Hayvan Modelleri Seçiminde Dikkat Edilecek Hususlar M. Ensari Güneli M. Ensari Güneli, Veteriner Hekim, PhD (Tıbbi Farmakoloji) DEÜ Tıp Fakültesi Laboratuvar Hayvanları Bilimi AD, İzmir DEÜ İzmir Biyotıp ve Genom Merkezi & İzmir Uluslarası Biyotıp ve Genom Enstitüsü, İzmir MEG, DEÜ, Ocak 2016
Bu sunum ile şu konuların anlaşılmasına yön vereceğini hedeflenmektedir. Deneysel hayvan araştırmalarında: Maksimum düzeyde, daha fazla bilgi edinilmesini sağlayacak kabul edilebilir hayvan deneyleri planlayabilmek. Taraflılıktan (bias) uzaklaştırmak. Uygun hayvanı/modeli seçmek. Varyasyon kaynaklarını öngörmek. Etik, etkili, ekonomik bir yol izlemek. İstatistikçilerin işini kolaylaştırmak, böylelikle çalışmanın kalitesini daha da artırmak.
Deneysel dizayn ile ilgili TARİH İlk prensiplerin en az 2000 yıl önceye dayandığı bilinmektedir. Hıristiyan ve Yahudi kutsal kitaplarında kontrol gruplarının kullanımı tanımlanmıştır. Old Testament (167-164 BC) Athenaeus kitabında tekrarlama (replication) ve kontrol gruplarını tanımlamıştır. Athenaeus (200-300 AD)
İbn-i Sina (980-1037) Bir deneyin yürütülmesi için 7 kural tanımlamıştır. 1. İlaçlarla ilgili araştırmalarda eş zamanlı olarak birden fazla etkili bağımsız değişkenden kaçınmak, 2. Hasta araştırmalarda eş zamanlı olarak birden fazla etkili bağımsız değişkenden kaçınmak, 3. Kontrol gruplarının kullanımı, 4. Bağımsız değişkenlerdeki değişimlerinin gözlenmesi, 5. Olası ekstra değişkenlerin belirlenmesi, 6. Şansa bağlı yalancı etkilerden kaçınmak için çalışmaların tekrarlanması, 7. İlaçların sadece hayvanlarda değil insanlarda da etkililiğini araştırmak.
John Stuart Mill (1806-1873) Gözlemsel çalışmalar ile deney arasındaki farklılıkları tanımlamışlardır Wilhelm Max Wundt (1832-1920)
Randomizasyon Randomizasyon deneysel araştırmalarda en önemli tekniklerden biridir. Sadece bilinen değişkenleri değil bilinmeyen ekstra değişkenleri de kontrol altına almayı sağlar İstatistikçi Sir Ronald Aylmer Fisher (1890-1962) randomizasyon terimini gerçek anlamda ilk kullanan kişi olarak tahmin edilmektedir.
ARAŞTIRMA: Az bilineni ya da bilinmeyeni tam bilinen yapma çabasıdır. Sağlık alanındaki araştırmalarda amaç; sağlıklı organizmayı ve hastalığı anlayabilmek, korumak veya tedavi için güvenli ve etkili yollar üretebilmektir. Sağlık alanında Araştırma Deneysel araştırmalar Hücre kültürleri Hayvan deneyleri Klinik araştırmalar (in vitro) (in vivo)
Deneysel araştırmalar; bir varsayımın doğruluk durumunu denemek ya da kanıtlamak için, kontrol edilebilir şartlar altında, özgül yöntemler kullanılarak ölçme işlemlerinin yapılmasına dayanan, geçerli ve güvenilir verilerin üretildiği bilimsel araştırma yöntemleridir. Deneysel hayvan araştırmaları ise; bilimsel bilgi elde etmek amacı ile omurgalı veya omurgasız hayvanlar üzerinde yapılan/yapılacak çalışmaları ifade etmektedir ARAŞTIRMACININ TEMEL HEDEFİ DENEYSEL SÜRECİ İYİ ANLAMAK OLMALIDIR
Araştırma dizaynı nedir?
Araştırma dizaynı bilimsel bir problemi çalışmak/çözmek için yapılan sistematik bir plandır.
Deneysel dizayn nedir? Deney; veri elde etmek amacıyla yapılan bir işlem/çalışmadır. Deneysel tasarım; spesifik bir amaca ulaşmak için bir çalışmanın planlanarak yapılmasıdır.
Hayvan Deneylerinin Tasarlanması
Neden önemlidir 1 Etik, ekonomik, bilimsel sebeplerden dolayı araştırmacılar hayvanları etkili/uygun bir şekilde kullanmalıdır. İyi deneysel dizayn bunun için temeldir. Michael Festing
İyi deneysel dizayn ; Bilimsel kaliteyi artıracak Daha iyi dergilerde yayınlama sağlayacak Zaman ve para tasarrufu sağlayacak Daha az hayvan kullanımı Tüm bunlar hepimizi mutlu edecektir
Yasal gereklilikler ve 3R Ulusal yasalar Hayvan Sağlığı ve Zabıtası Yönetmeliği (8.5.1986) Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar İçin Kullanılan Deney Hayvanlarının Korunması, Deney Hayvanlarının Üretim Yerleri İle Deney Yapacak Olan Laboratuarların Kuruluş, Çalışma, Denetleme, Usul ve Esaslarına Dair Yönetmelik (16.5.2004) Hayvan Deneyleri Etik Kurullarının Çalışma Usul ve Esaslarına Dair Yönetmelik (06.07.2006, 15 Şubat 2014 ) Deney Hayvanları Kullanım Sertifikası Eğitim Programına Dair Genelge (2007/11)
Replacement (alternatifler?) Reduction (hayyvan sayısı?) Refinement (prosedürler?) Zoolog William Russell Mikrobiyolog Rex L. Burch 4.R esponsibility (sorumluluk) http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=i7n6_jcowo8
Neden önemlidir 2 Araştırmacılar nadir olarak deneysel dizayn konusuyla ilgilenmektedir. İstatistik kursları genellikle elde edilecek verilerle ilgili analitik metotlara odaklanmaktadır. Bazı çalışmalar yetersiz/yanlış dizayndan dolayı yanlış sonuçlara yol açmıştır. Bazı çalışmalar ihtiyaç duyulandan daha geniş tutulmuştur
Örneğin, iki deneysel hayvan araştırma konusuyla ilgili 133 ve 33 yayınlanmış makale incelenerek bazı sonuçlara ulaşılmıştır. Bu makalelerde yapılan hatalarla ilgili olarak şu soruları tahmin etmeye çalışalım. Sizce: 1. Deneysel planlama hata oranı % kaç civarındadır? 2. Bu çalışmaların % kaçı ihtiyaç duyulandan daha geniş tutulmuştur? 3. Uygun olmayan istatistiksel analiz kullanım oranı nedir?
1. Deneysel planlama hata oranı %30 2. Çalışmaların %33 ü ihtiyaç duyulandan daha geniş tutulmuştur 3. Uygun olmayan istatistiksel analiz kullanım oranı %67
İyi bir hayvan deneyi dizaynında önemli adımlar: 1. Konu seçimi Rasyonellik, Gereklilik, Uygulanabilirlik, Tekrarlanabilirlik, Devamlılık gibi 2. Gözlem 3. Bilgi Toplama 4. Orijinal fikir ya da problemin ortaya konulması 5. Amaç 6. Değişkenlerin belirlenmesi 7. Hipotez
Çalışmanın diğer amaçlarının tanımlanması Deneysel birim in seçilmesi Değişkenlerin tanımlanması ve kontrol altına alınması Tedavinin seçimi (bağımsız değişken) Bağımlı değişkenlerin seçimi Deney düzeninin seçimi Örnek sayısının belirlenmesi İstatistiğin planlanması Gerekiyorsa pilot çalışma Protokoller ve standart çalışma prosedürleri İstatistiksel analiz Yorumlama Sonuçların sunulması
Deneyin planlanmasında Yeni bir araştırma projesi yaparken akılda tutulması gerekenler Projenin amaçlarının açık bir şekilde tanımlanması İyi bir literatür bilgisi En uygun modelin seçilmesi Doğru verinin en uygun şekilde toplanması Sonuçların en uygun şekilde yorumlanması
Hayvan çalışmalarında sistematik derleme ve meta analiz Sistematik derleme (systematic review) O alanda yayınlanmış olan çalışmaları kapsamlı bir biçimde tarayıp çeşitli kabul ve red kriterleri kullanarak hangi çalışmaların derlemeye gireceğini belirleyip bu çalışmada yer alan bilgilerin sentez edilmesi ile oluşturulur. Sistematik derlemeler kanıta ulaşmak için vazgeçilmez bir yoldur. Meta-analiz En az iki çalışmanın verilerinin birleştirilmesi ile belirli bir girişimin etkisini tek bir tahmin edici ile göstermek amacıyla geliştirilen istatistik yöntemlerdir. Hayvan çalışmalarından elde edilen verilerin bu şekilde analiz edilmeleri klinik çalışmalara (translasyonel tıp) katkı sağlayacaktır. SYRCLE is the research group of the Central Animal Laboratory of the Radboud Univeristy Nijmegen Medical Centre.NL.
Son zamanlarda hayvan çalışmalarının da SR ile analizinde ilgi-artış vardır. Çalışmanın dizaynını ve yönetim kalitesini değerlendirmek için ilişkili tüm çalışmaların metotlarını analiz eder. SR bilimin kalitesinin, hasta güvenliğini ve 3Rnin daha iyi olmasına katkı sağlayacaktır.
Hayvan çalışmalarında araştırma konusunun belirlenmesi (konseptüal) Problem ve Hedefler en basit şekli ile net olarak tanımlanmalıdır
Problemin belirlenmesi.. nin üzerine.. nin etkisi nedir? 1 2 (bir şeye bir şeyin etkisi nedir?) Etkilenebilecek faktörler (etkiler) ve değiştirebileceğimiz faktör (neden) tanımlanır. 1 e etkileri ve 2 ye nedeni koyunuz.
Değişkenler (bağımlı ve bağımsız) Neden sonuç ilişkisini bulmaya çalışırız. Sonucu etkileyen ve etken (neden) olduğu düşünülen faktörlere bağımsız, Etkenlerden etkilendiği düşünülen ve sonuç olan değişkenlere bağımlı değişken denir.
Örnek Problem: Kafes tasarımı laboratuvar sıçanının fizyolojik fonksiyonlarını etkilediğini göstermektedir. Problemin yeniden ifadesi: Sıçanların vital fonksiyonları üzerine saydam kafesin etkisi nedir? Bağımsız değişken (değiştirebileceğimiz faktör, etken): Saydam kafes. Bağımlı değişken (etkilenecek faktör/faktörler, sonuç): Vital fonksiyonlar.
Hayvan model seçimi Araştırmacıların en sık karşılaştıkları problem olarak tanımlanabilir. Yanlış hayvan tipi veya model seçimi = yanlış deney Filogenetik skalada en düşük hayvan kullanılmalı (replacement)
Mümkün olan durumlarda; - Klinik veya subklinik olarak sağlıklı, - Genetiği bilinen, tanımlanmış - İyi çevre, - Diyet -Konvansiyonel hayvanlardan daha pahalıdır -Daha az sayıda hayvan kullanımı demektir -Sonuçlar daha güvenilir ve tekrarlanabilirdir. -Hayvan maliyeti projelerde cüzi miktarlarda, NEDEN?
1950 den önce hemen hemen tüm lab hayvanları oldukça geniş bir viral, bakteriyal ve parazotolojik organizmaları barındırıyordu. Mycoplasma pulmonis ve diğer mo lar Kronik akciğer hastalığı Bozulan araştırma Düşük yaşam süresi Lab Rat ~ 1 y Daha fazla hayvan kullanımı (değişkenlik)
Sıçanlar Kronik solunum hastalığı Sağlıklı Böbrek ağırlığı SD 43.3 birim Power Analizi 18.6 unit n=200 n=42
Specific Pathogen Free (SPF) 1950 lerden itibaren Özellikle bazı patojenlerden arınmış hayvanlar
Tür seçimi Tür model uygunluğu Benzer çalışmalarla ilgili literatür taraması yapmak İhtiyaç duyulan hayvan modeli belirlenmek En sık kullanılan hayvanlar farelerdir -Küçük -Ekonomik -Birçok straini, genetik modeli ve tekniği mevcut
Tür seçimi Sıçan diğer bir seçim Daha büyük Çok deneyim ve bilgi mevcut Diğer kemirgenler: hamster, guinea pig, gerbil Büyük türler: tavşan, köpek, domuz...
Genetik tipin seçimi Deneysel tasarımda hayvanın genetik özelliğini (strain) belirlemek oldukça önemlidir. 4 temel genetik tip Outbred stok İsogenic strainler (inbred ve F1 hibrit) Mutant and polimorfizm Transjenik strainler Neden genetik olarak inbred hayvanların kullanımı genellikle daha önemlidir?
İnbredler genetik olarak birbirilerine çok benzer
Genetik olarak inbred hayvanların kullanımı şunlardan dolayı önemlidir: Fiziksel ve fizyolojik özellikleri uniformdur. Birbirine benzerlik çok yakındır. Genetik olarak stabil ve bir çok strainin özelliği biliniyor. Bazı spesifik hastalıklarda model olarak kullanılabilmektedir. Kalite kontrol edilebilir ve yüksek standartlardadır. Göreceli olarak daha az sayıda kullanılmaktadır. Outbred olan stoklardan daha ucuzdur.
İnbred hayvanların kullanmak değişkenleri kontrol etmede etkili bir yoldur Değişkenlik ne kadar yüksekse kabul edilebilir istatiksel güç seviyesine ulaşmak için ihtiyaç duyulan hayvan sayısı daha yüksek olacaktır 400 ün üzerinde inbred fare straini, 200 sıçan straini, az sayıda diğer türlerde http://www.informatics.jax.org
Strainlerin nomenklatürü
Hayvan modeli Hayvan modeli insanların hastalıklarını araştırmak, anlamak için kullanılan insan olmayan hayvanların kullanıldığı yaşayan canlı organizmalardır. 1. İndüklenmiş model 2. Spontan model 3. Negatif model 4. Olası modeller (orphan modeller)
Hayvan modellerini insanlara uyarlayabilir miyiz?
Hayvan türü seçerken Hayvan büyüklüğü, kan miktarı, organ yapısı ve modele uygunluk Seçilecek türlerin anatomi, biyoloji ve üreme (reprodüktif fizyoloji) fonksiyonlarının iyi bilinmesi gerekir Tür bazında düşünme Soy bazında düşünme Her soy her çalışmaya uygun değil
Fizyolojik Özellikler a) Yaşam alanları b) Nabız ve soluk sayısı c) Toplam kan miktarları d) Deney süresinde öldürmeden alınabilen kan miktarı ve bölgeleri e) Kan parametre özellikleri f) Enjeksiyon bölgesi ve o bölgelere verilebilecek maksimum madde volümü g) Çıkardığı idrar miktarı h) Günlük içtiği su miktarı i) Dışkı özelliği
Anatomik Özellikler a) Yapılacak çalışmaya anatomik yapı olarak uygunluk b) Türler arası anatomik farklılıklar c) Özel anatomik eksiklerden faydalanma
Özel koşullar Cerrahi girişimler için seçilecek bir hayvanda; - operasyona uygun olması, - büyük hayvanlar için mevcut olan cerrahi tekniklerin küçük hayvanlara uygulanabilmesi, - hayvana sürekli kanül takılabilmesi,
NMR, radyografi, anjiografi, telemetri gibi deney izleme yollarına uygun olması, Uzun sürebilecek genel anesteziye dayanabilmesi, Seçilen materyalin uygunluğunu tespit edebilmek için bir ön çalışma (pilot çalışma) yapılabilmesi gibi kriterler esas alınmalıdır.
Bazı türlerin araştırmalarda kullanım alanları Fare (mouse): Kanser, antikor, ilaç, ve aşı,.. araştırmalarında kullanılırlar Sıçan (rat, keme): temel tıp, ilaç, gıda, davranış, toksisite... Kobay (guinea-pig): Duyarlılık çalışmaları, aşı, immünolojik araştırmalar, otoloji, bazı diyet çalışmalarında, jüvenil diyabet, tüberkülozis, hamilelik komplikasyonları...
Tavşan (rabbit): Toksisite çalışmaları, antiserum üretimi, göz ve deri irritasyon testleri, damar sertliği...
Hamster: Tümör, kan dolaşımı, üreme ve fötüs bozukluklarında, bazı deneysel enfeksiyonlara (leptospiroz, influenza, köpek gençlik hastalığı) duyarlı ve hipotermi çalışmalarında (kış uykusuna yatar), diş çürümesi, diabetes mellitus, muscular dystrophy, Kalp hastalıkları Gerbil: Epilepsi, kolesterol metabolizması ve damar sertliği çalışmaların, obezite, filarya, beyin infarktüsleri,.. Kedi : İlaç geliştirmesinde, kalp-damar hastalıklarında ve nörolojik araştırmalarda,..
Köpek (dog): Aşı ve ilaç testleri, cerrahi tekniklerin geliştirilmesi, kalp-damar hastalıklarının araştırılmasında,.. Domuz (pig): Aşı ve gıda araştırmalarında, ayrıca pek çok organları (deri, pankreas,gis,kvs,iskelet ) insanlarınkine benzerlik gösterir Koyun (sheep), keçi (goat): Antikor geliştirme, cerrahi tekniklerin geliştirilmesi... Maymun: Aşı ve ilaçların test edilmesi, davranış çalışmaları, insanlara özgü infeksiyon hastalıkları çalışmalarında,.
13 Aralık 2011 SALI Resmi Gazetede yayımlanan Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığından: DENEYSEL VE DİĞER BİLİMSEL AMAÇLAR İÇİN KULLANILAN HAYVANLARIN REFAH VE KORUNMASINA DAİR YÖNETMELİK İNSAN-DIŞI PRİMATLARIN BİLİMSEL AMAÇLAR İÇİN PROSEDÜRLERDE KULLANILABİLECEĞİ TARİHLER Tür Adı Latince Tür Adı Tarih Marmoset Callithrix jacchus 1/1/2013 tarihinden itibaren Cynomolgus maymunu Macaca fascicularis Bakanlığın süre uzatımı kararı almaması kaydıyla 1/1/2022 tarihinden itibaren. Rhesus maymunu Macaca mulatta Bakanlığın süre uzatımı kararı almaması kaydıyla 1/1/2022 tarihinden itibaren. İnsan-dışı primatların diğer türleri Bakanlığın süre uzatımı kararı almaması kaydıyla 1/1/2022 tarihinden itibaren.
Kanatlılar (tavuk, güvercin, bıldırcın): Tavuklar; genellikle beslenme, aşılama, bağışıklık, embriyolojik ve toksikoloji çalışmalarında, güvercin ve kumrular; fizyoloji ve davranış, farmakokinetik ve toksikoloji çalışmalarında... Soğukkanlı omurgalılar - Sürüngenler (reptiles): Zooloji, ve karşılaştırmalı çalışmalarda,.. - Amfibiler (amphibian): Organ gelişimi ve moleküler genetik çalışmalarda,.. - Balıklar: Çevre kirliliği,genetik (zebrafish)..
Deney dizaynı ve istatistik birbiriyle oldukça yakın ilişki içerisindedir. FRAME Reduction Steering Committee Training School in the Experimental Design & Statistical Analysis of Biomedical Experiments Hosted by SYRCLE, Nijmegen, The Netherlands
Deneysel Birim (The Experimental Unit) Genellikle göz ardı edilen ya da yanlış tanımlanmaktadır Veri aldığımız bir kişi, hayvan, veya nesne Örneğin tedavi edilen bir fare kafesi ya da bir tavşan Yanlış kullanımı= yanlış sonuç Genellikle deneysel birim bireysel bir hayvandır http://isogenic.info/html/6 experimental_unit.html
Bireysel hayvan En yaygın durumdur. Her hayvan bireyselleştirilmişözgü uygulamaya maruz kalır Eğer bir kafese diyet içinde ya da su içinde ilaç konup verilirse deneysel birim bireysel hayvan olmaz.
Hamile anne ve yavrular Bir teretojinite çalışmasında hamile dişiler bir test maddesiyle veya plasebo ile tedavi ediliyor. Ölçümler doğumdan sonra her hayvanda bireysel olarak yapılıyor. Sizce deneysel birim nedir?
Kafes Hayvanın bir bölgesi
Sorular Hayvanlar her kafeste ikili olarak barındırılıyor ve tedavileri yem veya su içinde veriliyor. N nedir? Sağdaki deneyde her tankta 7 balık bulunmaktadır. Soldaki tanka test maddesi sağdakine de çözücü su içine verilerek uygulanıyor. Amaç balıklarda bir enzimin düzeyini belirlemektir. Deneysel birim nedir?
Biaslar Bias, değişik şekillerde sınıflandırılabilir ve çok sayıda taraf tutma şekli vardır. Zamanlama açısından sınıflandırmak gerekirse 2 ana başlık vardır: A. Çalışmanın tasarımı, yürütülmesi ya da analizi sırasında taraf tutma B. Çalışmanın yayınlanması ve değerlendirilmesi sırasında taraf tutma Deneysel planlamada; Gruplar arasında sistematik bir farklılık oluşturulması Tedavi grubuna özel koşullar uygulanması Aynı kişi tarafından yapılan ölçümler Uygun randomizasyonun yapılmaması Kör çalışma yapılmaması
Randomizasyon Randomizasyon; deneklerin çalışmaya katıldıktan sonra hangi gruba ayrılacaklarının rastlantısal olarak belirlenmesi demektir. Deneklerin çalışma ve kontrol gruplarına rastgele ayrılması çalışma gruplarının etkinliği incelenecek olan tedavi dışındaki öngörülen ve öngörülmeyen tüm faktörler açısından benzer özelliklere sahip olmasını sağlamak amacıyla yapılır. Her bir deneysel birim numaralandırılmalıdır.
Şunları yapabilirsiniz: Basit randomizasyon Örnek; 24 fareyi 4 gruba randomize etmek için Kağıt parçalarına 1 den 24 e kadar numaraları bir kabın içine koyarak iyi bir şekilde çalkalayınız. Çekiliş yaparak her bir gruba (n=6) hayvanları randomize olarak dağıtabilirsiniz. Rastgele sayılar tablosu Excell Bilgisayar programları MINITAB
Hayvan sayısının belirlenmesinde önemli kavramlar
Hipotez testleri Sıfır hipotezi (H o )Null, Yokluk Hipotez Karşıt Hipotez (H 1 ) Alternatif, Araştırma Hipotezi
Örnek; bir problemin ifade edilmesi ve hipotez tipleri Problemin ifadesi: Hangi diyet sıçanlarda daha fazla ağırlık artışına yol açar: diyet A ya da diyet B? Ho: Gruplar arasında benzer sonuçlar beklenir (her iki diyettte sıçanlarda benzer yakınlıkta ağırlık artışı yapar) H1: Deneysel gruptan farklı sonuç göstermesi beklenir (A diyeti B diyetinden daha fazla ağırlık kazandıracaktır, ya da tersi)
İstatistiksel Anlamlılık değeri (p-value) Güç (power) The coefficient of variation Tek yönlü veya çift yönlü? HO : μ1 = μ2 H1: μ1 > μ2 or H1: μ1 < μ2
Hayvan sayısının belirlenmesi Az sayıda hayvan hayvanları boşuna kullanmak-acı vermek-öldürmek Çok sayıda hayvan kısmi kayıp Deney süresince hiç kaybedilmemesi farz edilir
Pratikte örnek sayısının belirlenmesinde ETİK VE HAYVAN SAYISI 1. Beklenen etkinin büyüklüğü(gruplar arasındaki fark) 2. Populasyondaki etkinin standart sapması 3. Etkinin ortaya çıkması için deneyden beklenen güç (genellikle 80-90%) 4. Önemlilik düzeyi (genellikle.05 veya.01).
Bilgisayar programı: Sample Power http://www.psycho.uniduesseldorf.de/abteilungen/aap/gpower3/do wnload-and-register http://www.stat.uiowa.edu/~rlenth/power/ http://www.biomath.info
Kontroller Pozitif kontroller Sham kontroller Comparative Controls Negatif kontroller Vehicle Controls Bir çalışmada kontrol gruplarının sayısı ne olmalıdır?
Hayvan deneylerinin standartlaştırılması Hayvan deneylerinin standartlaştırılması; deneyde kullanılacak hayvanların, çevresel ve deneysel koşullarının sabit tutulması veya kontrol altına alınması anlamına gelir. Örneğin; Çevresel ortamın standardizasyonu Beslenmenin standardizasyonu Genetik olarak birörnek hayvanların kullanılması Mikrobiyolojik kalitenin sağlanması Yaş Madde uygulama yolu-zamanı-miktarı Örnek alma yolu-hacmi-zamanı Araştırmacı, bakıcı ve diğer personellerin tutum ve davranışları
DENEYSEL HAYVAN ÇALIŞMALARINI PLANLAMADA BAZI YARDIMCI İNTERNET KAYNAKLARI
http://www.isogenic.info/index.html
3Rs- Reduction.co.uk
EXPERİMENTAL DESİGN Authors: Michael F.W. Festing, David Dewhurst, Jake Broadhurst and Lynne Robertson.
Happy animals make good science (Poole) - Teşekkürler - 78