ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ LABORATUVARI II DENEY: ENZİM KİNETİĞİ DENEYİN AMACI Katalaz enzimi katalizörlüğünde gerçekleşen hidrojen peroksitin parçalanma reaksiyonuna ait Michaelis Menten sabitlerinin ve kinetik parametrelerin hesaplanması TEORİ ENDÜSTRİYEL ENZİMLER VE ENZİM KİNETİĞİ Hücrelerde oldukça önemli metabolik görevleri olan enzimler, biyokimyasal reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir. Enzimler çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere gündelik ve ekonomik hayata girmiştir. Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Çünkü mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır. Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır. Enzimlerin mikrobiyolojik yolla üretilmesinde genellikle derin kültür tekniği ve aerobik karıştırmalı tank tipi biyoreaktörler kullanılır. Mikroorganizmalar yardımı ile enzim üretimi birçok faktör tarafından etkilenir. Besi ortamının kompleks kimyasal bileşimi gibi faktörler yanında ph ve oksijen temini gibi dış faktörler de enzim üretim verimi için önemlidir. Mikroorganizma seçimi bir başka önemli konudur. Seçilen mikroorganizma kısa sürede yüksek verimle enzim üretebilmeli, toksik madde ve antibiyotik üretmemeli, ucuz besi ortamında rahatlıkla çoğalabilmeli, gerek enzim üretimi sırasında gerekse izolasyon ve saflaştırma işlemleri sırasında problem oluşturacak yan ürünler üretmemelidir. Bazı 1
endüstriyel enzimler ve kullanım alanları Tablo 1 de verilmiştir. (Dr.Halil Tosun, Biyoteknolojide Enzimler). Tablo 1 Yaygın kullanım alanı olan bazı endüstriyel enzimler Enzim Kullanım alanı Mikroorganizma α-amilaz Maltoz ve dekstrinin parçalanması, leke çıkarıcı, unun kalitesinin arttırılması, glikoz şurubu üretimi Bacillus subtilis Aspergillus oryzae; B.licheneformis Katalaz İçeceklerin bozulmasının önlenmesi A.niger Glikoz izomeraz GlikozFruktoz dönüşümü Aspergillus spp.;streptomycetes spp. Glikoz oksidaz Biyosensör A.niger Laktaz Laktoz Glukoz+Galaktoz Kluyveromyces laktis Proteaz Deterjan katkı maddesi, deri endüstrisi B.subtilis Lipaz Deterjan endüstrisi, yağların parçalanması A.oryzae Enzimlerin katalizör olarak kullanılması oldukça yaygındır. Bununla birlikte enzimin ticari olarak kullanımının yaygınlaşmasında en önemli engel enzimin çalıştığı oldukça spesifik koşullarının sağlanmasının zorluğudur. Enzimden en uygun koşullarda yararlanmak ve ürün seçiciliğini arttırmak için enzimin çalışma koşullarının optimize edilmesi zorunludur. Seçicilik sıcaklık, ph ve ortamda bulunan diğer maddelerin miktarlarından oldukça etkilenir. Bu problemin önüne geçmek için diğer bir yol mikroorganizmaları içerisinde eşzamanlı olarak birçok reaksiyonun aynı anda gerçekleştiği birer mikrofabrika gibi kullanmaktadır. Bu şekilde kullanım daha ekonomik olsa da reaktantların hücre içerisine, ürünlerin de hücre dışına kütle transferinde sınırlamalar prosesi yavaşlatmaktadır. Ayrıca hücre içerisinde bulunan diğer enzimler farklı dönüşüm reaksiyonları ile reaktantları farklı ürünlere çevirebilir ve istenilen ürün miktarında azalma gözlenebilir. Fakat uygun şartların sağlanması ile bu yöntem enzimin izole edilip kullanılmasından daha ekonomiktir. Ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae) mikroorganizmalar arasında en iyi bilinen maya türüdür. Son yıllarda bu mayanın basitliği ve çeşitli amaçlarla kullanılması nedeniyle bu tür üzerinde biyoteknolojik araştırmalar artmıştır. S.cerevisiae yaygın şekilde fermentasyon ve fırıncılıkta kullanılmaktadır. Arkeolojik kazılarda, S.cerevisiae nin kullanımının MÖ 4000 yılına kadar uzandığı bulunmuştur. Maya üzerine çalışmalar var olan kullanım alanlarında verimin arttırılmasının yanında biyolojik proseslerin anlaşılması ve 2
uygulama alanlarının geliştirilmesi açılarından da önemlidir. S.cerevisiae tüm gen haritası çıkarılmış ilk canlıdır. Bu deneyin kapsamında S.cerevisiae bir mikrofabrika olarak kullanılacak ve içerdiği katalaz enziminin H 2 O 2 parçalama kabiliyetinin H 2 O 2 konsantrasyonu değişimi incelenecektir. Hidrojen peroksit canlılardaki hidroliz ve dehidroliz reaksiyonlarında küçük miktarlarda ortaya çıkan toksik bir maddedir. Genel olarak tüm peroksitler yaşayan organizmalara zarar verir. Bu nedenle canlılarda bu maddeye karşı savunma da kullanılan katalaz enzimi bulunmaktadır. Katalaz enzimi hidrojen peroksitin parçalanmasında oldukça etkili bir ezimdir. Bir molekül katalaz, saniyeler içinde 40 milyon hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) molekülünü su ve oksijen şeklinde parçalayabilir. Enzimler bir katalizör olduğundan enzimatik reaksiyonlara ait kinetik parametrelerin belirlenmesi pilot ve büyük ölçekli biyoreaktörlerin ya da tesislerin kurulması ve en uygun şartlarda işletilmesi açısından önemlidir. Enzim kinetiği yaygın şekilde Michaelis Menten kinetik eşitliğine bağlı olarak hesaplanır. Michaelis Menten kinetiği, enzim kinetiğinin en basit ve en iyi modellerinden biridir. Alman biyokimyacı Leonor Michaelis ve Kanadalı hekim Maud Menten'e atfen adlandırılmıştır. Basit bir enzimatik reaksiyon aşağıdaki gibi yürümektedir. E+SE.S E+P Bu enzimatik reaksiyon modeli için enzim reaksiyon hızını betimleyen Michaelis Menten kinetik denklemi Eşitlik 1 deki gibidir. Bu denlemde reaksiyon hızı (V), bir substrat ([S]) konsantrasyonu cinsinden ifade edilir: v = [] [] (1) Burada, V max sistemden elde edilebilecek en yüksek reaksiyon hızıdır, enzimi doyurucu substrat konsantrasyonunda bu hıza ulaşılır. Michaelis sabiti K m, reaksiyon hızının V max 'ın yarısı olduğu substrat konsantrasyonudur. Genelde tek substratlı biyokimyasal reaksiyonların Michaelis Menten kinetiğine uyduğu varsayılır. V max ve K m sabitlerinin belirlenmesi için tipik yöntem, farklı substrat konsantrasyonlarında ([S]) bir seri enzim ölçümü yapılması ve reaksiyon ilk hızının (v 0 ) ölçülmesidir. Burada 'ilk' teriminden kasıt, reaksiyon hızının başlangıçtan sonraki nispeten kısa bir süre içinde ölçülmesidir, bu süre zarfında enzim-substrat kompleksinin oluşmuş olduğu ama substrat konsantrasyonun yaklaşık sabit olduğu ve dolayısıyla denge veya kararlı hal yaklaşımının geçerli olduğu varsayılır. Reaksiyon hızını konsantrasyona göre grafiğe geçirilince ve Michaelis-Menten denklemi ile doğrusal olmayan regresyon yapılarak Km ve V max parametreleri elde edilebilir. Bununla birlikte parametrelerin 3
bulunmasında daha kesin bir yöntem lineerleştirilmiş Michaelis-Menten denklemini kullanmaktır. Farklı lineerleştirme yöntemleri olsa da en yaygın kullanılan yöntem Eşitlik 2 de verilen Lineweaver Burk eşitliğidir. = + [] DENEYDE KULLANILAN MALZEMELER Deney düzeneği Şekil 1 deki gibi kurulacaktır. Malzemeler; (2) 250 ml erlen 250 ml mezür İki delikli tıpa Şırınga Serum hortumu Kronometre Magnetik karıştırıcı ve magnetik balık Deneyde kullanılacak sarf maddeler ise aşağıdaki gibidir. Marketlerde satılan yaş ya da kuru maya H 2 O 2 DİKKAT!!! H 2 O 2 aşındırıcı, kuvvetli oksitleyici bir kimyasal olup kesinlikle eldivensiz kullanılmamalıdır. 4
Şekil 1 Deney düzeneği DENEYİN YAPILIŞI Bu deneyde maya içerisinde bulunan katalaz enziminin kinetiği üzerinde çalışılacaktır. Katalaz hidrojen peroksiti parçalayarak su ve oksijen oluşumunu sağlar. 2H O 2H O + O En az beş farklı konsantrasyonda hazırlanan H 2 O 2 çözeltileri enzim için substrate (besin) olarak kullanılacaktır. Deneylerde seyreltilmiş konsantrasyonlar kullanılacaktır. Seyreltilk konsantrasyonlarda yapılan deneylerde reaksiyon çok hızlı gerçekleşmeyeceğinden verileri toplamak daha kolay olacaktır. Ayrıca ekzotermik reaksiyonlarda düşük konsantrasyonlarda deney yapıldığında reaksiyon ortamının sıcaklığı önemli ölçüde değişmeyecek ve neredeyse izotermal şartlarda deney yapılmış olacaktır. Enzim kaynağı olarak ticari olarak satılan hamur mayası kullanılacaktır. Katalaz enzimi için yaş maya (50g/L) ya da kuru maya (12g/L) kullanılarak sulu süspansiyon hazırlanır. Erlene belirli hacimde süspansiyon alınır. Deney düzeneği şekildeki gibi kurulur. Eklenen H 2 O 2 konsantrasyonlarına bağlı olarak aşağıdaki Tablo 2 deki gibi tablolar hazırlanır. Oluşan gaz hacmi kaydedilir ve ideal gaz yasası kullanılarak deney koşullarında gazın molü hesaplanır. 5
Tablo 2 Veri tabloları için örnekler. Süre (sn) Çıkan O 2 hacmi Çıkan O 2 Konsantrasyonu 10 20... [S]; H 2 O 2 kons. %0.5 %1.0 %1.5 %2.0 %2.5 [V] ; Hız Deney sonuçları için Tablo 2 de verilen tablolara benzer tabloların deney raporunda verilmesi gerekmektedir. Ayrıca her hesap için bir örnek hesaplama gösterilmelidir. 6
Veriler kullanılarak Km ve Vmax değerlerinin bulunması için Şekil 2 deki sıralama izlenmelidir. a. b. c. Şekil 2 Deney verileri kullanılarak (a) O 2 konsantrasyonunun zamana bağlı değişimi; (b) İlk hızların konsantrasyonla değişimi ve Km-Vmax hesabı (c) Lineweaver Burk grafiği ile Vmax ve Km değerlerinin hesaplanması. Çalışma Soruları 1. Basit bir enzimatik reaksiyon aşağıdaki gibi yürümektedir. E+SE.S E+P Bu reaksiyon için Michaelis Menten eşitliğini türetiniz. 2. A maddesi bir enzimatik katalitiz reaksiyonu ile bozulmaktadır. Reaksiyon hız denklemi Michaelis Menten eşitliğine bağlı olarak aşağıdaki gibi gösterilebilir. r = [ ] [ ] 7
Reaksiyon bir kesikli reaktörde gerçekleştiğine göre bu reaksiyon için gerçekleşen dönüşüm (x) ve bu dönüşüme ulaşmak için gerekeli süre (t) arasındaki eşitliği türetiniz. Kaynaklar 1. Dr.Halil Tosun, Biyoteknolojide Enzimler 2. H.Scott Fogler; Temel Kimyasal Tepkime Mühendisliği; Çeviri, Prof.Dr. Satılmış Basan; Bölüm 7: Enzimatik Tepkimelerin Temelleri 3. http://www.ou.edu/openeducation/ou-resources/biochemical-methods/lab-11/michaelismenten-derivation.pdf 8