Dr. Zeynep Karakaş Dr. Ferda Özkınay. İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi,

TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ 2014: 4 1 Dr. Zeynep Karakaş Dr. Ferda Özkınay İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Ege Çocuk Üniversitesi Hematoloji Tıp Onkoloji Fakültesi, Bilim Tıbbi Dalı, Genetik İstanbul, Anabilim Türkiye Dalı, Çocuk Sağlığı e-posta: ve Hastalıkları zkarakas@istanbul.edu.tr Anabilim Dalı, Çocuk Genetik Hastalıkları Bilim Dalı, İzmir, Türkiye e-posta: Anahtar f.ferda.ozkinay@ege.edu.tr Sözcükler Alfa talasemi, Genetik, Klinik, Anahtar Sessiz alfa Sözcükler talasemi taşıyıcı, Ağır alfa talasemi taşıyıcı, Hb H hastalığı, Hb Barts, Hidrops fetalis Hemoglobinopati, Moleküler genetik testler, Talasemi HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ ÖZET Hemoglobin dört globin zincirinden oluşan tetramerik bir yapı gösterir. Fetusta en yüksek oranda bulunan hemoglobin, HbF(α2γ2) iken, erişkinde hemoglobinin %95 i HbA (α2β2), <%3,2 si HbA2 (α2δ2), <%1 i HbF dir (α2γ2). Bugüne kadar moleküler düzeyde globin genlerinde yaklaşık 1000 civarında mutant allel saptanmıştır. Hemoglobinde bulunan globin zincirlerinden birinin az sentezlenmesi veya hiç yapılamaması yani kantitatif yetersizliği talasemi tablosuna (α ve β talasemi) sebep olurken, globin zincirinin yapısal bozuklukları yani kalitatif bozuklukları yapısal hemoglobin bozukluklarını oluşturur. Bu klinik tabloları gösteren hastalardaki genotipleri ve taşıyıcılardaki moleküler defekti göstermek, kesin tanı koymada, prognozu tahminde, tedavi seçeneklerini uygulamada ve genetik konsültasyonda önemlidir. Yeni gelişen DNA teknolojisi talasemiler ve yapısal hemoglobinopatilerin moleküler tanısında, hızlı ve yüksek doğrulukta tanı testlerinin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu yöntemler mutasyonu doğrudan tayin eden direk yöntemler ve indirek yöntemler olarak sınıflandrılır. Direk yöntemler arasında Allel Spesifik Olgonükleotid Hibridizasyon (ASO), Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS), dizi analizi, gap-pcr yöntemleri sayılabilir. Denature edici Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) ve Denature edici Yüksek performanslı Likid Kromatografi (DHPLC) yöntemleri indirek yöntemlerdir. Ayrıca son yıllarda Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA), Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF), Real-time PCR, Melting Curve Analysis (MCA) gibi yöntemler hızla kullanıma girmektedir. Moleküler tanıda yöntem/yöntemler, hastanın fenotipik bulgularına, hematolojik parametrelere ve toplumdaki sık rastlanılan mutasyonlara ve laboratuvarın özel koşullarına göre seçilir. 30

HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ 31 HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ Hemoglobin molekülü, oksijenin hemoglobine reversibl bağlanmasını sağlayan prostetik grup olan hem ve globin protein zincirlerinden oluşur. Hemoglobinin yapısında bulunan, globin zincirlerinin sentez bozuklukları dünyada en yaygın rastlanılan kalıtsal tek gen hastalıkları grubudur. Epidemiyolojik çalışmalar malaryanın sık olduğu bölgelerde, bu enfeksiyona karşı koruyucu olduğu bilinen hemoglobinopati taşıyıcılığının da sık olduğunu göstermektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık %5 i globin varyantlarından birini taşımaktadır. Alfa ve beta talasemi taşıyıcılarının sıklığı %1,7 dir (1). İnsanlarda hemoglobin dört globin zincirinden oluşan tetramerik bir yapı gösterir. Bu tetramerik yapı içinde, insan yaşamının evrelerine göre değişkenlik gösteren iki α veya α benzeri, iki β veya β benzeri genin ürünü olan dört globin zinciri bulunur. Hemoglobinler, yapısındaki globin zincirlerine göre adlandırılır. Fetusta en yüksek oranda bulunan hemoglobin, HbF (α2γ2) iken erişkinde hemoglobinin %95 i HbA (α2β2), <%3,2 si HbA2 (α2δ2), <%1 i HbF dir (α2γ2). α globin zincirleri 16. kromozomun kısa kolu üzerinde bulunan iki α geni (α1 ve α2) tarafından kodlanır; γ, δ, β, globin zincirleri ise 11. kromozomun kısa kolu üzerinde bulunan γg- γa, δ, β genleri tarafından kodlanır. Bugüne kadar moleküler düzeyde globin genlerinde yaklaşık 1000 civarında mutant allel saptanmıştır (2). Bu moleküler değişikliklere http:// globin.cse.psu.edu/ sitesinde HbVar bilgibankası (HbVar database) yoluyla ulaşılabilir. Hemoglobinde bulunan globin zincirlerinden birinin az sentezlenmesi veya hiç yapılamaması yani kantitatif yetersizliği talasemi tablosunu (α ve β talasemi) oluştururken, globin zincirinin yapısal bozuklukları, yani kalitatif bozuklukları yapısal hemoglobin bozukluklarını (HbS) oluşturur. Yapısal hemoglobin bozukluklrından HbE de zincirin yapısının bozulmasının yanısıra, globin zincir sentezi de azaldığı için hastalık tablosu talasemilere benzer. Hemoglobin bozuklukları oluşturdukları klinik tablolara göre dört ana grupta incelenmektedir (3). 1- β talasemi sendromları (δβ talasemi, HbE/β talasemi de bu gruba girer) 2- α talasemi sendromu 3- Orak hücreli anemi (Hb S/S, Hb S/C, HbS/β-thal. ve daha az rastlanılan Hb S/Dpunjab, Hb S/OArab ve Hb S/Lepore 4- Hemolitik anemi, polisitemi ve nadiren siyanozun olduğu Hb varyantları Bu klinik tabloları gösteren hastalardaki genotipleri ve taşıyıcılardaki moleküler defekti göstermek, kesin tanı koymada, prognozu tahminde, tedavi seçeneklerini uygulamada ve genetik konsültasyonda önemlidir. Ülkemizde ve Akdeniz çevresindeki ülkelerde globindeki β zincirinin az yapıldığı veya hiç yapılamadığı β talasemi daha sık görülür. β Talasemide Genetik β talasemide başlıca üç klinik fenotip görülür. Transfüzon bağımlı talasemi major tablosu Nadir transfüzyon gerektiren talasemi intermedia tablosu TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ

32 2014:4 1 Talasemi taşıyıcılığı (Talasemi minor) Bu sınıflandırma fenotipe dayalıdır. Hastalıkta genotip-fenotip ilişkisi orta düzeyde ve modifiye edici faktörler olduğundan genotipi tam yansıtmaz (3,4). Son yayınlarda beta talasemi sınıflandırması aşağıdaki gibi yapılmaktadır (5): β talasemi Talasemi major Talasemi intermedia Talasemi minor Diğer hemoglobinopatiler ile birlikte olan β talasemi HbC/Beta-thalassemia HbE/Beta-thalassemia HbS/Beta-thalassemia Herediter persistan fetal hemoglobinopati ile birlikte olan β talasemi Otozomal dominant β talasemi Diğer bulgularla birlikte olan β talasemi Trikotiyodistrofi ve β talasemi X e bağlı trombositopeni ve β talasemi Beta-Globin Geni ve Mutasyonlar β ve β benzeri genler, 11. kromozom üzerinde bulunur (Şekil 1). Bu genlerin herbiri sırasıyla embriyonal yaşamdan erişkin yaşama kadar soldan sağa doğru eksprese olur. Embriyonal ve fetal yaşamda eksprese olan, beta gen bölgesindeki epsilon geni erişkinde inaktiftir. Gama geni çok az eksprese olur. Erişkinde hemoglobinin %95 i HbA (α2β2), <%3,2 si HbA2 (α2δ2), <%1 i HbF dir (α2γ2) (4,6,7). Bu gen bölgesinin başlangıcında, genlerin ekspresyonunu kontrol eden elemanlar (lokus kontrol bölgesi-lcr) bulunur. Bazı nadir beta talasemi formlarında, tüm genler sağlam olduğu halde bu düzenleyici bölge elemanları delesyona uğrar ve tüm genlerin ekspresyonunda belirgin bir azalma olur. Düzenleyici bölgedeki bazı cisacting mutasyonlar veya γ geni promotorunda transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasını aktive edici mutasyonlar γ- globin ekspresyonunu dolayısıyla fetal hemoglobini değişik düzeylerde arttırır ve bu durum herediter persistan Şekil 1. 11. kromozom üzerinde bulunan β ve β benzeri genler

HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ 33 fetal hemoglobinemi (HPFH) adını alır. Deltabeta talasemide en azından bir γ- globin genini sağlam bırakan δ, β genlerinin delesyonu söz konusudur. Bu durumda orta düzeyde δβ talasemi tablosu ve HbF de artma vardır (8,9). Beta globin geni 3 ekzon içerir ve 146 amino asitten oluşan bir protein kodlar. Birinci ekzon 1-29 amino asitleri, ikinci ekzon 30-104, üçüncü ekzon 105-146 aminoasitleri kodlar (Şekil 2). TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ Şekil 2. Beta globin geni Βeta talasemi geni içinde 200 den fazla mutasyon tarif edilmiştir. Mutasyonların çoğu nokta mutasyonları olup nadiren delesyonlar ve insersiyonlar da görülebilir (10). Mutasyonların dağılımı toplumdan topluma değişiklik gösterir. Bazı mutasyonlarda protein hiç sentezlenemez ve β 0 talasemi adını alır. Bazı mutasyonlarda ise protein sentezi vardır fakat yetersizdir. Protein sentezi az miktarda olduğunda β+ talasemiden söz edilir. β 0 talasemilerde genellikle klinik tablo daha ağırdır. Türk toplumunda en sık olarak IVS-1-110 mutasyonuna rastlanır. Bu mutasyon β+ talasemi olmasına rağmen ağır klinik tablo yapar. Birinci intronda bulunan IVS-1-110 mutasyonu intron içinde bir ekzon yapışma bölgesi oluşturarak, RNA oluşması sırasında, birinci ekzonun ikinci ekzona yapışacağı yerde buraya yapışmasına neden olur ve sentezi azaltır. Toplumumuzda β talasemi geninde bulunan en sık 7 mutasyon tüm olgulardaki mutasyonların %75-80 ini oluşturur (Tablo 1) (11). Tablo 1. Türk toplumunda en sık rastlanılan 7 mutasyon (11) Mutasyon Tipi Sayı % IVS-I-110 312 39,3 IVS-I-6 (T-C) 80 10,1 FSC-8 (-AA) 43 5,5 IVS-I-1 (G-A) 40 5,0 IVS-II-745 (C-G) 40 5,0 IVS-II-1 (G-A) 37 4,7 Cd 39 (C-T) 30 3,8

34 2014:4 1 BETA TALASEMİDE KLİNİK TABLOYU ETKİLEYEN GENETİK FAKTÖRLER Beta talasemili hastalarda klinik bulgular değişkenlik gösterir. Klinik tabloyu etkileyen genetik faktörler 3 ana grupta incelenmekedir (12): 1. Primer modifiye edici faktörler 2. Sekonder modifiye edici faktörler 3. Tersiyer modifiye edici faktörler. Primer Modifiye Edici Faktörler: Bu gruba β talasemi gen bölgesinde bulunan genlerdeki mutasyonlar girer. β genindeki bazı mutasyonlarda globin zinciri sentezi tamamen durmaktadır. β 0 talasemi olarak adlandırılan bu tip talasemilerde klinik tablo, hemoglobin sentezinin kısmen yapılabildiği β+ veya β++ talasemilere göre daha ağırdır. β 0 mutasyonlar genellikle 1. ve 2. ekzonda ya da ekzon-intron sınırına yakın bölgelerde bulunan nokta mutasyonları veya küçük delesyonlar ve insersiyonlardır. Cd 6-A and cd 8-AA gibi birkaç β 0 talasemi mutasyonu, γ- globin geninin promotor bölgesindeki aktive edici bir mutasyonla bağlantı gösterdiği için, yüksek HbF üretimi nedeniyle hafif klinik tablo gösterir (13). β talasemide büyük delesyonlar nadirdir. Büyük delesyonlar kapsadığı gen bölgesine göre değişik bulgular gösterir. Örneğin -125 den +78 e kadar olan bazların delesyona uğradığı mutasyon 5 bölgesindeki CACCC, CCAAT ve TATA elementleri de içerir. Bu bölgede bulunan ve genlerin ekspresyonu arasındaki dengeyi sağlayan lokus kontrol bölgesi (LCR=Lokus control region) de yok olduğu için β geni ile cis durumda bulunan δ ve γ genlerinin ekspresyonu artmıştır ve bu nedenle HbA2 düzeyleri belirgin şekilde yüksek olarak bulunur. On birinci kromozom üzerindeki tüm β ve β benzeri genlerin ve LCR bölgesinin delesyona uğradığı (εγδβ) 0 talasemide ise hematolojik parametreler talasemi taşıyıcılığını gösterirken HbA2 düzeyleri normal olarak bulunur (14). Son yıllarda yapılan çalışmalarda β geninde yeni delesyon mutasyonları tarif edilmektedir (15,16). Genin 5 bölgesinde promotor bölgede ilk ekzonun önündeki 50 nükleotidi içeren bölgede oluşan veya 3 UTR de bulunan bazı mutasyonlar gizli mutasyon lardır. Taşıyıcılarda bulgu vermezler. Homozigot olarak bulunduklarında taşıyanlarda beta talasemi taşıyıcılığı tablosu görüldüğü için veya ağır bir başka mutasyon ile birleşik heterozigot durumda bulunduklarında talasemi intermedia tablosu gösterdiklerinde yapılan analizlerde saptanır (12,13). Bu mutasyonlardan bazıları: 92 C T, 101 C T, 5 UTR +10 T, 5 UTR +33 C G, IVS2 844 C G, CAP +1 A C, 3 UTR +6 C G dir. Hafif mutasyonlar, gizli mutasyonlar gibi genellikle genin 5 promotor bölgesinde, 3 UTR bölgesinde ve PoliA bölgesinde bulunur. Hafif mutasyon taşıyıcılarında hematolojik parametreler taşıyıcılığı gösterir. Bu mutasyonlar homozigot durumda genellikle talasemi intermedia tablosu yaparlar. Ağır mutasyonlarla birleşik heterozigotluk durumunda klinik tablo talasemi intermedia tablosundan, talasemi major tablosuna kadar değişkenlik gösterir (13). Bu mutasyonlardan bazıları: 90 C T, 88 C A, 88 C T, 87 C A, 87 C G, 87 C T, 86 C G, 31 A G, 30 T A, 30 T C, 29 A G, 28 A G (zencilerde hafif Çinlilerde ağır), 5 UTR +22 G A, CD 19 A G Malay, CD 24 T A, CD 26 G A (Hb E), CD 27

HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ 35 G T Knossos, IVS1 6 T C, 3 UTR 47 C G, PolyA AATAAA AACAAA, PolyA AATAAA AATUAA, PolyA AATAAA AATAGA, PolyA AATAAA AATAAC dir. Bazı β talasemi mutasyonları tek allelde bulunduklarında da hafiften ağıra değişen talasemi tablosuna neden olurlar. Bu tip otozomal dominant kalıtılan 30 kadar mutasyon tarif edilmiştir. Mutasyonlar genellikle 3. ekzondadır. Taşıyıcılığın nadir olduğu toplumlarda görülür. Sıklıkla de-novodur. Eritrositlerde alfa ve anormal β çökmesi (inkülizyonlar) vardır (17). Sekonder Modifiye Edici Faktörler: Diğer globin zicirlerini kodlayan genlerdeki defektler bu gruba girer. Talasemide eritrosit yıkımına neden olan en önemli patolojik olay eritositlerin içinde α globin zincirlerinin yığılmasıdır. Bu nedenle α gen delesyonlarında α globin sentezi azalacağı için klinik tablo hafifler. α gen delesyonunun bulunduğu, α-/αα, - - /αα, α- /α-, α- /- - genotipleri β talasemi ile bulunduklarında klinik tabloyu hafifletir. Triplikasyon veya quadriplikasyonları (ααα, αααα) klinik tabloyu ağırlaştırır. HbF nin yüksekliği klinik tabloyu hafifleten bir diğer nedendir. β ve δ genlerinin total delesyonunda HbF yüksekliği vardır ve klinik tablo daha iyidir. β talasemi gen bölgesinde bulunan Gγ genindeki -158 C>T (Xmn1-Gγ) polimorfizmi hematopoetik stresde HbF sentezini arttırır. Ayrıca 6q, Xp, 8q de γ sentezi ilgili lokusların HbF düzeyini etkileyerek fenotipi değiştirdikleri ortaya konmuştur (12,17,18). Tersiyer Modifiye Edici Faktörler: Osteoporoz talaseminin komplikasyonlarındandır. Kemik metabolizmasında görev alan VDR, ESR, Kollagen genlerindeki varyasyonlar osteoporozun gelişmesini etkiler (19,20,21). Artmış demir yükü talasemide patolojik bulguların ve organ yetmezliklerinin gelişmesinde en önemli faktördür. Demir metabolizmasında rol oynayan, HFE geni, C282Y ve H63D genlerindeki polimorfizmlerin fenotipi etkilediği gösterilmiştir (22-24). Bilirubin metabolizması genlerindeki polimorfizmler (Örnek: UGT1 geni (TA)7 polimorfizmi) ve immun sistem genlerindeki (HLA, TNF, ICAM gibi) polimorfizmlerin de talasemili hastalarda morbidite ve mortaliteyi etkilediği gösterilmiştir (25,26). TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ ALFA TALASEMİDE GENETİK Alfa talasemi, globinin α zincirlerini kodlayan genlerdeki delesyonlar veya diğer tipteki mutasyonlar sonucu zincirin yetersiz sentezi sonucu meydana gelir. α globin zincirleri her iki 16. kromozom üzerinde bulunan 2 şer genden (α1 ve α2), toplam 4 gen tarafından kodlanır ve normal genotip, αα/ αα olarak yazılır (Şekil 3). Bu genlerdeki moleküler defektler sonucu α Talasemi taşıyıcılığı, HbH hastalığı (β4) ve Hb Bart s (γ4) hidrops fetalis tabloları gelişir. Bu klinik tabloların prevalansı Güney Asya, Uzak Doğu, Ortadoğu, Sahra altı Afrika ve Hindistan da yüksektir (27). Alfa talasemi de taşıyıcılar ve hastalar moleküler defektin durumuna göre düşük Hb, MCV, MCH gösterirler eritrosit sayısı yüksektir. HbA2 normal veya hafifçe azalmış olabilir. Elektroforez ile tanı konulmaz, moleküler genetik analiz tanıda önemlidir. Demir eksikliği anemisi ile karışabilir. Demir tedavisi hastalara zararlı olabilir (1). Alfa talasemide Mendel kalıtımı biraz daha karmaşıktır, birden fazla taşıyıcı türü vardır, genotiplere göre fenotipler Tablo 2 de gösterilmiştir.

36 2014:4 1 Şekil 3. Alfa talasemide genotiplere göre fenotipler Tablo 2. Alfa talasemide genotiplere göre fenotipler Genlerde delesyon olabildiği gibi, geni inaktive eden bir nokta mutasyonu da olabilir. Ebeveynlerden biri α- /αα, diğeri - - /αα ise ve her iki ebeveyn de talasemi kromozomlarını çocuğa verirse, çocuk - - /α - olacaktır. Bunun sonucunda β4 teramerleri tayin edilebilir düzeylerde olacak ve HbH hastalığı ortaya çıkacaktır. Bu kişilerde ortadan ağır düzeylere (Hb: 2,6-13,3 g/dl) kadar değişen anemi vardır letal değildir. HbH düzeyleri (%0,8-40) değişiktir (27,28). HbH hastalığında klinik tablo moleküler defekte bağlıdır. Non-delesyonel tipte defekt olanlarda, delesyonlu hastalara göre daha ağır klinik tablo görülür (29,30). Genlerin hiçbirisinin çalışmadığı durumda Bart s Hidrops fetalis sendromu görülür. Bu olgularda hemoglobinin çoğunu fizyolojik olarak non-fonksiyonel γ4 ve β4 homotetramerleri oluşturur. Ayrıca bu fetuslarda fonksiyon gören, oksijen taşıyan tek hemoglobin olarak, değişen düzeylerde Hb Portland (ζ2γ2) vardır. Bu hemoglobin sayesinde fetal yaşamlarını sürdürürler. Düzenleyici bölge - MCS (multispecies conserved sequences) mutasyonları da genler sağlam olduğu halde zincir sentezini bozarak α talasemiye neden olabilir (27).

HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ 37 HBS HASTALIĞI ve GENETİK Orak hücreli anemide globin zincirinde kalitatif (yapısal) bozukluk vardır. Globinde 6. pozisyondaki hidrofilik amino asit glutamik asit, hidrofobik amino asit olan valine değişmiştir (CTC>CAC). Ortaya çıkan hemoglobin, HbS adını alır ve elektroforezde farklı hareket eder. Taşıyıcıda, HbA2 ve F normaldir. Homozigot olanlarda, ateş, enfeksiyon, dehidratasyon ve oksijensiz ortamda eritrositlerde oraklaşma meydana gelir ve bu durum kanın normal akışını engeller (Oraklaşma Krizi). Klinik tablo talasemilerden farklıdır. Hastalarda vazooklüziv krizler, hemolitik krizler, dalakta sekestrasyon krizleri, aplastik krizler görülür. HbS homozigot veya diğer hemoglobinopatiler ile bileşik heterozigotluk (HbS/HbC, HbS/β talasemi) durumunda olabilir. Homozigotlarda genellikle hastalık tablosu daha ağırdır. Son yıllarda HbS hastalarında klinik tabloyu modifiye eden genetik faktörlerden sıkça söz edilmektedir (31). Bunlarda en önemlisi HbF üretimini etkileyen genetik faktörler ve eşlik eden α talasemi tablosudur (32). HbF yüksekliğinin ağrılı krizleri, bacak ülserlerini azalttığı ve yaşamı uzattığı ile ilgili kuvvetli bulgular olduğu bildirilmektedir. HbS allelinin, γ genini sağlam bırakıp diğer β genlerini delesyona uğratan β talasemi alleli ile bileşik heterozigot durumda olması çok hafif klinik bulgulara sebep olmaktadır. Çünkü bu durumda HbF fazla üretilmektedir. HbF in fazla üretimine yol açan, HPFH yapan, γ gen mutasyonları veya γ genini aktive eden ilişkili genlerdeki mutasyonlar klinik tabloyu hafifletmektedir (31). Son yıllarda tüm genomu araştıran çalışmalar 11. kromozomda ve genomun başka bölgelerinde β genleri fonksiyonlarını etkileyen ve HbF düzeylerinde değişikliğe neden olan çok sayıda gen göstermektedir (33-35). HbS hastalığında klinik tabloyu modifiye eden bir başka genetik faktör α talasemi varlığıdır. Hastalarda aynı zamanda α talasemi var ise HbS nin hücre içi kosantrasyonu düşmekte ve hücre hasarı azalmakta ve hemoliz düzelmektedir (36). Buna bağlı olarak bacak ülserleri, inme, priapizm gibi bazı semptomların azaldığının gösterildiği bildirilmektedir (31). Homozigot Hb S-α talasemi birlikteliğinde, hastalarda hematolojik bulgular örneğin anemi düzelir, ancak ağrılı krizlere etkisi çok önemli değildir. S/β talasemide β globin geninde, bir allelde β talasemi diğer allelde orak hüre anemisi mutasyonu olanlarda orak hücre semptomları genellikle ön planda olabilir. Βu mutasyonunun tipine ve diğer modifiye edici genetik faktörlere göre klinik tablo hafiften ağıra değişir. TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ DİĞER BAZI YAPISAL HEMOGLOBİNOPATİLER VE GENETİK HbC Beta globin geninde kodon 6 da glutamik asit lizine değişir. Homozigotlarda erişkinde ortaya çıkan hafif anemi vardır. HbC/β talasemi bileşik heterozigotluğunda klinik tablo değişkendir. β 0 alleli taşıyanlarda ve HbA2 düşük olanlarda klinik tablonun daha ciddi olduğu bildirilmektedir (39). HbS/HbC: Orak hücre anemisi tablosuna yakın tablo verir. Daha hafiftir fakat taşıyıcılıktan daha ağırdır.

38 2014:4 1 HbD Punjab (Hb Los Angeles) HbD de β globin geninde kodon 121 GAA ->CAA değişimi vardır. Hindistan ve Pakistan da en sık mutasyondur. Glutamik asit, glutamine değişir. Homozigotlarda çok hafif bulgular olabilir. β talasemi alleleri ile bileşik heterozigotluk durumunda genellikle hafif anemi vardır (37). HbS ile birlikte ise orak homozigot HbS hastalığı benzeri ağır tablo görülebilir (38). HbE Beta globin kodon 26 da glutamik asit lizine (GAG->AAG) değişir. Mutasyon kodon 25-27 de alternatif yapışma bölgesi oluşturarak zincirin ekspresyonunu etkilediğinden talasemi tablosu verir. Uzakdoğu Asya da sıktır. Homozigotlarda hafif talasemi tablosu görülür iken β talasemi alleleri ile orta veya ağır derecede talasemi tablosu görülür (40). HbS ile bileşik heterozigotluğu (HbS/HbE), orak hücreli anemi tablosuna daha yakın semptomlar görülür. Tablo S/β tablosuna benzer (41). HEMOGLOBİNOPATİLERDE MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ Hemoglobinopatilerde, hastalarda ve taşıyıcılarda mutasyonların tayini için moleküler analiz teknikleri uygulanmadan önce hematolojik parametreler ve hemoglobin elektroforezi sonuçları değerlendirilmelidir. Bu çalışmalar DNA analizinde hedef gen veya gen bölgesini belirlemede ve seçilecek moleküler analiz yöntemini belirlemede en önemli adımdır. Hasta veya taşıyıcılardaki hematolojik parametrelerin ve elektroforez sonuçlarının durumuna göre moleküler tanıda uygulanacak yöntemlerin seçimi yapılır. Bu yöntemlerin çoğu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) nunun kullanıldığı tekniklerdir (26). Hemoglobinopatilerin moleküler genetik tanısını yapan laboratuvarlar, ülkelerinin koşullarını, ülkelerinde sık görülen hemoglobin bozukluklarının genetik özelliklerini, kendi laboratuvarlarındaki özel koşulları ve yöntemi uygulamadaki deneyimlerini göz önünde bulundurarak tanıda yol haritalarını belirlemelidir. Teknolojideki gelişmeler, yeni, hızlı ve yüksek doğrulukta moleküler genetik analiz yöntemlerinin keşfine ve hemoglobin bozukluklarının tanısında da yeni uygulamalara yol açmaktadır (42,43). Hemoglobinopatilerin moleküler genetik tanısında kullanılan yöntemler geleneksel olarak iki gruba ayrılmaktadır (27): 1. Direkt mutasyon tayini yapan yöntemler: Doğrudan özgün mutasyonun olup olmadığını gösterirler. Nokta mutasyonları için Allel Spesifik Olgonükleotid Hibridizasyon (ASO), Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS), dizi analizi gibi yöntemler, delesyonlar için de gap-pcr yöntemi bu gruba giren örneklerdir. 2. İndirekt yöntemler: Belirli bir gen veya gen bölgesini, dizi değişikliği olup olmadığının anlaşılması için, tarayan yöntemlerdir. Denature edici Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) ve Denature edici Yüksek Performanslı Likid Kromatografi (DHPLC) yöntemleri bu gruba girer. Bu yöntemlerle mutasyonun yerinin saptanmasından sonra dizi analizi ile özgün değişikliğin ortaya konulması gerekir.

HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ 39 Otomatize ve hızlı uygulanabilen dizi analizi yöntemleri nokta mutasyonlarının daha sık olarak görüldüğü küçük genler (β globin geni gibi) için rutin uygulanabilecek teknikler arasında sayılmakta ise de, delesyonların olduğu gen ve gen bölgeleri için uygun değidir. Bu bölgeler için Southern-blot, gap- PCR gibi yöntemler halen geçerlidir. Bu yöntemlerin dışında son yıllarda Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA), Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF), Real-time PCR, Melting Curve Analysis (MCA) gibi yöntemler hızla kullanıma girmektedir (27). Hemoglobin bozukluklarında tanıda en sık kullanılan yöntemler ve ana prensipleri aşağıda kısaca özetlenmiştir: Allel Spesifik Olgonükleotid Hibridizasyon (ASO) Bu yöntem hedef dizi ile, birisi mutasyonlu diğeri de normal dizi için hazırlanmış olan iki oligonükleotid probunun hibridizasyonuna dayanır. Tanıda ilk kullanılan yöntemlerdendir (44). Yöntemde, belli mutasyonların sık olarak gözlendiği toplumlarda dot blot veya reverse dot blot şeklinde uygulama ile homozigot, heterozigot ve normal genotipe sahip olanlar kolayca saptanabilir. Ticari olarak üretilen, reverse dot blot yönteminin kullanıldığı kitler ile toplumlarda sık rastlanılan mutasyonların multipleks PCR ile çoğaltılan DNA da kolayca tanımlanmasını mümkün hale gelmiştir (45). Bu yöntemde normal ve mutasyonlu problar membrana emdirilmiştir. Genomik DNA ile hibridizasyon sonucunda normal ve mutant paralel bantlar değerlendirilerek tanı konur. Ülkemizde rastlanılan alfa globin ve beta globin mutasyonlarının büyük kısmını (%90-95 oranında) kapsayan ticari kitler bulunmaktadır (Viennalab StripAssay) (Şekil 4). Bu klasik metodun prensiplerine dayanan micro-array teknolojisinin kullanıldığı tanı yöntemleri de uygulanmaktadır (46). Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS) Bu yöntemde tanı konulması istenen DNA dizisi ile tam uyum gösteren primer ile yapılan PCR reaksiyonunda başarılı olur iken, 3 ucunda dizi ile uyum göstermeyen primer ile PCR reaksiyonunun başarılı olmamasına dayanır. ARMS yöntemi için çok sayıda farklı primerler düzenlenmiştir. Bu yöntem en çok kullanılan yöntemlerden birisidir (47). Bilinen mutasyonların tanısında hızlı ve pratik bir test olmasına karşın her primer için ayrı standardizasyon gerektirir ve test koşulları iyi standardize edilemediği zaman yalancı pozitif ve yalancı negatif sonuçlar gözlenebilir. Gap-PCR Delesyon tipinde mutasyonları tayin etmede ideal yöntemlerdendir. Tam olarak sınırları bilinen delesyon şeklindeki mutasyonların saptanmasında kullanılır. Delesyonun olduğu DNA bölgesinde 5 ve 3 bölgelerinde bir kısım dizi uyan primerlerle bölge çoğaltılır. Çoğalan delesyonlu DNA bölgesindeki diziler normal ile kıyaslandığında daha küçüktür (3,42). Beta talasemiye neden olabilen nadir görülen β geni delesyonları, alfa talasemiye neden olan α genlerindeki delesyonlar, δ-β talasemiler, Hb Lepore tanısında kullanımı kolay ve ucuz bir yöntemdir (48). Allel drop-out oluşmasına yatkın bir yöntemdir (42). TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ

40 2014:4 1 Şekil 4. Beta talaseminin moleküler tanısında kullanılan Strip Assay. Test ile saptanabilen mutasyonlu ve normal allelleri gösteren bantlar DNA Dizi Analizi Moleküler tanı koymada en güvenilir yöntemlerdendir. Daha çok nokta mutasyonlarının sık görüldüğü ve mutasyon dağılımı geniş olan toplumlarda β globin geni analizi için bazı laboratuvarlarda ilk yöntem olarak kullanılmaktadır. Ayrıca birçok laboratuvarda, diğer ucuz ve pratik tanı yöntemleri ile gösterilemeyen mutasyonları saptamak için uygulanmaktadır. Örneklerin hazırlanması ve sonuçların okunması özel beceri gerektirir. Dizi analizinde heterozigotların saptanmasında dikkatli bir gözle analiz yapılmalıdır. Delesyonların, özellikle büyük delesyonların bulunduğu, α talasemi gibi, hemoglobin bozuklukları için uygun değildir. Denature Edici Yüksek Performanslı Likid Kromatografi (DHPLC) Yöntemleri ve Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) PCR ürününde bilinmeyen mutasyonların olduğu bölgeleri saptamada kullanılan yöntemlerdir. Her iki yöntem de jel üzerinde mutant ve normal allelin farklı hareket etmesi prensibine dayanır. Elde edilen sonuçlara göre mutasyonun saptanmasında başlıca dizi analizi olmak üzere bir diğer yönteme gereksinim vardır. DHPLC metodu hem bilinen hem de bilinmeyen β geni mutasyonlarını saptamada güvenilir ve yüksek duyarlılıkta, nispeten ucuz bir tekniktir (3,42).

HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ 41 Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF) Kısa ekzonik dizilerin multipleks PCR ile çoğaltılmasına dayanan yarı kantitatif bir yöntemdir. Özellikle gen içindeki delesyon ve duplikasyonların saptanmasını sağlar (49). Real-Time PCR Günümüzde PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlayan cihazların gelişimi ve flöresan ışıma tekniklerinin kullanılması ile gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerde ölçmek ve devam eden PCR reaksiyonuna gerçek zamanlı (real time olarak) müdahale etmek mümkün olmuştur. Bu teknoloji flöresan kantitatif RT-PCR, kantitatif kinetik PCR gibi çeşitli adlarla da isimlendirilmektedir. Hedef DNA dizisini hem çoğaltan hem de kantifiye eden bir laboratuvar yöntemidir. Hemoglobinopatilerin tanısında pratik ve güvenli bir teknik olarak rutin uygulamaya hızla girmektedir (50,51). Normal alleli ve mutasyonlu alleli gösterecek problar farklı erime dereceleri gösterecek şekilde düzenlenir. Tek nükleotid mutasyonlarında elde edilen normal ve mutant alleli gösteren eğriler arasında genellikle 5-10 derecelik bir farklılık olur. Böylece mutant ve normal alleller kolaylıkla ayırt edilebilir (Şekil 5). TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ Şekil 5. Beta talasemide IVS 1-110 mutasyonu için yapılan RT-PCR sonucu: Normal allel 620 de, mutant allel 560 de pik göstermektedir Preimplantasyon genetik tanıda tek hücrede RT-PCR kullanılarak talasemi mutasyonlarının başarıyla saptanabildiği ve güvenle kullanılabileceğini gösteren çalışmalar vardır (52,53). Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA) Delesyon tipinde mutasyonları saptamada Southern blot, FISH ve gap-pcr gibi zaman alıcı ve zor tekniklerin yerini almaktadır. Son yıllarda hızla rutin

42 2014:4 1 kullanıma girmiş olan ucuz ve pratik bir yöntemdir. Hedef bölgedeki kopya sayısı değişikliklerini saptama esasına dayanır. Hedef bölgeye çok sayıda probun hibridize edildikten sonra, bu hibridize edilen probların universal -tag PCR probları kullanılarak kantitatfif PCR ile çoğaltılmasına ve elde edilen fragmentlerin özel bilgisayar programları kullnılarak analiz edilmesine dayanır (54). α ve β gen bölgelerini kapsayan MLPA ticari kitleri üretilmiştir (MRC-Holland and ServiceXS). Yeni Nesil Dizi Analizi Son yıllarda çok sayıda geni bir arada, tüm ekzonları veya tüm genomu dizileyebilen cihazlar geliştirilmiştir. Yakın gelecekte tüm globin genlerini, modifiye edici genleri bir arada dizileyerek daha ayrıntılı genomik bilgiye ulaşmak, fenotip için daha doğru öngörüde bulunmak mümkün hale gelecektir. Sonuç olarak, hemoglobinopatilerin moleküler genetik tanısıda kullanılan bir çok yöntem geliştirilmiş ve geliştirilmektedir. Bazen tanıda yukarıda sayılan yöntemlerden birden fazlasının kullanılması gerekebilir. Tanıda kullanılacak yöntemin/yöntemlerin saptanmasında analiz yapılacak hasta veya taşıyıcılarda fenotipik bulguların ve hematolojik parametreler ile hemoglobin elektroforezi sonuçlarının iyi değerledirilmesinin yanısıra toplumda sık rastlanılan mutasyonların ve her laboratuvarın özel koşullarının da dikkate alınması gerekir. Kaynaklar 1. Muncie HL Jr, Campbell J. Alpha and beta thalassemia. Am Fam Physician. 2009;80:339-344. 2. J. M. Old. Screening and genetic diagnosis of haemoglobin disorders. Scand J Clin Lab Invest. 2007;67:71-86. 3. Clark BE, Thein SL. Molecular diagnosis of haemoglobin disorders. Clin Lab Haem. 2004;26:159-176. 4. Weatherall DJ. The Thalassemias. In: Williams Hematology, edited by Ernest Beutler, et al. 5th ed. New York: McGraw-Hill, 1995. 5. Galanello R, Origa R. Beta-thalassemia. Orphanet J Rare Dis. 2010;5:11. 6. Birgens H, Ljung R. The thalassemia syndromes. Scan J Clin Lab Invest. 2007;67:11-26. 7. Mosca A, Paleari R, Leone D, Ivaldi G. The relevance of hemoglobin F measurement in the diagnosis of thalassemias and related hemoglobinopathies. Clin Biochem. 2009;42:1797-801. 8. Forget BG. Molecular basis of hereditary persistence of fetalhemoglobin. Ann N Y Acad Sci. 1998;850:38-44. 9. Thein SL, Wood WG. The molecular basis of β thalassemia,δβ thalassemia and hereditary persistence of fetal hemoglobin. In: Steinberg MH, Forget BG, Higgs DR, Weatherall DJ, eds. Disordersof hemoglobin, 2nd edn. Cambridge: Cambridge University Press,2009: 323 56. 10. Weatherall DJ, Clegg JB. The thalassaemia syndromes.blackwell Scientific Publications, Oxford, 2001. 11. Tadmouri GO, Tüzmen S, Özçelik H, et al. Molecular and population genetic analyses of beta-thalassemia in Turkey. Am J Hematol. 1998;57:215-220. 12. Weatherall DJ. Phenotype-genotype relationships in monogenic disease: lessons from the thalassaemias. Nat Rev Genet. 2001;2:245-255. 13. Cao A, Galanello R. Beta-thalassemia. Genet Med. 2010;12:61-76.

HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ 43 14. Thein SL.Genetic modifiers of the beta-haemoglobinopathies. Br J Haematol. 2008;141:357-366. 15. Gallienne AE, Dréau HM, McCarthy J, et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification identification of 17 different beta-globin gene deletions (including four novel mutations) in the UK population. Hemoglobin. 2009;33:406-416. 16. Lee ST, Yoo EH, Kim JY, Kim JW, Ki CS. Multiplex ligation-dependent probe amplification screening of isolated increased HbF levels revealed three cases of novel rearrangements/deletions in the beta-globin gene cluster. Br J Haematol. 2010;148:154-160. 17. Thein SL. The molecular basis of β-thalassemia Cold Spring Harb Perspect Med. 2013;1:3. 18. Rund D, Fucharoen S. Genetic modifiers in hemoglobinopathies.curr Mol Med. 2008;8:600-608. 19. Ferrara M, Matarese SM, Francese M, et al. Effect of VDR polymorphisms on growth and bone mineral density in homozygous beta thalassaemia. Br J Haematol. 2002;117:436-440. 20. Origa R, Fiumana E, Gamberini MR, et al. Osteoporosis in beta-thalassemia: Clinical and genetic aspects. Ann N Y Acad Sci. 2005;1054:451-456. 21. Wonke B, Jensen C, Hanslip JJ, et al. Genetic and acquired predisposing factors and treatment of osteoporosis in thalassaemia major. J Pediatr Endocrinol Metab. 1998;11(Suppl 3):795-801. 22. Martins R, Picanço I, Fonseca A, et al. The role of HFE mutations on iron metabolism in beta-thalassemia carriers. J Hum Genet. 2004;49:651-655. 23. Andreani M, Radio FC, Testi M, et al. Association of hepcidin promoter c.-582 A>G variant and iron overload in thalassemia major. Haematologica. 2009;94:1293-1296. 24. Sampietro M, Lupica L, Perrero L, et al. The expression of uridine diphosphate glucuronosyltransferase gene is a major determinant of bilirubin level in heterozygous beta-thalassaemia and in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br J Haematol. 1997;99:437-439. 25. Giovannoni L.TNFA locus is associated with beta degrees 39 thalassemia in Corsica and Sardinia. Eur Cytokine Netw. 2008;19:196-203. 26. Old JM. Screening and genetic diagnosis of haemoglobinopathies. Scand J Clin Lab Invest. 2007;67:71-86. 27. Harteveld CL, Higgs DR. Alpha-thalassaemia. Orphanet J Rare Dis. 2010;5:13. 28. Ribeiro DM, Sonati MF. Regulation of human alpha-globin gene expression and alpha-thalassemia. Genet Mol Res. 2008;7:1045-1053. 29. Fucharoen S, Thonglairuam V, Winichagoon P. Hematologic changes in alphathalassemia. Am J Clin Pathol. 1988;90:193-196. 30. Durmaz AA, Akın H, Ekmekçi AY, et al. Severe alpha thalassemia case compound heterozygous for Hb Adana in alpha1 gene and 20.5 kb double gene deletion. J Pediatr Hematol Oncol. 2009;31:592-594. 31. Steinberg MH, Sebastiani P. Genetic modifiers of sickle cell disease.am J Hematol. 2012;87:795-803. 32. Driss A, Asare KO, Hibbert JM, Gee BE, Adamkiewicz TV, Stiles JK. Sickle cell disease in the post genomicera: A monogenic disease with a polygenic phenotype. Genomics Insights. 2009;2009:23-48. 33. Solovieff N, Milton JN, Hartley SW, et al. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia:genome-wide association studies suggest a regulatory region in the 5 olfactory receptor gene cluster. Blood. 2010;115:1815-1822. TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ

44 2014:4 1 34. Farrell JJ, Sherva RM, Chen ZY, et al. A 3-bp deletion in the HBS1L-MYBintergenic region on chromosome 6q23 is associated with HbF expression.blood. 2011;117:4935-4945. 35. Makani J, Menzel S, Nkya S, et al. Genetics of fetal hemoglobin in Tanzanian and British patients with sickle cell anemia. Blood. 2011;117:1390-1392. 36. Steinberg MH, Embury SH. Alpha-thalassemia in blacks: Genetic and clinical aspects and interactions with the sickle hemoglobin gene. Blood. 1986;68:985-990. 37. Rahimi Z, Akramipour R, Korani S, Nagel RL. Hb D-Punjab [beta 121 (GH4) Glu-->Gln]/ beta0-thalassemia [IVSII.1(G-->A)] in two cases from an Iranian family: first report. Am J Hematol. 2006;81:302-303. 38. Kelleher JF Jr, Park JOK. Life-threatening complications in a child with hemoglobin SD- Los Angeles disease. Hemoglobin. 1984;8:203-213. 39. Weatherall DJ, Clegg JB. The band db thalassemia in association with structural hemoglobin variants. In: The Thalassemia Syndromes, eds DJ Weatherall & JB Clegg. Blackwell Science Ltd, Oxford. 2001;p. 415-419. 40. Fucharoen S, Weatherall DJ. The hemoglobin E thalassemias. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012;2:8. 41. Vichinsky E. Hemoglobin E syndromes. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:79-83. 42. Harteveld CL, Kleanthous M, Traeger-Synodinos J. Prenatal diagnosis of hemoglobin disorders: present and future strategies. Biochem. 2009;42:1767-1779. 43. Kutlar F. Diagnostic approach to hemoglobinopathies. Hemoglobin. 2007;31:243-250 44. Saiki RK, Walsh PS, Levenson CH, Erlich HA. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc Natl Acad Sci USA. 1989;86:6230-6234. 45. Gold B. Origin and utility of the reverse dot-blot. Expert Rev Mol Diagn. 2003;3:143-152. 46. Cremonesi L, Ferrari M, Giordano PC, et al. An overview of current microarray-based human globin gene mutation detection methods. Hemoglobin. 2007;31:289-311. 47. Old JM, Varawalla NY, Weatherall DJ. Rapid detection and prenatal diagnosis of b-thalassaemia: studies in Indian and Cypriot populations in the UK. Lancet 1990;336; 834-837. 48. Tan AS, Quah TC, Low PS, Chong SS. A rapid and reliable 7-deletion multiplex polymerase chain reaction for alpha-thalassemia. Blood. 2001;98;250-251. 49. Rose C, Rossignol J, Lambilliotte A, Depret S, Le Metayer N, Pissard S. A novel (epsilongammadeltabeta)(o)-thalassemia deletion associated with an alpha globin gene triplication leading to a severe transfusion dependent fetal thalassemic syndrome. Haematologica. 2009;94:593-594. 50. Liu JZ, Yan M, Wang LR,et al. Molecular prenatal diagnosis of alpha-thalassemia using real-time and multiplex polymerase chain reaction methods. Hemoglobin. 2008;32:553-560. 51. Maciag M, Płochocka D, Adamowicz-Salach A, et al. Diversity of thalassemia variants in Poland - screening by real-time PCR. Acta Haematol. 2008;120:153-157. 52. Traeger-Synodinos J, Vrettou C, Kanavakis E. Rapid detection of fetal Mendelian disorders: thalassemia and sickle cell syndromes. Methods Mol Biol. 2008;444:133-145. 53. Durmaz B, Özkınay F, Onay H, et al. Genotyping of β-globin gene mutations in single lymphocytes: a preliminary study for preimplantation genetic diagnosis of monogenic disorders.hemoglobin. 2012;36:230-243. 54. Harteveld CL, Voskamp A, Phylipsen M, et al. Nine unknown rearrangements in 16p13.3 and 11p15.4 causing alpha- and beta-thalassaemia characterised by high resolution multiplex ligation-dependent probe amplification. J Med Genet. 2005;42:922-931.