Kalıtsal hemolitik anemilere sistematik yaklaşım ve ayırıcı tanıda yeni nesil dizi analizinin kullanımı

Transkript

1 Kalıtsal hemolitik anemilere sistematik yaklaşım ve ayırıcı tanıda yeni nesil dizi analizinin kullanımı Dr. Yeşim Aydınok

2 Kalıtsal Hemolitik Anemiler Aile öyküsü Fizik Bakı Hematolojik İncelemeler Moleküler Genetik Tanı Anemi Splenektomi Kolelithiazis Kolesistektomi Anemi Subikter Splenomegali Retikulosit Haptoglobin Laktik dehidrogenaz İndirek bilirubin Hemogram RBC indeksleri Periferik yayma

3 Kalıtsal Hemolitik Anemiler Hemoglobinopatiler Talasemiler (α,β,δβ Talasemi) Varyant Hemoglobinler (S,E,D,C,OArab,Lepore) Anstabil Hemoglobinler Eritrosit enzim bozuklukları Embden-Meyerhof yolu (Aldolaz, PFK, PGK, GPI, HK, PK, TPI) Hekzos monofosfat şant ve Glutatyon metabolizması (G6PD, GR, GS) Nükleotid metabolizması (ADA, AK, P5 N) Eritrosit membran bozuklukları Yapısal bozukluklar; HS, HE, HPP, SAO RBC membran permeabilite değişikliği; HSt (OHSthidrositoz, DHSt-xerositoz, CHS,FS) PFK; Fosfofruktokinaz, PGK; Fosfogliseratkinaz, GPI; Glukozofosfatizomeraz, HK; Hekzokinaz, PK; Pirüvatkinaz, TPI; Triosofosfatizomeraz, G6PD; Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GR; glutatyon redüktaz, GS; glutatyon sentetaz, ADA; adenozin deaminaz, AK; Adenilat kinaz, P5 N; Primidin 5 nükleotidaz, HS; herediter sferositoz, HE; herediter eliptositoz, HPP; herediter piropoikilositoz,hst; herediter stomatositoz, OHSt; overhydrated stomatositoz, DHSt; dehydrated stomatositoz, CHS; kriyohidrositoz, FS; familial pseudo hiperkalemi

4 Hemoglobinopatilerin genetik temeli HbA : a 2 b 2 HbA 2 : a 2 d 2 HbF : a 2 g 2 HbE2 : a 2 e 2 βhs=upstream regulatory element. β-lcr=β-locus control region HbE1 : z 2 e 2 Harteveld CL and Higgs DR. Orphanet J Rare Dis 2010;5:13, Galanello and Origa. Orphanet J Rare Dis. 2010, 5:11 26

5 Alfa ve Beta Talasemide Genotip - Fenotip Chromosome 11 Beta Talasemi β/β = Normal β/β T = Taşıyıcı β/β DT =Talasemi İntermedya β T /β T =Talasemi İntermedya β T /β T =Talasemi Major Alfa Talasemi αα/αα= Normal α-/αα = α + taşıyıcı α-/α- veya -- /αα = α 0 taşıyıcı -- /-α = Delesyonel HbH (β4) --/α T α = Non-delesyonel HbH (β4) -- /-- = Hb Barts (g4) Anormal Hemoglobinler; >1500 DNA varyantı, yapısal protein varyantları oluşturur Orak hücre sendromları HbS/S, HbS/β T, HbS/C, HbS/D, HbS/O-Arab, HbS/HbLepore, HbS/E J Traeger-Synodinos et al.ejhg, 2015

6 Hemoglobinopatilerde tanısal yaklaşım Hemogram Periferik kan yayması ve retikulosit Hemoglobin fraksiyonlarının analitik ölçümü Hemoglobin elektroforez: Alkali selüloz asetat Asidik sitrat agar Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) Kapiller elektroforez (CE) İzoelektrik odaklanma (IF) HPLC veya CE ile tanınamaz: α-talasemi taşıyıcılığı Anstabil hemoglobinler (OD) Heinz body hemolitik anemiler İsopropanol presipitasyon Isı stabilite testi (50 0 C, 1-2 h) J Traeger-Synodinos et al.ejhg, 2015

7 Hastalık b- Talasemi Major b- Talasemi Intermedia Delesyonel HbH Non-delesyonel HbH Başlangıç 3-9. aylar 2-4 yaş >4 yaş 0-3 ay Fizik Bakı Solukluk, skleralarda subikter, splenomegali Hb<7 g/dl Hb 8-10 g/dl Hb 9-12 g/dl Hb<7 g/dl RBC, MCV ve MCH azalmış, RDW artmış, Retikulosit>%8 Hemogram HPLC / CE HbF>%50, HbA 2 <%3.5 HbF %10-50 (%100) HbA 2 >% 3.5 HbH (0.8 40%) HbA 2 Ebeveynler Her ikisi HbA 2 % Bir veya her ikisi atipik taşıyıcı Her ikisi MCV/MCH MCV/MCH / sınır MCV/MCH HPLC normal

8 Şiddet skalası Alfa ve Beta Talasemide Fenotip-Genotip Normal Talasemi intermedia Talasemi major Genotip Β N / β N β-talasemi Trait (2.belirleyici) β N / β T ααα/αα Homozigot β-talasemi (2. belirleyici) Β N / β D β ++ / β + + α-/αβ 0 / β + + HbH Klasik NTD β-talasemi Transfüzyon bağımlı β-talasemi β ++ / β + β ++ / β 0 β +/ β 0 Genotip αα/αα Sessiz HbH --/-α + β thal Klasik HbH --/-α Non-delesyonel HbH --/α T α Transfüzyon bağımlı HbH --/α T α α T α/α T α HbH hidrops --/α T α α T α/α T α Normal Asemptomatik Talasemi intermedia Talasemi major Hydrops

9 β-gen kümesi dışında sekonder belirleyiciler 6. kromozom HBS1L-MYB rs (A>C) HBS1L-MYB rs (T>C) 2. kromozom KLF1 sekans analizi g.-158 (C>T) BCL11A rs (G>T) BCL11A rs (A>G) Swee Lay Thein Hematology 2013:

10 Hemoglobinopati Tanısında Moleküler Testler Hematolojik verilerin klinikle uyumsuz kaldığı kompleks durumları doğrulukla tanımlamada ve çoklu transfüzyon almış olguların tanısında moleküler testlere gereksinim vardır. Chromosome 11 HBD HBB HBA Mutasyon tipi Moleküler Genetik Yöntem Nokta mutasyon Reverse hybridization ve HBB, HBA, HBD DNA sekans 1 Delesyon Reverse hybridization ve HBB, HBA, HBD MLPA 2 1. DNA sekans; Sanger dizi analizi, 2. MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification

11 Kalıtsal Hemolitik Anemiler Hemoglobinopatiler Talasemiler (α,β,δβ Talasemi) Varyant Hemoglobinler (S,E,D,C,OArab,Lepore) Unstabil Hemoglobinler Eritrosit membran bozuklukları Yapısal bozukluklar; HS, HE, HPP, SAO RBC membran permeabilite değişikliği; HSt (OHSthidrositoz, DHSt-xerositoz, CHS,FS) Eritrosit enzim bozuklukları Embden-Meyerhof yolu (Aldolaz, PFK, PGK, GPI, HK, PK, TPI) Hekzos monofosfat şant ve Glutatyon metabolizması (G6PD, GR, GS) Nükleotid metabolizması (ADA, AK, P5 N) PFK; Fosfofruktokinaz, PGK; Fosfogliseratkinaz, GPI; Glukozofosfatizomeraz, HK; Hekzokinaz, PK; Pirüvatkinaz, TPI; Triosofosfatizomeraz, G6PD; Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GR; glutatyon redüktaz, GS; glutatyon sentetaz, ADA; adenozin deaminaz, AK; Adenilat kinaz, P5 N; Primidin 5 nükleotidaz, HS; herediter sferositoz, HE; herediter eliptositoz, HPP; herediter piropoikilositoz,hst; herediter stomatositoz, OHSt; overhydrated stomatositoz, DHSt; dehydrated stomatositoz, CHS; kriyohidrositoz, FS; familial pseudo hiperkalemi

12 HS Gen Protein Kalıtım HS1 ANK1 Ankyrin AD HS2 SPTB Spectrinβ AD HS3 SPRA1 Spectrinα AR HS4 SLC4A1 Band3 AD HS5 EPB4.2 Band 4.2 AR HE Gen Protein Kalıtım HE1 EPB41 Band 4.1 AD HE2 SPRA1 Spectrinα AD HE3 SPTB Spectrinβ AD HPP SPRA1 Spectrinα AR HSt Gen Protein Kalıtım OHS RHAG Rh type A AD DHS1 PIEZO1 Piezo-type ion channel AD DHS2 KCNN4 Ca-act-K channel pr4 AD FP ABCB6 ATP binding cassette AD CHC SLC4A1 Band 3 AD Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11);

13 Eritrosit membran bozukluklarında tanı Hemolitik anemi, sarılık ve splenomegali İlk basamak incelemeler: Aile öyküsü ve kalıtım şekli Hb, MCV, MCH, MCHC Periferik yayma HS HPP HE SEAO HSt %75 OD %25 OR OR OD OD OD MCV: N MCV: MCV: N MCV: N MCV: artmış Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11); King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):

14 Eritrosit membran bozukluklarında tanı Hemolitik anemi, sarılık ve splenomegali HS HPP HSt MCV N MCHC>34.5 g/dl MCV MCV >90 DHS; MCHC >36 g/dl OHS; MCHC g/dl Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11); King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3): Gallagher PG. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2015

15 Eritrosit membran bozukluklarında tarama testleri % lysis [NaCl] Ozmotik frajilite testi (sensitivite %68) Eosin-5 -maleimide testi (sensitivite %92-93) Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11); King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):

16 Eritrosit membran bozukluklarında Tanı OF EMA HS HPP OHSt DHSt OIHA CDA-II N/ N/ tarama testleri Polyacrylamide gel electrophoresis CDA-II; hafif hemolitik anemi, splenomegali, mikrosferositler ve OF artışı var. Retikulosit HS dan daha düşük. Splenektomiden tam yararlanmaz. Moleküler analiz: SEC23B Hafif olgular (%8-11) tanımlanamayabilir King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3): Bolton-Mags PHB, et.al, British Journal of Haematology, 156, 37 49

17 Eritrosit membran bozukluklarında moleküler genetik tanı Protein (Gen) Kromozom Ekzon (n) Hastalık Alfa spektrin (SPTA1) 1q HS, HE Beta spektrin (SPTB1) 14q HS, HE Ankyrin (ANK1) 8p HS Band 3 (SLCA41) 17q HS, SAO,CHS Protein 4.1 (EPB41) 1p HE Protein 4.2 (EPB42) 15q HS RhAG (RHAG) 6p OHSt PIEZO1 (FAM38A) 16q qter 51 DHSt Glut1 (SLCA2A1) 1p CHS ABCB6 (ABCB6) 2q FP HS;herediter sferositoz, HE; herediter eliptositoz, SAO; güney asya ovalositoz, CHS; kriyohidrositoz, FP; familial pseudohiperkalemi King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):304-25

18 Eritrosit membran bozukluklarında moleküler genetik tanı Aile öyküsünün açık olduğu Fenotipik özellikleri uyumlu Tarama testlerinin kuşku taşımadığı olgular Karmaşık fenotipik özellikleri olan Açık bir genotip/fenotip korelasyonu kurulamayan Genetik danışma veya yönetimi sorunlu olgular

19 Kalıtsal Hemolitik Anemiler Hemoglobinopatiler Talasemiler (α,β,δβ Talasemi) Varyant Hemoglobinler (S,E,D,C,OArab,Lepore) Unstabil Hemoglobinler Eritrosit membran bozuklukları Yapısal bozukluklar; HS, HE, HPP, SAO RBC membran permeabilite değişikliği; HSt (OHSthidrositoz, DHSt-xerositoz, CHS,FS) Eritrosit enzim bozuklukları Embden-Meyerhof yolu (Aldolaz, PFK, PGK, GPI, HK, PK, TPI) Hekzos monofosfat şantı ve Glutatyon metabolizması (G6PD, GR, GS) Nükleotid metabolizması (ADA, AK, P5 N) PFK; Fosfofruktokinaz, PGK; Fosfogliseratkinaz, GPI; Glukozofosfatizomeraz, HK; Hekzokinaz, PK; Pirüvatkinaz, TPI; Triosofosfatizomeraz, G6PD; Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GR; glutatyon redüktaz, GS; glutatyon sentetaz, ADA; adenozin deaminaz, AK; Adenilat kinaz, P5 N; Primidin 5 nükleotidaz, HS; herediter sferositoz, HE; herediter eliptositoz, HPP; herediter piropoikilositoz,hst; herediter stomatositoz, OHSt; overhydrated stomatositoz, DHSt; dehydrated stomatositoz, CHS; kriyohidrositoz, FS; familial pseudo hiperkalemi

20 X-bağlı Normokrom normositer kronik hemolitik anemi Spesifik membran bozukluğu yok OF ve EMA test normal HPLC varyant hemoglobin yok DAT negatif X-bağlı OD Eritrosit enzim HNSHA; bozuklukları Heterojen bir grup bozukluk Tamamen kompanse hemoliz Transfüzyona bağımlı Doğumda fatal anemi Splenomegali/sarılık/kolelithiazis Demiri yükü (NTD olanlar dahil) En sık enzim bozuklukları; G6PD (Akut hemolitik kriz) PK (hafif-şiddetli/nsha) P5 N (orta şidet-tx yok/nsha) Nadir enzim bozuklukları *(nöromuskuler bzk.,mental retard.,myopati) Hexokinaz Glukoz-6-fosfat izomeraz* Fosfofruktokinaz* Aldolaz* Triezofosfat izomeraz* Fosfogliserat kinaz*

21 Eritrosit enzim bozukluklarında tarama testleri Spektrofotometrik yöntemle enzim aktivitesi (IU/Hb) ölçümü rezidüel enzim aktivitesi ve klinik şiddet arasında korelasyon yoktur enzimin invitro stabilitesi lökosit ve trombositlerin örnekten uzaklaştırılması (isosymes) kan transfüzyonu hasta örneğindeki retikulosit sayısı (HK, PK, G6PD ve P5 N de enzim aktivitesi genç eritrositlerde yüksektir) sonucu etkileyebilir (P5 N ve diğer nükleotid metabolizması enzimlerinin saptanmasında basit ve tekrarlanabilir bir tarama yöntemi yoktur.) DNA düzeyinde tanının doğrulanması

22 Yeni nesil dizi analizi (NGS) NGS

23 Hangi yeni nesil dizi analizi? Ekzom Tüm Genom Hedeflenmiş

24 Tüm Genom/Ekzom Dizi Analizi %1.5

25 Genom/Ekzom Hedeflenmiş

26 Hedeflenmiş Yeni Nesil Dizi Analizi Kalıtsal hemolitik anemiler heterojen bir grup hastalıktır. Klinik bulgular çoğu kez ayırt ettirici değildir. Geleneksel testler tanı koymada yetersiz kalabilir. Kompleks genetik yapının Sanger dizi analizi ile taranması zaman ve kaynak kaybıdır Bir çok genin bir arada çalışılması; hızlı analiz, düşük maliyet Yeni bulunan genler kolayca panele dahil edilebilir Elde edilen veri ile başa çıkılabilir Hedef zenginleştirme ile ekzonların yanısıra, splice sites, intron ve regulatör bölgeler kapsanabilir Tanımlanan yeni varyantların patojenitesini değerlendirmek için aile bireyleriyle birlikte çalışılması uygun olur Yeni nesil dizi analizi ile saptanan DNA varyantları Sanger dizi analizi ile doğrulanır

27 A B C D E F H G Hi Seq ve MiSeq illumina Inc., San Diego, CA, USA Thermo Fisher Scientific Ion torrent, S.L., Waltham MA, USA