İ.Ü. CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Parkinson Hastalığı ile α-sinüklein Geni Polimorfizmlerinin İlişkisinin Araştırılması Araş.Gör. Yener KURMAN İSTANBUL - 2015
GİRİŞ *Parkinson hastalığı (PH), hareket bozukluğu ile birlikte görülen ilerleyici bir nörodejeneratif bir hastalıktır. *65 yaş üstü bireylerin % 2 sini ve *85 yaş üstü bireylerin de % 4-5 ini etkilemektedir. Patolojik bulgular; *Orta beyindeki substantia nigra pars kompakta daki dopaminerjik nöronların ilerleyici kaybı
*Dopaminerjik nöronlarda Lewy cisimciği veya Lewy nöritleri olarak adlandırılan sitoplazmik inklüzyonların bulunmasıdır.
Son 20 yıllık genetik çalışmalarda Parkinson hastalığının önemli derecede genetik bileşene sahip olduğu gösterilmiştir. Parkinson vakalarının; % 90-95 lik kısmı sporadik, % 5 lik kısmı ise Mendel tipi tek genli kalıtım gösterir.
*Parkinson hastalığı ile ilişkilendirilen ilk gen SNCA genidir (1997). *SNCA geni, Lewy cisimciklerinin esas bileşeni olan α-sinüklein proteinini kodlar. *SNCA geninde çeşitli mutasyonlar (A53T,A30P, E46K, A18T, A29S, H50Q, G51D, A53E) *Duplikasyonlar ve *Triplikasyonlar tanımlanmıştır.
*Çeşitli Genom çapında ilişki (GWA) çalışmaları ve hastakontrol çalışmalarında, SNCA genindeki intronik rs2736990 polimorfizmi ve 3 bölgede bulunan rs356219 polimorfizminin hastalıkla en fazla ilişkili olan tek nükleotid polimorfizmleri arasında olduğu gösterilmiştir.
AMAÇ Toplumlara özgü genetik heterojeniteyi dikkate alarak biz de bu çalışmada; SNCA geninin 3 bölgesinde yer alan rs356219 ve intronik bölgede yer alan rs2736990 polimorfizmleri ile erken ve geç başlangıçlı Parkinson hastalığı arasındaki ilişkiyi Türk toplumunda araştırmayı amaçladık.
GEREÇ VE YÖNTEM Çalışmada, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı ve İstanbul Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalı Davranış Nörolojisi ve Hareket Bozuklukları Birimi tarafından 2012-2014 yılları arasında Birleşik Krallık Parkinson Hastalığı Topluluğu Beyin Bankası Klinik Tanı Kriterleri ne göre teşhisi konmuş; 184 geç başlangıçlı (Yaş Ortalamaları 68.19 8.29) 73 erken başlangıçlı (Yaş Ortalamaları 50.83 8.64) Toplam= 257 Parkinson hastası ve herhangi bir nörodejeneratif hastalığı bulunmayan toplam 165 kontrole ait periferik kan örnekleri kullanıldı.
Periferik kan örneklerinden yüksek tuz konsantrasyonu kullanılarak DNA izolasyonu yapıldı. DNA saflığı ve miktarı spektrofotometrik ölçüm ile tayin edildi. DNA Saflığı = OD 260 / OD 280 = 1,8 ± 0,2. Genomik DNA örneklerinden, α-sinüklein geninin rs2736990 ve rs356219 bölgelerine özgü problar kullanılarak RT-PZR metodu ile erime noktaları hesaplanarak genotipleri tespit edildi.
α-sinüklein geninde araştırdığımız SNP ler SNP No Bulunduğu Bölge Değişiklik Gösteren Alleller rs356219 3 Bölge A/G rs2736990 4. İntron C/T
SNCA geni rs2736990 bölgesine ait genotiplerin erime noktası sıcaklıkları TT Genotipi için 60,58 0 C TC genotipi için 60,58 0 C-66,44 0 C CC genotipi için 66,44 0 C dir
SNCA geni rs356219 bölgesine ait genotiplerin erime noktası sıcaklıkları AA genotipi için 50,98 0 C AG genotipi için 50,98 0 C 58,52 0 C GG genotipi için 58,52 0 C
RT-PZR reaksiyon karışımı Reaksiyon Bileşeni Hacim dh 2 O 5,45 µl Primer Prob Karışımı 0,25 µl FastStart Master 1 µl MgCl 2 * 0,8 µl MgCL 2 son konsantrasyon 3 Nm LightCycler FastStart DNA Master HyProbe (Roche Diagnostic) 7,5 µl
İstatistiksel değerlendirme İstatistiksel analizler, SPSS 17.0 istatistik yazılım programı kullanılarak yapıldı. SNCA genine ait polimorfizmlerin analizi için kikare (χ2) yöntemi kullanıldı. p < 0,05 olan değerler anlamlı olarak değerlendirilmiştir. Genotiplere, Hardy Weinberg Eşitliği (HWE) kullanılarak test yapıldı.
BULGULAR rs 2736990 Bölgesi Geç başlangıçlı Parkinson hastaları ve hasta grubuyla yaş paralelliği gösteren sağlıklı kontrollerde, α-sinüklein geni rs2736990 bölgesi genotip dağılımları ve allel dağılımları açısından; anlamlı bir fark bulunmadı (sırasıyla p=0,388 ve p=0,185)
Erken başlangıçlı Parkinson Hastaları ve hasta grubuyla yaş paralelliği gösteren sağlıklı kontrollerde, α-sinüklein geni rs2736990 bölgesi genotip dağılımları ve allel dağılımları açısından; anlamlı bir fark bulunmadı (sırasıyla p=0,793 ve p=0,573)
rs 356219 Bölgesi Geç başlangıçlı Parkinson Hastaları ve hasta grubuyla yaş paralelliği gösteren sağlıklı kontrollerde α-sinüklein geni rs356219 bölgesi genotip ve allel dağılımları açısından; anlamlı bir fark bulunmadı (sırasıyla p=0,102 ve p=0,114)
Erken başlangıçlı Parkinson Hastaları ve hasta grubuyla yaş paralelliği gösteren sağlıklı kontrollerde α-sinüklein geni rs356219 bölgesi genotip ve allel dağılımlar açısından; anlamlı bir fark bulunmadı (sırasıyla p=0,507 ve p=0,637)
rs356219 genotip dağılımlarını AG+GG ve AA taşıyan geç başlangıçlı Parkinson hasta grubu ve kontrol grubunu karşılaştıracak şekilde tekrar analiz ettik. AG+GG genotipinin, AA genotipine kıyasla geç başlangıçlı PH grubunda anlamlı düzeyde daha fazla bulunduğunu saptadık. p=0,037 Gruplar Rs356219 Genotipleri, n(%) AA AG+GG Geç Başlangıçlı Parkinson Hastaları (n=184) 63 (%34,2) 121 (%65,8) Sağlıklı Kontroller (n=98) 46 (%46,9) 52 (%53,1) Toplam (n=282) 109 (%38,7) 173 (%61,3)
rs356219 genotip dağılımlarını AG+GG ve AA taşıyan erken başlangıçlı Parkinson hasta grubu ve kontrol grubunu karşılaştıracak şekilde tekrar analiz ettik. AG+GG genotipi sıklığının, AA genotipine kıyasla erken başlangıçlı PH grubunda anlamlı bir fark göstermediğini saptadık p=0,873
Geç ve erken başlangıçlı hasta grupları arasında rs2736990 bölgesi genotip dağılımları ve allel dağılımları istatistiksel olarak karşılaştırıldığında; anlamlı bir fark bulunmadı (sırasıyla p=0,648 ve p=0,370)
Geç ve erken başlangıçlı Parkinson Hasta gruplarında α-sinüklein geni rs356219 bölgesi genotip ve allel dağılımlarının karşılaştırıldığında; AG genotipinin, geç başlangıçlı hasta grubunda, GG genotipinin ise erken başlangıçlı hasta grubunda anlamlıya yakın derecede fazla görüldüğü bulundu (p=0,087) ancak allel dağılımları açısından anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,356).
TARTIŞMA *Çeşitli GWA çalışmalarında rs2736990-c risk alleli Parkinson hastalığı ile kuvvetli bir şekilde ilişkilendirilmiştir. Ancak çalışmamızda; C alleli, her iki hasta grubunda kontrol grubuna göre daha fazla görülen allel olmasına rağmen bu sonuç istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.
Bu durum; Çalışmamızda kullandığımız hasta ve kontrol sayısının sınırlı olmasından, Popülasyona özgü heterojenlik, çevresel faktörlerin etkileri gibi faktörlerden kaynaklanıyor olabilir.
* AG genotipinin, geç başlangıçlı hasta grubunda, GG genotipinin ise erken başlangıçlı hasta grubunda anlamlıya yakın derecede fazla görülmesi (p=0,087), bu tek nükleotid polimorfizminin hastalığın başlangıç yaşı ile de ilişkilendirilebileceğine işaret etmektedir.
SONUÇ Çalışmamızda Türk toplumunda rs2736990 tek nükleotid polimorfizmleri ile Parkinson hastalığı arasında bir risk ilişkisi bulunmadı.
Geç başlangıçlı Parkinson hasta grubunda AG+GG genotip sıklığının kontrole göre anlamlı düzeyde yüksek olduğu yönündeki bulgumuz SNCA rs356219 tek nükleotid polimorfizminin artmış hastalık riski ile ilişkili olduğunu teyit etmiştir.
Söz konusu SNP nin protein fonksiyonunu nasıl etkilediği bilinmemektedir. Bu söz konusu varyantların ilişkili olduğu Parkinson patogenezini etkileyen mekanizmaların aydınlatılması için fonksiyon çalışmalarının yapılması önem taşımaktadır.