizmalara karşı etkilidirler. Temosilin ise zayıf bir indükleyici olup bu enzimler tarafından hidrolize dayanıklıdır (24). Plazmid Aracılı Beta-laktamazlar Moleküler sınıf A ve D içinde yer alan en geniş kategoriye sahip enzimlerdir (12). Dereprese mutantların ortaya çıkışından sorumlu genler kromozom kaynaklı olduğundan bakteriler arasında yayılmasında problem olmaz diye düşünülürken son on beş yıldır tipik olarak Enterobacter ve Citrobacter türlerinde görülen yüksek düzeyde sefalosporinaz üretimi Klebsiella spp. ve E.coli de de dikkat çekmeye başlamıştır. Burada problemin dereprese mutantlardan kaynaklanmadığı, söz konusu bakterilerin plazmid kaynaklı AmpC geni taşıdıkları belirlenmiştir. Plazmid kaynaklı sefalosporinazlar (MOX-1, FOX-1, CMY-1, CMY-2, LAT-1, BIL-1, MIR-1) kromozomal AmpC sefalosporinazlarla ilişkilidir. İlk olarak K.pneumoniae kökenlerinde saptanan (MIR-1) bu beta-laktamazlar sefoksitin, oksiiminosefalosporinler ve aztreonama dirence neden olurlar. GSBL lerin aksine beta-laktamaz inhibitörlerine de dirençlidirler (MOX-1 hariç) (25). Plazmid bağımlı beta-laktamazlar beş başlık altında toplanabilir (6): TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 enzimleri, klasik OXA ve PSE enzimleri ve daha nadir dar spektrumlu enzimler, TEM ve SHV türevi GSBL ler, TEM ve SHV den kaynaklanmayan GSBL ler ve inhibitör dirençli TEM mutantları. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar ayrı başlık altında anlatılacaktır. TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 enzimleri: Enterobakterilerde plazmid kaynaklı enzimlerin en yaygını TEM-1 olup, E.coli izolatlarının yaklaşık %50 sinde görülen ampisilin direncinin %90 ından sorumludur. Ayrıca bu enzim Haemophilus, Vibrio ve Neisseria cinslerinde giderek artan miktarda görülen ampisilin ve penisilin direncinden de sorumludur. TEM-1 enzimi penisilin ve sefalotin ile sefaloridin gibi ilk kuşak sefalosprorinleri hidrolize edebilmektedir. TEM-1 den ilk türeyen enzim olan TEM-2, orijinal beta-laktamazdan tek bir aminoasit yerleşimindeki farklılık ile ayrılır, fakat substrat profilinde bir değişiklik söz konusu değildir. SHV-1 en çok K.pneumoniae kökenlerinde bulunmakla birlikte Citrobacter 7

diversus, E.coli ve P.aeruginosa da da bu enzimlere rastlanmıştır. TEM tipi betalaktamazların aksine SHV-1 in nispeten daha az sayıda türevi vardır (26). Klasik OXA ve PSE enzimleri: Enterobakterilerde klasik OXA enzimlerinin en yaygın tipi OXA-1 olup genel olarak penisilinlere karşı düşük düzeyde direnç sağlar. OXA-1 üreten bakterilerin çoğu piperasilin-tazobaktama duyarlı olmalarına karşın klavulanatla olan kombinasyonlara dirençlidir. Geniş spektrumlu sefalosporinler bu enzimlere dayanıklıdır. PSE-1 ve PSE-4 beta-laktamazları klasik TEM tiplerine benzer direnç paterni göstermekte olup gram negatif bakterilere etkili tüm penisilinler, sefoperazon ve sefsulodin bu enzimlere duyarlıdır. Bu enzimlere sahip P.aeruginosa izolatları sıklıkla inhibitör kombinasyonlarına dirençlidir (6). İnhibitöre dirençli TEM mutantları: TEM tipi beta-laktamazlardaki mutasyonlar sonucu GSBL lerde olduğu gibi yeni beta-laktamaz inhibitörlerine dirençli varyantların oluştuğu belirlenmiştir. Bu enzimler GSBL olmamakla birlikte sıklıkla GSBL ler ile birlikte anılmaktadırlar, çünkü bu enzimler de klasik TEM ve SHV tipi enzimlerden türemişlerdir. Bu enzimler önceleri Inhibitor Resistant TEM (IRT) olarak isimlendirilmiş, ancak daha sonra köken aldıkları TEM ya da SHV de sıralamaya girmiştir. Örneğin IRT-1 TEM-31, IRT-2 TEM-44 olarak yeniden numaralanmıştır (6). Günümüzde en az 19 farklı IRT mevcuttur (8). IRT ler esas olarak E.coli izolatlarında bulunmuştur, fakat aynı zamanda K.pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis ve C.freundii nin bazı kökenlerinde de gösterilmiştir. IRT ler klavulanik asit ve sulbaktam ile inhibisyona dirençli olmakla birlikte tazobaktam ve sonradan kullanılan piperasilin/tazobaktam kombinasyonuna duyarlı kalmaya devam etmektedirler (26). TEM-50 ve TEM-68 gibi nadir örnekler dışında IRT ler üçüncü kuşak sefalosporinleri hidroliz etmemektedir (27). GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZLAR Oksiimino-sefalosporinlerin gram negatif bakteriler nedeniyle gelişen infeksiyonların tedavisinde 1980 li yıllarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmasından sonra yeni betalaktamazlar ortaya çıkmıştır. Bunlardan ilki Almanya da bir Klebsiella ozaenae kökeninde bulunan SHV-2 enzimidir. Etki spektrumlarının artmasından dolayı bu enzimler genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar olarak isimlendirilmişlerdir (28). 8

Genel Özellikleri Oksiimino-sefalosporinleri (örn. sefotaksim ve seftazidim) ve monobaktamları (örn. aztreonam) hidrolize ederek etkisiz hale getirirler. Genellikle sefamisinlere (örn. sefoksitin) ve karbapenemlere duyarlıdırlar (27). Buna karşın klavulanik asit gibi beta-laktamaz inhibitörleriyle olan kombinasyonlar her zaman etkili olmayabilir. Enzim çok miktarda sentezleniyorsa, birden fazla enzim varsa veya permeabilitede porin kaybına bağlı bir azalma söz konusu ise bazı GSBL içeren bakteriler bu kombinasyonlara dirençli olabilirler (15). Ayrıca infekte eden bakteri miktarı, ilacın dozu ve var olan GSBL nin tipine göre de betalaktam/beta-laktamaz inhibitörü kombinasyonunun etkisi farklılık gösterebilir (26). Çoğu GSBL enterik gram negatif bakterilerin klasik plazmid kökenli beta-laktamazları olan TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 den köken alır. Köken alınan ana enzimin moleküler yapısındaki aminoasitlerden bir ila dördünün yerine farklı aminoasitlerin gelmesi sonucu oluşurlar (14). Bugün 100 ü aşan TEM tipi ve 50 yi aşan SHV tipi GSBL mevcuttur (29). Mevcut GSBL tipleri ve sayılarına ilişkin en güncel bilgilere ulaşmak için http://www.lahey.org/studies/webt.html web adresinden yararlanılabilir. Sınıflandırılması Büyük çoğunluğu aktif bölgesinde serin molekülü içerir ve Ambler in moleküler sınıflamasına göre sınıf A da (Bush sınıflamasına göre Grup 2be), oksasilini hidrolize eden beta-laktamazlar ise sınıf D de (Bush sınıflamasına göre Grup 2d) yer alırlar. Yapısal ve evrimsel özellikler açısından GSBL ler dokuz farklı grup içinde sınıflandırılmaktadır. Bu gruplar TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES/IBC, TLA, BES ve OXA dır (30). TEM: Geçmişe bakıldığında 1987 de izole edilen TEM-3 ilk TEM tipi GSBL olmayabilir. 1982 de Liverpool da ilk olarak plazmid taşıyan bir genin kodladığı seftazidim direncine sahip K.oxytoca izole edildi. Sorumlu beta-laktamaz bugün TEM-12 olarak adlandırılan enzimdi. O yıllardan bu yana 100 ün üzerinde TEM tipi beta-laktamaz tanımlanmıştır ve bunların çoğunluğu GSBL dir. İzoelektrik nokta aralıkları 5,2-6,5 arasındadır. Beta-laktamaz inhibitörleriyle çoğunun etkisinin azaldığı bulunmuştur (31). TEM enzimlerinde görülen aminoasit yer değişiklikleri sınırlı sayıda pozisyonda görülür. Bu değişiklikler 104. pozisyonda glutamat yerine lizin, 164. pozisyonda arjinin yerine serin ya da histidin, 238. pozisyonda glisin yerine serin ve 240. pozisyonda glutamat yerine lizin şeklindedir. TEM-AQ denilen TEM benzeri enzimler diğer TEM enzimlerinde görülmeyen birkaç aminoasit yer değişikliği ya da aminoasit çıkartılmasını içerir. En sık 9

E.coli ve K.pneumoniae de görülmekle birlikte enterik ve non-enterik pek çok bakteride de bulunabilecekleri bildirilmiştir (28). SHV: Aminoasit değişikliği olan pozisyonlar TEM grubu GSBL lere kıyasla daha azdır. SHV türlerinin çoğunda karakteristik değişiklik 238. pozisyonda glisin yerine serinin gelmesidir (8). SHV-5 ilişkili pek çok tür 240. pozisyonda glutamat yerine lizinin gelmesiyle oluşur. Her iki pozisyondaki aminoasit yer değişikliğinin TEM tipi beta-laktamazlarda da görülmesi ilginçtir. Seftazidimin etkin hidrolizi için 238. pozisyondaki serin rezidüleri, sefotaksimin etkili hidrolizi için ise lizin rezidüleri önemlidir. Sadece SHV-10 inhibitör dirençli özelliktedir. SHV tipi GSBL ler K.pneumoniae dışında C.diversus, E.coli ve P.aeruginosa da da tanımlanmıştır (28). CTX-M: Almanya, Fransa ve Arjantin de 1990 ların başında sefotaksime seftazidimden daha yüksek düzeyde direnç gösteren GSBL üreten gram negatif bakteriler tanımlandı. Ambler sınıf A beta-laktamazlardan olan bu enzimler sefotaksimi yüksek düzeyde etkilediğinden CTX-M olarak adlandırıldı (32.). Esas olarak Salmonella enterica serovar typhimurium ve E.coli de bulunmakla birlikte diğer Enterobacteriaceae türlerinde de tanımlanmışlardır (26). Aminoasit dizilerine göre beş farklı grupta toplanırlar: CTX-M-1 grubu (CTX-M-1, -3, -10, -11, -12, -15, -22, -23, -29, -30, -32, -33, -28, -36, -54 ve UOE-1), CTX-M-2 grubu (CTX-M-2, -4, -6, -7, -20, -31, -44 (önceden TOHO-1 di) ve FEC-1), CTX- M-8 grubu (CTX-M-8 ve CTX-M-40), CTX-M-9 grubu (CTX-M-9, -13, -14, -16, -17, -18, - 19, -24, -27, -45 (önceden TOHO-2 idi), -46, -47, -48, -49 ve CTX-M-50) ve CTX-M-25 grubu (CTX-M-25, -26, -39 ve CTX-M-41) (33). CTX-M enzimleri en yaygın plazmid aracılı TEM ve SHV beta-laktamazlarla %40 ya da daha az homoloji gösterir. Bilinen aminoasit dizileriyle %70-75 arasında olan en iyi benzerlik skoru K.oxytoca, Proteus vulgaris ve C.diversus un sefalosporinleri hidrolize eden kromozomal enzimleriyle gözlenir. CTX-M tipi beta-laktamazların genişlemiş spektrumlu aktivitesinde anahtar role CTX-M enzimlerinde değişmeden var olan 237. pozisyondaki serin rezidüleri katkıda bulunmuştur (34). Tazobaktam bu enzimlere karşı klavulanata göre yaklaşık 10 kat daha fazla inhibitör etkiye sahiptir. TOHO-1 ve TOHO-2 yapısal olarak CTX-M tipi beta-laktamazlarla ilişkilidir. Bunların hidrolitik aktiviteleri seftazidime göre sefotaksime karşı daha güçlüdür (31). 10

OXA: Bu enzimler diğer GSBL lerin aksine moleküler sınıf D de ve fonksiyonel grup 2d de yer alırlar (30). OXA-15 ve OXA-32 OXA-2 den türemiştir (27,35). OXA-11, OXA- 13, OXA-14, OXA-16, OXA-17, OXA-19, OXA-28 ve OXA-35 ise OXA-10 dan türemiştir (27,36-39). OXA-11, -14, -15 ve OXA-16 seftazidim direncine yol açarken, OXA-17 sefotaksime direnç oluşturmaktadır (28). Oksasilin ve kloksasiline karşı gösterdikleri yüksek hidrolitik aktivite en önemli özellikleridir. Beta-laktamaz inhibitörleri tarafından inhibe edilmez ya da zayıf bir biçimde inhibe edilirler (40). Ancak OXA-18 in klavulanik asit ile tamamen inhibe edildiği bildirilmiştir. En sık P.aeruginosa da bulunmakla birlikte diğer gram negatif bakterilerin çoğunda tespit edilmiştir (29). Bunlara ek olarak pek çok GSBL olmayan OXA derivesi de tanımlanmıştır. Bunlar OXA-20, OXA-22, OXA-24, OXA-25, OXA-26 ve OXA-30 dur (28). Oksasilinazların çoğunluğu kromozomal enzimlerdir, bununla birlikte Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. ve Enterobacteriaceae ailesi gibi gram negatif patojenlerde plazmidlerde yerleşen genlerle kazanılır ve transpozon ya da integronlar tarafından kontrol edilirler (40). PER: Tanımlanmış GSBL tipleriyle yakın ilişki içinde olmayan bazı GSBL tipleri daha vardır. İlk kez Türkiye den bir hastanın P.aeruginosa kökeninden izole edilen PER-1 bunlardan biri olup kromozomal bir enzimdir (41). Daha sonra aynı enzim Salmonella enterica serovar typhimurium ve Acinetobacter baumannii izolatlarında da gösterilmiştir. Bu enzim seftazidime dirençli A.baumannii kökenlerinin %60 kadarında bulunmaktadır (26). PER-1 enzimi içeren P.aeruginosa nın en belirgin özellikleri, izolatların seftazidime çok dirençli olmalarına karşın (MİK 256 µg/ml) piperasilin için daha düşük bir direnç göstermeleridir (MİK: 8-16 µg/ml). Bu enzimler klavulanik asit ve tazobaktama duyarlıdır (8). Epidemiyoloji Geniş spektrumlu beta-laktamlar ilk kez Batı Avrupa da kullanılmaya başladığından GSBL ler ilk olarak burada görülmeye başlamış, ancak kısa sürede ABD ve Asya ya da yayılmıştır. ABD de GSBL yapım oranı kurumlara bağlı olarak % 0-25, ortalama %3 civarındadır (28). Klinik izolatlar arasında GSBL lerin prevalansı şehirden şehire ve hatta hastaneden hastaneye farklılık gösterir. Fransa da 1990 larda nozokomiyal K.pneumoniae izolatlarının %25-35 inde GSBL üretimi varken son yıllarda infeksiyon kontrol önlemlerinin 11

uygulanmasıyla bu oran düşmeye başlamıştır (31). On Avrupa ülkesindeki 31 merkezde yapılan son büyük incelemede 1610 E.coli ve 785 K.pneumoniae izolatı arasında GSBL prevalansı Kuzey Avrupa ülkelerinde (örn. Almanya) %1-5 kadar düşük, Doğu Avrupa ülkelerinde (örn. Rusya, Polonya ve Türkiye) ise %39-47 kadar yüksek bulunmuştur (27). Son yıllarda yapılan ve Japonya dan 196 farklı kurumun verilerini içeren bir çalışmaya göre E.coli lerin %0,12 sinden ve K.pneumoniae lerin %0,03 ünden azında GSBL üretimi saptanmıştır (26). Kore de bu oran %4,8, Tayvan da %8,5 ve Honkong da %12 ye yakındır (28). Trakya Üniversitesi Hastanesi nde 1995-1999 yılları arasında yapılan bir çalışmada toplam 194 nozokomiyal Enterobacteriaceae kökeninin %11,8 inde GSBL üretimi gösterilmiştir (42). Spesifik GSBL lerin sadece belirli ülke ya da bölgelerde görülmesi ilginçtir. Örneğin TEM-10 uzun yıllardır ABD de, salgınlarla ilişkisi olmayan bazı GSBL üreten mikroorganizmalarda bulunmaktadır. Bununla birlikte son yıllarda TEM-10 Avrupa da da benzer sıklıkta görülmektedir (31). Fransa da SHV-3, SHV-4 ve TEM-3, Almanya da ise SHV-2 ve SHV-5 daha sıktır (43). Farklı olarak SHV-5 beta-laktamaz dünya çapında en yaygın rastlanılan GSBL dir ve Hırvatistan, Fransa, Yunanistan, Polonya, Macaristan, Güney Afrika, İngiltere ve ABD den bildirilmiştir (28). Kore de en sık bulunan GSBL lerin SHV-12 ve CTX-M tipi beta-laktamazlar olduğu saptanmıştır (44). CTX-M tipi GSBL ler başlıca Salmonella enterica serovar typhimurium ve E.coli de bulunmuştur, fakat diğer Enterobacteriaceae türlerinde de tanımlanmıştır (28). Önceleri TEM ve SHV tipi enzimler baskın olan GSBL ler iken, son on yılda CTX-M enzimleri hem hastane kökenli hem de toplum kökenli izolatlarda en sık görülen GSBL ler halini almıştır (33). Genellikle Güney Amerika, Uzak Doğu ve Doğu Avrupa ülkelerinde daha baskın olarak bulunur. Arjantin de en sık görülen GSBL CTX-M-2 dir. Polonya da CTX-M-3 yaygın olarak bulunur. Son yıllarda CTX-M tipi enzimler ABD de ve Batı Avrupa ülkelerinde de bildirilmiştir (32). Genişlemiş spektrumlu OXA enzimlerinin ilki olan OXA-11 ve daha sonra OXA-14, - 15, -16 ve OXA-17 ilk kez Türkiye de izole edilen farklı P.aeruginosa kökenlerinde tanımlanmıştır (8). Bunların Türkiye ve Fransa da sık bulunmalarının nedeninin bu enzimleri içeren kökenlerin bulunmasından mı yoksa bu enzimler üzerinde çalışan araştırmacıların bu ülkelerde bulunmasından mı kaynaklandığı bilinmemektedir (28). Ülkemizde bildirilen diğer GSBL türleri PER-1, SHV-12, SHV-5, SHV-2, CTX-M-15, CTX-M-3 ve CTX-M-2 dir (9,45-50). 12

Neden Olduğu Sorunlar Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz sentezleyen bakterilerin klinikte neden olduğu sorunların başında direnç problemi gelmektedir. Bu enzimlerden birini sentezlediği saptanan gram negatif bakteri penisilinlere, tüm sefalosporinlere ve monobaktamlara dirençli kabul edilmelidir. Öte yandan bu enzimleri kodlayan plazmidler aynı zamanda pek çok beta-laktam dışı antibiyotiğe karşı da genetik materyal taşımaktadırlar. Bu yüzden GSBL sentezleyen bakteriler aynı zamanda başta aminoglikozidler olmak üzere kinolonlar, tetrasiklin, kloramfenikol ve sülfonamidlere karşı da direnç gösterebilirler (51,52). Bir bakteri sentezlediği GSBL enziminin farklı sefalosporinlere afinitesinin farklı olması ve inokulum etkisi gibi nedenlerle 3. kuşak sefalosporinlere duyarlı gibi gözükebilir. Ancak bu bakterinin neden olduğu hastalık üriner sistem dışında bir infeksiyonsa 3. kuşak sefalosporin tedavisi başarısızlıkla sonuçlanır. Örneğin TEM-26 taşıyan bir K.pneumoniae kökeni in-vitro seftazidime dirençli (MİK >256 µg/ml), sefotaksime ise duyarlı (MİK 0,5 µg/ml) gözükebilir. Böyle bir durumda sefotaksim tedavisi başarısızlıkla sonuçlanır. Bunun nedeni TEM-26 nın düşük yoğunluklarda bile seftazidime yüksek afinite göstermesi, sefotaksimi ise ancak infeksiyon ortamındaki gibi yüksek bakteri yoğunluğu durumunda hidrolize edebilmesidir (52). Bu yüzden rutin duyarlılık testlerinde seftazidime yüksek afinite gösteren GSBL lerin sık rastlanıldığı bir yerde laboratuvarın sefotaksim ve seftriaksonu rutin duyarlılık testlerinde kullanılan 3.kuşak sefalosporin olarak tercih etmesi GSBL saptanmasını güçleştirecektir (7). Buna karşın CTX-M tipi GSBL ler ise genellikle seftazidimi hidrolize etmezler, dolayısıyla seftazidim GSBL varlığını göstermede tek başına uygun bir belirleyici değildir (53). Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz sentezleyen organizmalarla olan infeksiyonların tedavisi konusunda randomize, kontrollü çalışmalar yoktur (27). Ancak çeşitli retrospektif çalışmalarda GSBL varlığının mortalite ve morbiditeyi olumsuz yönde etkilediği gösterilmiştir (52). Yakın zamanda yapılan çok merkezli prospektif bir çalışmada GSBL üreten K.pneumoniae ile gelişen bakteremilerde uygun antibiyotik kullanılmadığında mortalitenin arttığı, baktereminin başlangıcından itibaren ilk beş gün içinde uygulanan karbapenemin in vitro olarak etkin görülen diğer antibiyotiklere kıyasla mortaliteyi önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur (54). Saptama Yöntemleri Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz üreten bakteriyel kökenlerin artan prevalansı birçok salgına neden olmuştur. Bu durum GSBL tarama ve doğrulama testleri için hızlı ve 13

güvenilir laboratuvar testlerinin yerleşmesini gerekli kılmıştır (55). Clinical and Laboratory Standarts Institute (CLSI) bu testlerin K.oxytoca, E.coli ve P.mirabilis izolatları için rutin olarak yapılmasını önerir (56). Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü nün önerdiği genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz tarama ve doğrulama testleri: Disk diffüzyon yöntemi ve dilüsyon yöntemleriyle yapılır. 1) Disk diffüzyon yöntemi: Bu yöntemi uygularken CLSI sefpodoksim (10 µg), seftazidim (30 µg), aztreonam (30 µg), sefotaksim (30 µg) ve seftriakson (30 µg) içeren antibiyotik disklerinden bir ya da testin duyarlılığını arttırmak için birden fazlasının kullanılmasını önerir. Müller-Hinton agar besiyerinde yapılan disk diffüzyon testi sonucunda sefpodoksim 17 mm, seftazidim 22 mm, sefotaksim 27 mm, aztreonam 27 mm, seftriakson 25 mm inhibisyon zonu oluşturmuşsa bakterinin GSBL ürettiğinden şüphelenilir. Bu durumda sefotaksim ve seftazidim tek başına ve klavulanik asit (10 µg) ile birlikte test edilerek fenotipik doğrulama testi yapılmalıdır. Klavulanik asit varlığında inhibisyon zon çapında 5 mm artış olması GSBL varlığını doğrular (56). 2) Dilüsyon yöntemleri: Mikroplate ya da tüpte katyon katkılı Müller-Hinton broth (MHB) ile yapılan dilüsyon testleri ile elde edilen MİK değerlerinin seftazidim, sertriakson, aztreonam ve sefotaksim için 2 µg/ml, sefpodoksim için ise 8 µg/ml (Proteus için 2 µg/ml) olarak saptanması GSBL üretiminin olduğunu düşündürür. Tarama testinin pozitif çıkması durumunda sefotaksim ve seftazidim tek başlarına ve klavulanik asit (4 µg/ml) ilavesiyle birlikte test edilmelidir. Klavulanik asit ilavesiyle oluşan MİK değerleri 8 kat azalma gösterdiğinde GSBL üretimi fenotipik olarak doğrulanmış olur (56). Çift disk sinerji testi (ÇDST): Fransız araştırmacılar tarafından 1980 lerin sonlarında tanımlanmıştır. Test edilecek mikroorganizma inoküle edilen MHA besiyerinin merkezine amoksisilin/klavulanat (20 µg/10 µg) diski yerleştirilir ve çevresine merkezden merkeze 30 mm uzaklık olacak şekilde 30 µg lık seftriakson, sefotaksim (tercihen), seftazidim, aztreonam ya da 10 µg lık sefpodoksim disklerinden bir ya da birkaçı yerleştirilerek klavulanat ile bu antibiyotikler arasındaki sinerji araştırılır. 37 C de bir gecelik inkübasyondan sonra klavulanat içeren disk ile sefalosporinler arasında ürememe zonu ya da sefalosporinlerin inhibisyon zonunda klavulanat içeren diske doğru belirgin genişleme GSBL nin varlığını gösterir (22,27). GSBL ürettikleri genotipik olarak doğrulanan kökenlere karşı bu yöntemde 14

sefpodoksimin tercih edimesiyle duyarlılık %79-97, özgüllük %94-100 arasındadır (57,58). Yanlış negatif sonuçlar SHV-2, SHV-3 ve TEM-12 içeren izolatlarda görülmüştür (57,59). Klavulanat eklenen agar yöntemi: Klavulanat (4 µg/ml) eklenen MHA ile klavulanatsız MHA besiyerine ekim yapıldıktan sonra geniş spektrumlu sefalosporin içeren diskler yerleştirilir. İki besiyeri arasında antibiyotiklerin inhibisyon zonunda 10 mm artış olması GSBL yapımını gösterir. Seftazidimle duyarlılığı %93-96 ve özgüllüğü %100 dür (60). Üç boyutlu test: Bu test Thomson ve Sanders (57) tarafından tanımlanmıştır. Disk difüzyon yöntemini esas alan bu yöntemin ondan teknik olarak farkı, MHA plağının merkezine yakın tarafta ve antibiyotik disklerinin 3 mm uzağında ucu 11 no.lu bisturinin kalınlığına eşit olacak şekilde dairesel bir bıçak taşıyan alet ile yapılan kesi ile besiyerinde yarık açılmasıdır. Direkt ve indirekt olarak uygulanabilir. Direkt yöntemde 0,5 McFarland bulanıklığına eşit olacak şekilde hazırlanan test edilecek bakteri süspansiyonu MHA plağının yüzeyine inoküle edilir. İndirekt yöntemde ise besiyeri yüzeyine kullanılan antibiyotiklere duyarlı olduğu bilinen bir köken ekilir. Kesilen yarığın içerisine ise test edilecek bakterinin yaklaşık olarak 10 9-10 10 bakteri yoğunluğuna eşit olacak şekilde hazırlanan süspansiyonu steril mikropipet kullanılarak inoküle edilir, 35 C de 18-20 saatlik inkübasyondan sonra yapılan değerlendirmede antibiyotiklere ait inhibisyon zonunda yarık hizasında bozulma ya da kesilme görülmesi yarığa ekilen kökenin GSBL ürettiğini gösterir. Oldukça duyarlı bir test olmasına karşın hem teknik hem de iş yükü olarak zordur. E-test yöntemi: E-test şeritleri (AB Biodisk Solna, İsveç) ilaç emdirilmiş plastik şeritlerdir. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz E-test şeritleri ise bir tarafında değişen konsantrasyonlarda seftazidim, diğer tarafında ise sabit konsantrasyonda klavulanat (2 µg/ml, sonraları 4 µg/ml olarak değişmiştir) ilave edilmiş seftazidim (MİK: 0,12-32 µg/ml) içerir (61). CTX-M tipi enzimler gibi sefotaksim hidrolizini tercih eden GSBL leri tespit etmek için de sefotaksim içeren şeritler mevcuttur (53). Klavulanat varlığında sefalosporinlerin MİK değerinde sekiz kat veya daha fazla bir azalma olması GSBL varlığını gösterir. Hem tarama hem de fenotipik doğrulama için yararlıdır (31). Fenotipik doğrulamada duyarlılığı %87-100, özgüllüğü %95-100 arasındadır (59-62). Bazen klavulanatın sadece seftazidim olan tarafa doğru diffüzyonu nedeniyle seftazidimin MİK değerlerini okumak zor olabilir. Bu durumlarda 15

sadece seftazidim ya da sefotaksim içeren şeritlerle ayrıca MİK değerlerini ölçmek tercih edilir (31). Otomatize antimikrobiyal duyarlılık test sistemi: VİTEK, MicroScan ve BD Phoenix otomatize antimikrobiyal test sistemleriyle de GSBL varlığı saptanabilir. VİTEK (BioMérieux, Fransa) GSBL test kartları sefotaksim (0,5 µg/ml) ve seftazidimi (0,5 µg/ml) tek başına ve klavulanat (4 µg/ml) ile kombine olarak kullanır. Klavulanat içeren kuyucuklar sefalosporinlerin tek başına olduğu kuyucuklarla karşılaştırıldığında önceden tahmin edilen üremedeki azalma miktarı GSBL varlığını gösterir. Duyarlılık ve özgüllüğü %90 ın üzerindedir (63). Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz ve AmpC betalaktamazlarının her ikisini de üreten K.pneumoniae izolatlarında yanlış pozitif sonuçlar gözlenmiştir (64). K.peumoniae, K.oxytoca ve E.coli dışındaki türlerde bu testin GSBL tespit etmedeki güvenilirliği bilinmemektedir (31). Phoenix (BD, ABD) GSBL testinde ise seftazidimle sefotaksime ek olarak sefpodoksim ve seftriakson da hem tek başına hem de klavulanat ile kombine olarak kullanılır. Bu test için algoritma tanımlanmıştır. Sadece E.coli ve Klebsiella türleri için değil Proteus, Enterobacter ve Citrobacter türlerinde de GSBL test sonucu güvenilirdir (65). Beta-laktamaz inhibitörleriyle kombine edilen seftazidim ya da sefotaksim içeren MicroScan (Dade Behring, ABD) panellerinin de GSBL saptamada güvenilirliğinin yüksek olduğu gösterilmiştir (66). Dizileme dışındaki moleküler yöntemler: Buraya kadar bahsedilen testler sadece GSBL varlığını ortaya koymaktadır. Klinik izolatta hangi GSBL tipinin olduğunun aydınlatılması ise çok daha karışıktır. GSBL çalışmalarının ilk dönemlerinde izoelektrik noktanın tayini genellikle GSBL varlığının gösterilmesi için yeterliydi. Bununla beraber sayıları gittikçe artan TEM tipi beta-laktamazların benzer izoelektrik noktalara sahip olmaları nedeniyle GSBL nin izoelektrik noktayla tayini artık mümkün değildir. Aynı durum GSBL lerin SHV, CTX-M ve OXA aileleri için de geçerlidir (28). İlk GSBL çalışmaları TEM ailesine ait olan DNA probları kullanılarak yapıldı (67). Ancak bu yöntem yoğun emek gerektirir, GSBL ve GSBL olmayan beta-laktamazlar arasında ve TEM ile SHV varyantları arasında ayrım yapamaz (28). TEM-1 ve TEM-2 arasındaki ayrımı saptamada kullanılan oligotipleme metodu da ilk moleküler yöntemlerdendir. Bu yöntem nokta mutasyonları tespit etmek için tasarlanan oligonükleotid probları kullanır (53). 16

Bir enzim ailesine ait beta-laktamazların varlığını tayin etmek için kullanılan en kolay ve en yaygın yöntem beta-laktamaz genine özgü nükleotid primerlerinin kullanıldığı PZR dir. Oligonükleotid primerleri Genbankası gibi kullanıma açık yerlerden seçilebilir (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html). Bu primerler genellikle nokta mutasyonların olmadığı bilinen bölgelerden seçilmiştir. Bununla birlikte TEM ve SHV nin farklı varyantlarını ayırt edemez. Ayrıca GSBL ve GSBL olmayan enzimleri birbirinden ayıramaz (28). TEM tipi beta-laktamazların alt tiplerinin saptanmasında kullanılan bir yaklaşım; PZR ye restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizinin eklenmesidir. Bu yöntemde amplifiye edilmiş PZR ürünleri restriksiyon endonükleaz enzimleriyle sindirime tabi tutulur ve oluşan parçalar elektroforez ile ayrılır. Her bir restriksiyon enzimiyle oluşturulan parçanın boyutu TEM yapısal geni içindeki nokta mutasyonları gösterir (28). SHV gen mutasyonlarını tespit etmek için son zamanlarda restriction site insertion PZR tekniği geliştirilmiştir. PZR-RFLP ve restriction site insertion PZR yöntemlerinin kombinasyonlarının SHV için epidemiyolojik çalışmalarda kolayca uygulanabildiği gösterilmiştir. Belirli SHV varyantlarını tespit etmeye yarayan bir diğer yöntem PZR-single strand conformational polymorphism ve PZR-RFLP nin birlikte kullanımıdır (31). Yine bu iş için son zamanlarda geliştirilen yöntemlerden biri de ligaz zincir reaksiyonudur. Bu yöntemde termostabil ligaz ve biyotinle işaretli primerler kullanılır ve tek baz çifti değişikliği tespit edilebilir (68). Kromozomal DNA ile yapılan pulsed-field gel electrophoresis yöntemini GSBL üreten mikroorganizmaların genotiplemesi için çoğu araştırmacı kullanır. GSBL lerin çok büyük bir çoğunluğu plazmid aracılı olduğundan epidemiyolojik çalışmalarda plazmid profili analizi de kullanılır. Bu yöntemde izole edilen plazmidlerin sayı ve boyutları agaroz jel elektroforezi ile gösterilir. Ayrıca ribotipleme, RFLP ve arbitrary primed PZR olarak da bilinen randomly amplified polymorphic DNA epidemiyolojik çalışmalar için kullanılan diğer yöntemlerdir (31). DNA DİZİ ANALİZİ Bu yöntemde; nükleik asit izolasyonu, DNA sentezi ve nükleik asit hedefinin işaretlenmesi, işaretlenmiş hedeflerin elektroforetik olarak ayrılması ve elektroforezden elde edilen bilginin anlamlı DNA dizi bilgisine dönüştürülmesi şeklinde dört basamak vardır (69). 17

Nükleik Asit İzolasyonu Tanımlanmış hedefler sıklıkla dizi analizinden önce PZR ile çoğaltılırlar. Duyarlılığı en üst düzeye getirmek ve hedef dizilerin okunabilirliğini arttırmak için yeterli miktarda hedef DNA nın bulunması gereklidir. Elektroforez öncesinde kullanılan DNA konsantrasyonu dizi analizi reaksiyonunda sinyal yoğunluğu ve çözünürlüğü etkiler. Fazla miktarda bulunan DNA, floresan sinyalini doyurarak çözünürlüğü azaltan düşük sinyallerin alınmasına neden olur. Yeterli dizi verisi ortaya çıkartmak için gereken uygun DNA konsantrasyonu hedefin büyüklüğü ve cinsine, kullanılan dizi analizi kimyasına ve dizi analizi platformuna bağlıdır. Genel olarak kapiller elektroforezde kalıp jel elektroforezine kıyasla daha az miktarda DNA kullanılması gerekir (69). İşaretleme Stratejileri ve DNA Dizi Analizi Çalışmaların çoğunda zincir uzamasının sonlandırılması yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntem DNA polimerazların deoksinükleotid trifosfat (dntp) ların yanında deoksiribozun 3 pozisyonunda OH grubu taşımayan dideoksinükleotid trifosfat (ddntp) ları substrat olarak kullanmaları esasına dayanır. Sentezlenen DNA iplikçiğine dntp eklendiğinde uzama devam ederken, ddntp eklenmesi halinde zincir uzaması durmaktadır. Kalıp DNA lar, primer, dntp karışımı ve enzimin konulduğu dört reaksiyon tüpünün her birine bir ddntp eklenmesinden sonra bağlanma ve uzama işlemleri uygulanmaktadır. Böylece reaksiyon tüplerinde farklı uzunluklarda DNA parçalarının oluşması gerçekleşmektedir. Daha sonra bu DNA parçaları akrilamid jelde elektroforeze tabi tutulmaktadır (70). Dizi analiz sonucunu görünür hale getirmek için farklı boyalarla ortaya çıkartılan floresan sinyalin belirlenmesi, radyoizotopik sinyal belirleme stratejilerinin yerini almıştır. Florofor belirteçler oligonükleotid primerlere (boya primerler) veya dideoksi sonlandırıcı nükleotidlere (boya nükleotid) eklenebilir. Otomatize sistemlerin çoğunda reaksiyonun başlangıcında floresan veren madde ile işaretli primer veya nükleotidler kullanılarak baz dizilimi gözlenebilir hale getirilmektedir (69). Florofor işaretleme stratejileri çok sayıda floresan boya ve eşleştirme yöntemlerini kullanma avantajına sahiptir. Applied Biosystems (Foster city, California) çok sayıda floresan boya geliştirmiştir. Bunlar arasındaki Big Dye teknolojisi dört renkli işaretleme ve belirleme ile tek tüpte dizi analizi reaksiyonları gerçekleştirebilir, duyarlılık ve çözünürlüğün arttırılmasını sağlar (69). 18

DNA Fragmanlarının Ayrılması ve Sinyal Belirlenmesi Bugün en sık kullanılan yaklaşım olan Sanger in DNA analizi (70) ile oluşturulan fragmanların büyüklüğü birbirinden sadece bir baz ile farklılık gösterir. Bu nedenle güvenli veri elde edebilmek için yüksek çözünürlükte ayırma işlemlerinin kullanılması gerekir. Kalıp jel veya kapillerler kullanılarak DNA dizisinin belirlenmesinden sonra elektroforez ile fragmanlar birbirinden ayrılabilir. Fragmanın büyüklüğü ile belirlenen 3 ucunun kimliğine göre elektroforetif izler anlamlı DNA dizi bilgisine dönüştürülür. Bir hedefe ait olan ve tek bir dizi analizi reaksiyonu sonucu belirlenebilen nükleotid bazlarının sayısı okuma uzunluğu olarak tanımlanır. Farklı otomatize dizi analiz sistemleri ve farklı dizi analizi kimyalarıyla elde edilebilen okuma uzunlukları ve örnek işleme verimleri birbirinden farklıdır. Bu sistemler arasında otomatik kalıp jel dizi analiz cihazlarından LI-COR Global IR 1000 base pair (bp), ABI Prism 377 cihazı ise 900 bp okuma uzunluğuna sahip olup, tek kapillere sahip ABI Prism 310 cihazının okuma uzunluğu 650 bp, 96 kapillere sahip ABI Prism 3700 cihazının ise 550 bp dir (69). Dizi Verilerinin Değerlendirilmesi Elektroforetik görüntünün anlamlı DNA dizi verisine dönüştürülmesi, bilgisayar destekli algoritmalar, elle işleme ve dizi derlemesine gerek duyar. Dizi verisinin kalitesi ve değerlendirilmesini etkileyen çeşitli değişkenler elde edilen piklerin yüksekliği, genişliği ve pikler arası uzaklıktır. Piklerin yüksekliği belirlenebilen sinyal yoğunluğu ile, pik genişliği her bir sinyalin birbirine göre dağılımı ile, pikler arası uzaklık ise farklı fragmanların çözünürlüğü ile ilişki göstermektedir. Sıranın ortasında sinyal yoğunluğu en fazladır, uçlara doğru gidildikçe sinyaller azalır. Özellikle elektroforetik ayırma işleminin başında ortaya çıkan ve bağlanmamış floresan işaretlere bağlı artefaktlar sinyal oranlarını azaltıp veriyi bozabilir. Elektroforezin sonunda piklerin genişlemesi ve sinyal yoğunluğunun azalması nedeniyle baz yakalama doğruluğu azalır. Sinyal yoğunlukları belirgin şekilde artmışsa ya da sıralar birbirinin üzerine çıkmışsa elle optimizasyon gerekebilir. Son dizi verisinin düzeltilmesi otomatik olarak yapılabilir ancak elde edilen dizi verisinin kalitesinin de değerlendirilebilmesi için elle değerlendirilmesi tavsiye edilir (69). Nükleotid dizileme izolatlardaki spesifik beta-laktamaz geninin saptanması için altın standart olmayı sürdürmektedir. Bu yöntemle GSBL lerin tüm varyantları tespit edilebilir. Ancak, yoğun emek gerektirir ve kullanılan yönteme bağlı olarak değişik sonuçlar da verebilir (28). 19

GEREÇ VE YÖNTEMLER Bu çalışma; Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu onayı alınarak Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı laboratuvarı ve İstanbul İontek laboratuvarında gerçekleştirildi (Ek 1). Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu (TÜBAP) tarafından 734 numaralı proje ile destek sağlandı. Çalışmada Trakya Üniversitesi Eğitim-Uygulama ve Araştırma Hastanesi nde yatan ve hastaların çeşitli materyallerinden hastane infeksiyonu etkeni olarak 15 Kasım 2004-30 Haziran 2005 tarihleri arasında Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı laboratuvarında izole edilen 269 Escherichia coli izolatı arasından GSBL üreten 45 izolat kullanılmıştır. Bir hastadan tekrar izole edilen aynı izolatlar çalışmaya alınmamıştır. ÇALIŞMADA KULLANILAN KİMYASALLARIN HAZIRLANMASI Agar Dilüsyon Testi İçin Gerekli Kimyasallar 1) 0,5 McFarland bulanıklık tüpü: Önce %1 H 2 SO 4 (Riédel de haën, Almanya) den 9,9 ml ve %1BaCl 2 (Merck, Almanya) den 0,1 ml alınıp karıştırılarak 1 McFarland bulanıklık tüpü elde edildi. Bu solüsyon 1:1 oranında distile su ile sulandırılarak 0,5 McFarland bulanıklığı oluşturuldu. 2) Müller-Hinton agar besiyeri: Toz MHA (Oxoid, İngiltere) dan 38 gr alınarak hacim distile su ile 1000 ml ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda (Schott Gerate, GMBH, Almanya) karıştırılarak kaynatıldıktan sonra otoklavda (OT 4060 Nüve) 121 C de 15 dk 20

tutularak sterilizasyon sağlandı. Su banyosunda (ST 402 Nüve) 50 C ye soğutularak kullanıma hazır hale getirildi. 3) Müller-Hinton broth besiyeri: Toz MHB (Oxoid, İngiltere) den 21 gr alınarak hacim distile su ile 1000 ml ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra deney tüplerine 2 şer ml dağıtıldı. Otoklavda 121 C de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı. Beta-laktamazların İzoelektrik Noktalarının Tespiti İçin Solüsyonlar 1) 0,1 M Fosfat tamponu: Na 2 HPO 4 (Merck, Almanya) ten 35,81 gr, KH 2 PO 4 (Merck, Almanya) ten 13,60 gr alınıp Merck (Almanya) firması tarafından sağlanan özel saf su ile hacim 1000 ml ye tamamlandı. Hazırlanan solüsyonun ph si ph metre (Inolab, Almanya) yardımıyla 0,1 M HCl ya da 0,1 M NaOH kullanılarak 7,0 a ayarlandı. 2) Akrilamid-bisakrilamid %25 lik stok solüsyonu: Akrilamid (Sigma, ABD) den 24,25 gr, Bisakrilamid (N, N -metilenbisakrilamid) (Sigma, ABD) den 0,75 gr alınıp hacim saf su ile 100 ml ye tamamlanarak elde edildi. Filtre edilerek 4 C de saklandı. 3) %0,1 lik Riboflavin (w/v) stok solüsyonu: Riboflavin 5 P (Sigma, ABD) den 50 mg alınıp hacim saf su (Merck, Almanya) ile 50 ml ye tamamlanarak elde edildi. Filtre edilip 4 C de saklandı. 4) %25 lik Gliserol (w/v) solüsyonu: Gliserol (Merck, Almanya) den 25 ml alınıp 50 ml saf su ile süspansiyon hazırlandıktan sonra hacim saf su ile 100 ml ye tamamlanerak elde edildi. 5) %10 luk Amonyum persülfat solüsyonu: Amonyum persülfat (Sigma, ABD) tan 100 mg alınarak saf su ile 1000 ml ye tamamlandı. Solüsyon günlük taze olarak hazırlandı. DNA İzolasyonu İçin Solüsyonlar 1) 10xTE tamponu (100mM Tris-10 mm EDTA) stok solüsyonu: Trizma-baz (Sigma, ABD) dan 12,11 gr, EDTA (Sigma, ABD) dan 3,72 gr alınarak hacim distile su ile 1000 ml ye tamamlandı, ph: 8,0 a ayarlandı. 21