Hücre Üzerine Mikrocerrahi Uygulamaları Hücrenin altbirimlerine ayrılması Moleküllerin analizi Prof. Dr. Müjgan Cengiz
Canlı Hücrelerdeki Moleküllerin İzlenmesi Mikroskopla inceleme hücrede belli düzeyde araştırma sağlar. Hücre sabit bir yapıda değildir. Stabil görünen yapılar bile birleşir ayrılır yeniden organize olur. Bu dinamik yapının izlenmesinde optik mikroskop kullanılır. Görüntüleme için radyoaktif bileşikler, floresan boyalar(aequorin) kullanılır.
Balık yumurtasına lüminesan protein olan aquorin verilince serbest Ca varlığında floresan ışık yayılır. Spermle birleşen yumurtanın Ca ları 10 saniyede değişir. Serebellumdaki purkinje hücrelerindeki kalsiyum değişimi floresan bir boya ile görünür hale getirilir.
Hücreye Membrandan geçemeyen maddelerin yerleştirilmeleri. A) Maddeler hücreye bir mikropipet yardımıyla basınç uyulayarak veya eğer madde elektrik yüklüyse voltaj ugulayarak yerleştirilebilir. Uygulanan voltaj iyonik yük nedeniyle maddeyi hücre içine geçirir. Bu yönteme iontophoresis denir. B) Hücre zarı kısa ama yoğun bir elektrik şokuna tabi tutularak membran yapısı bozulur ve made membrandan kolayca geçecek hale getirilir.
C) Membranla kaplı veziküller istenilen madde ile yüklenir ve hedef hücreye entegre olarak maddeyi hücre içine geçirir. D) DNA ile kaplanmış altın partikülleri farklı bir geni çekirdeğe sokar.
Hücrenin Altbirimlerine Ayrılması Biyokimyasal analizlerin yapılabilmesi için hücrenin doğal yapısının bozulması gereklidir. Çeşitli hücre altbirimlerinin ayrılması için zarar verici olmayan ayırma yöntlemleri gereklidir. Bu işlem organellerin kendi fonksiyonlarının korunması için gereklidir. Doku önce kendisini oluşturan hücre tiplerine ayrılır. Daha sonra fonksiyon gören organellerine ve makromoleküllerine
Organeller ve Makromoleküller Ultrasantrifüjleme Yoluyla Ayrılır Hücreler çeşitli yollarla parçalanabilirler. A) osmotik şok uygulanabilir B) Ultrasonik titreşim veya C) Küçük bir kapta ona uygun bir kolla ezilebilir veya D) Blendırda parçalanabilir(kesici bıçakla).
Bu işlemler hücrenin pek çok zarını parçalayarak (plazma membranı ve endoplazmik retikulum membranı) bazı zarlarda küçük kapalı veziküller oluşturur. Bu parçalama işlemi dikkatlice uygulanırsa, çekirdek, mitokondri, golgi aygıtı, lizozomlar ve peroksizomlar gibi organeller zarar görmeden izole edilebilirler.
Hücrelerin bu süspansiyonu yoğun bir karışımdır (buna homojenat veya ekstrakt denir) ve çeşitli membranla çevrili organelleri içerir. Bu organellerin her biri farklı büyüklük, yük ve yoğunluğa sahiptir. Kullanılan homojenizasyon ortamı dikkatlice seçilmelidir (her organel için ardarda yapılan deneme yöntemi ile bulunmuştur).
Homojenatın farklı bileşenleri ayrılacaktır. Bu şekilde hücre organellerinin ayrılması preparatif ultrasantrifüjleme yoluyla yapılır. Hücre içeriğinin bulunduğu karışım yüksek hızlarda santrifüjlenir.
Preparatif Ultrasantrifüjleme Bu yöntem hücre komponentlerini büyüklük ve yoğunluklarına göre ayırmaktadır: Genellikle, ayrılacak olan en büyük birimler en hızlı çöker. Düşük hızlarda çekirdek sedimenti gibi büyük bileşenler santrifüj tüpünün dibinde bir tortu oluştururlar;
Daha yüksek hızlarda mitokondri pelleti çöker; Daha yüksek hızlarda ve daha uzun santrifüjleme işlemlerinde önce küçük kapalı veziküller daha sonrada ribozomlar çöker.
Santrifüjleme adımlarının tipik değerleri şunlardır: Düşük hız santrifüjleme 1000 g de 10 dakika Orta hız santrifüjleme 20,000 g de 20 dakika Yüksek hız santrifüjleme 80,000 g de 1 saat Çok yüksek hız santrifüjleme 150,000 g de 3 saat Bütün bu bileşenler kirlidir, bulaşanların temizlenmesi için pellet birkaç kez kullanılan tamponla yıkanıp tekrar
Yoğunluk Garadienti Santrifüjlemesi Yoğunluk gradiyenti santrifüjlemesi olarak adlandırılan diğer bir santrifüjleme yöntemi de vardır. Bu işlem santrifüj tüpünün sukroz gibi bir çözeltinin farklı yoğunluklarda doldurulmasıyla uygulanır. Oluşturulan yoğunluk gradienti (en yoğun bölümü tüpün en altındadır)aşağıdan yukarıya doğru azalan yoğunluklarda hazırlanır ve ayırma işlemi sırasında bu bantlar birbirine karışmaz.
Daha iyi bir ayırım yapabilmek için homojenat yoğun olmayan bir tuz çözeltisi içinde santrifüj tüpünün üzerine ince bir pipet yardımıyla uygulanır (santrifüj tüpü %5 ile %20 arasında tabakalandırılmış sukroz çözeltisiyle hazırlanmıştır).
Santrifüjleme yapıldığı zaman, karışımdaki çeşitli bileşenler gradient boyunca farklı bantlara hareket ederler, her bir bileşen hız sedimentasyonu denilen bir işlemle farklı hızda çöker. Bunu izleyen santrifüjlemede farklı bileşenler tek tek toplanır, basitçe bu işlem santrifüj tüpünün tabanının delinmesiyle gerçekleştirilir.
Parçalanmış hücrelerde kompleks işlemlerin moleküler ayrıntılarının incelenmesi Ultrasantrifüjle izole edilmiş olan organellerin ve diğer büyük hücresel alt birimlerin çalışılması farklı hücresel bileşenlerin anlaşılmasına çok büyük katkılar yapmıştır.
Santrifüjleme ile saflaştırılmış mitokondri ve kloroplastlarla yapılan deneylerde bu organellerin temel fonksiyonları ve enerjiyi hücrelerin kullanabileceği şekle nasıl dönüştürdüğü gösterilmiştir. Benzer şekilde, düz ve granüllü endoplazmik retikulumdan (mikrozomlar) oluşan salgı vezikülleri birbirinden ayrılarak hücrelerde bu kompartmanların fonksiyonları
Proteinler kromatografi yöntemi ile ayrılırlar Proteinler kolon kromatografisi ile ayrılabilirler. Bu yöntemde çözeltideki protein karışımı geçirgen katı bir matriks ile doldurulmuş kolondan geçirilir. Farklı proteinler matriks ile etkileşimlerine bağlı olarak farklı zamanlarda kolondan ayrılırlar ve akış zamanına göre kolonun ucundan toplanırlar (şekil).
Örnek (farklı moleküllerin karışımı) kolonun üstüne uygulanır. Matriks, sellüloz gibi geçirgen bir maddedir. Büyük miktarda sıvı kolondan geçirilir. Moleküller tabandan toplanır. Farklı örnek bileşenleri farklı hızlarda hareket ederler. Ve ayrı tüplerde toplanırlar.
Kromatografide üç tip matriks kullanılmaktadır. İyon-değişim kromatografisi (A) kullanılan matriksin taşıdığı yük, ters yükteki moleküllerin geçişini engeller. Kullanılan matriks tipleri; Dietillaminoetilselüloz (DEAE-cellulose) pozitif yük taşır ve karboksimetilselüloz (CM-cellulose) negatif yük taşır. Jel filtrasyon kromatografisi (B) matriks inert ama geçirgendir. Moleküller matriksten geçecek kadar küçüktür fakat kolondan yavaş geçerler.
Matriks materyallerinden olan polisakkaridin por büyüklüğüne göre farklı tipleri vardır (dekstran, agroz veya akrilamid). Bu özelliğinden dolayı çeşitli molekül ağırlığındaki moleküllerin ayrılmasında kullanılır. Affinite kromatografisi (C) özel bir liganda kovalent olarak bağlanmış suda çözünmez bir matriks içerir. Bu ligand bir antikor molekülü veya özel bir proteini bağlayan bir enzimin substratı olabilir.
Bu substrat özel bir proteini bağlayabilir. Enzim molekülü immobilize substrata bağlanır. Bu enzim tutulmuş olur. Sıvının kalan kısmı akar. Daha sonra bu immobilize enzim diğer bir çözeltiyle bu bölgeden uzaklaştırılır. Bu çözelti antijen-antikor kompleksi oluşturabilir veya ayrılacak bileşiğe uygun yüksek tuz içeren bir çözelti veya farklı ph da bir bileşik olabilir. Aranan bileşik saf olarak ayrılır.
Bu teknik nişasta gibi geçirgen bir matriks içine uygulanan proteinleri ayırmak için kullanılır. Elektroforez Bir proteinin büyüklüğü ve altbirim kompozisyonu SDS poliakrilamid jel elektroforezi tarafından saptanabilir. Proteinler net negatif veya net pozitif yük taşırlar. Protein içeren bir çözeltiye elektrik yükü uygulandığında proteinler büyüklük, yük ve şekline bağlı olarak göç ederler.
Her protein molekülü çok sayıda negatif yüklü SDS molekülü bağlar. Bu işlem proteinin yükünü maskeler. Proteinin pozitif elektroda göç etmesini sağlar. Daha sonra voltaj uygulanır. Poliakrilamid jel moleküler elek olarak davranır. Büyük moleküller küçüklerden sonra göç eder. Protein karışımı ayrı protein bantları olarak görülür.
Referanslar 1-1-Molecular Biology of the Cell.Alberts B.,Johnson A.,Lewis J.,Raff M.,Roberts K.,Walter P.4. Edition. Garland Science 2002. 2-The Cell Molecular Approach. Cooper M.G. Hausman R.E. 3 Edition.ASM Press.2004.