PapilloCheck PapilloCheck high-risk

Sağlık Açısından Gücümüz HPV DNA-Chip PapilloCheck PapilloCheck high-risk Kullanım Kılavuzuna Bakınız 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 (PapilloCheck ) tip ve 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (PapilloCheck high-risk risk) tip insan papillomavirüslerin rahim boynu örneklerinde genotiplenmesi için tanısal kit. Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir 505 060 TEHLİKE 60

Sağlık TELİF Açısından HAKKI BİLGİLERİ Gücümüz PapilloCheck Test Kitinin Kullanımı için Talimatlar Telif hakkı, 2015 - Greiner Bio-One,, Tel: +49 (0) 7022 948-0, Faks: +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com, www.gbo.com Bildirim Tüm hakları saklıdır. Bu belgede yer alan bilgiler, daha önceden duyuru yapılmaksızın her an değişebilir. Bu belgenin, Greiner-Bio-One GmbH'nin önceden verilmiş yazılı onayı olmadan herhangi bir biçimde ya da şekilde kopyalanması ya da çoğaltılması yasaktır. Ticari marka hakkı Kullanılan marka adları ve etiketler, ilgili sahiplerinin mülkiyetindedir. Kullanıcı için önemli bilgiler PapilloCheck Test Kitinin doğru kullanımı için kullanıcının bu talimat kılavuzunu dikkatli bir şekilde okuması ve izlemesi gerekmektedir. Üretici, bu sistem testinin bu belgede açıklanmayan şekilde kullanımı ya da test sisteminin kullanıcısı tarafından yapılan değişiklikler konusunda herhangi bir sorumluluk kabul etmeyecektir. KULLANIM AMACI PapilloCheck bir tanı kitidir ve insan rahim boynu smear'larından alınan DNA preparatlarında 24 türde insan papillomavirüsünün kalitatif tespiti ve genotiplemesinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kitin yalnızca uygun niteliklere sahip personel tarafından kullanılması amaçlanmıştır. PapilloCheck high-risk risk bir tanı kitidir ve insan rahim boynu smear'larından alınan DNA preparatlarında 14 türde high-risk riskli insan papillomavirüsünün (hrhpv) kalitatif tespiti ve genotiplemesinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kitin yalnızca uygun niteliklere sahip personel tarafından kullanılması amaçlanmıştır. PapilloCheck, İn Vitro Tıbbi Tanı Cihazları Direktifinin (98/79/EC) koşullarına uyduğundan dolayı CE uyum işareti taşımaktadır. PapilloCheck kullanılarak elde edilen her tanı sonucu diğer klinik bulgular veya laboratuar bulguları ile birlikte yorumlanmalıdır. PapilloCheck Test Kitleri yalnızca laboratuar kullanımına yöneliktir ve ilaç, evsel veya diğer amaçlar doğrultusunda kullanım için tasarlanmamıştır. Bu ürünler, yalnızca moleküler biyolojik teknikler konusunda uzmanlaşmış teknisyenler ve doktorlar gibi profesyonel kullanıcılar tarafından kullanma amaçlıdır. Aksi belirtilmediği sürece, bu Kullanım Talimatlarında PapilloCheck adı, hem PapilloCheck hem de PapilloCheck high-risk riski ifade etmek için kullanılacaktır. 2

Sağlık SEMBOLLER Açısından SÖZLÜĞÜ Gücümüz tr Parti kodu Yeniden kullanmayın Son kullanma tarihi Kullanım Talimatlarına Başvurun Katalog Numarası Üretici Ambalaj hasarlıysa, kullanılmamalıdır Sıcaklık limiti <n> test için yeterli içerik TEHLİKE ve UYARI işaretlerine sahip GHS resimleri IVD! tr CE işaretleri In vitro tıbbi tanı cihazı Karanlık yerde saklayınız Önemli Not 3

Sağlık İÇİNDEKİLER Açısından Gücümüz 1. KİT İÇERİĞİ... 6 2. GEREKLİ SARF MALZEMELERİ, EKİPMANLAR VE DONANIMLAR... 7 3. NAKLİYE VE SAKLAMA... 9 4. GÜVENLİK TALİMATLARI... 10 5. ATIKLARIN YOK EDİLMESİ... 11 6. GİRİŞ... 12 6.1 Arka Plan Bilgileri... 12 6.2 PapilloCheck ile saptanabilir HPV tipleri... 12 6.3 Miktar tayini prensibi... 13 6.4 PapilloCheck çipinin tasarımı... 15 6.4.1 PapilloCheck çip düzeni...15 6.4.2 Çip üstü kontroller...16 7. PAPILLOCHECK İŞ AKIŞI İÇİN TALİMATLAR... 18 7.1 Genel talimatlar... 18 7.2 Oda ayrımı... 18 7.3 Uyarılar ve önlemler... 19 7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi...19 7.3.2 Çipleri ile işlem yapma talimatı...19 7.3.3 Genel önlemler...19 7.3.4 Güvenli çalışma...20 8. PAPILLOCHECK PROSEDÜRÜ... 21 8.1 Numune toplama ve DNA izolasyonu... 21 8.1.1 Örnek toplama...21 8.1.2 DNA Ekstraksiyon...23 8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)... 23 8.2.1 Termal döngüleyici kurulumu...24 8.2.2 Urasil-N-Glikolaz (UNG) tedavisi 11...24 8.2.3 PCR reaksiyonu kurulumu...25 8.3 Hibridizasyon ve yıkama... 27 8.3.1 Hazırlık ve kurulum...27 8.3.2 Hibridizasyon...28 8.3.3 Yıkama ve kurutma...30 8.4 PapilloCheck çipinin taranması ve değerlendirilmesi... 32 9. SORUN GİDERME... 33 10. TEKNIK DESTEK... 34 4

Sağlık Açısından Gücümüz 11. PAPILLOCHECK PERFORMANS ÖZELLİKLERİ... 35 11.1 PapilloCheck Analitik Performansı... 35 11.1.1 Analitik hassasiyet...35 11.1.2 Analitik özgüllük HPV türleri...36 11.1.3 Analitik özgüllük HPV dışı organizmalar...36 11.2 Yinelenebilirlik (Ara Yeniden Üretilebilirlik)... 36 11.3 Yeniden Üretilebilirlik... 37 11.4 Dayanıklılık... 37 11.5 PapilloCheck Klinik Performansı... 38 12. PAPILLOCHECK KISA PROTOKOL... 40 12.1 Oda 2: Reaksiyon karışımı PCR kurulumu... 40 12.2 Oda 2: PCR-DNA şablon eklentisi / PCR reaksiyonu... 41 12.3 Oda 3: Hibridizasyon - Hazırlık / Hibridizasyon reaksiyonu... 42 12.4 Oda 3: Yıkama ve kurutma / Tarama ve değerlendirme... 43 5

Sağlık 1. Açısından KİT İÇERİĞİ Gücümüz PapilloCheck ve PapilloCheck high-risk risk Test İçerik Miktar Kiti 1 PapilloCheck (REF ) PapilloCheck PCR MasterMix 5 x PapilloCheck PCR MasterMix 2 5 x 300 µl PapilloCheck Slide kutusu, 5 x 12 Dizi 1 x PapilloCheck Slide kutusu, 5 PapilloCheck çipli 3, 12 dizili, 60 numune için 1 PapilloCheck Hib. Tamponu 2 x PapilloCheck Hibridizasyon Tamponu 2 x 1.000 µl PapilloCheck TAMP A kons. 2 x PapilloCheck Yıkama tamponu A, konsantratı 2 x 40 ml PapilloCheck TAMP B kons. 1 x PapilloCheck Yıkama tamponu B, konsantratı 1 x 15 ml Broşür Kullanım Talimatlarını İndir 1 PapilloCheck high-risk risk (REF 505 060) PapilloCheck high-risk risk PCR MasterMix 5 x PapilloCheck high-risk risk PCR MasterMix 5 x 300 µl PapilloCheck high-risk risk Slide kutusu, 5 x 12 Dizi PapilloCheck high-risk risk Hib. Tamponu PapilloCheck high-risk risk TAMP A kons. PapilloCheck high-risk risk TAMP B kons. 1 x PapilloCheck high-risk risk Slide kutusu, 5 PapilloCheck high-risk risk çipli 3, 12 dizili, 60 numune için 2 x PapilloCheck high-risk risk Hibridizasyon Tamponu 2 x PapilloCheck high-risk risk Yıkama tamponu A, konsantratı 1 x PapilloCheck high-risk risk Yıkama tamponu B, konsantratı 1 2 x 1.000 µl 2 x 40 ml 1 x 15 ml Broşür Kullanım Talimatlarını İndir 1 1 Bir PapilloCheck veya PapilloCheck high-risk risk Test Kiti 60 numunenin analizi için yeterlidir. 2 DNA Taq Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz dışında PCR için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. 3 Bir PapilloCheck çipi, 12 PapilloCheck mikro dizisi içerir. Bu Kullanım Talimatlarında, çip ve slide kelimeleri eşanlamlı 6

olarak kullanılmaktadır. Sağlık Açısından Gücümüz 2. GEREKLİ SARF MALZEMELERİ, EKİPMANLAR VE DONANIMLAR PapilloCheck 'in listelenen sarf malzemeleri, ekipmanlar ve donanımlar ile birlikte ve yalnızca profesyonel personel tarafından kullanılması önerilmektedir. Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar PapilloCheck Test Kiti 60 reaksiyon için 1 test kiti PapilloCheck high-risk risk Test Kiti 505 060 60 reaksiyon için 1 test kiti PapilloCheck Toplama Kiti 465 075 50 numune için 1 test kiti ocheck DNA İzolasyon Kiti / Tek Kolon Preparasyon 515 040 50 hazırlama için 1 test kiti Steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu 4 0,5 µl - 10 µl 0,5 µl - 20 µl 10 µl - 100µL 10µL - 200 µl 100 µl - 1000 µl 765 288 774 288 772 288 739 288 750 288 96/960 96/960 96/960 96/960 60/600 50 ml polipropilen tüp 5 1,5 ml reaksiyon tüpü Pipetleyici için plastik pipetler Pipet 10 ml Pipet 25 ml Pipet 50 ml 210 261 616 201 607 180 veya 607 160 760 180 veya 760 160 786 180 veya 768 160 25/450 500/4000 1/200 1/200 1/200 5 Yalnızca slide santrifüj mevcut 465 değilse 060 gerekir. 4 Belirtilen uç boyutlarından bazıları kullanılabilir mikropipetlere bağlı olarak isteğe bağlıdır. 7

Sağlık Açısından Gücümüz Sarf Malzemeleri Greiner Bio-One Kat. No. Miktar CheckScanner 862 070 1 CheckReport Yazılımı Temel 862 080 1 CheckReport Yazılımı PapilloCheck eklentisi 862 081 1 CheckReport Yazılımı PapilloCheck high-risk risk eklentisi Bilgisayar sistemi: CheckReport Yazılımı ve PapilloCheck veya PapilloCheck high-risk risk eklentisi Başlangıç Paketi CheckScanner (CheckScanner, bilgisayar sistemi, CheckReport Yazılımı, PapilloCheck veya PapilloCheck high-risk risk eklentisi) 862 088 1 862 910 1 862 170 1 ocheck Hibridizasyon Odası, slide tutuculu 447 070 1 Slide tutucu için manyetik tutucu 447 001 1 ocheck Washbox 6 447 020 1 Gerekli enzimler Taq Polimeraz: HotStarTaq DNA Polimeraz 5 U/μl (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209) Urasil-N-Glikosilaz: Urasil-DNA Glikosilaz 1 U/µL (Thermo Scientific; #EN0361, #EN0362) Gereken ek sarf malzemeleri PCR-kalitesinde su Saflaştırılmış su Tek kullanımlık eldivenler DNA Away (Thermo Scientific; #7008, #7009, #7010) Lütfen yalnızca kullanılan döngüleyicinin üreticisi tarafından üretilen, uygun ve PCR ile uyumlu 8 tüplü şeritler, teli tüpler veya levhalar kullanın. İş akışını optimize etmek için 8 tüplü şeritlerin kullanılması önerilir. Gereken ek ekipmanlar 1,5 ve 2 ml reaksiyon tüpleri için mikrosantrifüj 50 ml polipropilen tüpler için santrifüj Tekli 0,2 ml reaksiyon tüpleri veya 8'li tüp PCR şeritleri için mikrosantrifüj PCR termal döngüleyici: GeneAmp PCR sistemi 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) Veriti 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH) Su banyosu (50 C) Mikropipetler (1-1000 μl arası farklı aralıklar) 8-Kanallı multipipet (aralık: 5-50 μl), örn. Brand Transferpette -8 (Marka) Cam ve plastik pipetler için pipetleyici Vortex çalkalayıcı Farklı reaksiyon tüpleri için raflar Süreölçer Atık kabı Gerekli ek donanımlar Bilgisayar (sistem gereksinimleri için CheckScanner TM ve CheckReport TM Yazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız) 6 PapilloCheck yıkama prosedürü için üç adet ocheck Yıkama teknesi gerekmektedir. 8

Sağlık 3. Açısından NAKLİYE Gücümüz VE SAKLAMA PapilloCheck Test Kitinin nakliyesi ortam sıcaklığında gerçekleştirilir. Bununla birlikte kit teslim alındıktan hemen sonra 4 ila 'de saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. PapilloCheck çiplerinin bulunduğu slide kutusunu daima nem giderici ile birlikte kapalı, fermuarlı bir çantada saklayın. Serilerin karışmasını önlemek için tüm bileşenler orijinal kit ambalajlarında saklanmalıdır. Doğru bir şekilde saklanan PapilloCheck Test Kiti ve bileşenleri belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Ayrıca bu koşullar altında raf ömrü, kitin ve bileşenlerinin ilk kez açılmasından sonra son kullanma tarihinden sapmaz. PapilloCheck Test Kitinin 4 ila sıcaklıkta saklanması, Hibridizasyon Tamponu ve Tampon B'de tuzların çökelmesine neden olabilir. Oda sıcaklığına (18 ila 25 C) dengelenme, karıştırma ve tüp/şişe vorteksleme öncesinde çökeltiler çözünmelidir. Ürün PapilloCheck Test Kiti PapilloCheck high-risk risk Test Kiti Depolama 4 ila, ışıktan korunan şekilde 4 ila, ışıktan korunan şekilde 9

Sağlık 4. Açısından GÜVENLİK Gücümüz TALİMATLARI PapilloCheck Test Kiti yalnızca laboratuar kullanımına yöneliktir ve ilaç, evsel veya diğer amaçlar doğrultusunda kullanım için tasarlanmamıştır. DNA çipleri tozsuz bir ortamda kullanılmalıdır. Slidelar üzerinde toz ve diğer parçacıkların birikmesi, tatmin edici olmayan veya geçersiz sonuçların elde edilmesine neden olabilir.! Her zaman uygun bir laboratuar önlüğü giyin, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde verilen güvenlik talimatlarını izleyin. Mevzuat Bilgileri: PapilloCheck Test Kitinin aşağıdaki bileşenleri zararlı veya tehlikeli bileşenler içerir. Kit Bileşeni Miktar Tehlikeli içerik 1272/2008 (EC) numaralı Düzenleme için sınıflandırma GHS resimli çizelgesi ve sinyal kelimesi Tehlike ve tedbir ifadeleri PapilloCheck Hibridizasyon Tamponu, guanidin tiyosiyanat, %20-60, CAS No. 593-84-0 akut toksisite, oral (kategori 4), akut toksisite, soluma (kategori 4), kronik suda toksisite (kategori 3), cildi tahriş edebilir (kategori 1c) TEHLİKE H302 H332 H314 H412 P273 P280 P305+ P351+P338 Yutulursa zararlı. Solunursa zararlı. Ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarlarına neden olur. Uzun süreli etkiler ile birlikte su altı yaşam için tehlikelidir. Çevreye salınmasından kaçının. Koruyucu eldivenler/koruyucu kıyafet/göz koruyucu/yüz koruyucu takın/giyin. GÖZE KAÇMASI HALİNDE: Birkaç dakika boyunca suyla durulayın. Kontak lenslerinizi (varsa) çıkarın. Durulamaya devam edin. EUH032 İlave tehlike bilgileri (AB) Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır. PapilloCheck Tampon B, sodyum dodesil sülfat, < %20, CAS No. 151-21-3 cilt irritasyonu (kategori 2), ciddi göz hasarı (kategori 1) TEHLİKE H315 H318 P280 P305+ P351+P338 Cilt irritasyonuna neden olur. Ciddi göz hasarına neden olur. Koruyucu giysi/göz koruması/yüz koruması kullanın. GÖZE KAÇMASI HALİNDE: Birkaç dakika boyunca suyla durulayın. Kontak lenslerinizi (varsa) çıkarın. Durulamaya devam edin. Bu ürüne ait güncel Güvenlik Veri Formu, Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com Teknik Bilgi ve Hizmetler Yükleme Merkezi 10

Sağlık 5. Açısından ATIKLARIN Gücümüz YOK EDİLMESİ PapilloCheck çipi yıkandıktan ve kurutulduktan sonra yıkama çözeltileri I ve II özel bir tedbir olmaksızın atılabilir. Kullanılmış PapilloCheck çipi, kullanılmamış kit bileşenlerini ve kullanılmamış hibridizasyon karışımını laboratuar kimyasal atıklarıyla birlikte bertaraf edin. Bertaraf etme ile ilgili tüm ulusal düzenlemelere, devlet düzenlemelerine ve yerel düzenlemelere riayet edin. 11

Sağlık 6. Açısından GİRİŞ Gücümüz 6.1 Arka Plan Bilgileri Hemen hemen tüm rahim boynu kanseri vakalarında karsinojenik insan papillomavirüs (HPV) ile kalıcı enfeksiyon tespit edilmiştir ikincisi tüm dünyada kadınlarda en yaygın görülen kanserdir 7. Bugüne kadar 100'den fazla HPV tipi saptanmıştır, bunların yaklaşık 40 tanesi cinsel yolla bulaşır ve genital mukozayı enfekte eder. Rahim boynu HPV tipleri high-risk risk (high-risk riskli HPV, hrhpv) ve düşük risk grubunda (düşük riskli HPV, lrhpv) sınıflandırılır. High-risk risk HPV türleri, rahim boynu kanseri oluşum riskinin artışı ile ilişkilendirilmiş olsa da düşük risk HPV türleri, genel olarak benign genital siğillere neden olur 8. Ancak high-risk riskli grupta dahi, kanser veya rahim boynu intraepitelyal lezyonu (CIN) gelişim riski türe bağlıdır 9. Tüm rahim boynu kanseri vakalarının yaklaşık %70'i, HPV 16 veya 18'in kalıcı enfeksiyonu ile bağlantıldır. En baskın düşük risk türleri HPV 6 ve 11'dir. Karsinojenik HPV ve rahim boynu kanseri arasında neredeyse mutlak bir etiyolojik bağlantıya dayalı olarak, artı hrhpv testleri birincil rahim boynu kanseri taraması açısından göz önünde bulundurulmaktadır 10. 6.2 PapilloCheck ile saptanabilir HPV tipleri PapilloCheck 18 high-risk risk ve 6 düşük risk tür insan papillomavirüslerin (HPV) (Tablo 1), tespitini sağlarken PapilloCheck high-risk risk, 14 high-risk risk türde insan papillomavirüslerin (hrhpv) (Tablo 2) tespitini sağlar. Tablo 1: PapilloCheck ile saptanabilir HPV tipleri HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6 HPV 18 HPV 51 HPV 66 HPV 11 HPV 31 HPV 52 HPV 68 HPV 40 HPV 33 HPV 53 HPV 70 HPV 42 HPV 35 HPV 56 HPV 73 HPV 43 HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44 / HPV 55* * PapilloCheck HPV 44 ile HPV 55'in ayırt edilmesini sağlamaz. Tablo 2: PapilloCheck high-risk risk ile saptanabilir hrhpv tipleri HPV 16 HPV 51 HPV 18 HPV 52 HPV 31 HPV 56 HPV 33 HPV 58 HPV 35 HPV 59 HPV 39 HPV 66 HPV 45 HPV 68 7 Walboomers, J. et al (1999). İnsan papillomavirüsü, tüm dünyada invaziv rahim boynu kanserinin gerekli nedenidir. J Pathol. 189(1):12-9., Cinsel Yolla Yayılan Enfeksiyonlar 76:80-87 8 Burd EM. İnsan papillomavirüsü ve rahim boynu kanseri. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1 17. 9 Bosch F.X. et al. (2008). İnsan papillomavirüs enfeksiyonlarının epidemiyolojisi ve doğal geçmişi ve rahim boynu neoplazideki tipe özgü sonuçları. Aşı. 26 Suppl 10:K1-16. 10 Meijer, C.J. et al. (2009). 30 yaş ve üstü kadınlarda birincil rahim boynu kanser taramasına yönelik insan papillomavirüs DNA test gerekliliklerine ilişkin kılavuzlar. Int J Cancer (Uluslararası Kanser Dergisi). 124(3):516-20. 12

Sağlık 6.3 Açısından Miktar tayini Gücümüz prensibi PapilloCheck, insan papillomavirüs (HPV) genomu E1 geninin bir parçacığının tespit edilmesine ve genotiplemesine yönelik mikrodizi tabanlı bir test kitidir. Miktar tayini prosedürü Şekil 1'de özetlenmiştir. PapilloCheck analizinden önce bir rahim boynu smear'i numunesinden DNA izole edilmelidir. Numune toplama ve DNA izolasyonu PapilloCheck Test Kitinin parçaları değildir. Greiner Bio-One numune toplama (PapilloCheck Toplama kiti) ve DNA izolasyonuna (ocheck DNA İzolasyon Kiti) yönelik özel ürünler de sunmaktadır ve bu ürünler ayrı olarak satın alınmalıdır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). Bir rahim boynu numunesinden viral ve insan genomik DNA'sının izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı HPV'ye özgü primerler grubunun bulunduğu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilir. Aynı reaksiyonda insan tek kopya geni ADAT1 (insan trna-özgül adenozin deaminaz1), rahim boynu numunesinde insan numunesi materyalinin varlığını (numune kontrolü) ve PapilloCheck 'de bulunan dahili kontrol şablonunu izlemek için amplifiye edilir. PCR MasterMix, PCR (PCR kontrolü) performansını izlemek için amplifiye edilir. Ayrıca PapilloCheck PCR MasterMix, dutp içerir. Böylece, önceki PCR reaksiyonlarından kaynaklanan taşınma kontaminasyonu Urasil- N-Glikosilaz (UNG) uygulaması ile giderilebilir (bkz. bölüm 8.2.2). PCR ürünleri daha sonra spesifik DNA problarına hibridize edilir ve PapilloCheck çip yüzeyine çip üstü kontrolleri eklenir. Her çip 12 DNA-mikro dizisi içerir, 12 rahim boynu numunesinin eş zamanlı analizine olanak tanır. Hibridizasyon sırasında bağlı DNA floresanla etiketlenir ve bağı çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. Hibridizasyon etkinliği izlenir (hibridizasyon kontrolü). Son olarak PapilloCheck çipi sırasıyla CheckScanner ve CheckReport Yazılımı kullanılarak otomatik olarak taranır, analiz edilir ve değerlendirilir (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). CheckScanner, iki renkli lazer tarayıcısı olup (532 nm ve 635 nm eksitasyon dalgaboyları) HPV'ye özgü amplifikasyon ürünlerinin yanı sıra kontrollerinin varlığı ile oluşturulan floresan sinyalinin tespit edilmesini sağlar (bkz. bölüm 6.4.2). CheckReport Yazılımı, sonuçların görüntülenmesine, analizine ve değerlendirilmesine olanak sağlar ve tespit edilen HPV türlerinin ve kontrollerin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda otomatik olarak gösterir. Rapor, tespit edilebilir bir veya daha fazla 24 HPV türünün veya 14 hrhpv türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösterir ve kapsamlı çip üstü kontrolleri analizi son derece güvenilir kılar. 13

Sağlık Açısından Gücümüz 1. PCR reaksiyonu 2. Hibridizasyon 3. Yıkama ve kurutma veya 4. Tarama ve analiz Şekil 1: PapilloCheck miktar tayini prosedürü 1. PCR reaksiyonu: DNA izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı ve iki kontrol hedefinin parçacıkları PCR ile amplifiye edilir. Amplifikasyon ürünleri daha sonra çip üzerinde tamamlayıcı DNA problarına hibridize edilir. 2. Hibridizasyon: Her bir HPV türü, beş kopya halinde bulunan spesifik DNA probu ile tespit edilir. Hibridizasyon sırasında floresan etiketleme uygulanır. 3. Yıkama ve kurutma: Bağı çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. 4. Tarama ve analiz: PapilloCheck çipi, CheckScanner ve CheckReport Yazılımı kullanılarak taranabilir, analiz edilebilir 72636 oluşturulur. Frickenhausen ve değerlendirilebilir. Tespit edilebilir bir veya daha fazla HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösteren bir rapor 14

Sağlık 6.4 Açısından PapilloCheck Gücümüz çipinin tasarımı 6.4.1 PapilloCheck çip düzeni Her PapilloCheck veya PapilloCheck high-risk risk çipi, kuyucuk A1 - B6 olarak tayin edilmiş 12 mikrodizi içerir. Her kuyuda, farklı problardan oluşan tekli bir mikrodizi incelenir. Her bir tekli mikro dizi, yükseltilmiş bir kenarla çevrelenir. Her prob beş kez damlatılır. Mikro dizi düzeni Şekil 2 kısmında gösterilmektedir. Tanımlanan çip üstü kontrolleri, 6.4.2. bölümde daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. oryantasyon kontrolü numune kontrolü a) kırmızı kanal (635 nm) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 b) hibridizasyon kontrolü oryantasyon kontrolü oryantasyon kontrolü numune kontrolü c) yeşil kanal (532 nm) HPV 6 HPV 11 HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 40 HPV 42 HPV 43 HPV 44/55 hibridizasyon kontrolü HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 53 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 HPV 70 HPV 73 HPV 82 oryantasyon kontrolü Şekil 2: PapilloCheck çipinin tasarımı a) PapilloCheck çipinin şematik çizimi. b) ve c) Kırmızı kanal taraması (b) için kullanılan iki farklı ikaz dalga boyutu için CheckReport Yazılım tarafından görüntülenen görseller: Yazılımı 532 nm) ve PapilloCheck mikrodizi yerleşim planının şematik çizimleri. HPV türü spesifik problar ve çip üstü kontroller belirtilir. 15

Sağlık Açısından Gücümüz 6.4.2 Çip üstü kontroller PapilloCheck DNA-çipinin tasarımı kapsamlı çip üstü kontrolleri içerir. Çeşitli kontrol sistemleri, numune kalitesi ve DNA izolasyonu (numune kontrolü), PCR reaksiyonunun kalitesi (PCR kontrolü), hibridizasyon etkinliğinin (hibridizasyon kontrolü) yanı sıra nokta homojenliği ve baskı kalitesi (işletim kontrolü ve baskı kontrolü) de dahil olmak üzere miktar tayini ve çip işlemenin tüm kritik adımlarını izler. HPV türlerinin varlığına veya yokluğuna ek olarak CheckReport Yazılımı kontrollerin ve tespit edilen HPV türlerinin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda gösterir. Farklı kontrollerin okunması için CheckScanner 'in her iki eksitasyon dalgaboyu kullanılır. Miktar tayini performansının kontrolü için (numune ve PCR kontrolü) kırmızı kanal kullanılırken (635 nm eksitasyon dalgaboyu), hibridizasyonun ve çipin kalitesi (hibridizasyon, oryantasyon ve baskı kontrolü) yeşil kanalda değerlendirilir (532 nm eksitasyon dalgaboyu). Numune kontrolü PapilloCheck, insan tek kopya geni ADAT1'in (insan trna-spesifik adenozin deaminaz1) bir parçacığını amplifiye ederek numunenin numunenin ve/veya DNA izolasyonunun kalitesini izler. İnsan DNA'sı rahim boynu numunesinden izole edilen DNA'da yeterli miktarda mevcut ise numune kontrol noktalarında bir floresan sinyali verilir. ADAT1 amplifikasyonu yoksa ya da yetersizse, CheckReport Yazılımı örnek kontrolünü "başarısız" olarak gösterecektir. Bunun da patojene özgü noktalardan gelen sinyale bağlı olarak iki farklı sonucu bulunmaktadır. HPV için bir örnek pozitif olduğunda analiz geçerlidir. Bu durumda, başarısız numune kontrolü, eşlik eden DNA ve PCR sırasında hedef DNA fazlalığı arasındaki karşılaştırmanın doğrudan sonucudur. Bir diğer yandan, örnek HPV için negatif sonuç verdiğinde, CheckReport Yazılımı, analizi kötü numune toplama (numunede yetersiz sayıda hücre bulunması) ve/veya etkisiz DNA izolasyonu nedeniyle "başarısız" olarak gösterecektir. Bu durumda, analizin DNA izolasyonu ile veya gerekli olduğunda yeni bir numune alınarak yinelenmesi önerilir (bkz. bölüm 9). PCR kontrolü PapilloCheck ayrıca PCR performansını da izler. PapilloCheck PCR MasterMix'de bulunan dahili kontrol şablonunun amplifikasyonu PapilloCheck çipindeki PCR kontrol noktalarında bir sinyal oluşturur. Amplifikasyon reaksiyonunun kalitesi aynı zamanda CheckReport Yazılımı ile de otomatik olarak değerlendirilir. PCR performansı önceden tanımlanmış eşiğin altında ise CheckReport Yazılımı PCR kontrolünü "başarısız" olarak gösterir ve analiz tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9). Numunedeki HPV DNA çok high-risk ise, PCR kontrol noktalarının floresan sinyali, PCR reaksiyonu sırasındaki rekabete bağlı olarak düşük olabilir veya olmayabilir. Bu durumda testin geçerli olarak kabul edilebilmesi için en az bir HPV-spesifik probunun floresan sinyali önceden tanımlanmış eşiği aşmalıdır. Hibridizasyon kontrolü PapilloCheck, PapilloCheck çipinde spesifik DNA dizilerine hibridize olan PapilloCheck Hibridizasyon Tamponu içinde floresan ile etiketlenmiş prob kullanımı ile hibridizasyonun etkinliğini izler. Yeterli bir hibridizasyon etkinliği her bir dizi noktasında floresan sinyalleri ile sonuçlanır. PapilloCheck çipindeki beş hibridizasyon kontrol noktasının sonuçları ayrıca CheckReport Yazılımı ile de değerlendirilir. 16

Sağlık Oryantasyon Açısından ve baskı Gücümüz kontrolü PapilloCheck çipinin oryantasyon kontrol noktaları, hibridizasyon prosesinin etkinliğine bakılmaksızın floresan sinyalleri verir. Bu noktalar, sinyallerin doğru analizi için bir ön koşul olan doğru nokta tespitine yönelik kılavuz noktaları olarak CheckReport Yazılımı tarafından kullanılır. PapilloCheck çipi üzerindeki yazdırma kontrolü, nokta varlığını ve hibridizasyonunu kontrol eder. Ayrıca baskı prosesinin kalitesi her bir çip noktasında (baskı kontrolü) yeşil bir floresan sinyali ile izlenir. 17

Sağlık 7. Açısından PAPILLOCHECK Gücümüz İŞ AKIŞI İÇİN TALİMATLAR Aşağıdaki iş akışı açıklaması, PapilloCheck ve PapilloCheck high-risk risk ürünlerinin uygulanması için aynıdır. Lütfen yalnızca PapilloCheck Test Kitinin bileşenlerini kullanarak PapilloCheck için verilen açıklamayı izleyin. Lütfen yalnızca PapilloCheck high-risk risk Test Kitinin bileşenlerini kullanarak PapilloCheck high-risk risk için verilen açıklamayı izleyin. 7.1 Genel talimatlar Moleküler biyolojide halihazırda kullanılan en gelişmiş teknikler bir laboratuvara uygulandığında, laboratuar personelinin azami güvenliğini ve high-risk kaliteli sonuçlar sağlamak amacıyla aşağıdaki talimatlar göz önünde bulundurulmalıdır. DNA izolasyonu, amplifikasyon ve amplifikasyon ürünlerinin tespiti uygun nitelikli personel gerektirir. Ayrıca DNA bozunması veya amplifikasyon ürünleri ile kontaminasyon nedeniyle ortaya çıkanlar gibi hatalı sonuçları engellemek için net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gerekmektedir. Bunu sağlamak için Bölüm 7.2'de tanımlandığı gibi izolasyon, amplifikasyon ve tespit alanlarının ayrılması gerekir. Her alanda ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır. Laboratuvar önlüklerini, eldivenleri veya ekipmanları kesinlikle farklı bir alandan bir başka alana aktarmayın. 7.2 Oda ayrımı Şekil 3 bir laboratuvarın nasıl üç farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir. Bu odalardan biri yalnızca DNA izolasyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve çalıştırılması için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin kontaminasyonunu önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılır. Ekipmanların ve sarf malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk kullanılması yararlı olabilir. Oda 1 Oda 2 Oda 3 Şekil 3: Manuel işleme alma için oda ayırma Oda 1: DNA izolasyon prosedürünün tamamı bu odada gerçekleştirilmelidir. Oda 2: Bu odada, PCR reaksiyon karışımı ayarlanır ve alikuotlara bölünür (en uygunu bir PCR ocağı altında). Oda 1'de izole edilen DNA numunelerinin eklenmesi oda 2 içinde ayrı bir alanda gerçekleştirilmelidir. Oda3: Hibridizasyon reaksiyonu, yıkama adımları ve çip kurutma üçüncü laboratuvar odasında yapılır. Ayrıca CheckScanner TM, CheckReport Yazılımı ile birlikte PapilloCheck miktar tayininin nihai analizi için kullanılır.! Ekipmanlar ve sarf malzemeleri, farklı laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir. Bu nedenle, laboratuvara ekipman temin edilirken ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin edilmesine dikkat edilmelidir. 18

Sağlık 7.3 Açısından Uyarılar ve Gücümüz önlemler 7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir ve her bir laboratuvar odası için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır. Laboratuvar temizliği: Çalışma alanı, çalışma öncesinde ve sonrasında DNA-AWAY (Thermo Scientific) veya uygun bir temizleme solüsyonu ile dekontamine edilmelidir. Analizin her adımında eldiven takılmalıdır ve özellikle DNA izolasyonu sırasında sık sık değiştirilmelidir. Numune tüpleri: Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır. Pipetleme: Aerosol bariyerli uygun mikropipet filtre uçları kullanılmalıdır (steril, DNase, Rnase ve insan DNA'sı içermeyen). Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir. 7.3.2 Çipleri ile işlem yapma talimatı DNA çipleri tozsuz bir ortamda kullanılmalıdır. Çip yüzeyinde toz ve diğer parçacıkların birikmesi önlenmelidir. Çip yüzeyindeki hibridizasyon bölgesine dokunulmamalıdır. Çipin yalnızca etiketli tarafı hibridizasyona yöneliktir. Çip üzerinde spesifik olmayan floresana yol açtıklarından DNA çiplerinin tanımlanması için işaret kalemleri kullanılmamalıdır. DNA çipleri yalnızca tek kullanımlıktır. Hibridize edilen çipler yeniden kullanılamaz. Kullanılmamış çipler, teslim edilen ve nem çekici fermuarlı torba içinde, orijinal kutusunda saklanır. 7.3.3 Genel önlemler Teslim alındığında kit bileşenlerinin hasarlı olup olmadığını kontrol edin. Bileşenlerden biri hasar görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurun. Hasar görmüş kit bileşenleri kullanılmamalıdır. Bu komponentlerin kullanılması, kit performansını zayıflatabilir. Kit, son kullanma tarihinden sonra kullanılmamalıdır. Farklı serilere ait reaktifleri karıştırmayın. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. Yalnızca kitle birlikte sağlanan ve üretici tarafından tavsiye edilen reaktifleri/ekipmanları kullanın. Tüm ekipman üzerinde (ör. PCR döngüleyiciler veya pipetler) düzenli kalibrasyon/bakım işlemleri gerçekleştirilmelidir. Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle olabildiğince doğru bir şekilde pipetlemeye dikkat edin. Reaktiflerin mikrobik kontaminasyonunu önlemek için alikuotlar reaktif tüplerinden alınırken dikkatli olunmalıdır. Kullanılmayan reaktifler ve atık materyal, federal yönetim ve eyalet düzeyindeki kılavuz ilkelere uygun olarak bertaraf edilmelidir. 19

Sağlık 7.3.4 Açısından Güvenli çalışma Gücümüz Daima uygun bir laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu önlükler kullanın. Kitler yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır. İnsanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken dikkatli olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için, numune lizisi tamamlanana kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir. Tüm biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul ederek kullanın ve bertaraf edin. Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten kaçının, bu numuneleri sıçratmayın ve püskürtmeyin. İnsan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük kullanın. Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin. Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler kullanmayın. Numuneleri ve reaktifleri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Bu ürüne ait Güvenlik Veri Formunun güncel sürümü Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com Teknik Bilgi ve Hizmetler Yükleme Merkezi 20

8. PAPILLOCHECK PROSEDÜRÜ Aşağıdaki bölümde, her bir analiz edilen rahim boynu numunesinde tespit edilebilir bir veya daha fazla HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça belirten ayrıntılı bir raporun hazırlanması ile sonuçlanan farklı çalışma adımları ayrıntılı bir şekilde açıklanmaktadır. Şekil 4, gerekli olan farklı çalışma adımlarına bir genel bakış sunar. Ayrıca spesifik miktar tayini adımının tanımlandığı ilgili alt bölümü de gösterir. Çalışma adımları bu bölümde belirtilen sırada gerçekleştirilmelidir. Her adım mavi ok ile gösterilmiştir.! CheckReport Yazılımı ile örnek toplama, DNA izolasyonu ve analiz PapilloCheck Test Kitinin parçaları değildir. Bu nedenle bu çalışma adımlarının tanımı bu bölümde kısaltılmıştır. Daha ayrıntılı bilgi için lütfen Kullanım Kılavuzuna bakın, örn: PapilloCheck Toplama Kitinden, ocheck DNA İzolasyon Kiti ve CheckReport Yazılımından. 8.1 Numune toplama ve DNA izolasyonu 8.1.1 Örnek toplama Örnek toplama, PapilloCheck Test Kitinin bir parçası değildir. Greiner Bio-One tarafından rahim boynu örneklerine yönelik özel bir toplama kiti (PapilloCheck Toplama Kiti) de sunulmaktadır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). PapilloCheck aşağıdaki toplama sistemleri veya araçlarından biri ile toplanan insan rahim boynu smear'larından ocheck DNA İzolasyon Kiti ile hazırlanan DNA kullanılarak valide edilmiştir: PapilloCheck Toplama Kiti (Greiner Bio-One, Frickenhausen, ) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, ABD) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) STM (Qiagen, Hilden, ). Easyfix (VWR, Radnor, PA, ABD) Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, Fransa) Uygun taşıma araçları veya DNA izolasyon sistemleri ile ilgili daha fazla bilgi için yerel Greiner Bio- One distribütörünüz ile iletişime geçin veya Greiner Bio-One internet sitesine başvurun: www.gbo.com Teknik Bilgi ve Hizmetler Yükleme Merkezi 21

Bölüm 8.1.2 DNA izolasyonu ocheck DNA İzolasyon Kiti Bölüm 8.2 PCR Bölüm 8.3.2 Hibridizasyon Bölüm 8.3.3 Yıkama ve kurutma veya Bölüm 8.4 Tarama ve değerlendirme Şekil 4: Farklı PapilloCheck çalışma adımlarına genel bakış 22

8.1.2 DNA Ekstraksiyon DNA izolasyonu, PapilloCheck Test Kitinin bir parçası değildir. PapilloCheck analizinden önce Greiner Bio-One tarafından sağlanan ocheck DNA İzolasyon Kiti (bkz. Bölüm 2) kullanılarak DNA izolasyonu gerçekleştirilmelidir. ocheck DNA İzolasyon Kitini kullanırken lütfen Kullanım Kılavuzunu izleyin. ocheck DNA İzolasyon Kiti ile DNA izolasyonu için 250 µl numune çözeltisi kullanılmalıdır. Aşağıdakiler ile toplanan insan rahim boynu smear numuneleri: PapilloCheck Toplama Kiti ile (Greiner Bio-One, Frickenhausen, ) PreservCyt toplama ortamında (Hologic, Bedford, MA, ABD) Easyfix içinde (VWR, Radnor, PA, ABD) veya Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, Fransa) doğrudan işlenebilir. Surepath toplama ortamında (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) toplanan rahim boynu numuneleri kullanım öncesinde yıkanmalıdır: 5 dakika boyunca 11.000 x g'de 250 µl numuneyi santrifüje alın ve peleti 250 µl distile edilmiş suda bekletin. Daha sonra 250 µl ocheck DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir. STM toplama ortamında (Qiagen, Hilden, ) toplanan rahim boynu numuneleri seyreltilmelidir: 100 µl numune ve 150 µl distile edilmiş su kullanın. 250 µl seyreltilmiş numune ocheck DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir. Genel olarak rahim boynu smear numunesi çok konsantre görünüyorsa ve zaten agrege olmuşsa, DNA izolasyonuna başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir! Oldukça seyreltilmiş olan ve görünür hücresi bulunmayan rahim boynu smear numuneleri, DNA izolasyonu için daha high-risk hücre verimi elde etmek üzere konsantre hale getirilmelidir: 5 dakika boyunca 11.000 x g'de 1000 µl numuneyi santrifüje alın ve peleti 250 µl distile edilmiş suda bekletin. Daha sonra 250 µl ocheck DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir.! Bu konsantrasyon adımı yalnızca PapilloCheck Toplama Kiti ile, PreservCyt, Easyfix ve Cyt-All toplama ortamında ya da Surepath toplama ortamında toplanan rahim boynu smear numuneleri için uygundur. STM toplama ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir. 8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) PCR, son derece küçük DNA miktarlarını tespit edebilen çok hassas bir yöntemdir. Reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için özel önlemlere uyulmalıdır (bkz. Bölüm 7). HotStarTaq Polimeraz ve Ursail-N-Glikosilaz gerekir ancak PapilloCheck Test Kiti ile birlikte verilmez ve ayrı olarak satın alınmalıdır (bkz. Bölüm 2).! PapilloCheck Test Kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq Polimeraz ve Thermo Scientific tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak (bkz. bölüm 2) valide edilmiştir. İddia edilen performansı elde etmek için bu enzimlerin kullanılması zorunludur. 23

8.2.1 Termal döngüleyici kurulumu PapilloCheck Test Kiti aşağıdaki termal döngüleyicilerle valide edilmiştir: GeneAmp PCR sistemi 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) Veriti 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).! İddia edilen performansın elde edilmesi için yukarıda belirtilen termal döngüleyicilerden birinin kullanılması kesinlikle şarttır. PapilloCheck PCR'nin termal döngüleyici programı Tablo 3'de özetlenmektedir. Tablo 3: PapilloCheck PCR'nin termal döngüleyici programı Süre Sıcaklık C Döngü sayısı 20 dk 37 C 1 15 dk 95 C 1 30 s 25 s 45 s 30 s 45 s 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C 40 15 Tutun 10 C Ayrıca her termal döngüleyici için aşağıdaki işlem parametreleri ayarlanmalıdır. Bu parametrelerin nasıl ayarlanması gerektiğinin açıklaması için ilgili termal döngüleyicinin Kullanım Kılavuzuna bakınız. GeneAmp PCR sistemi 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) Reaksiyon hacmini 26 µl'ye, rampa hızını 9600 e ayarlayın ve 103 C kapak sıcaklığını kullanın. Veriti 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) PapilloCheck PCR programına girmek için Veriti 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyicinin Dönüştürme Yöntemi aracını kullanın ve 9600 Emülasyon Modu nu seçin. Reaksiyon hacmini 26 µl'ye ve kapak sıcaklığını 103 C'ye ayarlayın. peqstar 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH) Isıl döngüleyici ile birlikte sağlanan ön programlı PapilloCheck PCR programı PapilloCheck.js yazılımını kullanın. Genellikle program şu yoldan açılabilir. local/scripts/greinerbioone/papillocheck. js. 8.2.2 Urasil-N-Glikolaz (UNG) tedavisi 11 PapilloCheck PCR MasterMix PapilloCheck PCR sırasında amplifikasyon ürünlerine dahil edilen dutp içerir ve PCR ürünlerini UNG ile bozunmaya duyarlı hale getirir. UNG, PCR ürününü deoksiuridilat kalıntısının dahil edildiği bölgelerde ayırır. Ayrık PCR ürünleri sonraki bir reaksiyonda amplifiye edilmez. Bu nedenle UNG uygulaması, önceki PCR kontaminasyonlarından taşınma kontaminasyonunu gidermek için kullanılabilir 11. 11 PapilloCheck ürününü satın aldığınızda ürünle birlikte ABD Patent Numaraları 5,035,996; 5,683,896; 5,945,313; 6,287,823 ve 6,518,026 altında sınırlı bir lisans ve ilgili yabancı patentler gelir. 24

Urasil-N-Glikolazı 1:200 PCR-sınıfı su ile seyreltin. Her PapilloCheck PCR reaksiyon kurulumu için yeni bir UNG seyreltmesi kullanın (bkz. Bölüm 8.2.3). Seyreltilmiş UNG'yi yeniden kullanmayın. 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek UNG seyreltmeyi karıştırın. Urasil-N-Glikosilaz orijinal konsantrasyonu 1 U/µl'dir. Sonuç olarak, seyreltmenin konsantrasyonu 0,005 U/µl'dir.! PapilloCheck Test Kiti Thermo Scientific tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). İddia edilen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur. Bu seyreltmeden 1 µl kadarını her bir PapilloCheck PCR reaksiyonuna ekleyin (bkz. Bölüm 8.2.3, Tablo 4). Bu miktar, PCR taşınma kontaminasyonunu gidermek için yeterlidir. PCR performansı üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden ve PapilloCheck hassasiyetinin azalması ile sonuçlanabileceğinden daha high-risk konsantre edilmiş UNG solüsyonu kullanmayın. Genel olarak UNG uygulaması için PCR reaksiyon karışımı 37 C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra, UNG 95 C'de 15 dakika süreyle ek inkübasyon adımı ile etkisizleştirilir. Bu iki adım PapilloCheck PCR'ye zaten dahil edilmiştir ve termal döngüleyici programının ilk iki adımına karşılık gelir (bkz. Tablo 3). İkinci adımda (95 C'de 15 dakika) Urasil-N-Glikosilaz'ın etkisizleştirilmesi ve HotStarTaq Polimeraz etkinleştirmesi gerçekleşir.! PapilloCheck PCR'nin dahil edilen UNG sistemi yalnızca önceki PCR reaksiyonlarından PCR ürünleri ile taşınma kontaminasyonlarını giderir. Numune hazırlama, DNA izolasyonu veya PCR şablon ekleme sırasında meydana gelenler gibi diğer kontaminasyonlar giderilemez. Bu nedenle Bölüm 7'de tanımlanan kontaminasyonunun önlenmesi için talimatların ve özel önlemlerin izlenmesi hala gereklidir. 8.2.3 PCR reaksiyonu kurulumu HotStarTaq Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz hariç olmak üzere PapilloCheck PCR MasterMix, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli olan tüm bileşenleri zaten içermektedir (PCR tamponu, MgCl 2, dntp'ler, primerler, PCR kontrol şablonu). Genel olarak, PapilloCheck PCR kurulum prosedürü iki ayrı bölüme ayrılabilir: PapilloCheck PCR MasterMix nihai mastermix'inin hazırlanması ve şablon olarak izole DNA eklemek için nihai PCR reaksiyonunun hazırlanması.! PapilloCheck Test Kiti, Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq Polimeraz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). İddia edilen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur. Nihai mastermix hazırlığı, reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için en uygun bir biçimde PCR ocağı gibi korunan bir ortamda gerçekleştirilir. Nihai mastermix hazırlığı (PapilloCheck PCR MasterMix, HotStarTaq Polimeraz ve Urasil-N- Glikosilaz'dan oluşur) Tablo 4'te belirtildiği gibi gerekli PCR miktarı için hazırlayın. 25

Çoklu numuneleri analizi etmek için nihai mastermix bir seri halinde hazırlanmalıdır (tüm analizler için gerekli olan miktarda). Pipetleme sırasında hacim varyasyonlarını düzenlemek için reaksiyonların sayısının her çip için (n) 1 arttırılması (=n+1) önerilir, örn: 12 numunenin test edilmesi gerekiyorsa 13 amplifikasyon reaksiyonu için bir nihai mastermix hazırlayın (bkz. Tablo 4). Bir çipin reaksiyonları için her zaman bir flakon PapilloCheck PCR MasterMix kullanın.! Hazırlanan her nihai mastermix'in her serisi için bir negatif kontrolün dahil edilmesi önerilir. Negatif kontrol olarak uygun DNA izolasyon kitinin DNA elüsyon tamponu veya PCR kalitesinde su kullanılabilir. 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek nihai mastermix'i iyice karıştırın. Her bir PCR reaksiyonu için 21 μl miktarda örneği 0,2 ml, ince duvarlı PCR reaksiyon tüpüne pipetleyerek bölün. Şablon DNA'yı nihai mastermix'in kurulumundan ayrı bir çalışma alanına ekleyin (bkz. Bölüm 7.2). Reaksiyon karışımının hazırlanması için her bir nihai mastermix'e 5 µl DNA ekstraktı ekleyin ve 2 saniye süreyle vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya birçok kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. Bir PCR reaksiyonunun toplam hacmi 26 µl'dir. Reaksiyon tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve Bölüm 8.2.1'de tanımlanan termal döngüleyiciyi kullanarak PCR reaksiyonunu başlatın (Tablo 2).! PCR tamamlandıktan sonra amplifikasyon ürünleri hibridizasyon için hemen kullanılmalı veya bir hafta süreyle -20 C'de saklanmalıdır. Tablo 4: PapilloCheck PCR reaksiyonunun kurulumu 1 reaksiyon 13 reaksiyon (1 çip) 26 reaksiyon (2 çip) 39 reaksiyon (3 çip) 52 reaksiyon (4 çip) PapilloCheck PCR MasterMix HotStarTaq DNA Polimerazı (5 U/µL) 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Urasil-N-Glikosilaz (1:200 seyreltme, 0,005 U/µl) 1 µl 13µL 26 µl 39 µl 52 µl Numune DNA eklenmeden önce toplam hacim (nihai mastermix) Rahim boynu numunesinden DNA ekstraktı (DNA şablonu) Reaksiyon başına toplam hacim (nihai PCR reaksiyonu) 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl 5 µl 26 µl 26

8.3 Hibridizasyon ve yıkama 8.3.1 Hazırlık ve kurulum Gerekli tüm bileşenlerin oda sıcakllığına dengelenmesi için hibridizasyon prosedürüne başlamadan en az 30 dakika önce hibridizasyon ve yıkama adımlarının hazırlıklarına başlayın. Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözmek için bunları 30 dakika süreyle oda sıcaklığına maruz bırakın ve kullanım öncesinde iyice karıştırın. PapilloCheck Test Kitinin 4 ila 'de saklanması Hibridizasyon Tamponunda ve Tampon B'de SDS çökeltisi ile sonuçlanabilir. Solüsyonların oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin ve daha sonra tüpe vorteks uygulayın veya çökeltiler çözülene kadar şişeyi karıştırın. ocheck Hibridizasyon Odasını Hazırlayın: Hibridizasyon Odasına yeni bir nemli kağıt havlu yerleştirin ve neme doygun bir ortam oluşturmak için kapağı kapatın. Çip üzerindeki kullanılmış hibridizasyon karışımının küçük hacminin buharlaşmasını önlemek için hibridizasyonun neme doygun bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekir. Greiner Bio-One tarafından PapilloCheck analizi için özel bir Hibridizasyon Odası sunulmaktadır (bkz. Bölüm 2). Gereken miktarda PapilloCheck çiplerini hazırlanan Hibridizasyon Odasında en az 10 dakika süreyle oda sıcaklığında (20-25 C) inkübe edin.! Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu iki ucun yalnızca birinde bir mıknatıs içerir. Dörtten az PapilloCheck çipinin paralel olarak hibridize edilmesinin gerekmesi durumunda slide tutucuyu mıknatısın karşı tarafından PapilloCheck çipleri ile doldurmaya dikkat edin. Aksi takdirde PapilloCheck çipleri yıkama prosedürü sırasında sıvı ile kaplanmaz. Yıkama solüsyonları I, II ve III'ü aşağıdaki talimatlara uygun olarak hazırlayın. Yıkama solüsyonları I, II ve III'ün hazırlanması: Yıkama solüsyonu karışımını Tablo 5te gösterildiği gibi analiz edilmekte olan PapilloCheck çipleri sayısı için uygun olan yıkama solüsyonları I, II ve III için hazırlayın. Yıkama solüsyonu karışımının üç eşit hacmini üç ayrı ocheck Yıkama Teknelerine alikuotlar halinde bölün ve yıkama solüsyonu I, II ve III olarak etiketleyin. Her bir ocheck Yıkama Teknesi, 4 çipe kadar gerekli olan yıkama solüsyonunun doğru miktarını gösteren yerleşik bir terazi içermektedir. Tampon miktarını kontrol etmek için lütfen bu teraziyi kullanın. Yıkama solüsyonu II'yi kullanmadan önce sıcaklık kontrollü bir su banyosunda en az 20 dakika süreyle 50 C'ye önceden ısıtın. Su banyosunun dolum seviyesinin yıkama solüsyonu II'nin dolum seviyesine eşit olmasını sağlayın. Tablo 5: Yıkama solüsyonu karışımının hazırlanması PapilloCheck çipi sayısı Bileşenler 1 2 3 4 Saflaştırılmış su 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml PapilloCheck Tampon A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml PapilloCheck Tampon A 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml Toplam hacim 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml 27

! Muhtemelen PapilloCheck sonuçlarına engel olacak yıkanmış PCR ürünlerinin birikmesine yol açacağından yıkama solüsyonlarını kesinlikle yeniden kullanmayın. Her miktar tayini için yeni yıkama solüsyonu kullanın. Hazırlanan yıkama solüsyonu karışımı oda sıcaklığında bir hafta süreyle saklanabilir. SDS çökeltisi meydana gelip gelmediğini kontrol edin. Çökelti meydana gelmişse, çökelti çözülene kadar yıkama solüsyonu karışımını ısıtın ve tekrar oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra bir sonraki hibridizasyon deneyi için hazırlanın. 8.3.2 Hibridizasyon Hibridizasyon 20 ve 25 C arası bir ortam sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. PapilloCheck PCR reaksiyonunun PCR ürünlerinin PapilloCheck çipine hibridizasyonu için ana çalışma adımları Şekil 5'de açıklanmıştır. PCR ürünlerini kullanmadan önce karıştırın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün.! PCR ürünleri hibridizasyona kadar -20 C'de saklanmışsa PCR ürünlerini karıştırmadan önce çözün ve daha sonra belirtilen şekilde ilerleyin. Hibridizasyon Tamponuna kullanmadan önce vorteks uygulayın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. 30 μl PapilloCheck Hibridizasyon Tamponunu bir 8x PCR şeridinin temiz reaksiyon tüpüne aktarın. Daha rahat olması durumunda, yeni bir PCR plakası kuyusu kullanılabilir. 5 μl PCR ürününü Hibridizasyon Tamponuna ekleyin ve birkaç defa yukarı aşağı pipetleme yaparak ya da vortekslemeyle karıştırın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. 25 μl hibridizasyon karışımını, çok kanallı bir pipetin altı kanalını kullanarak her bir çip kuyucuğuna aktarın. Hava kabarcığı oluşmasını önleyin! 8 kanallı multipipet ve 8x PCR şeridi kullanılarak altı numunenin paralel bir şekilde işlenmesi önerilir (bkz. Şekil 6). Bu kullanım etkinliğini, hızını arttırır ve böylece buharlaşma riskini azaltır. Bir seferde birden fazla slaytın işlenmesi gerekiyorsa multipipet kullanımı, doğru hibridizasyon süresinin elde edilmesi için zorunludur.! Baloncuk oluşumundan kaçının! Mümkün olursa bir çipin 12 kuyucuğunu hibridize edin. 12'den daha az numunenin işlenmesi durumunda kullanılmamış kuyucukları boş bırakın. İşlenmiş bir çipte kullanılmamış kuyucuklar gelecek numuneler için kullanılamaz.! Hibridizasyon karışımının dökülmesini önlemek için çipi dikkatli bir şekilde kullanın. Dökülme numunelerin çapraz kontaminasyonuna ve hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir. Çipi, karanlık, neme doygun bir ortamda, hazırlanmış bir Hibridizasyon Odası içinde ortam sıcaklığında (20 ila 25 C arası) tam olarak 15 dakika süreyle inkübe edin. Hibridizasyon sırasında Hibridizasyon Odasını hareket ettirmemeye dikkat edin.! İnkübasyon zamanını veya hibridizasyon reaksiyonunun sıcaklığını kesinlikle değiştirmeyin, bu floresan sinyal yoğunluğunun kaybolmasına veya spesifik olmayan floresanda artışa neden olabilir. Hibridize edilen çipleri doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın. 28

Hibridizasyon Odasında neme doygun bir ortam hazırlayın. Gereken miktarda PapilloCheck çipini hazırlanan Hibridizasyon Odasında oda sıcaklığında inkübe edin (bkz. Bölüm 8.3.1). 30 µl PapilloCheck Hibridizasyon Tamponunu PCR şeridin 0,2 ml reaksiyon tüpünde 5 µl PCR ürünü ile inkübe edin. İyice karıştırın. 25 µl hibridizasyon karışımını PapilloCheck çipinin her bir kuyucuğuna çok kanallı bir pipet kullanarak aktarın. Hibridizasyon Odasını kapatın ve PapilloCheck çipini tam olarak 15 dakika süreyle ortam sıcaklığında inkübe edin (20 ila 25 C arası). Şekil 5: Hibridizasyon prosedürünün çalışma adımları 29

8.3.3 Yıkama ve kurutma Greiner Bio-One tarafından tedarik edilen özel ekipman dört PapilloCheck çipinin paralel yıkanmasını sağlar (bkz. Bölüm 2). PapilloCheck çiplerinin işlenmesi için gerekli olan ek ekipmanlar üç adet ocheck Yıkama Teknesi ve Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu kolundan oluşmaktadır. Farklı çalışma adımları Şekil 6'da gösterilmektedir. Hibridize edilen slaytları içeren manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından dikkatli bir şekilde çıkarın. Slide'ları içeren slide tutucuyu doğrudan yıkama solüsyonu I'i içeren ocheck Yıkama Teknesine bırakın. Manyetik tarafın ön tarafa baktığından emin olun. ocheck Kolunu slide tutucusuna takın ve üç yıkama adımının ilkine başlayın. Çipi oda sıcaklığında yıkama solüsyonu I içinde 10 saniye süreyle hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yıkayın. Diziler daima yıkama solüsyonu ile kaplı bir şekilde kalmalıdır. Çipi yıkama solüsyonu II içinde 60 saniye süreyle 50 C'de slide tutucuyu yukarı kuvvetlice hareket ettirerek yıkayın. Çipi oda sıcaklığında yıkama solüsyonu III içinde 10 saniye süreyle hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yıkayın. Santrifüj ile, çip yüzeyinden tüm sıvıları hemen giderin. Mikrodiziler için özel bir mikrosantrifüj kullanılırsa 1 dakika süreyle santrifüj edin. 50 ml'lik tüpler için geçerli olan bir santrifüjün kullanılması durumunda her yıkanan PapilloCheck çipini 50 ml'lik bir tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında 3 dakika süreyle 500 x g'de santrifüj edin. PapilloCheck çipi artık tarama için hazırdır ve hemen taranmalıdır. ocheck Yıkama Teknelerinin temizlenmesi için tamamlanan her yıkama ve kurutma işleminden sonra birkaç defa durulayın. 30