ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Gökhan BAKTEMUR KAVUNDA (Cucumis melo var. inodorus) IŞINLANMIŞ POLENLE UYARTILMIŞ HAPLOİD EMBRİYOLARIN AYRILMASINDA KULLANILABİLECEK FARKLI YÖNTEMLER BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KAVUNDA (Cucumis melo var. inodorus) IŞINLANIMŞ POLENLE UYARTILMIŞ HAPLOİD EMBRİYOLARIN AYRILMASINDA KULLANILABİLECEK FARKLI YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu tez 14/07/2009 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza.... İmza... İmza... Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Prof. Dr. Kazım ABAK Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2008YL14 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KAVUNDA (Cucumis melo var. inodorus) IŞINLANMIŞ POLENLE UYARTILMIŞ HAPLOİD EMBRİYOLARIN AYRILMASINDA KULLANILABİLECEK FARKLI YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Yıl : 2009, Sayfa : 61 Jüri : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA : Prof. Dr. Kazım ABAK : Prof. Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU Bu çalışma 2007-2009 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümünde yürütülmüştür. Materyal olarak Bahçe Bitkileri Bölümü bünyesinde toplanan kavun genetik kaynağındaki Yuva tipi geriye melez 3 (GM3) populasyonundan Y2 ve Y3 nolu genotipler kullanılmıştır. Bu çalışmada embriyoların daha kolay, hızlı, ekonomik ve etkili şekilde çıkartılabilmesi için farklı yöntemler denenmiştir. Çalışmada kontrol uygulaması olarak tohumların tek tek açılması yöntemi kullanılmış; bunun yanında, tohumların doğrudan besin ortamına ekimi, tohumlara ışıkta bakma, tohumların sıvı besin ortamına ekimi ve tohumlara yüzey sterilizasyonu yapılarak ekimi yöntemi olmak üzere olmak üzere beş farklı yöntem denenmiştir. Deneme sonucunda, meyve başına elde edilen ortalama embriyo sayıları tanık olarak kullanılan tek tek açma yönteminde 3.3 ile en yüksek çıkmış, bunu sırayla 3.1 adet ile tohumlara ışıkta bakarak ve 2.4 adet ile tohumların hepsinin CP besin ortamına ekimi yöntemleri izlemiş fakat bu üç uygulama arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli çıkmamıştır. Tüm tohumların sıvı ortama ekimi uygulamasında ise hiç embriyo gelişimi sağlanamamış ve yüksek oranda enfeksiyon sorunu meydana gelmiştir. Gerekli süre ile birlikte işçilik maliyeti dikkate alındığında ise en iyi uygulamanın tohumların ışıkta bakılarak ayrılması yöntemi olmuş, bunu tohumların doğrudan CP besin ortamına ekimi izlemiştir. Anahtar Kelimeler: Kavun, haploid üretim, ışıkta tarama kaynağı, ışınlanmış polen I

ABSTRACT MSc. THESIS DIFFERENT METHODS ON HAPLOID EMBRYO RESCUE OBTAINED USING IRRADIATED POLLEN Gökhan BAKTEMUR DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA Year : 2009, Sayfa : 61 Jury : Prof.Dr. Saadet BÜYÜKALACA : Prof.Dr. Kazım ABAK : Prof.Dr. Şebnem ELLİALTIOĞLU This study was conducted between the years 2007-2009 in Horticulture Department, Faculty of Agriculture, University of Çukurova. Genotype Y2 and Y3 selected from backcross three (BC3) population of Yuva melon genetic resources collected on the Department of Horticulture are allocated. In this study, different methods for embryo rescue were tested to find an easier, fast, economical and effective method. Inspecting the seeds one by one was used as control treatment. Other four methods tested are sowing seeds direct nutrient media, "inspecting seeds on the light", "floating seeds on liquid media" and " floating seeds on liquid media after surface sterilization. Overcome of this study show that, there is no significant difference statistically between the methods Inspecting the seeds one by one, sowing seeds direct CP nutrient media and "inspecting seeds on the light" although the average number of embryos per fruit are slightly different (3.3, 2.4 and 3.1 respectively). No embryo production was obtained from liquid culture due to infection. When labor costs and time requied for embryo rescue taking into account, the best methods are sowing seeds direct CP nutrient media and "inspecting seeds on the light". Key words: Cucumis melo, doubled haploid production, light source, liquid culture, irradiated pollen. II

TEŞEKKÜR Yüksek lisans çalışmalarım esnasında gerek ders gerekse tez dönemimde her türlü maddi ve manevi yardımlarını esirgemeyen, çalışmaların her aşamasında desteğini aldığım danışman hocam Sayın Prof. Dr. Saadet BÜYÜKALACA ya sonsuz teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım. Tez çalışmamın başından beri bilgi ve tecrübesinden faydalandığım Sayın Prof. Dr. Kazım ABAK hocama teşekkürlerimi sunarım. Tüm eğitim ve öğretim dönemim boyunca maddi ve manevi her konuda beni destekleyen ve her zaman yanımda olan aileme teşekkür ederim. Tez çalışmam içinde yer alan istatistik analiz kısmında yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Sevgi PAYDAŞ hocama teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmam içinde yer alan ışık kaynağı sistemini hazırlayan Sayın Prof. Dr. Orhan BÜYÜKALACA hocama teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamda yer alan ekonomik analiz kısmında yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Aykut GÜL hocama teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında gerek arazi çalışmaları olsun gerekse laboratuvar kısmında benden yardımlarını esirgemeyen araştırma görevlisi Mehtap YILDIZ a teşekkür ederim. Laboratuvar kısmında yardımlarını aldığım araştırma görevlileri Hatıra TAŞKIN, Songül ÇÖMLEKÇİOĞLU yüksek lisans öğrencisi Meltem BERBER ve lisans öğrencilerinden Meryem SARI, Özgün ÇAKIROĞLU na teşekkür ederim. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.... ABSTRACT...... TEŞEKKÜR...... İÇİNDEKİLER. SİMGELER VE KISALTMALAR... ÇİZELGELER DİZİNİ..... ŞEKİLLER DİZİNİ.. I II IIII IV VI VIII X 1. GİRİŞ... 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR.. 6 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER... 16 3.1. Materyal... 16 3.2. Yöntem.... 16 3.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi... 16 3.2.2. Emaskülasyon.. 18 3.2.3. Erkek Çiçeklerin Tozlanması ve Işınlanması.. 19 3.2.4. Çiçeklerin Tozlanması. 20 3.3. Embriyoların Çıkartılması... 22 3.3.1. Dezenfekiyon... 22 3.3.2. Tohum ve Embriyoların Çıkartılması.. 23 3.3.2.1. Tohumların Tek Tek Açılması Yöntemi. 26 3.3.2.2. Tohumların Doğrudan Besin Ortamına Ekimi. 27 3.3.2.3. Tohumların Sıvı Besin Ortamına Ekimi.. 28 IV

3.3.2.4. Tohumların Yüzey Sterilizasyonu Yapılarak Ekimi.. 29 3.3.2.5. Tohumlara Işıkta Bakma Yöntemi. 30 3.4. Ekonomik Analiz 31 3.5. İstatistik Analizi..... 31 4. BULGULAR VE TARTIŞMA... 32 4.1. Çiçeklerin Tozlanması.... 32 4.2. Tohum ve Embriyoların Çıkartılması..... 35 4.2.1. Tek Tek Açma.. 35 4.2.2. Doğrudan Ekim 37 4.2.3. Sıvı Ortama Ekim... 40 4.2.4. Sterilizasyonu Sonrası Ekim... 40 4.2.5. Işıkta Bakma... 42 4.3. Embriyo Kurtarma Yöntemlerinin Karşılaştırılması....... 43 4.4. Ekonomik Analiz 46 4.4.1. Yöntemlerin Süre Açısından Kıyaslanması.. 46 4.3.2. Yöntemlerin Maliyet Açısından Kıyaslanması.. 49 5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER... 51 KAYNAKLAR.... 54 ÖZGEÇMİŞ..... 61 V

SİMGELER VE KISALTMALAR GM : Geriye Melez Co 60 : Kobalt 60 Gy : Gray % : Yüzde g : Gram mg : Miligram ml : Mililitre l : Litre mg/l : Miligram/litre g/l : Gram/litre E20A : Çalışmada Kullanılan Besin Ortamı CP : Çalışmada Kullanılan Besin Ortamı MS : Murashige and Skoog Besin Ortamı W : Watt (Işık gücü) TBS : Tozlanan Bitki Sayısı TMS : Tutan Meyve Sayısı HGMS : Hasada Gelen Meyve Sayısı BDES : Bitkiye Dönüşen Embriyo Sayısı GBS : Gelişen Bitki Sayısı EO : Enfeksiyon Oranı TL : Türk Lirası $ : Dolar dk : Dakika v : Hacim n : Haploid 2n : Diploid 2,4-D : 2,4 dikloro fenoksi asetik asit M : Molar µm : Mikromolar VI

µ : Mikron kgy : Kilogray Ç.Ü. : Çukurova Üniversitesi VII

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. E20A besin ortamının bileşimi... 24 Çizelge 3.2. CP besin ortamının bileşimi... 25 Çizelge 4.1. Çizelge 4.2. Çizelge 4.3. Çizelge 4.4. Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. İki kavun genotipinde yıllara göre tozlanan bitki sayısı, tutan meyve sayısı ve hasada gelmiş meyve sayıları... 33 Kavunda tohumların tek tek açma yönteminde meyve başına tohum sayısı, elde edilen embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları.... 36 Kavunda tohumların doğrudan CP besin ortamıyla ekim yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları. 37 Kavunda tohumların doğrudan E20A besin ortamıyla ekim yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları.. 38 Kavunda sterilizasyon sonrası tohumların CP besin ortamına ekim yönteminin meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları.. 41 Kavunda sterilizasyon sonrası tohumların E20A besin ortamına ekim yönteminin meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları.. 41 VIII

Çizelge 4.7. Kavunda tohumlara ışıkta bakma yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları. 43 Çizelge 4.8. Çizelge 4.9. Çizelge 4.10. Çizelge 4.11. Kavunda meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayılarının yöntemlere göre karşılaştırılması.. 44 Farklı yöntemlerle elde edilen meyve başına ortalama embriyo sayıları... 45 Farklı yöntemlerle elde edilen meyve başına ortalama embriyo sayıları ve geçen süre... 47 Farklı embriyo kurtarma yöntemlerinde işgücü ve süreye göre embriyo maliyetleri. 50 IX

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Olgunlaşmamış Yuva kavunları... 16 Şekil 3.2. Tohum ekimi için viyollerin torf: perlit karışımı ile doldurulması 17 Şekil 3.3. Tohum ekimi yapılmış viyollerin fide serasındaki görünümü.. 17 Şekil 3.4. Ekim sonrası bakım işlemleri...... 17 Şekil 3.5. Fidelerin 2 3 yapraklı dönemi.. 17 Şekil 3.6. Yetiştiricilikte kullanılacak olan bitkilerin dikimden sonraki görünümü 17 Şekil 3.7. Bitkilerin ipe sardırılması.... 17 Şekil 3.8. Anthesisten 1 gün önceki aşama... 18 Şekil 3.9. Emaskülasyon işlemi.... 18 Şekil 3.10. Selofan keselerle kapatma.... 18 Şekil 3.11. Erkek çiçeklerin taç ve çanak yapraklarından ayrılması... 19 Şekil 3.12. Işınlamaya hazır erkek çiçekler.... 19 Şekil 3.13. Erkek çiçeklerin ışınlandığı reaktör ve ışınlamaya hazır erkek çiçekler 19 Şekil 3.14. Emasküle edilmiş kavun çiçeği. 20 Şekil 3.15. Emasküle edilmiş kavun çiçeğinde tozlama yapılışı... 20 Şekil 3.16. Kavun çiçeğinin selofan keseyle kapatılması.... 21 X

Şekil 3.17. Tozlamadan sonraki 4. gündeki bir meyvenin görünüşü. 21 Şekil 3.18. Hasat zamanı gelmiş bir meyve.... 22 Şekil 3.19. Ön hazırlık odasına meyvelerin getirilmesi... 22 Şekil 3.20. Meyvenin kuru yakma yöntemi ile dezenfeksiyonu... 22 Şekil 3.21. Kuru yakmanın yapılışı. 22 Şekil 3.22. Meyvenin boyuna kesimi.. 23 Şekil 3.23. Tohumların çıkartılması 23 Şekil 3.24. Tohumların binoküler mikroskop altında tek tek açılması... 26 Şekil 3.25. Haploid bir embriyonun E20A ortamına aktarılması...... 26 Şekil 3.26. Tohumların CP ortamına direk ekimi... 27 Şekil 3.27. Tohumların E20A ortamına direk ekimi... 27 Şekil 3.28. Tohumların sıvı ortama ekimi sonrası iklim odasına alınması. 28 Şekil 3.29. Kavun tohumlarına yüzey sterilizasyonunun yapılması.. 29 Şekil 3.30. Sterilizasyon sonrası kavun tohumlarının direk ekimi. 29 Şekil 3.31. Işık düzeneği... 30 Şekil 3.32. Işık düzeneğinde tohumlara bakma.. 30 Şekil 3.33. Haploid embriyo olan tohumların açılması.. 30 Şekil 4.1. Kavun genotiplerinde Nisan ayı tozlanan çiçeklerin (%) oranları..... 34 XI

Şekil 4.2. Kavun genotiplerinde Mayıs ayı tozlanan çiçeklerin (%) oranları.. 34 Şekil 4.3. Haploid embriyoların bitkiye dönüşümü... 36 Şekil 4.4. CP besin ortamı ile doğrudan ekim sonucu tohumların bitkiye dönüşümü. 39 Şekil 4.5. E20A besin ortamı ile doğrudan ekim sonucu tohumların bitkiye dönüşümü. 39 Şekil 4.6. Tek tek açma yöntemine göre olası embriyo kayıp oranları 46 XII

1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR 1.GİRİŞ Çok eskilere dayanan kabakgil sebzelerinin yetiştiriciliği günümüzde de oldukça önemli bir yere sahiptir. Bu sebzelerin en önemlilerinden birisi olan kavunun kökeni konusunda birçok kaynakta farklı görüşler bulunmaktadır. Pitrat ve ark., (1999), Cucumis cinsine giren yabani tiplerin Afrika da özellikle Sudan da çok yaygın görüldüğünü belirterek, kavunun orjininin Afrika olduğunu, M.Ö. 3000 yıllarında yetiştiriciliğine başlanan kavunun M.Ö. 2000 yıllarında Mısır a ve M.Ö. 1000 yıllarında da Hindistan a ulaştığını belirtmektedirler. Aynı kaynakta savunulan diğer bir görüşte ise kavunun orjinin Hindistan olduğu belirtilirken bu görüşün Hindistan da uzun zamandır kavun yetiştiriciliğinin yapılması ve çok sayıda yabani tiplerin bulunması ile desteklendiği belirtilmektedir. Aynı araştırıcılar, kavunun ikincil gen merkezi olarak ise Asya nın Akdeniz den Japonya ya kadar olan kesimini göstermektedirler. Bu görüşleri paylaşan Robinson ve Decker-Walters (1997) da, kavunun Afrika kökenli olduğunu belirtmekle birlikte ikincil gen merkezi olarak ise, Türkiye, İran, Hindistan, Afganistan, Çin gibi ülkeleri belirtmektedirler. Aynı yazarlar Doğu Anadolu Bölgesi nin, özellikle Van yöresinin önemli bir mikro gen merkezi olduğunu kaydetmektedirler (Köksal, 1999). Cucurbitaceae familyasında yer alan kavun (Cucumis melo L.) besin değeri ve üretiminin hızla artması nedeni ile oldukça önemli bir sebze türüdür. Kavun protein (% 0.6 1.2 / 100 g), vitamin, mineral maddeler, A (500 4200 IU /100 g ) ve K vitaminleri (130 330 mg / 100 g ) yönünden zengindir (Lorenz ve Maynard, 1988). Kavunun tüketim şekillerinin çeşitliliği ekonomik önemini arttırmaktadır. Taze olarak tüketiminin yanı sıra, son yıllarda meyve salatası ve meyve suyu yapımında kullanımı da yaygınlaşmıştır. Ayrıca gıda sanayinin diğer kollarında da (pasta, reçel, dondurma, meyveli yoğurt) kullanılmaktadır. Olgunlaşmamış meyveleri turşu yapımında kullanıldığı gibi, uzak doğuda çorba yapımında da değerlendirilebilmektedir. Bazı kavun çeşitlerinin süs bitkisi olarak da kullanıldığı bilinmektedir. Bunun yanı sıra parfümeri ve kozmetik sanayiinde (şampuan, parfüm) kullanımı da yaygındır (Wien, 1997). Kavun insan beslenmesi açısından ve yıllık 1,2 milyon ha'lık alanda 27,5 milyon ton üretim ile dünyada ekonomik olarak büyük 1

1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR öneme sahiptir. Türkiye 116 bin ha alanda yaklaşık 1,7 milyon ton kavun üretimi ile dünya kavun üreticisi ülkeler arasında ikinci sırada yer almaktadır (Anonim, 2007). Türkiye'de üretilen kavunların %85'i inodorous (Kırkağaç, Hasanbey, Yuva ve Kışlık Sarı) diğer kısım (%15) ise cantalupensis ve reticulatus grubunda yer almaktadır (Abak, 2001). Yetiştiricilik hemen tüm bölgelere yayılmış durumdadır. Cantalupensis grubu kavun tipleri genellikle Akdeniz bölgesinde yaygınlık gösterirken, inodorus grubu kavunlar İç Anadolu, Ege ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde yaygınlık göstermektedir. Ülkemiz kantalop kavunların gen merkezi olmasına rağmen, bu türün yabancı tozlanma eğiliminin yüksek olması ve üreticiler tarafından bilinçsizce yapılan tohum karışımları nedeni ile mevcut çeşitler sahip oldukları özellikleri kaybetmişlerdir. Yabancı tozlanmalar nedeni ile klasik ıslah çalışmaları kavunda 8 10 yıl sürmektedir. Bitkilerin ekonomik yararları göz önünde bulundurularak genetik yapılarını değiştirmeyi ve iyileştirmeyi amaçlayan ıslah çalışmaları, son yıllara kadar klasik yöntemlerle sürdürülürken günümüzde in vitro tekniklerin kullanılması ile daha hızlı ve etkin bir şekilde yürütülmeye başlanmıştır. Kendilenmiş bitki hatları sebze ıslahının temel materyalini oluşturmaktadır. Bu hatlar uzun yıllar süren kendilemelerle elde edilmektedir. Bu sürenin kısaltılması ve bir bitki materyalinin durağan hale getirilmesi için ardı ardına yapılması gereken kendilemelere alternatif olarak Dihaploidizasyon yöntemi büyük öneme sahiptir (Sarı, 1994). Haploid kromozom sayısına sahip bitkilerin elde edilmesi ve bunların kolhisin gibi bazı maddelerle kromozom sayılarının iki katına çıkartılmasıyla bir yıl içerisinde % 100 homozigot saf hatlar elde etmek mümkün olabilmektedir. Böylece 5 6 yıl süren homozigotlaştırma işlemini 1 yılda, 8 10 yıl süren ıslah çalışmaları da 3 4 yıl gibi bir sürede tamamlama olanağı ortaya çıkmaktadır. Doğada ortaya çıkış sıklığı az ve düzensiz olan haploid bitkiler yeterli miktarda olmadığı ve istendiği zaman bulunamadığı için ıslah çalışmalarında kullanılabilme özelliğine sahip değillerdir. Erkek veya dişi gamet hücrelerinden in vitro koşullarda haploid embriyo ve bitki elde etme olanağı sağlayan doku kültürü teknikleri birçok bitki türünde dihaploidlerin elde edilmesinde faydalıdır. Solanaceae ve Cruciferae familyalarına ait türlerin birçoğunda anter ve mikrospor kültürleri yoluyla androgenetik haploidler 2

1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR elde edilebilirken, Cucurbitaceae familyasına ait kabakgil sebzelerinde yumurta (ovul) kültürü ile daha olumlu sonuçlar alınabilmektedir. Cucurbitaceae familyasında önceleri hem anterler, hem de ovul ve ovaryumlar in vitro kültüre alınarak denenmiştir. Anter kültüründen olumlu bir sonuç alınamamış, ovul-ovaryum kültürlerinden elde edilen bitki sayıları ise çok az olmuştur. Kavunda dihaploidizasyon yöntemi 1979 yılında (Dumas de Vaulx, 1979) başarılı sonuçlar vermiştir. 1990 lı yıllara doğru gama ışını uygulanmış polenlerle tozlamalar yaparak in sitü haploid embriyo uyartımı ve bu embriyoların özel besin ortamları üzerinde in vitro kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmesi araştırılmıştır. Bu yolla Cucumis türlerinin ilk haploid embriyoları kavunda elde edilmiş ve bu embriyolar in vitro da bitkiye dönüştürülmüştür (Sauton ve Dumas de Vaulx, 1987). Daha sonra aynı teknik karpuzda, hıyarda ve kabakta denenmiş ve başarılı sonuçlar alınmıştır ( Sarı ve ark., 1991 ; Çağlar ve Abak, 1999; Kurtar ve ark., 2002). Haploidizasyon ıslah çalışmalarında araştırıcılara önemli avantajlar sunmaktadır (Reinert ve Bajaj, 1977; Pochard ve Dumas de Vaulx, 1979; Hermsen ve Ramanna, 1981; Abak, 1982; Emiroğlu, 1982; Bajaj, 1983; Lespinasse ve ark., 1983; Dunwell, 1985; Abak, 1988; Chambonnet, 1988; Abak, 1993; Demarly ve Sibi, 1989; Pierik, 1989; Bhojwani, 1990; Gallais, 1990; Sangwan ve Sangwan- Norell, 1990; Thorpe, 1990; Zhang ve ark., 1990; Kuckuck ve ark., 1991; Emiroğlu ve Gürel, 1993a; Sarı, 1994; Abak ve ark., 1996). Haploidler ve dihaploidler sitolojik ve genetik açıdan oldukça önemli deneysel materyallerdir. Diploid materyale uygulanan mutagenlerin resesif yönde oluşturduğu mutasyonlar, bu materyallerden seçilen haploidler yardımıyla daha ilk generasyonda belirlenebilmektedir. Ayrıca haploid hücre ya da bitkilerde ortaya çıkan mutasyonlar, bu bitkilerin kolayca diploidizasyonu sonucu yeni çeşitlerin geliştirilmesinde yarar sağlayabilmektedir. Haploid hücre kültürü, mutasyonlar ve hücre modifikasyonlarının incelendiği somatik hücre genetiği çalışmalarında çok elverişli bir yöntemdir. Haploidler ve dihaploid homozigotlarda genetik açılım (segregation) basittir, resesif genler dominantlar tarafından örtülmezler. Haploidlerin, değişik 3

1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR ortamlarda ve farklı patojenlere ya da patojenlerin farklı ırklarına karşı in vitro seviyede seçime olanak vermesi hastalıklara dayanıklılık çalışmalarında yer, zaman maddi kazanç sağlamaktadır. Özellikle yabancı döllenen türlerde 10 12 generasyon tekrarlanan kendilemeler ile ulaşılan homozigotiye, dihaploidizasyon yönteminin kullanılmasıyla bir generasyonda en hızlı ve kolay bir şekilde ulaşılır. Kendilemenin olanaksız olduğu bazı dioik türlerde haploid uyartımı ve bunu takip eden kromozom katlanmasıyla saf erkek bitkiler elde etmek mümkündür. Klasik yöntemlerle homozigotiye ulaşmanın oldukça zor olduğu ve kendileme depresyonunun görüldüğü çilek ve lahana gibi türlerde dihaploidizasyon ile bu sorun bir generasyonda çözülebilir Dihaploid bitkilerden oluşturulan saf hatlar kendine ve yabancı döllenen türlerde doğrudan çeşit olarak veya hibrit çeşitlerin geliştirilmesinde ebeveyn olarak kullanılabilirler. Ayrıca dominansi etkisinin kalkması nedeniyle, heterozigot bitkilerin kendilenmiş döllerinin değerlendirilmesinde Dihaploid hatlar çok güvenlidir. Yöntemin yaygınlaşmasını engelleyen iki önemli faktör bulunmaktadır. Birincisi ışın kaynağına bağımlılık, ikincisi ise haploid embriyoların çıkartılmasındaki yoğun işgücü ve zaman ihtiyacıdır. Yapılan bu çalışmada embriyoların daha kolay ve etkili çıkartılabilmesi için farklı yöntemler denemeye alınmıştır. Çalışmada şu anda yaygın olarak kullanılan tohumların tek tek açılarak içinden haploid embriyoların kurtarılması yöntemi kontrol olarak kullanılmıştır. Kapsamlı ıslah çalışmalarında çok fazla bitki ile çalışıldığından bu yöntem çok zaman alıcı olduğu için yeterince etkin olamamaktadır. Bu yönteme alternatif olarak hem daha kısa sürede yapılabilecek hem de etkin olabilecek diğer yöntemler denenmiştir. Bu yöntemler; 1. Çıkarılan tohumların tamamının hiçbir uygulamaya tabi tutulmadan doğrudan olarak besin ortamına ekimi ve 10 gün boyunca gözleminden sonra çimlenmeye başlayan haploid embriyoların kültür tüplerine aktarımı, 2. Çıkarılan tohumların tamamının agar içermeyen sıvı besin ortamına ekimi ve çimlenme gösteren haploid embriyoların agarlı ortama transferi, 4

1. GİRİŞ Gökhan BAKTEMUR 3. Çıkarılan tohumların hepsine % 15 lik sodyum hipoklorit uygulaması ile 10 dakika yüzey sterilizasyonu yapıldıktan sonra ortama ekim ve diğer doğrudan ekim yöntemlerinde olduğu gibi çimlenme gösteren haploid embriyoların aktarımı, 4. Güçlü bir ışık kaynağı üzerinde çıkarılan tohumların hepsine bakılarak haploid embriyoların aranması, içinde embriyo görünen tohumların açımı ve çıkarılan embriyoların kültür tüplerine aktarımıdır. Çalışma kapsamında bu yöntemlerin tamamı hem embriyoların kurtarılması için geçen süre hem de embriyo sayısı dikkate alınarak karşılaştırılmıştır. Ayrıca çalışma kapsamı içerisinde yöntemlerin ekonomik olarak kıyaslaması da yapılmıştır. 5

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Blakeslee ve ark. (1922), tarafından Datura stroamonium bitkisinde ilk doğal haploid bitkilerin keşfedilmesinden sonra haploidi çalışmaları başlamıştır. Daha sonra, konunun öneminden dolayı pek çok bitki türünde haploid bitki elde etme denemelerine girilmiş, bir yandan çiçeklere dışsal uygulamalar yaparak, öte yandan da haploid eşey hücreleri taşıyan dokuları in vitro kültürlere alarak başarıya ulaşılmaya çalışılmıştır. Bu çalışmalar her iki cinsiyete ait gametlerde de yürütülmüş; ancak 1976 yılına kadar yalnızca erkek gametlerden hareketle haploid bitkiler elde edilmiştir. 1964 yılında Guha ve Maheswari, 1967 yılında da Bourgin in katkılarıyla geliştirilen anter kültürü tekniği ile bugün birçok bitkide haploidi yöntemi ıslah programlarında kullanılır hale gelmiştir (Oinuma, 1977; Dumas de Vaulx, 1979; Henry ve Buyser, 1983). Aalders (1958), hıyarda (Cucumis sativus L.) haploid bitki elde etmek amacıyla, hasat ettiği olgunlaşmamış meyvelerin tohumlarını suda yüzdürme yöntemini uygulayarak su üzerinde kalan hafif tohumların embriyolarını kültüre almış ve 13 adet haploid hıyar bitkisi elde etmiştir. Cucurbitaceae familyasının ilk monoploid özelliği taşıyan bu bitkilerinin 8 tanesi büyütülebilmiş ve kolhisin uygulanarak diploid hale getirilmiştir. Fakat bu bitkilerden yeni bireyler elde edilememiştir. Dumas de Vaulx (1979), kavunu (Cucumis melo L.) (2n=24), Cucumis ficifolius (2n=4x=48) ile tozlayarak türler arası melezlemeler yapmıştır. Polenlerin çim borusu gelişimini uyartmak amacıyla, stigmalarını yüzeysel olarak bistüri ile kesip dişi çiçekleri kavun polenleri ile tozlayarak meyveler elde etmiştir. Tozlama sonucu elde edilen meyvelerin tohumlarından melez bitki elde edilememiştir ve oluşan bitkilerin gelişimlerinde sorunlarla karşılaşılmıştır. Bitkilerde kromozom sayımları yapıldığında haploid yapıda oldukları ve haploid oranlarının ise ilkbahar aylarında % 0.284, sonbaharda ise % 0.070 olduğu tespit edilmiştir. 6

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Dryanovska ve IIieva (1983), kavunda (Cucumis melo L.) organogenesis ve haploid bitki elde edebilmek için anter ve ovül kültürü kullanmışlardır. Araştırıcılar, ovülleri plesenta ile kültüre alarak kallus oluşturmuş ve bunun sonucunda da bir tane haploid bitki elde etmişlerdir. Custers ve Bergervoet (1984), 0, 10, 100 ve 1000 Gy dozlarında gama ışını uyguladıktan sonra Cucumis melo var. Noy Yizrael polenleri ile Cucumis sativus var. hardwickii yi tozlamışlardır. Tozlamadan 3 hafta sonra meyveler hasat edilmiştir. Endospermli embriyo taşıyan ovül sayısı ile embriyo ve endosperm boyutlarını incelenmiştir. Sonuç olarak 10 Gy dozundaki uygulama, kontrol polenleri ile yapılan uygulamalardan farklı sonuçlar vermemiş, ışın dozu yükseldikçe parametrelerde düşüş görülmüştür. Chambonnet ve Dumas de Vaulx (1985), kabakta (Cucurbita pepo L.) döllenmemiş ovülleri anthesisten 1-2 gün önce kültüre alarak % 4-7 oranında bitkicikler elde edebilmişlerdir. Araştırıcılar, sitolojik inceleme sonucunda bitkilerin diploid, haploid-diploid kimeralar ve poliploid gibi değişik ploidi düzeyine sahip olduklarını tespit etmişlerdir. Sauton ve Dumas de Vaulx (1987), kavunda ışınlanmış polen tekniği kullanılarak haploid embriyo elde edebilmek amacıyla yaptıkları çalışmada tozlamada kullanılan çiçek tomurcuğu sayısı, ışın dozu ve çeşidin etkilerini araştırmışlardır. Çalışma sonunda denenen her 3 faktörün de embriyo verimine etki ettiğini ve haploid embriyo oranının % 1.59 ile % 2.77 arasında değiştiğini bildirmişlerdir. Sauton (1987), ticari bir F1 kavun çeşidini normal kültür koşulları altında serada yetiştirerek kendileme yapmıştır. Ovaryumları tozlamadan 5 gün sonra alarak içerisine birkaç damla Tween-20 damlatmış olan % 10 luk kalsiyum hipoklorit solüsyonunda 10 dakika yüzey sterilizasyonu yaptıktan sonra saf su ile 3 kez çalkalayarak içerisinde nemlendirilmiş filtre kağıtları bulunan petrilere aseptik koşullarda transfer etmiştir. Plesanta dokuları dikkatlice çıkarılan ovüllerin 20 g/l sakkaroz + 10 g/l agar ilave edilen MS ortamında kültüre alındıktan 3 4 hafta sonra çimlendiği, 4 hafta sonunda da bitkilerin toprağa şaşırtılacak duruma geldiği gözlenmiştir. 7

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Shail ve Robinson (1987) un Cucurbita pepo türüne ait olan 3 çeşit kabak genotipinde ovül kültürü yapılmıştır. Denenen çeşitlerin sadece bir tanesinde kalluslar elde edilebilmiş; ancak bitkiye dönüşüm gerçekleşememiştir. Bu çeşit C. ecuadorensis ile tozlamadan 24-72 saat sonra çıkarılıp kültüre alındığında ovüllerden de bitki elde edilememiştir. Olgun meyvelerden çıkartılmış ve in vitro da kültüre alınmış embriyolardan türler arası melez bitkiler elde edilebilmiştir. Zagorcheva ve ark. (1987), Cucumis ficifolius un (2n=24) izole edilen dişi çiçeklerini C. sativus (2n=14) veya C. melo var. flexuosus un çiçek tozları ile tozlamışlar ve 8 bitki elde etmişlerdir. Bu bitkilerin birisinde yapılan kromozom sayımında, bitkinin n=12 kromozom taşıdığı (haploid olduğu) görülmüştür. Diploidlere göre daha yavaş geliştiği görülen bu haploid bitkilerde yaprakların küçük ve daha parçalı, açan dişi ve erkek çiçeklerin küçük, çiçek saplarının daha kısa olduğu ve taç yapraklarının altta birleşmediği belirlenmiştir. Bu haploidlerde kendileme yapıldığında meyve elde edilmezken, C. sativus çiçek tozlarıyla tozlandığında çiçeklerin % 80 inin meyve bağladığı ve bu meyvelerdeki tohum sayısının ortalama 3.5 adet olduğu saptanmıştır. Kwack ve Fujieda (1988) tarafından yapılan bir çalışmada, Cucurbita moschata nın döllenmemiş ovülleri in vitro kültüre alınarak haploidi uyartımı incelenmiştir. Yazarlar anthesis safhasında alınarak 2 gün 5 o C de ön sıcaklık uygulanan ovaryumlardan alınan ovüllerin 30 g/l sakkaroz içeren MS ortamı üzerinde kültüre alınmasının en iyi sonucu verdiğini ve ovüllerden % 17 sinin embriyo oluşturduğunu bildirmişlerdir. Bu embriyoların uygun bir ortama transferinde ise çoğunun kallus oluşturmaya yöneldiğini ve anormal morfolojik gelişmeler gösterdiğini, yalnız birkaç tanesinin normal sürgün ve kök verdiğini tespit etmişlerdir. Araştırma sonucunda elde edilen 3 bitkiden birinin diploid (2n=40), ikisinin ise tetraploid olduğu görülmüştür. Sauton (1988), kavunda ışınlanmış polen tekniği ile haploid embriyo verimi üzerine genotipin ve mevsimin etkisini incelemiştir. Mart-Ekim ve Şubat-Haziran dönemlerinde cam serada yetiştirilen bitkilerden Cucumis melo var. cantalupensis e giren Arizona ve Virka çeşitleri ile Vèdrantais çeşidi 300 Gray dozunda ışınlanmış polenle tozlanmıştır. En başarılı sonuçlar 100 tohumdaki embriyo oranının yaklaşık 8

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR olarak 2.6-2.9 arasında olduğu 10 Haziran 15 Eylül döneminden alınmıştır. Çalışmada 7 farklı genotip kullanılmış ve her genotip için 100 tohum açılmıştır. Açılan tohumlardan haploid embriyolar elde edilmiş olup in vitro ortamda kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmüştür. Çalışmadan elde edilen sonuçlar mevsimin haploid embriyo uyartımı için önemli bir etken olduğunu vurgulamıştır ve en yüksek haploidi oranı % 0.17 ve % 0.16 ile Arizona ve Vèdrantais çeşitlerinde gözlemlenmiştir. Savin ve ark. (1988), X ışınları kullanarak dolu-boş tohum ayrımının yapılması esasına dayanan bir yöntem geliştirmişlerdir. Araştırıcılar, bu teknik yardımıyla partenogenetik haploid embriyoları ayırma ile izole etmede önemli derecede hız kazanıldığından ve embriyo bulunmayan boş tohumları açarak kaybedilen zamandan tasarruf edildiğinden bahsetmişlerdir. Bu yöntem daha sonraki yıllarda Sauton ve ark. (1989), tarafindan kavun bitkisinde kullanılmıştır. Işınlanmış polenlerle toz1amadan 3, 4, 5 veya 6 hafta sonra aldıkları olgunlaşmamış meyvelerdeki tohumları farklı sürelerde (0, 10, 15 veya 20 saat) 4 C'de kurutmuşlardır. X ışınının voltajını 15 kvp, akımını 3 ma ve ışınlanma süresini 2 dakikaya ayarlayan araştırıcılar, haploid embriyoların en iyi görünümünü tozlamadan 4 5 hafta sonra çıkarılan ve 15 saat 4 C'de tutulan tohumlardan elde etmişlerdir. Sauton (1989), kornişon tipi hıyarlarda (Cucumis sativus L.) ışınlanmış polenlerle tozlama ile haploid embriyo uyartımı konusunda yaptığı çalışmada ışın kaynağı olarak Co 60 kökenli gama ışınını (300-1000 Gy) kullanmıştır. Tozlamadan 3 hafta sonra hasat edilen meyvelerin içindeki tohumlar tamamen boş bulunurken, sadece 1 adet meyve içerisinde az sayıda tohumda embriyo oluşumları gözlenmiştir. Araştırma sonucunda yaşayan bitki oranı ortalama % 0.3 olarak bulunmuştur. Buna rağmen normal diploid polenlerle toz1ama sonucu meydana gelen tohumların % 30-60'ının dolu ve diploid olduğu gözlenmiştir. 9

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Keller (1990a), yaptığı çalışmada Allium cinsine giren soğan (Allium cepa L. var. Stuttgarter Riesen, Carmen, Kartalski, Copra ile diğer bazı hatlar), pırasa (A. porrum L. ), şalot (A. phoenoprasum) ile A. altaicum ve A. fistulosum gibi bazı türlerde ovül, ovaryum ve çiçek tomurcuğu kültürleri ile başarılı haploidi çalışmaları yapmıştır. Soğanda in vitro kültüre alınan ovüllerden, genotiplere göre % 0.08 0.58 arasında değişen oranlarda doğrudan embriyo gelişimi ile bitkicikler oluşmuştur. Ovaryum kültürlerinde ise sadece kallus gelişimi olduğunu tespit edilmiş olup, diğer Allium türlerinde yalnızca kallus gelişimini sağlayabilmiş, bitki elde edememiştir. Soğanda elde edilen bu bitkilerin tümünün haploid kromozoma sahip olduğu ve morfolojik olarak da diploidlerden daha küçük olduğu gözlemlenmiştir. Keller (1990b), androgenesise tepki vermeyen bir tür olan Allium cepa L. de döllenmemiş ovaryum kültürü yaparak haploid bitki eldesinde başarılı olmuştur. Araştırıcı, geniş bir genotip koleksiyonunda yaptığı çalışmada elde ettiği 457 rejenerantın 164 ünde ploidi durumunu incelemiş ve % 62.2 sinin haploid, % 31.7 sinin diploid ve % 6.1 ininde mixoploid olduğunu saptamıştır. Bu çalışmda in vitro kültürde gelişimin erken döneminde dev çekirdek oluşumu, kallus oluşumu ve vitrifikasyon görülmüş olup, düşük düzeydeki bu oluşumlarla birlikte dejenerasyonun olduğu belirlenmiştir. Gürsöz ve ark. (1991) nın, karpuzda ışınlanmış polenlerle uyartım yoluyla haploid embriyo üzerine yaptıkları çalışmada, değişik safhalarda toplam 761 adet embriyo elde edilmiştir. Araştırıcılar, embriyoların çoğunluğunun (%72) globüler safhada olduğunu ve bitkiye dönüşüm oranlarının çok düşük bir düzeyde (761 embriyodan 17 adet biki elde edilebilmiştir) kaldığını bildirmişlerdir. 31 Mayıs 13 Haziran tarihleri arasındaki tozlama dönemi en uygun dönem olarak bulunmuştur. Elde edilen bitkilerde yapılan sitometrik analizler (Flow Sitometri) sonucunda bitkilerin tamamının haploid oldukları saptanmıştır. Maestro Tejada (1992), Vẻdranatis x PI 161375 melez kavun genotipinde, 10

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR 300 Gray dozunda gama ışını uygulanmış Vẻdranatis polenleriyle tozlamalar yapılmıştır. Tozlama sonucunda % 35-40 arasında olan meyve tutumunun dişi çiçeğin 8 adet erkek çiçek tomurcuğunun polenleriyle tozlanmasıyla % 87 ye çıktığını tespit etmiştir. Bununla birlikte, haziran ayının meyve başına elde edilen embriyo sayısı açısından (6 adet/meyve) en uygun dönem olduğu ve bu oranın eylül ayının ikinci yarısı itibariyle 0.8 adet/meyve ye kadar düştüğü görülmüştür. Embriyoların % 57 si bitkiye dönüştürülmüş olup, kolhisin uygulamalarıyla bunlardan dihaploid hatlar geliştirilmiştir. Sarı ve ark. (1992), üç botanik varyeteye ait (C. melo var. inodorus ve C. melo var. reticulatus ve C. melo var. cantalupensis) ait 5 kavun çeşidinde ışınlanmış polenle (300 Gy) haploid embriyo uyartımını amaçladığı çalışmalarında, bu yöntemin ve ışın dozunun kavunda genotiplere göre değişmekle birlikte etkin olduğu sonucuna varmışlardır. Abak ve ark. (1996), kavunda ışınlanmış polen tozlamaları ile haploid embriyo uyartımında genotip etkisi, dihaploid hatların oluşturulması, haploid ve diploid bitkilerin değişik yöntemlerle ayrımı konusunda yaptıkları çalışmada 3 varyeteye ait 18 genotipi denemeye almışlar ve 14 genotipte haploid embriyo oluşumu gözlemlemişlerdir. Ayrıca ploidi düzeylerinin belirlenmesinde stoma boyutlarının ve içerdikleri kloroplast sayılarının güvenle kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Yanmaz ve Taner (1996), kavun türünde 300 ve 350 Gy dozundaki gama ışını ile ışınladıkları polenlerle Yuva, Kırkağaç ve birkaç ümitvar kantalop hattını tozlamışlar ve 300 Gy dozunun haploid embriyo uyartımında (% 48.18) etkili olduğunu bildirmişlerdir. Yılan kavunu olarak da bilinen acur (Cucumis melo var. flexuosus) türünde embriyo uyartımını sağlamak amacıyla 250, 300 ve 350 Gy ışın dozunu deneyen Yanmaz ve ark. (1997), 300 ve 350 Gy dozlarında embriyo ve bitki elde ettiklerini bildirmişlerdir. 11

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Metwally ve ark. (1998), kabak bitkisinin ovaryumlarını anthesisten 1 gün önce toplayarak 0, 2, 4 ve 8 gün süre ile 4 o C sıcaklıkta tutmuşlardır. Araştırıcılar daha sonra ovülleri çıkararak 30 g/l sakkaroz, 8 g/l agar ve 2,4-D nin 0.1, 1.0, 5.0 ve 10 mg/l lik 4 farklı konsantrasyonunun eklendiği MS ortamında kültüre almış ve 25 ± 1 o C sıcaklık ve 16 saatlik ışık periyodunda 4 hafta bekletmişlerdir. Bu süre sonunda ovüller büyüme düzenleyici madde içermeyen MS ortamına transfer edilmiştir. Kültüre alınan 100 ovülden elde edilen bitki sayısı dikkate alındığında en fazla bitkinin, soğuk uygulaması yapılmayan ovaryumlardan çıkarılan ve 1 veya 5 mg/l 2,4-D eklenen MS ortamında kültüre alınan ovüllerden elde edildiği bildirilmiştir. Çağlar ve Abak (1999) tarafından, hıyarda ışınlanmış polenlerle in situ uyartım sonucu elde edilen değişik gelişme safhalarındaki haploid embriyolar in vitro kültüre alınarak bitkiye dönüştürülmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, 1992 1994 yılları arasında yılın değişik mevsimlerinde dört değişik hıyar genotipinden elde edilen embriyolar steril koşullar altında E20A ortamı üzerinde kültüre alınmışlardır. Embriyoların bitkiye dönüşüm oranları ile bitkiye dönüşme süreleri ve elde edilen bitkiciklerin in vitro gelişimleri incelenmiştir. Ayrıca bu bitkiciklerin in vitro klonlamayla çoğaltım olanakları araştırılmış ve çoğaltım katsayıları belirlenmiştir. İleri gelişim safhalarındaki haploid embriyolar globüler safhadakilere göre daha kısa sürede (3.5 günde) ve daha yüksek oranda (1.yıl % 60, 2. yıl % 80) bitkiye dönüşmüşlerdir. Mayıs Eylül ayları arasında in vitro kültüre alınan embriyolardan yılın öteki dönemlerine göre daha fazla sayıda haploid bitki elde edilmiştir. İkinci yıl haziran ayında embriyoların bitkiye dönüşümleri % 80 e ulaşmıştır. Elde edilen bitkicikler kullanılan besin ortamı üzerinde sağlıklı bir şekilde gelişmişler ve klonlamayla kolayca çoğaltılmışlardır. Arka arkaya yapılan çoğaltımlar arasında geçen süre yaklaşık 30 ar gün olmuş ve bitki başına elde edilen çelik sayısı da 3 12 arasında değişmiştir. Meyve başına haploid bitki sayısı çok yüksek olmamakla beraber, iki yılın sonunda 4 genotipten toplam olarak 190 adet haploid bitki elde edilmiştir. 12

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Sarı ve Yetişir (2002) tarafından, kavunda kendileme depresyonunu araştırmak için dihaploid saf hatlar ile onların üretildiği orijinal diploid hatlar bitki büyümesi, verim ve kalite açısından karşılaştırılmıştır. Geliştirilmiş olan dihaploid hatların bazı meyve ve bitkisel özellikleri belirlenmiştir. Bu özellikler; bitki ana gövde uzunluğu, boğum sayısı, ana gövde çapı, toplam verim, erkenci verim, meyve ağırlığı, meyve çapı, meyve yüksekliği, kabuk kalınlığı, meyve eti kalınlığı, çekirdek evi çapı ve çekirdek evi yüksekliği ile toplam suda çözünebilir kuru madde miktarıdır. Çalışmanın sonuçlarına göre, dihaploid hatlar, orijinal diploid genotiplere yakın değerler vermişlerdir. Kendileme depresyonu tespit edilememiştir. Meyve şekli, büyüklüğü ve kabuk rengi açısından genotipler arasında çok büyük bir varyasyon tespit edilmiştir. Kavunda dihaploidizasyon tekniği ile homozigotlaştırmanın bitki büyümesi, verim ve kalite üzerine önemli olumsuz bir etkiye sebep olmadığı sonucuna varılmıştır. Taner ve ark. (2003) tarafından yapılan bir çalışmada, gama ışınlamasının kavun (300 ve 350 Gy) ve acurda (250, 300 ve 350 Gy) çiçek tozu canlılığı ve haploid embriyo oluşumu üzerine etkileri incelenmiştir. Acurda in vitro çiçek tozu canlılığının 250 ve 300 Gy lik dozlarda (% 28.8 ve % 28.0) 350 Gy e (% 19.4) göre daha yüksek olduğu; artan doza ve çiçek tozu yaşına bağlı olarak çiçek tozu canlılığının azaldığı belirlenmiştir. Kavunda ise ışınlanmış çiçek tozları ile yapılan tozlamadan 72 saat sonra 300 Gy lik dozda çiçek tozu çim borularının % 64.54 ünün yumurtalığa ulaşarak haploidiyi uyardığı belirlenmiştir. Meyve tutumu ve haploid embriyo oluşumu üzerine ışınlamanın etkileri incelendiği zaman, her iki türde de 300 ve 350 Gy lik dozların 250 Gy e göre daha olumlu etkilere sahip olduğu görülmüştür. Lofti ve ark. (2003), tarafından yapılan bir çalışmada ışınlanmış polenle tozlamadan sonra oluşan tohumlar, embriyoların alınmasından önce 10 gün boyunca sıvı ortamda kültüre alınmışlardır. Bu partenogenetik embriyo içeren tohumların tanımını kolaylaştırmıştır. Çalışma ile 3 fertil hat tanımlanmıştır ve kendilenmiş tohumlar virüslere dayanımı değerlendirmek için elde edilmiştir. Yaprak dokularından flow sitometri ile bu hatlardan 2 tanesinin spontan dihaploid olduğu ve üçüncünün haploid ve diploid hücreleri içeren miksoploid olduğu tespit edilmiştir. 13

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Diğer bitkilerin çiçeklenme aşamasında steril oldukları görülmüştür. 20 steril bitkinin yapılan flow sitometri analizleri ile haploid oldukları görülmüştür. Haploid bitkilerdeki sürgünler yeni in vitro kültürlerin kurulması için kullanılmıştır. İstenilen özellikleri taşıyan dihaploid hatların oluşturulmasının kavun ıslahçıları için değerli bir araç olacağı bildirilmiştir. Claveria ve ark. (2005), hıyarda ışınlanmış polen tekniği ile dihaploid hatların oluşumu üzerine yaptıkları çalışmada öncelikle polenlere Co-60 ile 500 Gy de ışınlama yaparak parthenogenik embriyoları teşvik etmişlerdir. Daha sonra X ışını kullanarak embriyoları in vitro kurtarma yöntemi ile kültüre almışlardır. Kültüre alınan bu embriyolarda flow sitometri ve kodominant hıyar ve kavun SSR markırları kullanılarak istenmeyen zigotik yapıların tanımı yapılmıştır. Ayrıca spontan dihaploidizasyon olup olmadığına bakılmış ve bu olayın gerçekleşmediği belirlenmiştir. Haploid bitkiler kolhisin kullanılarak in vitro da dihaploid hale getirilmiştir. Sanjuan ve ark. (2006), hıyarda yaptıkları bir çalışmada şu yöntemleri kullanmışlardır: 1. Çiçek tozlarına 0.5 KGy dozda Co 60 ile ışınlama yapmışlar; 2. X ışını veya tek tek açım ile haploid embriyoları aramışlar; 3. SSR markırları ile zigotik olanları ayırmışlar; 4. Flow sitometri ile ploidi seviyesini belirlemişler; 5. In vitro kromozom katlamasını uygulamışlar; 6. Dış koşullara alıp kendilemişlerdir. Ko dominant markırlar ve flow sitometri ile bunların gametofitik orjinli oldukları belirlenmiştir. 500 M kolhisinle katlama yapılmış ve araziye aktarılmadan önce flow sitometri ile ploidi durumları belirlenmiştir. Sonuç olarak kendileme yapılan bütün hatlarda tohum elde edilmiştir. YongBing ve ark. (2006), kavunda yaptığı çalışmada haploid bitki eldesine, ana bitki ve dozun etkili olduğunu bildirmiştir. Beş genotipte haploid elde edilme ışınlanmış polen ile denemişler ve iki genotipten haploid elde etmişlerdir. Ortalama embriyo elde etme oranının % 0.29 olduğunu ve iki genotipin biri kalın diğeri ince olduğunu belirtmişlerdir. Meyve tutma oranı ise 300 Gy de % 50, 600 Gy de ise % 10 olarak bulunmuştur. 300 Gy dozda kalın etlide % 0.55 ince etlide % 0.63 oranında haploid embriyo elde edilmiş, 600 Gy de ise hiç embriyo elde edilememiştir. 14

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gökhan BAKTEMUR Lim ve Earle (2008), yapyıkları bir çalışmada gama ışını kullanılarak elde edilen 63 haploid kavun bitkisinde tek boğum kültürü ile çoğaltıldıktan sonra farklı kolhisin uygulamalarına tabi tutularak yapılan uygulamaların katlanmaya, çiçek tozu üretimine ve meyve tutumuna etkilerini incelemişlerdir. En etkili uygulamanın 3 cm lik sürgün ucu eksplantının 500 mg/l kolhisinde 3 saat tutulması olduğunu belirtmişlerdir. Bu uygulama sonunda bitki yaşama oranı nın % 83 ve katlanma oranı % 26 olduğunu ve meyve elde etme oranının ise iyi polen gelişimi gösteren türlerde % 60 olduğunu tespit etmişlerdir. In vivo uygulamalarında 5000 mg/l lik kolhisine, sürgününün uç kısmı 2 ile 4 saat süreyle batırılmış, uygulama sonucunda bazı meyveler elde edilmiş olmasına rağmen yaşayan bitki sayısı düşük olmuş ve bazı morfolojik bozukluklar gözlemlenmiştir. Lotfi ve Salehi (2008), tarafından yapılan çalışmada ışınlanmış polenle elde edilen tohumların sadece bir kaçında haploid embriyo olma şansı olduğundan embriyo kurtarma amacıyla tüm tohumların tek tek açılmasının haploid elde etme etkinliğini arttırmasına rağmen sıkıcı, bıktırıcı ve çok zaman alan bir yöntem olduğunu bildirmişlerdir. Işınlanmış polenle tozlamadan 3 hafta sonra meyvelerin hasadı yapılıp steril kabin ortamda tohumlar alınarak 10 gün boyunca sıvı ortamda tutulmuş ve embriyolar alınmıştır. Bu yöntemle tohum içinde bulunan haploid embriyolar gelişmesine devam etmiş yeşil renge dönüşmüş ve normal tohumdaki gibi çimlenme başlamış olduğundan kolay bir şekilde görülebilmiştir. Yazarlar bu metodun yaygın olarak kullanılan metoda göre çok daha kolay ve hızlı embriyo elde edilmesine, elde edilen embriyo sayısının ve kalitesinin de yüksek olmasına ve sonuç olarak da elde edilen haploid bitki sayısının artmasına neden olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca tohum çıkartımı ve kültüre alınmasında farklı bir yöntem olan çıkartılan tohumların akan su içinde yıkanması sonrası 10 dakika ticari hipo içerisinde dezenfeksiyon yapılarak steril kabin içerisinde açılıp direkt ekiminden daha etkin olarak bulunmuştur. 15

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Araştırma 2007 ve 2008 yıllarının ilkbahar ve yaz aylarında Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Yürütülmüştür. 3.1. Materyal Çalışmada Ç.Ü Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü bünyesinde yürütülen bir ıslah çalışmasının Yuva tipindeki geriye melez 3 (GM3) populasyonundan Y2 ve Y3 genotipleri materyal olarak kullanılmıştır. GM populasyonu 2005 yılında Fusarium solgunluğunun 0, 1, 2 ırklarına karşı testlemesi sonucunda dayanıklı olarak bulunan bireylerinin Yuva kavunu (Şekil 3.1) ile geriye melezlemesi ile elde edilmiştir. 3.2. Yöntem Şekil 3.1. Olgunlaşmamış Yuva kavunları 3.2.1. Bitkilerin Yetiştirilmesi Bitkilerin yetiştirilmesi amacıyla tohumlar Şubat ın üçüncü haftası ekilmiştir. Bu amaçla, 300 adet tohum fide yetiştirme serasında torf : perlit (2 v / 1 v) karışımı harç içeren viyollere ekilerek gerekli bakım işlemleri yapılmıştır (Şekil 3.2., 3.3 ve 3.4). Fideleri 2 3 yapraklı olduklarında (Şekil 3.5) (Mart ayının 16

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR ikinci haftası) 50x50x100 cm aralıklarla plastik seraya çift sıralı olarak dikilmiştir (Şekil 3.6). Gelişimleri için gerekli ilaçlama ve gübreleme yapılmıştır. Bitkiler ipe sardırılarak (Şekil 3.7) tek gövdeli yetiştirilmiş ve normal bakım işlemleri uygulanmıştır. Şekil 3.2. Tohum ekimi için viyollerin torf : perlit karışımı ile doldurulması Şekil 3.3. Tohum ekimi yapılmış viyollerin fide serasındaki görünümü Şekil 3.4. Ekim sonrası bakım işlemleri Şekil 3.5. Fidelerin 2 3 yapraklı dönemi Şekil 3.6. Yetiştiricilikte kullanılacak olan bitkilerin dikimden sonraki görünümleri Şekil 3.7. Bitkilerin ipe sardırılması 17

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.2.2. Emaskülasyon Emaskülasyon işlemi anthesisten 1 gün önceki aşamada bulunan çiçek tomurcuklarına (kapalı durumda bulunan taç yaprakların uç kısımlarının yeşilden sarıya dönüşme aşamasında) uygulanmıştır (Şekil 3.8). Kullanılacak tomurcuklar henüz kapalı iken ince uçlu bir pens yardımıyla emasküle edilmiştir (Şekil 3.9). Emaskülasyon işleminden sonra yabancı çiçek tozlarının çiçeğe girişini engellemek için selofan keselerle kapatılarak izole edilmiştir (Şekil 3.10). Şekil 3.8. Anthesisten 1 gün önceki aşama Şekil 3.9. Emaskülasyon işlemi Şekil 3.10. Selofan keselerle kapatma 18

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.2.3. Erkek Çiçeklerin Tozlanması ve Işınlanması Çiçek tozlarının elde edilmesi için anthesisten bir önceki güne rastlayan büyüklükte, henüz açılmamış fakat iyi gelişmiş erkek çiçek tomurcukları seçilerek toplanmıştır. Bu tomurcuklar taç ve kısmen çanak yapraklardan ayrıldıktan (Şekil 3.11) sonra 9 cm çaplı cam petri kaplarına konularak (Şekil 3.12) gama ışınıyla muameleye tabi tutulmuştur (Şekil 3.13). Işınlanan tomurcuklar oda koşullarında bekletilmiştir. Işınlama işlemi için Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalında ışın kaynağından yararlanılmıştır. Co 60 kaynağından gelen 300 Gy dozunda gama ışını kullanılmıştır. Şekil 3.11. Erkek çiçeklerin taç ve çanak yapraklarından ayrılması Şekil 3.12. Işınlamaya hazır erkek çiçekler Şekil 3.13. Erkek çiçeklerin ışınlandığı reaktör ve ışınlamaya hazır erkek çiçekler 19

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.2.4. Çiçeklerin Tozlanması Tozlama ışınlamanın ertesi günü sabahın erken saatlerinde emasküle edilmiş her dişi çiçek (Şekil 3.14) için 1 2 erkek çiçek tomurcuğunun stigma üzerine sürtülmesi şeklinde yapılmıştır (Şekil 3.15). Tozlamadan sonra yabancı polen girişini engellemek için çiçekler tekrar selofan keselerle kapatılmıştır (Şekil 3.16). İlerleyen günlerde çiçeklerdeki döllenme durumu kontrol edilerek, dişi çiçeğin şişkinleşmeye başladığı ve stigmanın kuruduğu dönemde selofan keseler çıkarılmıştır (Şekil 3.17). Tozlama işlemine 2007 yılında 10.05.2007 tarihinde, 2008 yılında ise 16.04.2008 tarihinde başlanmış, 2007 ve 2008 yıllarının Mayıs ayı nın son haftası son verilmiştir. Şekil 3.14. Emasküle edilmiş kavun çiçeği Şekil 3.15. Emasküle edilmiş kavun çiçeğinde tozlama yapılışı 20

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Şekil 3.16. Kavun çiçeğinin selofan keseyle kapatılması Şekil 3.17. Tozlamadan sonraki 4. gündeki bir meyvenin görünüşü 21

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3. Embriyoların Çıkartılması 3.3.1. Dezenfekiyon Tozlamadan 21 25 gün sonra olgunlaşmamış meyveler hasat edilmiştir (Şekil 3.18). Hasat edilen meyveler Doku Kültürü Laboratuvarı na getirilmiş (Şekil 3.19) önce çeşme suyuyla yıkanıp kurulandıktan sonra steril kabin içerisinde % 96 lık etil alkolle kuru yakma yöntemi ile dezenfekte edilmiştir (Şekil 3.20., 3.21). Şekil 3.18. Hasat zamanı gelmiş bir meyve Şekil 3.19. Ön hazırlık odasına meyvelerin getirilmesi Şekil 3.20. Meyvenin kuru yakma yöntemi ile dezenfeksiyonu Şekil 3.21. Kuru yakmanın yapılışı 22

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3.2. Tohum ve Embriyoların Çıkartılması Her bir uygulama 5 tekerrürlü olarak kurulmuş olup her tekerrür üç meyveden oluşmuştur. Steril kabin içinde kuru yakma sonrası meyveler boyuna kesilerek (Şekil 3.22) tohumlar petri kapları içerisine çıkarılmıştır (Şekil 3.23). Tohumlardan embriyoların çıkartılması ve bitkiciklerin elde edilmesinde 5 farklı yöntem denenmiştir. Denen yöntemler; tohumların tek tek açılması, tohumların doğrudan besin ortamına ekimi, tohumların sıvı ortama ekimi, tohumların yüzey sterilizasyonu sonrası ekimi ve tohumlara ışıkta bakma yöntemleridir. Bu yöntemlerin denenmesiyle bulunan embriyolar ve tohumlar besin ortamına konulmuş, petri ve cam kavanozlara yerleştirildikten sonra sıcaklığı 25 ± 1 C olan ve 16 saat aydınlık 8 saat karanlık olacak şekilde hazırlanmış iklim odasında inkübe edilmiştir. Bu çalışmada ayrıca kurulmuş olan besin ortamı denemesiyle de doğrudan tohum ekimi için en uygun ortam belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla E20A (Çizelge 3.1) ve CP (Çizelge 3.2) ortamları da denenmiştir. Denemede kullanılan besin ortamı bileşenleri aşağıda verilmiştir. Şekil 3.22. Meyvenin boyuna kesimi Şekil 3.23. Tohumların çıkartılması 23

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Çizelge 3.1. E20A Besin Ortamının Bileşimi ( Sauton, 1987 ) Makro elementler Miktarı (mg/l) KNO 3 1075.0 NH 4 NO 3 619.0 MgSO 4. 7H 2 O 206.0 CaCl 2. 2H 2 O 156.5 KH2PO4 71.0 Ca(NO 3 ).4H 2 O 25.0 NaH 2 PO 4.4H 2 O 19.0 (NH 4 )2SO 4 17.0 KCl 3.5 Mikro elementler MnSO 4. 7H 2 O 11.065 ZnSO 4. 7H 2 O 1.812 H 3 BO 3 1.575 KI 0.345 Na 2 MgO 4. 2H 2 O 0.094 CuSO 4. 5H 2 O 0.008 CoCl 2. 6H 2 O 0.008 Vitaminler ve Aminoasitler Myo-İnositol 50.300 Pyridoxine-HCl 5.500 Nikotinik asit 0.700 Thiamine-HCl 0.600 Calcium Pantothenate 0.500 Biotine 0.005 Glycine 0.100 Demir şelat 37.3 FeSO 4 7H 2 O 27.8 Büyümeyi Düzenleyiciler IAA 0.01 Miktarı (mg/l) Miktarı (mg/l) Miktarı (mg/l) 24

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR Çizelge 3.2. CP Besin Ortamının Bileşimi ( Chee ve ark., 1992 ) Makro elementler Miktarı (mg/l) CaCl 2 332.02 KCI 2237.00 K 2 HPO 4 170.00 KNO 3 2022.00 MgSO 4 180.54 NH 4 NO 3 1601.00 Ca(NO 3).4 H 2 O 250 Mikro Elementler CoCI 2. 6H 2 O 0.025 CuSO 4.5 H 2 O 0.025 FeNaEDTA 36.70 H 3 BO 3 6.20 KI 0.83 MnSO 4.H 2 O 16.90 NaSO 4.2H 2 O 0.25 ZnSO 4.7H 2 O 8.60 Vitaminler Myo-İnositol 90.10 Nikotinik asit 1.23 Pyridoxine-HCl 1.03 Thiamine-HCl 1.69 B 12 0.08 Büyümeyi Düzenleyiciler IAA 0.2 Miktarı (mg/l) Miktarı (mg/l) Miktarı (mg/l) 25

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3.2.1. Tohumların Tek Tek Açılması Yöntemi (Tek Tek Açma) Steril kabin içinde kuru yakma sonrası meyveler boyuna kesilerek tohumlar petri kapları içerisine çıkarılmıştır. Tohumların hepsi stereo binoküler mikroskop altında tek tek açılarak içlerinde embriyo bulunup bulunmadıkları kontrol edilmiştir (Şekil 3.24). Bulunan embriyolar tohumların içerisinden çıkarıldıktan sonra cam kavanozlara konularak besin ortamına ekilmiştir (Şekil 3.25). Şekil 3.24. Tohumların binoküler E20A mikroskop altında tek tek açılması Şekil 3.25. Haploid bir embriyonun ortamına aktarılması 26

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3.2.2. Tohumların Doğrudan Besin Ortamına Ekimi (Doğrudan Ekim) Meyve içerisinden çıkarılan tohumların hepsi hiçbir muameleye tabi tutulmadan petrilerdeki besin ortamına ekilmiştir. Bu yöntemi uygularken 80-120 adet tohum 5 cm çaplı plastik petrilere ekilmiştir (Şekil 3.26., 3.27) Besin ortamı olarak E20A ve CP ortamları kullanılmıştır Ekilen tohumlar 10 gün boyunca gözlemlenmiş ve çimlenmeye başlayan haploid embriyoların görülmesi ile birlikte kültür tüplerinde bulunan besin ortamına transfer edilmiştir. Şekil 3.26. Tohumların CP ortamına doğrudan ekimi Şekil 3.27. Tohumların E20A ortamına doğrudan ekimi 27

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3.2.3. Tohumların Sıvı Besin Ortamına Ekimi (Sıvı Ortama Ekim) Tohumların hepsi hiçbir muameleye tabi tutulmadan petrilerdeki sıvı besin ortamına ekimiştir. 80-120 adet tohumun 5 cm çaplı plastik petrilere ekimi gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.28). E20A ve CP ortamlarına ekilen tohumların gözlemi yapılarak haploid olan embriyoların görülmesi ile kültür tüplerinde bulunan besin ortamına transferi sağlanmıştır. Şekil 3.28. Tohumların sıvı ortama ekimi sonrası iklim odasına alınması 28

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3.2.4. Tohumların Yüzey Sterilizasyonu Yapılarak Ekimi (Sterilizasyon Sonrası Ekim) Tohumların hepsi %15 lik sodyum hipokloritte 10 dakika bekletilerek yüzey sterilizasyonu yapılmıştır (Şekil 3.29). Sterilizasyon sonrası steril saf su ile 3-5 kez yıkanmıştır. Daha sonra petrilerdeki besin ortamına ekimi sağlanmıştır. Bu yöntemde meyvelere kuru yakma uygulanmamış ve meyvelerin kesimi sonrası tohumlar steril kabin dışında çıkarılmıştır. Besin ortamı olarak E20A ve CP ortamları kullanılmıştır (Şekil 3.30). 10 gün süresince gözlemi yapılan tohumların haploid embriyoların tespiti ile kültür tüplerinde bulunan besin ortamına transferi gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.29. Kavun tohumlarına yüzey sterilizasyonunun yapılması Şekil 3.30. Sterilizasyon sonrası kavun tohumlarının direk ekimi 29

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.3.2.5. Tohumlara Işıkta Bakma Yöntemi (Işıkta Bakma) Kuru yakma yöntemi ile sterilizasyonu yapılan meyvelerin tohumları 5 cm çaplı cam petrilere konulmuştur. 13 W şiddetinde bir ışık kaynağının (Şekil 3.31) üzerine tohumlar petriler içerisinde yerleştirilerek tohumların içerisinde embriyo olup olmadığı tespit edilmeye çalışılmıştır (Şekil 3.32). Embriyo olan tohumlar (Şekil 3.33) açılarak kültür tüplerindeki besin ortamlarına aktarılmıştır. Şekil 3.31. Işık düzeneği Şekil 3.32. Işık düzeneğinde tohumlara bakma Şekil 3.33. Haploid embriyo olan tohumların açılması 30

3. MATERYAL VE YÖNTEMLER Gökhan BAKTEMUR 3.4. Ekonomik Analiz Haploid bitki elde edilmesinde yararlanılan 5 ayrı yöntemin maliyetleri harcana zaman ve kullanılan iş gücü bakımından incelenmiştir. Bu açıdan her bir yöntemde elde edilen haploid bitki sayısı ve bunu elde etmek için yapılan toplam iş gücü maliyeti hesaplanmıştır. Hesaplanan maliyet elde edilen haploid bitki sayısına bölünerek birim haploid bitki maliyeti bulunmuştur. Her bir yöntem için hesaplanan birim maliyetler kıyaslanarak en düşük maliyetli olan yöntem ortaya konulmuştur. 3.5. İstatistik Analizi Yöntemlerin karşılaştırılması amacıyla; meyve başına toplam embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı, enfeksiyon sayısı, bir meyveyi açmak için geçen süre ve embriyo başına iş gücü maliyeti vb. gözlemleri yapılmıştır. Sonuçların değerlendirilmesi için Varyans Analizi yapılmış ve farklılıklarının önemliliğinin kontrolü içinde Tukey testinden yararlanılmıştır. 31

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Çiçeklerin Tozlanması Kavun çiçeklerinde 2007 ve 2008 yıllarında yapılan tozlama Çizelge 4.1 de görüldüğü gibi Y2 ve Y3 genotiplerinde Nisan ve Mayıs aylarında gerçekleştirilmiştir. 2007 yılı Nisan ayında havaların serin geçmesi sebebiyle yeterli dişi çiçek oluşumu gerçekleşemediğinden tozlamalar sadece mayıs ayında ve Y2 ile Y3 genotiplerinde yapılmıştır. Tozlama Y2 genotipinde 75, Y3 genotipinde ise 61 bitkide gerçekleştirilmiştir. Tozlanan bitkilerden tutan meyve sayısı Y2 genotipinde 64, Y3 genotipinde ise 46 tanedir. Hasada gelmiş meyve sayılarının Y2 genotipinde 61, Y3 genotipinde ise 38 olduğu tespit edilmiştir. 2008 yılında ise Nisan ve Mayıs aylarında kavun çiçeklerinde tozlama yapılmıştır. Nisan ayında Y2 genotipinde 137, Y3 genotipinde 181 tane bitkide tozlama uygulanmıştır. Tozlanan bitkilerden tutan meyve sayısı Y2 genotipinde 50, Y3 genotipinde ise 108 tane olmuştur. Hasada gelmiş meyve sayısı ise Y2 genotipinde 26, Y3 genotipinde ise 53 dür. Mayıs ayında ise Y2 genotipinde 101, Y3 genotipinde 42 tane tozlama yapılmış olup bunlardan Y2 genotipinde 87, Y3 genotipinde 42 meyve tutmuş, hasada gelen meyve sayısı ise Y2 genotipinde 73, Y3 genotipinde 40 olduğu görülmüştür. Sonuç olarak 2008 Nisan ve Mayıs aylarında Y2 genotipinde toplam 238, Y3 genotipinde ise 223 bitkide tozlama yapılmıştır. Tozlanan bitkilerden Y2 genotipinden 137, Y3 genotipinden ise 150 meyve tutturulmuştur. Hasat zamanı geldiğinde ise Y2 genotipinde 99 Y3 genotipinde ise 93 meyve toplanılmıştır. 32

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.1. İki kavun genotipinde yıllara göre tozlanan bitki sayısı, tutan meyve sayısı ve hasada gelmiş meyve sayıları Aylar Nisan Mayıs Toplam TBS TMS HGMS Yıllar Y2 Y3 Y2 Y3 Y2 Y3 2007 - - - - - - 2008 137 181 50 108 26 53 2007 75 61 64 46 61 38 2008 101 42 87 42 73 40 2007 75 61 64 46 61 38 2008 238 223 137 150 99 93 TBS: Tozlanan Bitki Sayısı, TMS: Tozlanan Meyve Sayısı HGMS: Hasada Gelmiş Meyve Sayısı Y2 ve Y3 genotiplerinde 2008 yılı Nisan ve Mayıs aylarında uygulanan tozlamalarda; tozlanan bitki sayısının tutan meyve sayısı arasındaki oran ile tozlanan bitki sayısı ile hasada gelmiş meyve sayısı arasındaki oran incelenmiştir. Şekil 4.1. den de görülebileceği gibi, Nisan ayında Y2 genotipinde tozlanan bitki sayısının tutan meyve sayısına olan oranı % 36.5, tozlanan bitki sayısı ile hasada gelmiş meyve sayısı arasındaki oran ise % 19.0 olduğu tespit edilmiş bu oran Y3 genotipinde sırasıyla % 59.7 ve % 29.3 olarak görülmüştür. Şekil 4.2. incelediğimizde Mayıs ayında bu oranlar hava sıcaklığının artmasıyla birlikte artışlar göstermiştir. Buna göre Y2 genotipinde tozlanan bitki sayısının tutan meyve sayısına oranı % 86.1 iken tozlanan bitki sayısının hasada gelen meyve sayısına oranı % 72.3 olmuştur. Y3 genotipinde ise sırasıyla % 100 ve % 95.2 olarak bulunmuştur. 2007 ve 2008 yıllarında dişi çiçeklerde gerçekleştirilen tozlamalarda; tozlanan bitki sayısının tutan meyve sayısı ve hasada gelmiş meyve sayısına paralellik göstermediği görülmüştür. Bunun nedenleri arasında tozlama sonrası 3 4 gün içinde dişi çiçeklerde görülen sararmalar, tutan meyvelerde ise hasat zamanına yakın görülen çatlamalardır. Meyve sayısındaki azalmanın en aza indirilmesi için bu genotiplerde tozlama zamanının biraz daha geç dönemde yapılması ve sulama suyunun o döneme uygun miktarda verilmesi önerilebilir. 33

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR 100 80 Y2 Y3 Yüzde (%) 60 40 20 0 TBS/TMS TBS/HGMS Şekil 4.1. Kavun genotiplerinde Nisan ayı tozlanan çiçeklerin (%) oranları Y2 Y3 100 80 Yüzde (%) 60 40 20 0 TBS/TMS TBS/HGMS Şekil 4.2. Kavun genotiplerinde Mayıs ayı tozlanan çiçeklerin (%) oranları 34

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR 4.2. Tohum ve Embriyoların Çıkartılması 4.2.1. Tek Tek Açma Tozlamadan 21 25 gün sonra olgunlaşmamış meyveler hasat edilmiş ve meyvelerden çıkarılan tohumların hepsi binoküler stereo mikroskop altında tek tek açılarak içlerinde haploid embriyo varlığına bakılmıştır. Bulunan embriyolar çıkartılarak E20A besin ortamı içeren kavanozlara aktarılmıştır. Çizelge 4.2. de görüldüğü gibi kavunda tek tek açma yöntemi 2007 yılı ve 2008 yıllarında gerçekleştirilmiştir. Çizelgeden de görüleceği gibi 2007 yılında meyve başına ortalama tohum sayısı 1167 adet olarak bulunmuş ve açılan 15 meyveden 47 adet embriyo elde edilmiştir. Bu embriyolardan 2 tanesi globüler aşamada, 45 tanesi ise kalp aşamasındadır. Globüler aşamada olan 2 embriyoda camsılaşma meydana gelmiş ve bunlar gelişimini tamamlayamamıştır. Dolayısı ile bitkiye dönüşümleri de gerçekleşmemiştir. Çıkarılan embriyolardan 45 tanesi bitkiye dönüşmüş (Şekil 4.3) olup enfeksiyon görülmediğinden gelişen bitki sayısı da 45 olmuştur. 2008 yılında ise 2007 yılındaki sayılara paralel bir durum gözlenmiştir. Meyve başına ortalama tohum sayısı 1244, çıkarılan embriyo sayısı ise 45 adet olarak bulunmuştur. Bulunan embriyolardan 4 tanesi globüler, 41 tanesi ise kalp aşamasındaki embriyolardır. Globüler safhadaki 2 embriyo bir önceki yılda da görülen camsılaşma nedeniyle gelişmemiştir. Bu yüzden bitkiye dönüşen embriyo sayısı 43 olarak bulunmuş, bitkilerde enfeksiyondan yana bir sorunla karşılaşılmadığından bitki sayısında değişim meydana gelmemiştir. İki yılın ortalama değerlerine baktığımızda; meyve başına ortalama tohum sayısı 1206, bu tohumlardan elde edilen ortalama embriyo sayısı 46 olup bunların 3 er tanesi globüler, 43 er tanesi ise kalp şekilli embriyolardır. Çıkarılan embriyolardan bitkiye dönüşen sayı iki yıl ortalaması 44 olarak belirlenmiştir. 35

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.2. Kavunda tohumların tek tek açma yönteminde meyve başına tohum sayısı, elde edilen embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları Yıllar Tohum/ Embriyo Sayısı Meyve Glob. Kalp Torpedo BDES GBS ES 2007 1167 2 45-45 45-2008 1244 4 41-42 42 - Ortalama 1206 3 43-44 44 - BDES: Bitkiye Dönüşen Embriyo Sayısı, GBS: Gelişen Bitki Sayısı, ES: Enfeksiyon sayısı Şekil 4.3. Haploid embriyoların bitkiye dönüşümü 36

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR 4.2.2. Doğrudan Ekim Bu yöntemde meyvelerden elde edilen tohumların hepsi hiçbir muameleye tabi tutulmadan petrilere hazırlanmış olan besin ortamlarına ekilmiştir. Her petriye ortalama 80-120 tohumun ekimi gerçekleşmiştir. Besin ortamı olarak E20A ve CP ortamları denenmiş olup en iyi besin ortamının hangisi olduğu test edilmiştir. Ekilen tohumlarda 10 gün süreyle gözlem yapılmış, haploid olan embriyoların çimlenmeye başlayıp görülmesi ile birlikte kültür tüplerinde bulunan besin ortamlarına transferleri gerçekleştirilmiştir (Şekil 4.4 ve Şekil 4.5). Çizelge 4.3. ve Çizelge 4.4. de görüldüğü gibi 2007 yılı ve 2008 yılları arasında CP ve E20A besin ortamlar ile doğrudan ekim gerçekleştirilmiştir. Buna göre Çizelge 4.3. incelendiğinde CP besin ortamı ile doğrudan ekim yapıldığında 2007 yılında meyve başına tohum sayısı 1047, embriyo sayısı ise 38 olarak görülmüştür. Enfeksiyondan kaynaklanan bir sorun çıkmadığından bitkiye dönüşüm sayıları ile gelişen bitki sayıları değişmemiştir. 2008 yılında ise meyve başına tohum sayısı 1217, embriyo sayısı ise 33 olarak bulunmuştur. Aynı yıl yapılan çalışmada bitki gelişimini etkileyen herhangi bir sorun meydana gelmediğinden bitki sayılarında bir değişim görülmemiştir. İki yılın ortalamalarına baktığımızda meyve başına tohum sayısı 1132, embriyo sayısı ise 36 bulunmuştur. Çizelge 4.3. Kavun tohumlarının doğrudan CP besin ortamı ekimi yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları Yıllar Tohum/Meyve Embriyo Sayısı BDES GBS ES 2007 1047 38 38 38-2008 1217 33 33 33 - Ortalama 1132 36 36 36-37

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.4. e baktığımızda E20A besin ortamıyla doğrudan ekim sonucu elde edilen embriyo sayısı CP ortamına göre daha düşük olmuş, bunun sonucunda da bitki sayısı da daha az meydana gelmiştir. 2007 yılında meyve başına tohum sayısı 1311, embriyo sayısı 20, 2008 yılında bu sayılar meyve başına tohum sayısı 1274, embriyo sayısı 13 olarak bulunmuştur. Her iki yılda da enfeksiyon görülmediğinden embriyo sayıları ile bitkiye dönüşen embriyo sayıları ve gelişen bitki sayıları aynı kalmıştır. Bu yöntemde iki yılın ortalamasına baktığımızda; meyve başına tohum sayısı 1293 embriyo sayısı ise 17 olarak bulunmuştur. Çizelge 4.4. Kavun tohumlarının doğrudan E20A besin ortamı ekimi yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları Yıllar Tohum/Meyve Embriyo Sayısı BDES GBS ES 2007 1311 20 20 20-2008 1274 13 13 13 - Ortalama 1293 17 17 17 - Bu yöntem de denemeye alınan iki besin ortamı (CP ve E20A) arasında embriyo sayısı ve bitki sayısı bakımından oldukça önemli bir fark bulunmuştur. Bu farkın nedeninin E20A besin ortamının içerik açısından CP ortamına göre daha zayıf olmasıyla açıklanabilir. Bu sonuçlar besin içeriği düşük olan E20A ortamında gelişmesinin ileri aşamasına gelmiş bulunan embriyoların geliştiği, gelişmesinin daha önceki aşamalarında olan embriyolarının ise gelişmediğini düşündürmektedir. 38

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Şekil 4.4. CP besin ortamı ile doğrudan ekim sonucu tohumların bitkiye dönüşümü Şekil 4.5. E20A besin ortamı ile doğrudan ekim sonucu tohumların bitkiye dönüşümü 39

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR 4.2.3. Sıvı Ortama Ekim Bu yöntemde meyveden çıkartılan tohumların hepsi steril filtre kağıtları üzerine alınarak tohumların etrafındaki meyve suyu uzaklaştırılmaya çalışılmıştır. Daha sonra tohumların hepsi petrilere hazırlanmış olan sıvı besin ortamına ekimi yapılmıştır. Besi ortamı içerisine 80-120 tohum aktarılmıştır. Besin ortamı olarak E20A ve CP ortamları kullanılmıştır. Bu yöntemde büyütme odasına yerleştirilen petrilerde şişme görülmüş, parafilmle sarılmış olan petrilerden besin ortamının dışına aktığı gözlemlenmiştir. Bunun nedeninin tohumların etrafında kalmış olan meyve suyundan kaynaklanan bir enfeksiyon olayının gerçekleştiği düşünülmektedir. 10 gün süresince hiç bitki gelişimi görülmediğinden gözlemlere devam edilmiştir. Fakat tohumlarda bozulmalar meydana geldiği görülmüş ve enfeksiyonlar gelişmeye başlamıştır. Bu yöntemde hiçbir embriyo gelişimi gözlemlenememiştir. 4.2.4. Sterilizasyon Sonrası Ekim Hasat edilen meyvelerin tohumları kabin içerisinde yüzey sterilizasyonu yapılmıştır. Sterilizasyon sonrası tohumların E20A ve CP besin ortamlarına ekimleri gerçekleştirilmiştir. Tohumların doğrudan ekiminde yaptığımız besin ortamı uygulamasını bu yöntemimizde de denenmiştir. Buna göre 2007 ve 2008 yıllarında CP ve E20A besin ortamlarına sterilizasyon sonrası ekim gerçekleştirilmiştir. Çizelge 4.5. e göre 2007 yılında sterilizasyonu sonrası CP besin ortamına ekim de meyve başına tohum sayısı 1362, embriyo sayısı 6, 2008 yılında ise meyve başına tohum sayısı 1344 embriyo sayısı 8 olarak bulunmuştur. Enfeksiyondan kaynaklanan bir sorun olmadığından bitkiye dönüşüm sayıları ile gelişen bitki sayıları da değişmemiştir. İki yılın ortalama değerlerini incelediğimizde sırasıyla meyve başına tohum sayısı 1353 embriyo sayısı 7, bitkiye dönüşen embriyo sayısı ve gelişen bitki sayısı 7 olarak bulunmuştur. 40

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.5. Kavunda tohumların sterilizasyon sonrası CP besin ortamına ekim yönteminin meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları Yıllar Tohum/Meyve Embriyo Sayısı BDES GBS ES 2007 1362 6 6 6-2008 1344 8 8 8 - Ortalama 1353 7 7 7 - Çizelge 4.6. ı incelediğimizde 2007 yılında sterilizasyon sonrası E20A ortamına ekim de meyve başına tohum sayısı 1047, embriyo sayısı 1, 2008 yılında ise meyve başına tohum sayısı 1217, embriyo sayısı ise 5 olarak bulunmuştur. CP ortamında olduğu gibi E20A ortamına aktarılan tohumlardan elde edilen embriyolar ile bu embriyoların bitkiye dönüşüm sayısı ve gelişen bitki sayısında enfeksiyondan meydana gelen sorunlarla karşılaşılmadığı için bitki sayılarında bir azalma görülmemiştir. Her iki yılın ortalamasına baktığımızda meyve başına tohum sayısı 1252 embriyo sayısı ise 3 olduğu görülmüştür. Dolayısıyla bitkiye dönüşen embriyo sayısı ile gelişen bitki sayısı değişmemiştir. Çizelge 4.6. Kavunda sterilizasyon sonrası tohumların E20A besin ortamına ekim yönteminin meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları Yıllar Tohum/Meyve Embriyo Sayısı BDES GBS ES 2007 1047 1 1 1-2008 1217 5 5 5 - Ortalama 1252 3 3 3-41

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Bu yöntemden elde edilen embriyo ve bitki sayıları doğrudan ekim yöntemine göre oldukça düşük bulunmuştur. Bunun nedeninin sterilizasyon sıvısının tam olarak oluşmamış olan tohum kabuğundan geçerek embriyoları zararlandırması olarak düşünülmektedir. Tohum içerisine girmesi muhtemel olan sterilizasyon sıvısının uzaklaştırılamadığı için tam oluşmamış olan embriyoyu zararlandırdığı ve çimlenmesini engellediği görüşü hakim olmuştur. 4.2.5. Işıkta Bakma Bu yöntemde ise sterilizasyonu yapılmış meyvelerin tohumları çıkarılıp, floresan lamba içeren bir düzeneğin üzerine konulmuştur. Tohumlar tek tek incelenip embriyolu olarak belirlenenlerden embriyolar kurtarılıp besin ortamına ekimi sağlanmıştır. Çizelge 4.7. de 2007 ve 2008 yıllarında uygulanan ışıkta bakma yönteminde elde edilen veriler belirtilmiştir. Buna göre 2007 yılında meyve başına tohum sayısı 1301, embriyo sayısı 42 olup bu embriyoların 1 tanesi globüler 41 tanesi ise kalp safhasındaki embriyolardır. Bitkiye dönüşen embriyo sayıları ile gelişen embriyo sayılar aynı olup toplam 40 tane bitki meydana gelmiştir. Bu yöntemimizde 2 embriyodan biri şeffaf yapıda olduğundan, diğer embriyo ise enfeksiyondan kaynaklanan sorundan dolayı gelişimlerini tamamlayamamıştırlar. 2008 yılına baktığımızda ise meyve başına tohum sayısı 1197, embriyo sayısı 43 olarak bulunmuştur. Bu embriyoların hepsi kalp safhasındaki embriyolar olup, enfeksiyon sorunu yaşanmadığından bitkiye dönüşen embriyo sayıları ile gelişen embriyo sayıları değişmemiş ve 43 olarak tespit edilmiştir. İki yılın ortalaması ise meyve başına tohum sayısı 1249, embriyo sayısı 43, bitkiye dönüşen embriyo sayıları ile gelişen embriyo sayılarına baktığımızda bu sayı 42 olarak görülmüştür. Bu yöntemdeki en belirgin sınırlayıcı faktörün sürekli ışığa bakma zorluğu olduğu düşünülmektedir. 42

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.7. Kavunda tohumlara ışıkta bakma yöntemiyle meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayıları Yıllar Tohum/ Embriyo Sayısı Meyve Glob. Kalp Torpedo BDES GBS ES 2007 1301 1 41-40 40 1 2008 1197-43 - 43 43 - Ortalama 1249 1 42-42 42 1 4.3. Embriyo Kurtarma Yöntemlerinin Karşılaştırılması Yöntemler arasında kıyaslama yapıldığında Çizelge 4.8. e göre meyve başına tohum sayılarının birbirine yakın olduğu görülmüştür. Bunun yanı sıra embriyoların aktarılması ve bitkilerin gelişimi sırasında enfeksiyondan kaynaklanan bir durum söz konusu olmadığından bitki sayılarında da bir değişime rastlanılmamıştır. Dolayısıyla embriyo sayıları incelenerek yöntemler arasında karşılaştırılma yapılmıştır. Buna göre en fazla embriyo elde edilen yöntem 46 tane embriyo ile tek tek açma yöntemi olarak bulunmuştur. Bu yöntemi sırasıyla 42 tane embriyo ile ışıkta bakma yöntemi, 36 tane embriyo ile doğrudan CP besin ortamlarına ekim yöntemi izlemiştir. Diğer yöntemlerde çıkarılan embriyo sayıları ise doğrudan E20A besin ortamlarına ekim ile 17 embriyo, sterilizasyon sonrası CP ortamına ekim de 7 embriyo, E20A ortamında ekim sonucu 3 tane embriyo bulunmuştur. Sıvı ortama ekim yönteminde enfeksiyon sonucu embriyo gelişimi görülmemiştir. 43

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.8. Kavunda meyve başına tohum sayısı, embriyo sayısı, bitkiye dönüşen embriyo sayısı, gelişen bitki sayısı ve enfeksiyon sayılarının yöntemlere göre karşılaştırılması Yöntemler Tohum/Meyve Embriyo BDES GBS ES Sayısı Tek Tek Açma 1206 46 44 44 - Doğrudan Ekim CP 1132 36 36 36 - Doğrudan Ekim E20A 1293 17 17 17 - Sıvı Ortam CP - - - - - Sıvı Ortam E20A - - - - - Sterilizasyon Sonrası 1353 7 7 7 - CP Sterilizasyon Sonrası 1252 3 3 3 - E20A Işıkta Bakma 1249 42 42 42 1 Farklı yöntemlerle kurtarılan meyve başına ortalama embriyo sayıları Çizelge 4.9. da verilmiştir. Çizelgeden de görülebileceği gibi meyve başına embriyo sayıları açısından tek tek açma yöntemi, CP ortamlarına doğrudan ekim ve ışıkta bakma yöntemleri arasında istatistiki olarak fark görülmemiştir. Buna göre ortalama tek tek açma yöntemi ile 3.30, ışıkta bakma yöntemi ile 3.10, CP ortamlarına doğrudan ekim yöntemi ile 2.40 embriyo elde edilmiştir. E20A ortamlarına doğrudan ekim 1.10, sterilizasyonu sonrası ekim ile ortalama embriyo sayısı CP ortamında 0.50 iken E20A ortamında bu oran 0.20 embriyo olarak bulunmuştur. 44

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.9. Farklı yöntemlerle elde edilen meyve başına ortalama embriyo sayıları Yöntemler Embriyo/Meyve Tek Tek Açma 3.30 a Doğrudan Ekim CP 2.40 a Doğrudan Ekim E20A 1.10 b Sterilizasyon Sonrası CP 0.50 b Sterilizasyon Sonrası E20A 0.20 b Işıkta Bakma 3.10 a LSD %5 1.194 Diğer yöntemlerde olası embriyo kayıpları hesaplanmış ve değerler Şekil 4.6. da verilmiştir. Tek tek açma yöntemi ile embriyo çıkartmada hata payının en az olduğu düşünülerek Şekil 4.6. da görülebileceği gibi, tek tek açma yöntemine göre embriyo kaybının en düşük olduğu yöntem ışıkta bakma yöntemi olmuş ve olası kayıp % 4.6 olarak tespit edilmiştir. Bu değeri % 18.2 ile doğrudan CP ortamlarına ekim izlemiştir. Bunun dışındaki yöntemlerde olası embriyo kaybının daha fazla olduğu görülmüştür. En fazla embriyo kaybı % 93.2 ile sterilizasyon sonrası E20A ortamına ekim uygulamasında görülmüştür. 100 80 Yüzde (%) 60 40 20 0 Doğrudan Ekim CP Doğrudan Ekim E20A Sterilizasyon Sonrası CP Sterilizasyon Sonrası E20A Işıkta Bakma Şekil 4.6. Tek tek açma yöntemine göre olası embriyo kayıp oranları 45

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR 4.4. Ekonomik Analiz 4.4.1. Yöntemlerin Süre Açısından Kıyaslanması Yöntemlerin embriyo elde etmek için harcanan süre açısından kıyaslayabilmek için meyvelerin kesilmesinden itibaren zaman tutularak her yöntemin tohum çıkartımı dahil toplam süre, sadece embriyo kurtarmada geçen süre ve meyve başına embriyo sayıları belirlenmiştir (Çizelge 4.10). Buna göre her yöntemde meyveden sadece tohum çıkartımı ortalama 31.4 dk/meyve süre olarak hesaplanmıştır. Kontrol olarak denemede yer alan tek tek açma yönteminde ortalama olarak meyve başına 3.3 embriyo elde edilmiş, meyvelerdeki tohumların açılıp embriyoların bulunarak kültür tüplerindeki ortamlara ekilmesi için ortalama 103.5 dakika geçmiştir. Çizelge 4.10. Farklı yöntemlerle elde edilen meyve başına ortalama embriyo sayıları ve geçen süre Yöntemler Embriyo/Meyve Tohum Çıkartımı Hariç Süre Toplam Süre (dk/meyve) (dk/meyve) Tek Tek Açma 3.30 a 72.1 103.5 Doğrudan Ekim CP Doğrudan Ekim E20A 2.40 a 24.9 56.3 1.10 b 24.9 56.3 Sterilizasyon 0.50 b 45.0 70.00 Sonrası CP Sterilizasyon 0.20 b 45.0 70.00 Sonrası E20A Işıkta Bakma 3.10 a 17.4 48.80 Sıvı Ortam CP - 5.1 36.5 Sıvı Ortam E20A - 5.1 36.5 46

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Tohumların doğrudan içerisinde besin ortamı olan petri kaplarına ekildiği yöntemde ise meyve başına kurtarılan embriyo oranı 2.4 olmuş ve her bir meyvenin içindeki tüm tohumlar ortalama 56.3 dakikada besin ortamı içeren petri kaplarına ekilmiştir. Tek tek açma yöntemi ile kıyaslandığında elde edilen embriyo sayısı bakımından istatistiki bir fark görülmediği ve meyve başına tüketilen zaman açısından bu yöntem diğer yöntemin yaklaşık yarısı kadar bir zaman kullanıldığı belirlenmiştir. Işıkta bakma yöntemi ile baktığımızda embriyo içeren tohumlar ışık kaynağının üstünde kolaylıkla seçilebilmiştir. Embriyo içeren tohumlar açılarak embriyolar alınmış ve kültür tüpleri içersindeki besin ortamlarına aktarılmıştır. Işık kaynağı kullanılarak yürütülen denemede meyve başına ortalama 3.1 adet embriyo kurtarılmıştır. Bu yöntemde her bir meyvedeki tohumların incelenmesi ve içerisinde embriyo olan tohumların açılarak embriyoların kültür tüplerinde bulunan besin ortamlarına ekilmesi için ortalama 48.8 dakika gerekmiştir. Tek tek açma yöntemi ile kıyaslandığında işlem yarısından az bir sürede tamamlanmış, meyve başına embriyo sayısı açısından değerlendirildiğinde doğrudan ekim yöntemi ile istatistiki olarak aynı grupta yer almıştır. Işık kaynağı altında 1 saat içerisinde 400 tohumdan daha fazlasını incelediklerini belirten Lotfi ve Salehi (2008) nin çalışması ile kıyaslandığında bizim çalışmamızda saate yaklaşık 1500 tohuma bakılabilmiştir. Aynı araştırıcılar tek tek açımda bir meyvenin açımının saatler aldığını bildirmişlerdir. Ortalama benzer tohum sayısı ile yaptığımız bizim çalışmamızda ise 1 meyvenin açımı 1.5-2 saatte tamamlanabilmiştir. Tek tek tohum açma yönteminin bir olumsuzluğu da yeterince deneyimi olmayanlar tarafından yapılması durumunda embriyoların zarar görebilmesidir. Ayrıca globüler aşamadaki küçük ve tam gelişmemiş embriyolar da binoküler mikroskop kullanılmadığı takdirde gözden kaçabilmektedir. Bu yöntemlerin yanı sıra sterilizasyon sonrası ekim de ise her bir meyvenin içindeki tüm tohumlar ortalama 70.0 dakikada besin ortamı içeren petri kaplarına ekimi gerçekleştirilmiştir. Burada sürenin artmasının en önemli nedeni tohumların sterlizasyonu için geçen süredir. Bu yöntemde embriyo verimi oldukça düşük olmuştur. Bunun nedeni de tam 47

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR olgunlaşmamış olan tohum kabuğundan sterilizasyon sıvısının geçerek embriyoyu zararlanması olduğu düşünülmektedir. Sıvı ortama ekimde ise enfeksiyonlardan dolayı başarı elde edilememiştir. Lotfi ve ark., (2003) de yaptıkları bir çalışmada sıvı ortam kültüründeki bazı petrilerde enfeksiyon oluştuğunu ve kullandıkları meyvelerin %30 unun bu sebepten dolayı kaybettiklerini bildirmişlerdir. Bu araştırıcılar çalışmalarında iki farklı sterilizasyon yöntemi denemişler ve tohum sterilizasyonunun meyve sterilizasyonuna göre daha başarılı olduğunu belirtmişlerdir. Lotfi ve Salehi 2008 yılında yaptıkları bir diğer çalışmada da sıvı ortama alınan tohumların % 22 sinin enfeksiyon kaptığını bildirmişlerdir. Enfeksiyondan meydana gelen kayıpların Chlorox ile dezenfekte edilen tohumlarda % 7.8 den az iken, meyve dezenfeksiyonunda %35 oranında olduğunu belirtmişlerdir. Sıvı kültürde enfeksiyon çok büyük bir problem oluşturmaktadır. Çünkü tek bir tohumda meydana gelen bir enfeksiyon bile kısa sürede tüm ortama bulaşmaktadır. 4.3.2. Yöntemlerin Maliyet Açısından Kıyaslanması Haploid bitki elde edilmesinde yararlanılan 5 ayrı yöntemin maliyetleri de oldukça önemlidir. Bu açıdan her bir yöntemde elde edilen haploid bitki sayısı ve bunu elde etmek için yapılan toplam işgücü maliyeti incelenmiştir. Yapılan hesaplamalarda elde edilen her haploid bitkinin ücreti nin takriben 30$ (yaklaşık 47 TL) olduğu ve meyveden tohumları çıkartan bir işçiye 17 TL/gün, tohumlardan embriyo kurtarma işinde çalışanlara ise 33 TL/gün ödendiği esas alınmıştır. Maliyet hesabında bir işçinin günlük çalışma süresi de 480 dakika olarak hesaplanmıştır. Çalışmamızda elde edilen embriyoların hemen hemen tamamı bitkiye dönüştüğünden embriyo sayısı aynı zamanda bitki sayısı olarak kullanılmıştır. Hesaplanan toplam maliyet elde edilen haploid bitki sayısına bölünerek birim haploid bitki maliyeti bulunmuştur. Her bir yöntem için hesaplanan birim maliyetler kıyaslanarak en düşük maliyetli olan yöntem ortaya çıkartılmaya çalışılmıştır. 48

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.11 de incelediğimizde bir kişi günde 480 dakika çalışarak en fazla Işıkta Bakma Yöntemi ile gelir sağlanmıştır. Buna göre, Işıkta Bakma Yöntemi ile 86.3 tane bitki üretilmekte ve 4 141.90 TL gelir elde edilmektedir. Bu yöntemi, doğrudan CP ortamlarına ekim ve bu yöntem ile edilen bitki sayısı 46.2 adet olmuş olup elde edilen gelir ise 2 218.87 TL olarak hesaplanmıştır. Tek tek açma yöntemine göre embriyo sayısı düşük olan E20A ortamı ile doğrudan ekim sonucu aynı oranda bitki elde edilmiştir. Bunun yanı sıra işçilik maliyeti göz önüne alındığında daha fazla gelir elde edildiği görülmüştür. Buna göre, E20A ortamı ile doğrudan ekim sonucu 21.7 bitki elde edilmiş ve 1 043.74 TL gelir sağlanılmıştır. Tek tek açma yönteminde ise elde edilen bitki sayısı 21.7 adet olup 1 041.75 TL gelir sağlanmıştır. Son yöntem olarak sterilizasyon sonrası CP ortamına ekim yönteminde 4.9 bitki elde edilmiş ve 237.57 TL gelir sağlanılmış, E20A ortamıyla ekimde ise 2.1 bitki sağlanmış 101.38 TL gelir elde edilmiştir. Kapsamlı bir ıslah çalışması için yaklaşık 1000 bireyle çalışılabileceği düşünüldüğünde elde edilen veriler 1000 bitkiye göre hesaplandığında en kısa süren yöntem 11.6 gün ile ışıkta bakma yöntemi olup bu yöntemin işçilik maliyeti bu yüzden daha düşük olacaktır ve 382.4 TL olarak hesaplanmıştır. Diğer yöntemlerde ise CP ortamı ile doğrudan ekim de 21.7 gün sürmüş olup maliyeti 713.9 TL, E20A ortamı ile doğrudan ekim de 46 gün maliyeti 1517.6 TL, tek tek açma ile 46.1 gün 1520.5 TL, sterilizasyon sonrası CP ekim de 202.0 gün maliyet 6667.6 TL, sterilizasyon sonrası E20A ekim de 473.5 gün sürmüş olup maliyeti de 15.625 TL olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak 1 haploid bitki elde etmek için gerekli iş gücü maliyetini incelediğimizde ışıkta bakma yöntemi ile 0.4 TL, CP ortamıyla doğrudan ekim de 0.7 TL, E20A ortamıyla doğrudan ekim 1.5 TL tek tek açma yönteminde 1.5 TL, sterilizasyon sonrası tohumların CP ortamına ekimde 6.6 TL, E20A ortamına ekimde ise 15.6 TL gerekmektedir. 49

4. BULGULAR VE TARTIŞMA Gökhan BAKTEMUR Çizelge 4.11. Farklı embriyo kurtarma yöntemlerinde işgücü ve süreye göre embriyo maliyetleri 1000 bitki için Yöntemler Tek Tek Açma Yöntemi Direk Ekim CP Direk Ekim E20A Embriyo Sayısı/ Gün Gelir (TL) Süre (gün) İşçilik (TL) Haploid bitki /işgücü (TL) 21.7 1 041.75 46.1 1520.5 1.5 46.2 2 218.87 21.7 713.9 0.7 21.7 1 043.74 46.0 1517.6 1.5 Işıkta Bakma 86.3 4 141.90 11.6 382.4 0.4 Sterilizasyon Sonrası CP Sterilizasyon Sonrası E20A 4.9 237.57 202.0 6667.6 6.6 2.1 101.38 473.5 15.625 15.6 50

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Gökhan BAKTEMUR 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Kavunda ışınlanmış polen kullanılarak haploid embriyo elde edilmesi yönteminde embriyo kurtarma amacı ile farklı yöntemlerin kıyaslandığı bu çalışmadan elde edilen sonuçlar aşağıdaki gibi özetlenebilir: 1. 2007 yılı Nisan ayında havaların serin geçmesi sebebiyle yeterli dişi çiçek oluşumu gerçekleşemediğinden tozlamalar sadece mayıs ayında, 2008 yılında ise Nisan ve Mayıs aylarında Y2 ve Y3 genotiplerinde tozlama yapılmıştır. 2. 2007 ve 2008 yıllarında dişi çiçeklerde gerçekleştirilen tozlamalarda; tozlanan bitki sayısının tutan meyve sayısı ve hasada gelmiş meyve sayısına paralellik göstermediği görülmüştür. Bunun nedenleri arasında tozlama sonrası 3 4 gün içinde dişi çiçeklerde görülen sararmalar, tutan meyvelerde ise hasat zamanına yakın görülen çatlamalardır. 3. Nisan ayında Y2 genotipinde tozlanan bitki sayısı ile hasada gelmiş meyve sayısı arasındaki oranın % 19.0, Y3 genotipinde ise % 29.3 olduğu görülmüştür. Mayıs ayında bu oranlar hava sıcaklığının artmasıyla birlikte artışlar göstermiştir. Buna göre Y2 genotipinde % 72.3, Y3 genotipinde ise % 95.2 olarak bulunmuştur. Meyve sayısındaki azalmanın en aza indirilmesi için bu genotiplerde tozlama zamanının biraz daha geç dönemde yapılması ve sulama suyunun o döneme uygun miktarda verilmesi önerilebilir. 4. Tek tek açma yöntemi kullanılarak elde edilen iki yılın ortalama değerlerine baktığımızda; meyve başına ortalama tohum sayısının 1206, bu tohumlardan elde edilen embriyo sayısının 46 olduğu ve bu embriyolardan 44 tanesinin bitkiye dönüştüğü belirlenmiştir. Buna göre meyve başına oluşan haploid embriyo sayısının 3.3 olarak gerçekleştirilmiştir. 5. Doğrudan ekim yönteminde iki farklı besin ortamı (CP ve E20A) denenmiştir. Gerek embriyo sayısı gerekse bitki sayısı bakımından ortamlar arasındaki fark önemli bulunmuştur. İki yılın ortalamalarına baktığımızda CP ortamında meyve başına tohum sayısı 1132, embriyo sayısı ise 36 bulunmuştur. E20A ortamında ise meyve başına tohum sayısı 1293 embriyo sayısı ise 17 olarak 51

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Gökhan BAKTEMUR bulunmuştur. Bu farkın nedeni E20A besin ortamının içerik açısından CP ortamına göre daha zayıf olmasıyla açıklanabilir. Buna göre meyve başına embriyo sayısı CP besin ortamı ile 2.40, E20A besin ortamında ise 1.10 olarak bulunmuştur. 6. Denenen diğer bir yöntem olan sıvı ortama ekim yönteminde ise hiç embriyo elde edilememiştir. Bunu tohumların etrafında kalmış olan meyve suyunun besin ortamında enfeksiyon olması olarak açıklayabiliriz. Gözlem yapılan 10 gün süresince hiç bitki gelişimi görülmediğinden gözlemlere devam edilmiş ve tohumlarda bozulmalar meydana gelmiş ve enfeksiyonlar gelişmeye başlamıştır. 7. Sterilizasyon sonrası ekim yönteminde de yukarıda bahsedilen iki farklı besin ortamı denenmiştir. CP besin ortamı kullanılarak yapılan denemedeki iki yılın ortalama değerlerini incelediğimizde meyve başına tohum sayısı 1353 embriyo sayısı 7, E20A da ise bu değerler sırasıyla 1252 ve 3 olarak bulunmuştur. 8. Işıkta bakma yönteminde ise meyve başına tohum sayısı 1249, embriyo sayısı 43 olarak bulunmuştur. Bu yöntemdeki sınırlayıcı faktörün aynı kişinin sürekli olarak ışığa bakma zorluğu olduğu düşünülmektedir. Buna göre meyve başına embriyo sayısının 3.10 olarak gerçekleştirilmiştir. 9. Embriyo kurtarma yöntemleri karşılaştırıldığında meyve başına embriyo sayıları açısından en yüksek değerler tek tek açma yöntemi, ışıkta bakma yöntemi ve CP ortamına doğrudan ekim olmuş olup bu yöntemler arasında istatistiki fark bulunmamıştır. 10. Yöntemleri süre açısından kıyasladığımızda; kontrol olarak denemede yer alan tek tek açma yöntemi en fazla sürede açılmış, en az sürede ise ışıkta bakma yöntemi olmuştur. Bu yöntemin diğer yöntemlere göre daha kısa sürmesi ışık düzeneğinin üzerine konulan petri içerisindeki tohumların embriyoları daha kolay görünüyor olmasıdır. 52

5. SONUÇ VE ÖNERİLER Gökhan BAKTEMUR 11. Maliyet açısından yöntemleri incelediğimizde ışıkta bakma yöntemi ile en fazla gelir elde edilmiş en az gelir ise sterilizasyon sonrası E20A ortamına ekim yöntemi olmuştur. 12. Haploid embriyoların daha kolay ve etkili çıkartılabilmesi için denenen yöntemler sonucunda, ışıkta bakma yöntemi ve doğrudan CP ortama ekim yöntemleri ile kısa sürede çok sayıda haploid embriyo elde edilmiştir. Dolayısıyla kavun açısından çok geniş bir genetik potansiyele sahip olan ülkemizde bulunan yerel çeşitlerin ıslah çalışmaları hız kazanmış olacak ve dihaploidizasyon yöntemi ülkemiz ıslah programlarında daha yaygın ve etkin bir biçimde kullanılmasını etkileyecektir. 53

KAYNAKLAR AALDERS, K.E., 1958. Monoploidy in Cucumbers. Journal Heredity, 49: 41-44. ABAK, K., 1982. Biberde kökboğazı yanıklılığın kalıtımı üzerinde araştırmalar. A.Ü. Ziraat Fak. Doçentlik Tezi, Ankara, 62 s. ABAK, K., 1988. Türkiye de Bitki Islahı Çalışmalarında in vitro Tekniklerden Yararlanma. I. Uluslararası Tarım ve Biyoteknoloji Sempozyumu, 1-3 Haziran 1988, Ç. Ü., Adana, 7s. ABAK, K., 1993. Biber Islahında Anther Kültüründen Yaralanma. Bitki Islahı Simp. Bildirileri, TÜBİTAK TOAG Yay., 59-66. ABAK, K., 2001. Melons from Turkey: main types and their charactheristics. Proc. 23 th Geisenheim Meeting: International Training Course for Quality Inspectors for Fruit, Vegetables and Ware Potatoes. 12-14 february 2001, Geisenheim, 61-68. ABAK, K., SARI, N., PAKSOY, M., YILMAZ, H., AKTAŞ, H., TUNALI, C., 1996. Kavunda ışınlanmış polen tozlamaları ile haploid embriyo uyartımında genotip etkisi, dihaploid hatların oluşturulması, haploid ve diploid bitkilerin değisik yöntemlerle ayrımı. Tr. J. Agriculture and Forestry, 20, 425-430. ANONİM, 2007. FAO Statistical Database, http: www.fao.org. BAJAJ, Y.P.S., 1983. In vitro production of haploids. In: Handbook of Plant Cell Culture (eds: Evans, D.A., Sahrp, W.R., Ammirato, P.V., Yamada, Y.). Macmillan Publishing Company, Vol. 1., Chapter 6: 228-287. BHOJWANI, S.S., 1990. Plant tissue culture: Aplications and Limitations. Elsevier Science Puplishers B.V., Amsterdam, 502 p. BLAKESLEE, A.F., BELLING, J., FARNHAM, M.E., BERGNER, A.D., 1922. A haploid mutant in the Jimson weed, Datura Stramonium Science, 55, 646 647. BOURGIN, J. P., NITSH, J.P., 1967. Obtention de Nicotiana haloides a partir detamines cultivees in vitro Ann. Physiol. Veget., 9, 377 382. 54

CHAMBONNET, D., VAULX, R.D., 1985. Obtention of Embriyos and Plant from In Vitro Culture of Unfertilized Ovules of Cucurbita pepo. Cucurbits Genetics Cooperative Rep., 8: 66. CHAMBONNET, D., 1988. Production of Haploid pepper plants. Bulletin Interne de la Station d Amélioration des Plantes Maraichéres d Avignon-Montfavet, 1-10. CHEE, R.P., LESKOVAR, D.I., CANTLİFFE, D.J., 1992. Optimizing embryogenic callus and embryo growth of a synthetic seed system for sweetpotato by varying media nutrient concentrations. J. Am. Soc. Hort. Sci. 117:663 667. CLAVERİA, E., GARCİA-MAS, J., DOLCET-SANJUAN, R., 2005. Optimization of cucumber doubled haploid line production using in vitro rescue of in vivo induced parthenogenic embryos. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130(4):555-560. CUSTERS, J.B.M., BERGERVOET, J.H.W., 1984. Embryo size Cucumis sativus x C. melo as affected by irradiation of the polen. Cucurbit Genetics Cooperative, 7, 94 95 ÇAĞLAR, G., ABAK, K., 1999. Hıyarda (Cucumis sativus L.) in situ uyartım sonucu elde edilen haploid embriyolardan in vitro haploid bitki oluşturma. Tr. J. of Agriculture and Forestry, 23:283 290. DEMARLY, Y., SİBİ, M., 1989. Amélioration des plantes et biotechnologies. John Libbey and Comp., London, 152 s. DRYANOVSKA, O.A., ILIEVA, I.N., 1983. In vitro Anther and Ovule Cultures in Muskmelon. C.R. Acad. Bulgar Sci., 36(8): 1107-1110. DUMAS DE VAULX, R., 1979. Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L.) apres pollinisation par Cucumis ficifoilus A. Rich. Comptes Rendus de 1 Academie des Sciences Paris, Serie D, 289, 875 878. DUNWELL, J.M., 1985. Haploid Cell Culture- A Practical Approach (ed: R.A. Dixon). IRL Pres Ltd., Chapter 2: 21-36. EMİROĞLU, Ü.,1982. Haploidi ve bitki ıslahındaki önemi. Ege Üniversitesi. Ziraat Fakültesi Yayınları. No: 450, İzmir, 38 s. 55

EMİROĞLU, Ü., GÜREL, A., 1993. Bitki ıslahında modern biyoteknoloji. Short Course, The Biotechnology Revaluation. February 8 12, 1993. Organized by Ege Univ. Biotech. Cent and Fac. of Agr. Dept. of Crop Sci., İzmir, 103-110. GALLAIS, A., 1990. Théorie de la séléction en amélioration des plantes. INRA ed., Paris. GUHA, S., MAHESWARİ, S.C., 1964. İnvitro production of embryos from anthers of Datura. Nature, 204,497. GÜRSÖZ, N., ABAK, K., PITRAT, M., RODE, J.C., DUMAS DE VAULX, R., 1991. Obtention of haploid plants induced by irradiated pollen in watermelon (Citrullus ianatus). Cucurbit Genetic Cooperative, 11, 109-110. HENRY, Y., De BUYSER, J., 1983. Androgenese chez le ble tendre. Analyse theorique et utilisation en selection. These de Docteur d Etat. Specialite: Sciences Naturelles. Univ. Paris-Sud, Centre d Orsay, 132 ptannexes. HERMSEN, J.G.T., RAMANA, M.S., 1981. Haploidy and plant breeding. Phill. Trans. R. Soc. Lond. B., Vol. 292: 449 507. KELLER, J., 1990a. Culture of unpollinated ovules, ovaries and flower duds in some species of genus Allium and haploid induction via gynogenesis in Onion. Euphytica, 47: 241 247. KELLER, J., 1990b. Haploids from unpollinated ovaries of Allium cepa-single plant screening, haploid determination and long term storage. VII th International Cong. on Plant Tissue Culture, 24-29 June 1990, Amsterdam, Abst., 193. KÖKSAL, N., 1999. Haploid Kavun Bitkilerinde in vitro ve in vivo Yöntemlerle Diploidizasyon. Ziraat Fakültesi Yüksek Lisans, Sayfa Sayısı: 116, KUCKUCK, H., KABABE, G., WENZEL, G., 1991. Fundamentals of plant breeding. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. KURTAR, ES., SARI, N., ABAK., 2002. Obtention of haploid embryos and plants through irradiated pollen technique in squash (Cucurbita pepo L.). Euphytica 127:335 344 56

KWACK, N.S., FUJİEDA, K., 1988. Somatic Embriyogenesis in Cultured Unfertilized Ovules of Cucurbita moschata. J. Japan. Soc. Hort. Sci., 57(1): 34-42. LESPINASSE, Y., GODICHEAU, M., DURAN, M., 1983. Potential value and method of procuding haploids on apple tree, Malus pumila (Mill.) in vitro culture. Acta Horticulturae, 131: 223 230. LIM, W., EARLE, E.D., 2008. Effect of in vitro and in vivo colchicine treatments on polen production and fruit set of melon plants obtained by pollination with irradiated polen Plant Cell Tiss Organ Cult (2008) 95:115 124 DOI 10.1007/s11240 008 9422 9. LORENZ, O.A., MAYNARD, D.N., 1988. Knott s Handbook for Vegetable Growers. John Wiley & Sons, Inc, USA, 456 p. LOTFI, M., ALAN, A.R., HENNING, M.J., JAHN, M.M, EARLE, E.D., 2003. Production of haploid and doubled haploid plants of melon (Cucumis melo L.) for use in breeding for multiple virus resistance. Plant Cell Reports, 21(11): 1121-1128. LOTFI, M., SALAHI, S., 2008. Detection of cucumber parthenogenic haploid embryos by floating the immature seeds in liquid medium Cucurbitaceae 2008, Proceedings of the IXth EUCARPIA meeting on genetics and breeding of Cucurbitaceae (Pitrat M, ed), INRA, Avignon (France), May 21-24th, 2008. MAESTRO-TEJADA, M.C., 1992. Résistance du melon aux virus. Interaction avec les pucerons vecteurs. Analyse génétique sur lignées haplodiploides. Thése de Docteur, Spécialité Biologie des Organismes et Populations, Univ. de Droit, d Economie et des Sciences d Aix-Marseille, 134 p. 1 OINUMA, T., 1977. Tobacco breeding by anther culture Proc. Symp. On Trop Agric. Res., 11, 44 53. PIERIK, R.L.M., 1989. In vitro culture of higher plants. Martinus Nijhoff Publ., Dordrecth, 344 p. PITRAT, M., CHAUVET, M., FOURCY, C., 1999. Diversity, History and Production of Cultivated Cucurbits. Acta Hort. 492:21.28. 57

POCHARD, E., DUMAS DE VAULX, R., 1979. Haploid parthenogenesis in Capsicum annum L. Reprinted from the biology and taxonomy of the Solanaceae (eds: Hawkins, G., Lester, Shelding, A.D.). Linnean Society Symp., Series No: 7, 455-472. REINERT, J., BAJAJ, Y.P.S, 1977. Anther culture: haploid production and its significance. In: Plant Cell, Tissue and Organ Culture (eds: Reinert, J., Bajaj, Y.P.S.). Springer-Verlag, New York, 251-264. ROBINSON, R.W., DECKER-WALTERS, D.S., 1997. Cucurbits. In: Crop Production Science in Horticultures Series (Ed: Jeff Atherton, Alun Ress). CAB International Department of Horticultural Science. Cornell Univ. and D.S. Decker-Walters, The Cucurbit Network. U.S.A. SANGWAN, R.S., SANGWAN-NORREL, B.S., 1990. Anther and polen culture. In: Plant tissue culture: Appl. and Limit. (ed: Bhojwani, S.S.). Elsevier Science Puplishers B.V. Amsterdam, The Nedherlands, Chapter 9: 220 242. SANJUAN, D., CLAVERİA, R., GARCIA, E.M.J., 2006. Cucumber (Cucumis sativus L.) dihaploid line production using in vitro rescue of in vivo induced parthenogenic embryos. Acta Horticulturae. 725 (Vol.2). 837-843. SARI, N., ABAK, K., PITRAT, M., DUMAS DE VAULX, R., 1992. Kavunlarda (cucumis melo L. var. inodorus Naud ve C. melo L. var. reticulatus Naud) partenogenetik haploid embriyo uyartımı ve bitki eldesi. Doğa Tr. J. Agric. Forestry, 16: 302 314. SARI, N., 1994. Karpuzlarda ışınlanmış polen uyartımıyla haploid bitki eldesi üzerine genotipin ve mevsimin etkisi ile ışınlanma yerine geçebilecek uygulamalar üzerine araştırmalar. Doktora Tezi, Ç.Ü. Fen Bil. Ens., Adana, 244 s. SARI, N., ABAK, K., PITRAT,M., RODE, J.C., DUMAS DE VAULX, R., 1994. Induction of parthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in watermelon. HortScience, 29 (10), 1189-1190. SARI, N., YETİŞİR, H., 2002. Some agronomical characteristics of doubled haploid lines produced by ırradiated pollen technique and parental diploid genotypes in melons. Turk J. Agric For 26 (2002) 311-317. 58

SAUTON, A., 1987. Recherce d Haploides chez le Melon (Cucumis melo L.): Etude et Application á la Sélection de la Parthénogenése Induite par du Polen Irradié. Thése (Docteur Nouveau Régime), Spécialité: et Techniques du Languedoc, Montpellier, 123 p. SAUTON, A., DUMAS DE VAULX, R., 1987. Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L.) seeds and resulting from a parthenogenetic devolopment induced by irradiated polen. Cucurbit Genetics Cooperative, 11, 39-42. SAUTON A., 1988. Effect of season and genotype on gynogenetic haploid production in muskmeleon, Cucumis melo L. Scientia Horticulturae, 35, 71-75. SAUTON, A., 1989. Haploid Gynogenesis in Cucumis sativus Induced by Irradiated Polen. Cucurbit Genetic Coop., 12:22-23 SAUTON, A., OLIVER, C., CHAVAGNAT, A., 1989. Use of soft X-ray technique to detect haploid embryos in immature seeds of melon. Acta Hort., 253, 131-135. SAVIN, F., DECOMBLE, V., LE COUVIOIR, M.AND HALLARD, J., 1988. The x Ray Detection of Haploid Embryos Arisen in Muskmelon (Cucumis melo L.) Seeds and Resulting from a parthenogenetic Development Induced by Irradiated Pollen. Cucurbit Genetic Coop., 11:39-42. SHAIL, J.W., ROBINSON, R.W., 1987. Anther and Ovule Culture of Cucurbita. Cucurbits Genetics Cooperative Rep., 10: 92. TANER, K.Y., YANMAZ, R., KUNTER, B., SAĞEL, Z., TUTLUER, M.İ., PEŞKİRCİOĞLU, H., USLU, N. 2003. Bazı kabakgil türlerinde gama ışınlamasının polen canlılığı ve haploid bitki oluşumu üzerine etkileri. VIII. Ulusal Nükleer Bilimler ve Teknolojileri Kongresi, 15-17 Ekim 2003, Kayseri, Bildiri Özetleri, 39 s. THORPE, T.A., 1990. The current status of plant tissue culture. In: Plant Tissue Culture: Aplications and Limitatios (ed: S. S. Bhojwani). Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam. Chapter 9: 220 242. 59

WIEN, H.C., 1997. The Cucurbits: Cucumber, Melon, Squash and Pumpkin (H.C. Wien). The Physiology of Vegetable Crops. CAB International, Wallingford, Oxon, 9: 345-386. YANMAZ, R., TANER, Y.K. 1996. Türkiye'de sebzecilik konusunda yapılan çalışmalar. (Publications on vegetable crops in Turkey).GAP I. Sebze Tarımı Sempozyumu, 7-10 Mayıs 1996, Urfa, Bildiriler, 1-7. YANMAZ, R., ELLİALTIOĞLU, Ş., TANER, Y.K., 1997. The Effects of Gamma Irradiation on Pollen Viabıly and Haploid Plant Formatıon in Snake Cucumber (Cucumis melo L. var. flexuosusnaud.) YONGBING, Z., HONGPING, Y., YUAN, J.J., JIONGXIN, F., MINGZHU, W., JINFENG, C., 2007. Propagation of haploid melon (Cucumis melo L.) in vitro Acta Horticulturae Sinica. 34-2. 497-500. ZAGORCHEVA, L., ALEXANDROVA, M., KICHUKOVA, C., 1987. Polen mother cell meiosis in the haploid of Cucumis ficifolius A. Rich. Cucurbit Genetics Cooperative, 10, 37 38. ZHANG, Y.X., LESPINASSE, Y., CHEVREAU, E., 1990. Induction of haploid in fruit trees. In: In vitro Culture and Horticultural Breeding. (eds: Janicks, J., Zimmerman, R.H.). Acta Horticulturae, 280: 293-305. 60

ÖZGEÇMİŞ 1982 yılında Çanakkale de doğdum. İlkokul, ortaokul ve lise öğrenimimi İstanbul da tamamladıktan sonra 2002 yılında Dicle Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitkisel Üretim bölümünü kazandım. 2006 yılında mezun olup aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Yüksek Lisansa başladım. 61