TOKAT VE ORDU ÇEVRESĐ DEKĐ SERT KE ELERDE (ACARI: IXODIDAE) KE E-KÖKE LĐ E SEFALĐT VĐRÜSÜ VARLIĞI I TESPĐTĐ Tünay KARA Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Doç. Dr. Şaban TEKĐ 2010 Her hakkı saklıdır.
TEZ BEYA I Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Tünay KARAN
ÖZET Yüksek Lisans Tezi TOKAT VE ORDU ÇEVRESĐNDEKĐ SERT KENELERDE (ACARI: IXODIDAE) KENE-KÖKENLĐ ENSEFALĐT VĐRÜSÜ VARLIĞININ TESPĐTĐ Tünay KARAN Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsi Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Şaban TEKĐN Kene Kökenli Ensefalit Virüsü (TBE) Flaviviridae familyasına ait olan Flavivirüs genusu üyesidir. TBE Avrupa dan Asya ya kadar uzanan bir kuşakta endemik olarak görülmektedir. Hastalığın üç büyük formu vardır; Merkez Avrupa, Uzak Doğu ve Sibiryan alt tipi. TBE insanlara genellikle Ixodes ricinius, Ixodes persulcatus ve Haemphysalis concinna türü kenelerin ısırmasıyla bulaşır. Türkiye deki kene türlerinde Kene Kökenli Ensefalit Virüsü (TBEV) varlığıda dair yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu çalışmada, Tokat, Ordu merkez ve Fatsa ilçelerinden toplanan değişik sert kene türlerinde TBEV ünün varlığı RT-PCR ile test edilmiştir. RT-PCR sonuçlarına göre çalışmamız da toplanan sert kene türlerinde TBEV varlığına rastlanmamıştır. Bu sonuç, en azından çalışma bölgemizde toplanan kene türlerinin TBEV ile bulaşık olmadığını ve TBEV bulaştırma riski taşımadıklarını göstermektedir. 2010, sayfa 33 Anahtar kelimeler: Kene, TBEV, RT-PCR, Tokat, i
ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS IN IXODES TICKS (ACARI: IXODIDAE) FROM TOKAT AND ORDU VICINITY Tünay KARAN Gaziosmanpaşa University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Saban TEKĐN Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a member of the genus Flavivirus in the family of Flaviviridae. TBE is an endemic disease from Europe to Asia. TBE is an infectious disease involving the central nervous system, which may result in death. There are three major forms of the disease; Central European, Far Eastern and Siberian subtypes. TBEV is tranmitted to humans by ixodid tick species such as Ixodes ricinius, Ixodes persulcatus and Haemphysalis concinna. There are no evidence for the presence of TBEV in ticks species in Turkey. In the present study, presence of TBEV in hard ticks from Tokat and Ordu and Fatsa provinces were tested using revers transcriptasepolimerase chain reaction (RT-PCR). According to RT-PCR results, no TBEV detected in ticks collected in this study. This result indicated that hard ticks of the region tested were not harbored TBEV and have no potential for transmission of TBEV. 2010, pages 33 Anahtar Kelimeler: Ticks, TBEV, RT-PCR, Tokat, Ordu ii
Ö SÖZ Bu tez çalışmasının belirlenmesinde, yürütülmesinde ve çalışmalarımın yönlendirilmesinde her zaman yardımcı olan, danışman hocam Doç. Dr. Şaban TEKĐN e ve sayın Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALI ya teşekkür ederim. Yüksek lisans eğitimim boyunca beni destekleyen, yönlendiren, bilimsel ve sosyal katkılarını esirgemeyen bölüm başkanımız sayın Prof. Dr. Zekeriya ALTUNER e ve bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım Biyomühendislik Fakültesi öğretim üyesi sayın Prof. Dr. Đsa GÖKÇE ye tüm içtenliğimle teşekkür ederim. Çalışmalarım süresince her zaman yanımda olup, hiçbir emeği ve desteği benden esirgemeyen sevgili aileme ve arkadaşlarım Aşiyan KARABULUT, Şule KÜÇÜKYAĞCI ve Uzman Adem KESKĐN e destekleri için teşekkür ederim. Ayrıca, çalışmalarımızda tez örneklerimin sağlanmasında katkıda bulunan Tokat Devlet Hastanesi, Ordu Devlet ve Fatsa Devlet Hastanesi Başhekimleri ve personeline de teşekkür ederim. iii
ĐÇĐ DEKĐLER Sayfa ÖZET. i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SĐMGE VE KISALTMALAR DĐZĐNĐ.. Vi ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ... Vii ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ. Đx 1.GĐRĐŞ ve LĐTERATÜRÖZETĐ.. 1 1.1 Tarihçe... 1 1.2.1. Kene kökenli Ensefalit Hastalığı nın Dünyada ve Türkiye deki Epidemileri 1 1.2.1. Dünya daki Epidemileri 1 1.2.2. Türkiye de TBE Epidemileri 6 1.3. TBE Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Taşınımı... 7 1.3.1. TBE Virüsünün Yapısı 7 1.3.1.1. Flaviviriade Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu... 9 1.3.2. TBE Virüsünün Özellikleri.. 10 1.3.3. Kene Kökenli Ensefalit Virüsünün Taşınımı... 11 1.4. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu, Klinik Yol,Tanısı,Tedavisi ve Korunma Yolları... 13 1.4.1. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu.. 13 1.4.2. Klinik Yol ve Hastalığın Ortaya çıkması. 14 1.4.3. TBE Hastalığının Tanısı... 15 1.4.4. TBE Hastalığından Korunma Yolları... 17 1.4.4.1. TBE Aşısı. 17 2. MATERYAL VE YÖ TEM 19 2.1. Materyal... 19 2.1.1. Kullanılan Kimyasal madde ve Malzemeler 20 2.1.2. Cihazlar 20 2.1.3. Tampon ve solisyonların Hazırlanışı... 20 2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solisyonu... 20 2.1.3.2. 50X Tris Aceteta EDTA (TAE) Tamponu... 21 2.1.3.3. 1X TE Tamponu... 21 2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu...... 21 2.1.3.5. Etidium Bromür. 21 2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue.. 21 2.1.1.3.7. Çalışmada Kullanılan Primerler... 22 2.2. Yöntem.. 23 2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması. 23 2.2.2. Viral RNA Ekstrasyonu.... 23 2.2.3. One Step Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR).24 2.2.3.1. Thermal cycler ın Program Ayarı. 25 2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi 25 2.2.4.2. Örneklerin Agaroz Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi... 25 iv
ĐÇĐ DEKĐLER Sayfa 2.2.5. DNA Dizi Analizi. 25 3. BULGULAR... 25 3.1. Tokat ve Amasya Bölgesi Kenelerinde TBEV Varlığı... 26 3.2. Ordu Merkez ve Fatsa Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı 26 4. TARTIŞMA ve SO UÇ 28 KAY AKLAR 30 ÖZGEÇMĐŞ... 33 v
SĐMGE ve KISALTMALAR DĐZĐ Đ Simgeler Açıklama o C g L M % Yüzde o Santigrat Derecesi Gram Litre Molar Derece Kısaltmalar Açıklama Ark. TBE Bç cdna dk DNA dntp DTT EDTA ELISA HCL IgG IgM Kb KKKA CNS BOS Arkadaşları Kene Kökenli Ensefalit Baz çifti Komplementer DNA Dakika Deoksiribonükleik asit Deoksiribonükleosit Trifosfat Ditiotrietol Etilendiamintetraasetik Asit Enzim Bağlı Đmmün Assay Hidrojen Klorür Đmmunoglobulin G Đmmunoglobulin M Kilobaz Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Merkezi Sinir Sistemi Beyin Omurilik Sıvısı vi
ma Miliamper mg Miligram ml Mililitre TBEV Kene Kökenli Ensefalit Virüsü mm Milimolar MW Moleküler Ağırlık nmol Nanomolar ppm part per million PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RNA Ribonükleik asit RNAase RNAaz RSHM Refik Saydam Hıfzısıhha Merkezi RT-PCR Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu TAE Tris-Asetat EDTA TE Tris-EDTA UV Ultraviyole Pmol Pikomol µl Mikrolitre µl Mikromol vii
ŞEKĐLLER DĐZĐ Đ Şekil Sayfa Şekil 1.1 Kene Kökenli Ensefalit Hastalığı nın Dünya daki yayılışı...4 Şekil 1.2 Mevsimsel kene aktivitesi ile TBE insidansı arasındaki ilişki 5 Şekil 1.3 Arbovirüs ailesi...7 Şekil 1.4 TBE virüsünün yapısı ve elektron mikroskoptaki görünümü...8 Şekil 1.5 TBE Virüsü nün yapısal ve yapısal olmayan proteinleri 8 Şekil 1.6 Flaviviridae ailesindeki virüslerin replikasyonu 10 Şekil 1.7 TBE Virüsü'nü taşıyan bazı kene türleri...12 Şekil 1.8 TBE hastalığının real-time PCR ile tanısı..16 Şekil 3.1 RT-PCR sonrası PCR ürününün agaroz jel görüntüsü...27 viii
ÇĐZELGELER DĐZĐ Đ Çizelge Sayfa Çizelge 1.1 2001-2003 yılları arasında çeşitli ülkelerde TBE'li vaka sayısı..3 Çizelge 1.2 2005-2009 yılları arasında TBE hastalık sıklığının arttığı ülkeler..6 Çizelge 1.3 TBE virüsünü kene dışında bulaştıran diğer hayvanlar 11 Çizelge 1.4 TBEV suşlarının görüldüğü kene türleri.. 13 Çizelge 1.5 TBE aşısının içeriği.. 18 Çizelge 2.1 Bu çalışmada TBEV varlğını test etmek için toplanan kene cinsleri.19 Çizelge 2.2 Bu çalışmada TBEV varlığını test etmek için kullanılan primerler...22 ix
1 1. GĐRĐŞ ve LĐTERATÜR ÖZETĐ Tick-borne encephalit (TBE), Avrupa dan Asya ya kadar birçok ülkede görülen ve insanların merkezi sinir sistemini etkileyen önemli viral enfeksiyon hastalıklarından biridir. Enfeksiyon, farklı zamanlarada değişik isimlerle anılmıştır. Frühsommermeningoenzephalitis, Western subtype (FSME), Kumlinge s disease, Western subtype (Central European encephalitis), ve Russian Spring and Summer Encephalisitis, Eastern subtype (RSSE) olarakta adlandırılan enfeksiyon son zamanlarda TBE olarak isimlendirilmektedir (Gritsun ve ark., 2003). 1.1 Tarihçe Enfeksiyon klinik olarak ilk kez 1931 yılında Avusturyalı Schneider tarafından bildirilmiş, 1937 yılında Rus Lev Zilber kene ısırması ile ilişkili akut ensefalitis olgularını, 1947 yılında da Rusya dan Pavlovsky kene ve insanlar arasındaki zoonotik bulaşmayı tanımlamıştır. Bu hastalığa, kene ile bulaşan kene kökenli ensefalit virüsünün (TBEV) yol açtığı ise 1937 yılında Zilber tarafından bulunmuştur (Dumpis ve Crook, 1999). 1.2. Kene Kökenli Ensefalit Hastalığı nın Dünya da ve Türkiye ki Epidemileri 1.2.1. Dünyada ki Epidemileri TBEV enfeksiyonu Avusturya, Beyaz Rusya, Bosna, Hırvatistan, Çin, Çek Cumhuriyeti, Danimarka, Estonya, Finlandiya, Fransa, Almanya, Yunanistan, Đtalya, Japonya, Macaristan, Kazakistan, Letonya, Litvanya, Norveç, Polonya, Romanya, Rusya, Sırbistan, Slovak Cumhuriyeti, Slovenya, Đsveç, Đsviçre ve Ukrayna gibi birçok ülkede görülmüş ve virüs serolojik olarak tanımlanmıştır. Çizelge 1.1 de bazı ülkelerdeki TBE epidemileri verilmiştir (Süss, 2003). Avusturya TBE in en çok görüldüğü ülkelerden biri olup, 2003 yılında 87 TBE vakası bildirmiştir (insidans:100.000 de 1.9). Kene kaynaklı ensefalit vakaları daha çok
2 Avusturya nın güneyinde görülmektedir. Bütün bu vakalar aşılanmayan veya bildirilen aşı takvimine uymayan kişilerden oluşmaktadır. Geçen 5 yılda aşılanma oranı %79 dan %87 ye çıkmıştır. Aşılanma oranı küçük çocuklarda ve 65 yaş üstü grupta %70 lerde kalmıştır. Yaşlılardaki bu düşük aşılanma oranı Avusturya daki TBE e karşı mücadeleyi zorlaştırmaktadır (Kunz, 2003). Finlandiya da 1990' lı yıllarda ve 2001 yılında kene kaynaklı ensefalit vakaları bildirilmiştir. 2001 yılında vaka sayısı yıllık 40 ın üzerine ulaşmıştır. TBE Almanya da da görülen bir hastalıktır. 2003 de 276 vaka bildirilmiştir. Bu vakalar özellikle Almanya nın güneyinde Baden-Württemberg (%42) ve Bavaria da (%38) görülmüştür. Almanya TBE riski açısından üç bölgeye ayrılmıştır. Bir bölgede 1984-2003 yılları arasındaki 5 yıllık periyotta en az 25 TBE vakası varsa yüksek riskli alan, bir yılda iki veya daha az vaka ya da 1984-2003 yılları arasındaki 5 yıllık periyotta 5 veya daha az vaka varsa riskli alan olarak sınıflandırılmıştır. Aşılanmamış orman işçilerinde yapılan çalışmalarda kene kaynaklı ensefalit seroprevelansının yüksekliğine dayanılarak bazı bölgeler endemik olarak kabul edilmiştir. 2003 yılında üç yeni riskli alan tanımlanmıştır. Keneyle temas riski yüksek olan ve riskli alanlarda yaşayan kişilere aşılama önerilmektedir (Roggendorf, 1996). Macaristan da 1977 den beri TBE bildirimi zorunludur ve tüm veriler National Center for Epidemiology tarafından toplanmaktadır. Aseptik menenjit ve ensefalitli hastaların TBE için tek tanı laboratuvarı olan merkezin viroloji bölümünde 1977 den beri düzenli olarak test edilmektedir. 1977-1996 yılları arasında ortalama yıllık insidans 2.5/100.000 (range 1.8-3.8) olup 1981-1990 yılları arasında en yüksek düzeyde saptanmıştır. 1997 den 2000 e kadar tanı konulan TBE vakalarında önemli bir düşüş görülmüş, 2000 de insidans 100.000 de 0.5 olmuştur. 2001 den itibaren insidansda tekrar artış görülmüştür. Son 3 yılda yıllık ortalama rapor edilen vaka sayısı, 63 dür. Yüksek risk grubundakiler (çiftçi, orman işçileri vb.) için aşılama yapılmaktadır. Norveç te TBE de dahil bütün ensefalit vakalarının bildirimi zorunludur. 2003 de bir vaka bildirilmişke, Norveç te toplam 8 vaka rapor edilmiştir. Bir sağlık merkezinde düzenli takip edilen hastalar arasında yapılan küçük ölçekli bir seroprevalans çalışmasında %24 oranında TBE virus antikorları saptanmıştır. Norveç teki düşük insidansdan dolayı ülkelerarası yayılıma karşı aşılama son zamanlarda tavsiye edilmiştir (Scarpaas, 2004). TBE Polonya da 30 yıldan beri endemiktir ve bildirimi yapılmıştır.
3 1933 ten beri ülkede rapor edilen vaka sayısı 100 ile 350 arasındadır. 2002 yılında bu sayı 126 (insidans 100.000 de 0.33) ve 2003 yılında 339 (insidans 100.000 de 0.89)dur. Vakaların %8 i Polonya nın Litvanya ve Belarus a komşu iki güney batı ilinde gözlemlenmiştir. Polonya nın Çek Cumhuriyeti ne komşu olan kuzey doğu bölgeleri bu hastalığın ikincil merkezidir. TBE nin Slovakya da bildirimi zorunludur. Son on yılda rapor edilen vaka sayısı her yıl 54 ile 101 arasındadır. 2002 de 62 vaka (insidansı 100 000 de 1.15) ve 2003 de 74 vaka (insidansı 100 000 de 1.38) rapor edilmiştir. Rapor edilen bazı vakalar çiğ olarak tüketilen keçi ve koyun sütünden (ev yapımı) kaynaklanmıştır (Gresikova, 1968). TBE ve Lyme hastalıkları, Slovenya nın güneyinde endemik ve bildirimi yapılan hastalıklardır. 2003 yılında 272 vaka rapor edilmiştir (insidansı 100 000 de 13.6). 2002 yılında (262 vaka) ve 2001 yılında (260 vaka) rapor edilen vaka sayıları yaklaşık olarak aynıdır. TBE Đsveç te isteğe bağlı olarak laboratuvar bildirimine dahil olan bir enfeksiyon hastalığıdır. 1980 lerin sonunda ve 1990 ların başında yıllık yaklaşık 50-70 kadar vaka rapor edilmiştir. 2003 yılında 75 i erkek, 32 si kadın 107 TBE vakası bildirilmiştir. Endemik bölgelerde yaşayanlar veya buraları ziyarete gidenler gibi yüksek risk grubuna aşılama, tavsiye edilir (Gustawson, 1993). Çizelge 1.1 2001-2003 Yılları arasında çeşitli ülkelerde TBE li vaka sayısı ve insidansı (Süss, 2003) Ülke Yıl Rapor edilen vaka (S) Đnsidans (100.000) Avusturya 2003 87 1.09 Çek Cumhuriyeti 2003-5.9 Danimarka - - - Finlandiya 2001 >40 - Almanya 2003 276 - Macaristan 2001-2003 63 - Litvanya 2003-15.7 Letonca 2003 763 22 Norveç 2003 1 - Polonya 2003 339 0.89
4 TBE virüsü (kenelerde ve omurgalı konaklarda) tropik olmayan Avrupa orman kuşaklarının tüm güney kısmında, Batıda Alsae Lorraine de ve doğuda Çin in kuzey ve güneye ait bölgelerinde dağılım göstermektedir (Şekil1.1). 1988 de Japonya da izole edilmiş endemik bir virüs Hokkoida da belirlenmiştir. Norveç ve Đsveç in güneye ait kısmında bilinen risk bölgelerine ek olarak yeni risk bölgeleri oluştuğu bildirilmiştir (Scarpaas, 2004). Şekil 1.1 Kene kökenli ensefalit hastalığının Dünya daki yayılımı (Takeda, 2004) TBE Uluslar arası bilimsel çalışma grub(isw TBE), TBE hastalığının Avrupa da bir sağlık sorunu olduğu bildirilmiştir (Kunze, 2006). TBE insidansının, son yıllarda Avusturya hariç hemen hemen TBE riskli tüm Avrupa ülkelerinde arttığı ve bunun sebebinin küresel ısınmaya bağlı olarak değişen kene biyolojisi olduğu düşünülmektedir. TBE endemik bölgelere artan seyehat, seyehat sezonunun kene aktivitesinin yüksek olduğu periyoda uyması, koruyucu giysilerin kullanılmaması ve aşılanmama neticesinde TBE vakalarıda son zamanlarda artış rapor edilmiştir. Çizelge1.2 de görüldüğü kadarıyla özellikle Almanya, Güney Kore, Çek Cumhuriyeti, Đsveç, Đsviçre de hastalık vakalarında artış görülmüştür (Kim ve ark., 2009).
5 Çizelge 1.2 2005-2009 yılları arasında TBE hastalık sıklığının arttığı ülkeler (Kim ve ark., 2009) Ülke Prevalans (%) Çek Cumhuriyeti 15-54 Almanya 12-35 Güney Kore 14-25 Đsveç 10-22 Đsviçre 10-18 TBE hastalığı artan ülkelerde kene aktivitesi ilkbahar ve sonbahar aylarında olmak üzere 2 mevsimsel zirvesi göstermektedir ve TBE klinik vakaları özellikle mevsimsel kene aktivitesinin yaklaşık 4 haftasında ortaya çıkmaktadır (Şekil1.2). Şekil 1.2 Mevsimsel kene aktivitesi ile TBE insidansı arasındaki ilişki (Klaus, 2008)
6 1.2.2. Türkiye de TBE Epidemileri Diğer ülkelerin aksine, ülkemizde TBEV ile ilgili ve özellikle keneleri ihtiva eden çalışmalar çok sınırlıdır. Ülkemizde özellikle Karadeniz bölgesinde TBEV bulaşmasına sebep olabilecek kene türlerinin bulunması bu virüsün de kenelerle bulaşma ihtimalini güçlendirmektedir. Avrupa ülkelerinde aşılama proğramlarında bulunmasına rağmen, ülkemizde bu hastalık çoğunlukla asemptomatik seyretmesi ve düşük mortaliteye sahip olması nedeniyle fazla dikkat önemsenmemektedir. Hastalığın kalıcı ve yıllar sonradan çıkan etkileri insanlarda değişik sağlık sorunlarının oluşmasına ve hayat kalitesinin düşmesine neden olduğu göz ardı edilmektedir. Türkiye de TBE virüsü seroprevalansı ile ilgili çeşitli veriler bulunmakla birlikte bunların çoğundaki seropozitiflikler viral nötralizasyon ile doğrulanmamıştır. Bununla birlikte özellikle Türkiye nin Güneydoğu Anadolu bölgesinde yapılan bir seroprevalans çalışmasında olguların % 9.5 ğunda TBE virus seropozitifliği viral nötralizasyon yöntemi ile doğrulanmıştır (Ergunay ve ark., 2007). Türkiye de KKKA nin endemik olduğu bir bölgede, 39 KKKA şüpheli serumun birinin TBEV IgM pozitif olduğu bulunmuştur (Eser ve ark., 2007). 1.3. TBE Virüsünün Yapısı, Özellikleri ve Taşınımı 1.3.1. TBE Virüsünün Yapısı TBE virüsü tek zincirli pozitif RNA genomuna sahip, zarflı virüslerdir. Ortalama 50 nanometre (nm) çapında virionları vardır. 11 kb büyüklüğünde bir RNA olan genomu tek bir büyük açık okunan bölge içerir (Şekil 1.4). Açık okunan bölge yaklaşık 3400 amino asit büyüklüğünde bir polipeptidi kodlar (Heinz and Collet, 2000).. Bu polipeptid konak hücresi ve viral proteaz enzimleri tarafından çeşitli bölgelerden kesilerek işlemlendikten sonra virüsün yapısal (C, E ve M) ve yapısal olmayan proteinleri (NA1, NS2A,NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5) açığa çıkar. E protein, hücre reseptörüne bağlanma, füzyon ve nötralizan antikor yanıtı için önemlidir (Chambers,1990). Açık okunan bölgenin 3' ve 5' uçlarında virüsün genom replikasyonu, translasyon ve paketlenmesin de önemli rol oynayan özelleşmiş yapılarını içeren kodlamayan bölgeler bulunur (Şekil1.5). Bu virüsler Uluslararası Virüs Taksonomi Komitesinin sınıflandırma
7 tablosunda Flaviviridae Ailesinin Flavivirus cinsi içerisinde tek tür olarak sınıflandırılmış (Şekil 1.3) ve Avrupa, Sibirya ve Uzak Doğu olmak üzere üç alt tipe ayrılmıştır (Heinz and Collet, 2000). TBE ETİYOLOJİSİ Reoviridae dsrna segmentli,zarfsız Coltivirüs Kene vektörü Colarado kene ateşi Grup A Togaviridae ailesi Zarflı İkosohedral ss+rna Sitoplazmik membradan zarflı Rubivirüs genusu Rubella Alfavirüs genusu EEE WEE Arbovirüs Grup B Flaviviridae ailesi Zarflı İkosohedral ss+rna Sitoplazmik membrandan zarflı TBE Flavivirüs genusu Denque ateşi Japon ensefalit virüsü St Louis Ensefaliti Batı Nil Virüs Bunyaviridae Zarflı 3 helikal nükleotid Negatif sens, segmentli RNA Bunyavirüs genusu Kalifornia Ensefalit Grubu La Crosse Virüs Toscana virus Arbovirus ailesi Şekil 1.3 Arbovirüs ailesi (Heinz, 1999) 8
8 Şekil 1.4 TBE Virüsü nün yapısı ve elektron mikroskoptaki görünümü (Chambers,1990) Şeki1 1.5 TBE Virüsü nün yapısal ve yapısal olmayan proteinleri (Heinz, 2000)
9 1.3.1.1. Flaviviridae Ailesindeki Virüslerin Replikasyonu Viral glikoproteinlerin, duyarlı hücrelerdeki reseptör bölgelerini tanımaktan sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Bu hücrelerdeki reseptörlere bağlanan virüsler, endositoz ile hücre içine alınırlar. Sitoplazmaya alınan virüsler, replike olduktan sonra tomurcuklanarak endoplazmikretikulumdan ayrılırlar ve Golgi bölgesinde sitoplazmik veziküller içerisine alınırlar. Bu bölgeden de füzyon işlemi ile virüs en dıştaki zarını da alarak hücre dışına çıkar (Şekil 1.6) (Heinz,1991). 1.3.2. TBE Virüsünün Özellikleri TBEV, lipid zarfından dolayı organik solventler ve deterjanlarla inaktif olur. Zarf, çıplak nükleokapsiti ve hücresel nükleazdan da genomu korur. RNA nın farelere intracerebral injeksiyonu ile enfeksiyöz olduğu gösterilmiştir. Flavivirusların infektivite ve viral hemaglutininleri ph 8.4-8.8 arasında stabil olmasına karşın, TBEV geniş bir ph da (ph 1.42-9.19) canlı kalabilmektedir. Virusun E proteini asidik ph ile infektivitesini kaybetse de, virionlar süt ve mide sıvısında infektivitesini korurlar, bu durum TBEV nin oral yolla da infektivitesini açıklamaktadır. TBEV, 50 C de 10 dakikada infektivitesinin %50 sini kaybederler, tam bir inaktivasyon için 56 C de 30 dak. yeterlidir. Sıvı arerosol süspansiyonlardaki virusler oda ısısı %23-80 nem oranında 6 saat, dondurularak kurutulduğunda ise yıllarca stabil kalırlar. Pasterizasyon, Ultraviole ve gama ışınları, %3-8 lik formaldehid, %2 lik gluteraldehid, %2-3 lük hidrojen peroksit, 500-5000 ppm chlorine, alkol, %1 lik iyot ve fenol ile inaktive olurlar (Rey, 1995).
Şekil 1.6 Flaviviridae ailesindeki virüslerin replikasyonu (Anonim, 2007) 10
11 1.3.3. Kene Kökenli Ensefalit Virüsünün Taşınımı TBE virüsleri doğadaki yaşam döngüsü keneler ile omurgalılar arasında gerçekleşir. Kan emici keneler omurgalı konaklardan beslenme sırasında aldıkları virüsle enfekte olurlar ve yaşamları boyunca enfekte kalarak virüsü taşırlar (Süss 1992). Doğada özellikle Avrasya bölgesinde Ixodes ricinus, Ixodes persulcatus, Haemaphysalis concinna türü kenelerle taşınırlar (Şekil 1.6). Bu kene türleri ülkemizde de bulunmaktadır (Ozkan ve ark., 1987). Keneler haricinde Apodemus cinsi fareler virüsün en belirgin taşıyıcı konakları olarak bildirilmiştir. Đnsan ise tıpkı dana, keçi, koyun, geyik, kuğu gibi diğer büyük omurgalılarla birlikte yanlışlıkla konak olabilmektedir (Çizelge 1.3). Çizelge 1.3 TBE virüsünü kene dışında bulaştıran diğer hayvanlar (Bodemann, 2000) Konak Sıklık (%) Sarı boyunlu tarla faresi 47.9 Kırmızı astarlı köstebek 29.4 Tilki 18.0 Geyik 83 Köpek 2.0-5.6 Keçi 44.0 Sığır 35.5-91.0
12 Ixodes sp. (dişi) Haemaphysalis sp. Ixodes ricinius dorsal görüntüsü (Erkek) dorsal görüntüsü (dişi) ventral görüntüsü Şekil 1.7 TBE virüsünü taşıyan bazı kene türleri (Anonim,2006) TBE virüsü insanlara veya larva, nimf ve yetişkin keneler tarafından diğer konaklara taşınır. Sıcaklık kene kökenli hastalık dinamiklerinin belirleyicisidir. Kene aktivitesi Mart-Nisan ayında toprak sıcaklığı 5-7 o C derece arttığında başlar ve ortalama hava sıcaklığı Ekim veya Kasım da yaklaşık aynı değerde azaldığı zamanda yılın sonlarına doğru sonlanır. Kene aktivitisi aynı zamanda toprak nemliliği ve ilişkili nemlilik üzerine dayanır. Ixodes ricinius Avrupada TBEV bulaşında rol oynayan başlıca kene türü olup TBEV nün yayılması için esas sorumludur (batı alt tipi). TBE virüsünün Uzak Doğu alt tipi Ural Dağlarının ötesinde bulunmuştur ve temel vektörü Ixodes persulcatus tur (Çizelge 1.4).
13 Çizelge 1.4 Kene kökenli ensefalit virüsü suşlarının görüldüğü kene türleri TBEV suşu Taşıyıcı Kene Türü Referans Avrupa Uzak Doğu Ixodes ricinius Ixodes nipponensis Haemaphysalis concinna Haemaphysalis longicornis Haemahysalis flava Ixodes persulcatus Haemaphysalis japonica (Kim ve ark., 2009) (Ternovi, 2003) Sibiryan Ixodes persulcatus Haemaphysalis concinna (Kunze, 2006) 1.4. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu, Klinik Yol, Tanısı, Tedavisi ve Koruma Yolları 1.4.1. TBE Hastalığında Enfeksiyon Oluşumu Enfekteli kenenin insanı ısırmasından sonra, virüs kene ısırığının olduğu bölgedeki dermal hücrelerde replike olur. Kenenin salyası ile immün sistemin baskılanması nedeniyle virüs nötrofilik granülositlerin yanında Langerhans hücrelerinde de replike olur. TBE virüsü replikasyon için sadece Langerhans hücrelerini ve granülositleri kullanmaz, aynı zamanda lenf kapilerleri yolu ile bölgesel lenf bezlerine ulaşır. Böylece virüs lenfatik sistem yolu ile yayılır ve birkaç gün sonra, kan dolaşımı (viremi) safhasına ulaşır. Daha sonra diğer duyarlı organ ve dokulara istila eder, özellikle retiküloendotelyal sistemde (timus, dalak, karaciğer) etkili olarak replike olur. Bu basamaktan sonra virüs merkezi sinir sistemine ulaşmak için, beyin kapiler endotelyum hücrelerini enfekte eder. Beyin kapiler endotelyum hücrelerinin enfekte olması yüksek
14 virüs miktarına bağlıdır. Endotel hücreler istila edildikten sonra virüs replike olur ve beyin dokusu içerisinde beyindeki kapiler endotelyum hücrelerinden merkezi sinir sistemine geçer. TBE virüsü ayrıca sinir fibrilleri boyunca da yayılabilir. Bu durum özellikle laboratuar enfeksiyonlarında havadan virüs alındığında görülebilir. 1.4.2. Klinik Yol ve Hastalığın Ortaya Çıkması Hastalık dört periyodluk bir seyir gösterir: Đnkübasyon Periyodu: Çoğu vakalarda ilk basamağın saldırı öncesi, inkübasyon periyodu 7-14 gün veya 2-28 gün sürebilen periyodudur. Đlk Basamak: Ortalama ilk basamak 2-4 gün sürer (1-8 gün devam süresi nadir olarak incelenir) ve viremik fazla karşılaşır. Karakteristik olmayan grip benzeri semptomları ve çoğu vakada 38 o C bir artışla ilişkilidir. Bazen istisna olarak yüksek baş sıcaklıklar oluşabilir. Aseptomatik Aralık: Đlk basamak yaklaşık 8 gün süren aseptomatik aralık tarafından takip edilir. Bu periyod esnasında hastalar genelde septomsuzdur. Đkinci Faz: Enfeksiyondan sonra yaklaşık 2-4 hafta içinde hastaların üçte birinde hastalığın ikinci basamağı görülebilir ki, bu faz merkezi sinir sistemi (CNS) ile ilişkisi tarafından karakterize edilir. Klinik resmi meninjit, ensefalit, meningoenfalomyelitis, veya meningoensefaloradikulustur. Avrupa da yetişkin hastalarda ölüm oranı yaklaşık % 1 dir ve meningoensefalit, meningoensefalomyelitis ve otonom sinir sisteminin disfonksiyonu dahil TBE li hastalarda yaklaşık % 3 e çıkar. (Radda, 1983). Meninjitin asıl septomları ciddi baş ağrısı, mide bulantısı, kusma, ense sertliği, ve yüksek ateştir. Ensefalit, bilinçsizlik, uyuşukluktan derin uyku haline değişen ve bazı nadir durumlarda, koma gibi rahatsızlıklarla karakterize edilir. Hastalığın ileriki safhalarında vücutta bir takım değişiklikler görülebilir. Bunlardan bazıları karakterize edilmiştir. Özellikle merkezi sinir sistemini etkileyecek septomları vardır. Beyin bariyerini geçtikten sonra omurilik ve ensefalit sonrası septomlar olası. Diğer septomları uykusuzluk, kolların ve yüz kasının aşırı hareketliliği, dil titremesi, kasılma, baş dönmesi, konuşma bozukluklarıdır. Kranial (kafatasına ait) sinirleri içerdiğinde, esas olarak göz merceği, yüz kısmı ve boğaz kasları etkilenir. Bazı durumlarda nöropsiyatrik septomlar hakim olur ve hastalar psikiyatrik gözetime yollanır. TBE li nörolojik
15 anormalliklerin en büyük uzantısı hastalığın ortaya çıkan meningoensefalomyelitikte bulunur ki bu durum öncelikle ekstremitelerin zayıf paralizi tarafından karakterize edilir. Paraliz genellikle üst kolları, omuz eklem miyelitini ve baş kaslarını etkiler (Mickiene, 2005). 1.4.3. TBE Hastalığının Tanısı TBE virüsünün tanısı için değişik yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir (Haglund, 2000). BOS (Beyin omurilik sıvısı) incelemesi: BOS ta orta derecede pleositozis (100-300 hücre/µl), segmentli granülositler % 60-70, lenfositler %30-40 görülmektedir. Kan BOS bariyeri orta derecede bozulmuş olup, BOS / Serum albumin oranı artmıştır ve IgM ön planda olmak üzere intratekal antikor üretimi artmıştır. Nadiren ölümcül vakalarda beyin dokusunda elektron mikroskobu ile virus gösterilebilmiştir. Hücre kültüründe izolasyon: TBEV, hastalara ait serum ve / veya BOS örneklerinin memeli hücre kültürü ortamlarına (Vero, BHK-21, PK, RH, 293 veya A549 hücreleri) veya fare beynine inokülasyonundan sonra yapılabilmektedir. Serolojik tanı: 1980 lerden önce, tanıda kompleman fiksasyonu veya hemaglütinasyon inhibisyon testi kullanılmıştır. Hızlı tanı için, hemaglütinasyon inhibisyon testinde 2- merkaptoetanol ile muamele sonrası TBEV spesifik IgM antikorları saptanabilir. Bu testte erken akut dönem serumunda 0.05M 2-ME ile muameleden önce ve sonra serum Hemaglutinasyon inhibisyonu (HI) ile test edilmelidir (Allwinn, 2002). Günümüzde, TBE tanısında Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) serum ve BOS da serolojik tanı için oldukça iyi ve kullanışlı bir yöntemdir. Capture ELISA yöntemiyle, romatoid faktör veya heterofil antikorların interferansı nedeniyle oluşabilecek yalancı pozitifliklerden uzaklaşılarak TBEV-IgM çalışılabilmektedir. ELISA yöntemi ile IgM in gösterilmesi oldukça güvenilir bir serolojik testtir. Ancak, erken dönemde antikoru saptayamaması ile aşı sonrası ve doğal vakalarda 10 aya kadar devam eden IgM antikor varlığı bazen tanıda sorun oluşturabilmektedir. Bu nedenle TBEV spesifik IgG ELISA testi veya seronötralizasyon testleri ile konfirmasyon yapılması önerilmektedir (Sonnenberg, 2004).
16 Moleküler tanı: Hastalığın ilk fazı boyunca, hem kan hem de BOS örneğinden RT-PCR tekniği ile TBEV genomu saptanabilmektedir. Buna rağmen, bu teknikler pratikte tanıda minör derecede önemlidir, çünkü hastaların çoğu hastalığın ikinci fazında hekim muayenesine başvurmaktadır ve bu dönemde zaten kan ve BOS tan virüs temizlenmiş olmaktadır. Bu nedenle, RT-PCR tekniği TBE nin laboratuar tanısında hastalığın birinci faz dönemi hariç kullanılışlı değildir. Yeni real-time RT-PCR yöntemleri TBEV tanısında daha başarılıdır. Omurgalılarda vireminin araştırılması ve kenelerde virüs prevalansının epidemiyolojik surveyinde TBEV RNA sının RT-PCR ile taranması ile başarılı sonuçlar alınmıştır (Şekil 1.8). Ancak, TBE nin rutin tanısında virus izolasyonu ve moleküler yöntemlerin önemli bir rolü yoktur, genellikle ikinci fazın başlamasıyla beraber spesifik antikorların saptanmasıyla tanı konmaktadır (Puchhammer-Stock and Kunz, 1995). Şekil 1.8 TBE hastalığının real-time PCR ile tanısı (Schwaiger, 2003) 1.4.4. TBE Hastalığından Korunma Yolları Genel olarak diğer kene kökenli hastalıklarda uyulması gereken korunma yolları (Kenelerle mücadele, keneli alanlara girmeme, kene kovucu veya ilaçlı elbise kullanma, aşılanma) burada da gecerlidir.
17 1.4.4.1. TBE Aşısı TBE hastalığını önlemede en etkili yol aktif aşılamadır. TBE için halen çok sayıda aşı bulunmakta ve birçok ülkede rutin, bazı ülkelerde ise isteğe bağlı kullanılmaktadır. Örneğin, Avrupada Baxter firması tarafından TBE ye karşı kullanılmak üzere formaldehitle inaktive edilmiş sükroz gradienti ile saflaştırılmış TBEV antijeni içeren FSME-IMMUN adlı bir aşı yoğun olarak kullanılmaktadır (Baxter 2007). Bu aşının içeriği Çizelgede verilmiştir (Kunz 2003). Bu aşı üç dozda kullanılmakta ve yaşlara göre farklı dozda uygulanmaktadır. Avusturya da özellikle bu aşının uygulanmasıyla TBEV vakalarında çarpıcı bir şekilde azaldığı ispat edilmiştir. Diğer bir şekilde ticari olarak elde edilen aşı Encepur (Behringwerke AG, Marburg, Almanya ) piyasaya sunulmuştur. Bu aşı ile Almanya da TBEV ünün yüksek riskli bölgelerinde yaşayan bebek ve çocuklarda yaygın bir şekilde kullanılmıştır. Üçüncü olarak Rusya da üretilerek kullanılan aşı da rapor edilmiştir. Endemik TBE bölgelerine ziyaret eden ve kene ısırma riskinde olan kişilere TBE aşısı alması önerilir (Baxter 2007).
18 Çizelge 1.5 TBE aşısının içeriği (Kunz, 2003) FSME-Đmmün 0.5 ml FSME-Đmmün0.25ml (Genç) Aktif madde: inaktive edilmiş Formaldehit, saflaştırılmış Sukroz gradienti, TBE virüs antijeni 2.4 µg (hedef) 2-2.75 µg (aralık) 1.2 µg (hedef) 1-1.375 µg (aralık) Adjuvant: sulandırılmış 0.35 mg Al 0.17 mg Al Alüminyum hidroksit Tampon sistem: 3.45 mg 1.725 mg Sodyum klorit Sukroz Max. 15 mg Max. 7.5 mg Formaldehit Max. 5 µg Max. 2.5 µg Protamin sülfat Az miktar Az miktar Neomisin ve gentamisin Az miktar Az miktar Dengeleyici 0.5 mg 0.25 mg Enjeksiyon için su 0.5 ml 0.25 ml
19 2. MATERYAL ve YÖ TEM 2.1. Materyal Çalışmada, 2007-2008 yılları arasında Tokat, ve çevresinden yapılan arazi çalışmaları sonucunda ve sağlık kuruluşlarından kene ısırığı olan insanlardan toplam 690 kene örneği toplanmış ve TBEV varlığı için test edilene kadar -80 o C de muhafaza edilmiştir. Ayrıca 2010 yılı Temmuz-Ağustos ayları arasında Ordu Merkez ve Fatsa ilçelerinde insanlardan toplanan 228 kene (özellikle Ixodes ricinius) bu çalışmada kullanılmıştır (Çizelge 2.1). Çizelge 2.1 Bu çalışmada TBEV varlğını test etmek için toplanan kene cinsleri ve sayıları Keneler Tokat- Amasya Đlleri Ordu-Fatsa Bölgesi Hyalomma sp 630 _ Haemaphysalis sp 20 _ Ixodes sp 40 228 TOPLAM 690 228 Tokat ve Amasya ili için 630 adet Hyalomma cinsine kene örneği, 40 adet Ixodes cinsi kene örneği ve 20 adet Haemaphysalis cinsi kene örneği kullanılarak 10 keneden oluşan 69 adet kene havuzu oluşturulmuştur. Ayrıca Ordu merkez ve Fatsa ilçelerinden 205 adet ergin Ixodes ricinus örneği, 20 adet Ixodes cinsi nimf ve 3 adet larva 5 li gruplar halinde gruplanarak 46 adet kene havuzu oluşturulmuştur. Bu kene havuzları viral RNA izolasyonu için kullanılmıştır. 2.1.1. Kullanılan Kimyasal Madde ve Malzemeler Agaroz, Etidium bromür, Bromophenol blue (Sigma), Etanol, Glasiyal asetik asit (Merck), Sodyum asetat, HCI (Carlo Erba), Tris, EDTA, Gliserol, Xylene cyanol, Đsopropanol (Amresco), Sıvı azot, Moleküler ağırlık standartı (Vivantis), TBENC5'R- OF, TBEN5'CR-OR, TBENS4B-NS5-OF, TBENS4B-NS5-OR, TBENS4B-NS5-IF,
20 TBENS4B-NS5-IR, TBE913F, TBE1739R, TBE1192F TBE1669R (Đontek) primer seti, Viral RNA izolasyon kiti (Roche), RT-PCR kiti (Roche), Erlen, Beher, Cam Şişeler (100 ml, 500 ml, 1000 ml lik), Mezür, Bistüri, Forcep, Enjektör, Petri kapları (Isolab), Pipet uçları (Corning, Neptune, Eppendorf), Mikrosantrifüj ve PCR tüpleri (Axygen) ile diğer laboratuvar malzemeleri kullanıldı. 2.1.2. Cihazlar Thermal cycler (Peqlab), Santrifüjler (Eppendorf, Hettich), UV transillüminatör (Syngene), Yatay elektroforez (Scie-plas), Güç kaynağı (Consort), Hassas terazi (Acculab), ph metre (Hanna), Otomatik pipetler (Eppendorf, Brand), Manyetik karıştırıcılar, Vorteks (Ika), Buz makinesi (Scotsman), Otoklav (Hiclave), Etüv (Memmert), Mikrodalga fırın (Arçelik), 4, -20 ve -80 o C deki buzdolapları (Uğur, Arçelik, U410 premium), Fotoğraf makinesi (Sony) ve Saf su cihazları (Mes mp minipure, Millipore) kullanıldı. 2.1.3. Tampon ve Solüsyonların Hazırlanışı 2.1.3.1. 0.5 M EDTA Solüsyonu 16.81 g EDTA 90 ml H 2 0 içerisinde manyetik karıştırıcı yardımı ile partiküller tamamen çözününceye kadar karıştırıldı. ph:8.0 e ayarlandıktan sonra hacim 100 ml. ye tamamlandı. Otoklavda 121 o C de 20 dk. steril edildikten sonra, +4 o C deki buzdolyaplarında muhafaza edildi. 2.1.3.2. 50X Tris Asetat EDTA (TAE) Tamponu 242 g Tris, 57.1 ml Glasiyal asetik asit ve 100 ml 0.5 M EDTA (ph:8) manyetik karıştırıcı yardımı ile partüküller çözününceye kadar karıştırıldı. Hazırlanan çözeltinin ph ı Glasiyal asetik asitle 8.5 e ayarlandı ve toplam hacim distile su il ye tamamlandı. Steril edildikten sonra +4 o C deki buzdolaplarında muhafaza edildi.
21 2.1.3.3. 1X TE Tamponu 1.2 g 10 mm Tris HCI ile 0.37 g 1 mm EDTA, 900 ml distile su içerinde manyetik karıştırıcı yardımı ile çözüldü. ph:8 e ayarlandıktan sonra hacim 1000 ml ye tamamlandı. Hazırlanan tampon steril edildikten sonra +4 o C deki buzdolaplarında muhafaza edildi. 2.1.3.4. 3M Sodyum Asetat Solüsyonu 41 g Sodyum asetat, 90 ml distile su içerisinde çözüldü. ph:5.0 a ayarlandıktan sonra hacim 100 ml ye tamamlanır. Otoklavda steril edilerek +4 o C de muhafaza edildi. 2.1.3.5. Etidyum Bromür 10 mg Etidium bromür, 10 ml steril distile su içerinde hazırlandı ve 4 o C de muhafaza edildi. 2.1.3.6. 6X Bromophenol Blue 15 ml Gliserol, 0.25 g Bromophenol blue ile 0.25 g Xylene cyanol; 100 ml distile su içerisinde çözününceye kadar karıştırılarak hazırlandı.
22 2.1.3.7. Çalışmada Kullanılan Primerler Çizelge 2.2 Bu çalışmada TBEV varlığını test etmek için kullanılan primerler (Melik, 2007, Ternovi 1999) Primerler Sekans TBEV bölge (nt) 5'NCR-OF 5'NCR-OR NS4B-NS5-OF NS4B-NS5-OR NS4B-NS5-IF NS4B-NS5-IR TBE1738R TBE1192F (5'-AGA TTT TCT TGC ACG TGC AT-3') (5'-CTC TTT CGA CAC TCG TCG AGG-3') (5'-ATG AGT GGT GTG GTC AGG GGG-3') (5'-TGC ATG CTG AAC ACG TCC ATT CC-3') (5'-GGG GTT TTT GCC TCT TGG GC-3') (5'-CCC AGG CTT GTT ACC ATC TTT GG-3') 5'-TGG CCA CTT TTC AGG TGG TAC TTG GTT CC-3') (5'-CAG AGT GAT CGA GGC CTG GGG GYA A-3') 1-20( +sense) 195-175(-sense) (195 bp) 7582-7601(+sense) 8072-8050 (-sense) (490 bp) 7611-7630 (+sense) 8024-8002(-sense) (413 bp) 1709-1738 (-sense) 1192-1217 (+ sense) (546 bp) TBE1669R TBE913F (5'-AAC ACT CCA GTC TGG TCY CCT AGG TTG TA-3') (5'-TGC AAA TGC CAG GGA- 3') 1640-1669 (-sense) 913-928 (+sense) (756 bp)
23 2.2. Yöntem 2.2.1. Kene Dokularının Ayrılması Keneler -80 C den çıkarılarak petri kabı içine koyulduktan sonra, 400 µl RNAlater içinde steril bir bistüri yardımı ile boşaltım açıklığının hemen üst kısmından enine olarak ikiye kesildi, bütün dokuları dış iskelet kalacak şekilde dışarıya çıkarıldı. Dışarı çıkarılan dokular enjektör yardımı ile toplanıp ependorf tüplerine alındı. Enjektörün iğnesinden geçirilen dokuların tamamen parçalanması sağlandı. Oluşan bu homojenat 14000 rpm de 5 dk. santrifüj edilerek süpernatantı pelletinden ayrıldı. 2.2.2. Viral R A Ekstraksiyonu Kenenin ayrılan dokularından viral RNA izolasyonu için Roche un High Pure Viral RNA kiti kullanılmıştır. Đzolasyon, kit prosedürüne uygun olarak şu şekilde yapılmıştır: 1. Poly(A) carrier RNA içerisine 400 µl Elution Buffer, Inhibitor Removal Buffer a 20 ml, Wash Buffer a ise 40 ml etanol ilave edilerek solüsyonlar hazırlandı. 2. 12 numune için, 5 ml Binding Buffer a (4.5 M guanidine-hci, 50 mm Tris-HCI, %30 Triton X-100, ph: 6.6) 50µl carrier RNA eklendi. Akabinde filtreli kolonlara her bir numune için 200 µl serum ile 400 µl Binding Buffer+carrier RNA ilave edildi. 3. 8 000 x g de 15 s santrifüj edildi ve sonrasında collection tüpleri atılırak yeni tüpler kullanıldı. 4. Sonra, filtreli kolonlara 500 µl Inhibitor Removal Buffer (5 M guanidine- HCI, 20 mm Tris-HCI, ph: 6.6) ilave edildi. 5. 8 000 x g de 1 dk. santrifüj edildi ve collection tüpleri atılarak yerlerine yeni tüpler yerleştirildi 6. Sonrasında her bir tüpe 450 µl Wash Buffer (20 mm NaCI, 2 mm Tris- HCI, ph: 7.5) eklendi ve 8 000 x g de 1 dk. santrifüj edildikten sonra collection tüpleri atılırak yeni tüpler yerleştirildi. 7. Tekrar 450 µl Wash Buffer eklenerek 8 000 x g de 1 dk. santrifüj edildi. 8. Sonrasında 10 s kadar tekrar santrifüj yapıldıktan sonra collection tüpleri atıldı ve yerine eppendorf tüpleri yerleştirildi.
24 9. Filtreli kısıma 50 µl Elution Buffer (Nükleaz saf su) eklenerek, 8 000 x g de 1 dk. santrifüj edildi. 10. Son aşamada ise, filtreli kolonlar atıldı ve eppendorf tüplerindeki ekstraksiyon ürünleri etiketlenerek -80 C de saklandı. 2.2.3. One-Step Reverse Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT- PCR) RNA ekstraksiyonu sonucunda elde edilen örnekler, Roche transcriptor one-step RT- PCR kiti kullanılarak, RT-PCR ı yapıldı. Kit içeriğine göre: RNase free su (Vial 3) 13.5 µl 5X RT-PCR buffer (Vial 2) 5 µl Upstream primer 1 µl Downstream primer 1 µl Transcriptor Enzim mix (Vial 1) 0.5 µl Templete RNA 4 µl Bu işlemler sonucunda numunelerin toplam hacmi 25 µl olacak sekilde hazırlanmıştır. 2.2.3.1. Thermal cycler ın Program Ayarı Thermal cycler ın programı; Denatürasyon için 94 C de 2dk. ya, 50-60 C de 15 s (annealing), 72 C de 1dk. ya (extension) ve Final extension için ise 72 C de 5 dk. ya ayarlandı. 2.2.4. Agaroz Jel Elektroforezi 2.2.4.1. Agaroz Jelin Hazırlanması 1 gr agaroz ve 5 ul etidyum bromid eklendikten sonra bir mikro dalga fırında jel haline getirildi. Agaroz jel eletroferez tankına döküldü ve jelin soğuyup katılaşması beklendi.
25 Katılaşan jelin üzerine TAE tamponu döküldü, tarak çıkarıldı ve yükleme yapmak için jel hazır hale getirildi. 2.2.4.2. Örneklerin Agaroz Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi PCR sonrasında elde edilen ürünler %1 lik agaroz jel elektroferezi kullanılarak görüntülendi. Kısaca her bir tüpe 2 µl bromfenol mavisi (BFB) ile 5 µl DNA örneği eklenerek kısa süreli spin yapıldı. Đlk kuyucuğa 2-4 µl DNA MW standardı diğerlerine de PCR ürünleri koyuldu. Güç kaynağı 100 ampere ayarlandı ve yaklaşık 30 dakika koşturuldu. Jeller jel dökümantasyon cihazında ultraviyole ışık altında görüntülendi ve jel görüntüleri bilgisayara kaydedildi 2.2.5. D A Dizi Analizi Jel elektroforezi sonucunda elde edilen şüpheli DNA bantları veren örneklere ait PCR ürünleri DNA dizisinin belirlenmesi için REFGEN (Ankara) firmasına gönderildi. Elde edilen sekanslar NCBI BLAST proğramı kullanılarak bilinen viral sekanslarla karşılaştırıldı.
26 3. BULGULAR Bu çalışmada Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerinden toplanan kenelerde kene kökenli ensefalit virüsünün varlığı RT-PCR yöntemiyle araştırılmıştır. Çalışmamızda, Tokat, Amasya, Ordu ve Fatsa bölgelerinden toplanan toplam 918 kene örneği TBEV varlığı için RT-PCR yöntemiyle test edilmiştir. 3.1. Tokat ve Amasya Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı: Bu çalışmada, 2007-2009 yılları arasında arazi çalışmaları sonucunda toplanmış 690 kene örneği TBEV spesifik primerler setleri kullanılarak RT-PCR ı yapılmıştır. Test edilen kenelerden RT-PCR ürünleri pozitif bant veren 4 şüpheli örnek DNA dizi analizi yaptırılmış ve bunlarında nonspesisfik bantlar olduğu anlaşılmıştır (Şekil 3.1.a). Dolayısyla RT-PCR sonuçlarına göre Tokat bölgesinde test edilen kene örneklerinde TBEV varlığı saptanamamıştır. 3.2. Ordu Merkez ve Fatsa Bölgesi Kenelerinde TBE Varlığı: Bu çalışmada, 2010 yılı yaz aylarında Ordu Merkez ve Fatsa ilçelerinde insanlardan toplanan 228 adet Ixodes ricinus kene örneği TBEV spesifik primerler setleri kullanılarak RT-PCR ile test edilmiştir. Test edilen keneler arasında RT-PCR ürünleri pozitif bant veren 6 şüpheli örnek DNA dizi analizi yaptırılmış ve fakat bunlarında nonspesisfik bantlar olduğu anlaşılmıştır (Şekil 3.1.b). Sonuç olarak RT-PCR sonuçlarına göre Ordu ve Fatsa bölgesinde test edilen kene örneklerinde de TBEV varlığı saptanamamıştır.
27 500 bp 350 bp b. ) STD K39 500 bp 500 bp Şekil 3.1 RT-PCR sonrası dizi analizine giden PCR ürününün agaroz jel elektroforezi (%1 lik) yöntemi kullanarak görüntülenmesi a.) TBENS4B-NS5-IF ve- NS5-IR primer setleri b.) TBENS4B-NS5-OF ve TBE-NS4B-NS5-OR primer setleri kullanılmıştır.