Tıp Araştırmaları Dergisi: 2008 : 6 (2) :93-104 T AD DERLEME Programlanmış Hücre Ölümü: Apoptoz Nedir? Berrin Zuhal Altunkaynak, Elvan Özbek Atatürk Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Özet: İster tek hücreli ister çok hücreli canlılarda olsun; yaşamın başlıca kısımları doğum, büyüme, üreme, yaşlanma ve ölümdür. Organizmaların temel canlılık birimi olan hücrelerin gereksinimleri karşılanmadığında ölüm olarak adlandırılan ve hayati olayların geri dönüşsüz olarak durması anlamına gelen olay gerçekleşir. Yaşamın düzenli bir şekilde sürdürülebilmesi için canlıyı oluşturan hücrelerin sayısal dengesi de önemlidir. Bunun için hücre çoğalması ve ölümü arasında sabit bir oran bulunması gerekir. Bu derlemede başlıca iki hücre ölüm şekli olan nekroz ve apoptoz incelendi. Özellikle apoptoz çeşitli yönleri ile değerlendirilerek okuyucunun bu konu hakkında detaylı bilgiye ulaşması amaçlandı. Anahtar Kelimeler: Yaşam, hücre ölümü, apoptoz, nekroz Programmed Cell Death: What is the Apoptosis? In both alive with one cell and with many cells; main parts of life are birth, growth, reproduction, ageing and death. Cells are basic unit of organisms and if it is not supply of their requirement, death will be occurred. For maintaining of life in regular, numerical balance of cells is important. Thus, a stable ratio must be between cellular proliferation and death. In this review, necrosis and apoptosis, which are major types of cell death, were examined. Especially, apoptosis were accessed with multiple Yazışma Adresi: Dr. Berrin Zuhal ALTUNKAYNAK Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, 25100 Erzurum features. So, that readers reach to detailed knowledge in this subject was aimed. Key Words: Life, cell death, apoptosis, necrosis 1. Apoptoz Ne Demektir? Apoptoz terimi ilk olarak 1972 de J.F.K.Kerr tarafından (1) nekrozdan (2) farklı olarak gerçekleşen diğer bir ölüm şekli için tanımlanmıştır ve fizyolojik hücre ölümünü ifade eder. Eski bir yunan terimi olan apoptoz, kelime anlamı olarak yaprakların ağaçtan, petallerin çiçekten doğal olarak düşmesi anlamına gelmektedir. Bugün de bu terimin kullanımı uygundur ve fizyolojik nedenlerden kaynaklanan hücre ölümünü anlatır. Teorik olarak apoptoz, çeşitli travmatik hücre dışı lezyonlar ya da genetik faktörlerle aktive edilen ve hücrenin kendisi tarafından programlanmış bir mekanizma vasıtasıyla hücre ölümünü kontrol eden aktif bir işlem olup, hücrenin intiharı olarak tanımlanabilir. Böylece hormonal olarak aktif çeşitli maddeler, iyonize radyasyon ve kemoterapiyi içeren travmatik ajanlar vasıtasıyla gerçekleşen hücresel lezyonların ya da genetik faktörlerle aktive edilen hücresel intihar programının apoptoza neden olduğu söylenebilir (2). Fizyolojik bir işlem olarak apoptoz, normal gelişim sırasında ve olgun organizmadaki çeşitli hücre tiplerinin tahribi esnasında spesifik hücrelerin kaybından sorumludur. Apoptotik hücre sayısı kişinin ya da organizmanın sağlıklı ya da hasta oluşunu belirlediğinden, apoptozun fonksiyonel mekanizmaları hücrede denge unsurudur (3). Bu da demektir ki; apoptoz oranının azalması ile hücre sayısı artar aksine eğer apoptoz oranı artarsa hücre sayısı azalır ve istenmeyen doku tahribatı meydana gelir. Günümüzde insanı da içeren memeliler grubunda üretkenliğin dengelenmesinde
94 Altunkaynak ve Özbek Şekil 1: Apoptoza maruz kalan bir hücrede hücre ölümünün aşamaları görülmektedir (22). Şekil 2: Apoptoz esnasında Ca iyonunun rolünü göstermektedir (21). apoptozun önemli rol oynadığına dair sağlam kanıtlar vardır (4). Ayrıca birçok hastalığın genetiğinde de bu değişimler söz konusudur (5). Apoptoz tek hücreli organizmalarda hücre ölümünün tek yoludur (6). Çok hücreli organizmalarda ise genetik oluşumlu hücre hasarının bloke edilmesi ya da hücrenin tamamen yok edilmesi apoptoz vasıtasıyla gerçekleşir. Böylece hasarın yayılması ve tümör oluşumu gibi zararlı olasılıklar engellenmiş olur (7). Apoptoz olayının oluşmasından daha önce hücresel replikasyon işlemi durur (DNA onarımı) eğer bu esnada DNA tamiri gerçekleşemezse apoptoz ile sonuçlanan olaylar serisi başlar. Bu sırada apoptozun başlayıp başlamaması hasarın boyutuna, hücrenin tipine ve hücrenin üretkenlik potansiyeli olan tümor geliştirme riskine bağlıdır. Apoptoz sadece intra-uterin gelişme esnasındaki organogenez ve sinaptogenez olaylarında değil, aynı zamanda farklılaşmış dokuların olgunlaşmasında da esastır. Çünkü apoptoz vücudun bütünündeki hücre sayısının sabit tutulmasını ve immün sistem faaliyetlerinin gerçekleşmesini sağlar (7). Bu son olaya örnek olarak, immün bir reaksiyonun sonucu dikkate alınacak olursa; bu noktada aktive edilmiş lenfositlerin direkt apoptoz vasıtasıyla kendi antijenlerini elimine ettikleri görülür (8). Böylece apoptotik hücre miktarında görülen bir artış, daha önce de belirtildiği gibi dengenin olumsuz yönde bozulmasına; Alzheimer ve Parkinson gibi dejeneratif hastalıklardan ülseratif kolitler, AİDS gibi kronik hastalıklara ve hatta immünolojik hastalıklara bile neden olabilir (9-12).
Apoptoz 95 Ayrıca apoptoz; üyelerin oluşumunda, el ve ayak parmak taslakları arasındaki ara dokunun ortadan kalkmasında, omuriliğin şekillenmesinde, erkek fetüslerde müller kanalının tahribatı esnasında, viral enfeksiyonlarda Councilman cisminin oluşumunda ve iltihapta nötrofil ölümünün sağlanması ve menstrual siklus gibi birçok olayda görülür (13,14). 2. Apoptozun Aşamaları Yapılan in-vitro çalışmalar apoptozun ani gerçekleşen hızlı bir olay olduğunu gösterir. Apoptotik uyarıdan sonra hücre hızla ortamından uzaklaşır; yuvarlaklaşırken içeriği bir araya toplanır ve sitoplazması büzülür (Şekil 1). Bu büzülme kabarma gelişimi esnasında şiddetle gelişen aktivitelere yansır. Olayın dinamiği sitoplazmanın kaynamasına benzetilebilir. Protoplazmanın zardan uzaklaşmasından, apoptotik cisimin oluşumuna kadar bütün apoptotik olaylar zinciri birkaç dakika sürer. Bununla birlikte apoptotik hücrelerin fagositozu için daha uzun bir zaman gerekir. Hatta bu işlem 12-18 saat sürebilir (15,16). Tablo 1: Tip 1 hücre ölümünün görüldüğü tür ve yapılar. Yapı Tür Hücre Kaybı d-4 motor nöronlar Bazı solucanlar yok Blastoderm Kuş embriyosu bilinmiyor Kalp ventrikülleri Kuş embriyosu bilinmiyor İntestinal epitel Sıçan fetüs var Damak epiteli Sıçan embriyosu var Sırt kasları Fare embriyosu yok Elektromotor nöronlar Torpedo balık bilinmiyor embriyosu Servical visseromotor N. Kuş embriyosu %100 Lomber spinal lateral Kuş embriyosu %45 motor nöronlar Retina Genç fare bilinmiyor Sekonder lateral hat nöronları Mezensefalon ve metensefalon Metamorfik Kurbağa Kertenkele embriyosu %100 bilinmiyor Apoptozun gerçekleşmesi sırasında oluşan DNA çözülmesi, apoptozun mekanizma ve seviyeleriyle ilgili çalışmalarda önemlidir (17-19). Bu olaydan apoptozu belirleme yöntemlerinde de bahsedeceğiz. DNA çözülmesi olayı kromatin yığılmasına dayalı apoptoz sırasında çarpıcı bir şekilde ortaya çıkar (18). Apoptoz işlemi aktive edildikten 1 saat ya da daha uzun bir süre sonra DNA da tek iplikte bir çentikle başlayan çok karakteristik ve geri dönüşsüz bir parçalanma görülür. Böylece bu çözülmenin apoptozda bir anahtar olduğu düşünülür. DNA yarıklanması, DNA yı parçalayan enzim olan endonükleaz aktivitesini artırdığından önemli role sahiptir (4). Bu enzim aktivasyonu muhtemelen Ca/Mg oranının 1 ya da daha fazla oluşuna bağlı olabilir (Şekil 2) (4,18,20). Ama yinede DNA çözülmesi apoptoz için şart değildir. Sağlıklı bir hücrede basit hücresel ve moleküler bir olay herhangi bir anda apoptoza neden olabilir. Bu durum hücrelerin zaten sahip oldukları intihar programını gerçekleştirip gerçekleştirmeyeceklerini belirleyen inhibitör bir molekül taşımaları gerektiğini gösterir. Şekil 3: Heterofajik ve otofajik hücre ölümü görülmektedir (29, 35). Apoptozun Sınıflandırılması Apoptozun sınıflandırılması lizozomun fonksiyonuna göre yapılır (23, 24). Schweichel ve Merker, sıçanlardan aldıkları çeşitli fötal ve embriyonik dokularda yaptıkları çalışmalardan sonra 3 ana tip ve 2 alt tip içeren bir sınıflandırma yapmışlardır. Bu sınıflandırma aşağıda özetlenmiştir: Tip.1 Hücre ölümü (heterofaji): Hem çekirdek hem de sitoplâzmanın yoğunlaşmasıyla başlar. Nükleus yoğun kromatin kitlesi içerir ve bu yoğunlaşma çekirdek yarı piknotik olana kadar artar. Yüksek büyütmede DNA iplikçiklerinden oluşan paketlerin yoğun kromatin alanına daha yakın oldukları görülür. Nükleustan sonraki en önemli değişiklik hücre zarının katlanmasıdır.
96 Altunkaynak ve Özbek Sonraki rutin fagositoz aşamasından sonra hücre içeriği lizozomlar tarafından parçalanır (Şekil 3). Özetleyecek olursak bu çeşit hücre ölümünde hücrenin kendi lizozomlarının belirgin bir rolü yoktur. Hücrenin parçalanması diğer hücrelerin lizozomları vasıtasıyla olmaktadır (25,26). Hücre ölümünün bu şekli hemen hemen bütün özelleşmiş hücrelerde gözlenir. Bazı araştırmacılar bu çeşit hücre ölümünü yapısal hücre ölümü olarak tanımlamışlardır (27,28) (Tablo 1). Tip-2 Hücre ölümü (otofaji): Bu tip hücre ölümünde, hücrenin sindirimi büyük ölçüde hücrenin kendi lizozomlarıyla olur. Belirgin olarak geniş miktarda otofajik vakuollerle karakterizedir (30) ve bazen bu vakuoller mitokondri ve endoplazmik retikulumu da içerebilir (Şekil 3). Golgi organeli de sıklıkla genişler ve bu genişleme nükleosit disfosfataz aktivitesini artırır (31). Bu şekilde gerçekleşen hücre ölümünde genelde primer lizozomlar etkilidir. Bu lizozomlar içerdikleri hidrolitik enzimleri otofajik vakuollere boşaltırlar (23). Bazen lizozomal içeriğin sitoplazmaya döküldüğü de rapor edilmiştir ama tartışmalıdır. Bu çeşit hücre ölümünde de mikrovillus ve bağlantı kompleksi kaybı görülebilir (32), ve hücre zarında kabarmalar ortaya çıkabilir (33). Ölen hücreler etraflarındaki sağlam hücrelerin endositozuna maruz kalır (34). Schweichel ve Merker e göre bu çeşit hücre ölümü dejenere dokularda ortaya çıkar. Örneğin embriyonal gelişim esnasında epitelde ya da amfibi kuyruğunda metamorfoz sırasında görülür (Tablo- 2). Tablo 2: Otofajik hücre ölümünün gözlendiği yapı ve türleri göstermektedir. Yapı Tür Hücre Kaybı Yağ cisimcikleri Sirke sineği bilinmiyor Kolumnar ve goblet Kelebek larvası %100 hücreleri Kurbağa Kurbağanın %100 notokordunda metamorfoz dönemi Damak epiteli Fare ve sıçan bilinmiyor embriyosu Mezonefronlar Kuş embriyosu %60(yaklaşık) Müller kanalı epiteli Kuş embriyosu %100 Tip-3 Hücre ölümü: Bu tip hücre ölümü de kendi içinde 2 alt tipe ayrılır: a- Non-lizozomal vezikül parçalanması: Bu tipte hücre içi organellerin şişmesini takiben sitoplazmik alanların hücre dışı boşluklarla birleşmesi olayı gerçekleşir. Hücre ve hücresel yapılar küçültülerek tahrip edilir ve organeller elektron mikroskobuyla bile görülemeyecek kadar küçülür. Aynı şekilde hücre zarı parçalanır. Nükleusların tahribatı hücrenin logaritmik fazda olup olmadığına bağlıdır (27). Fakat genelde çekirdek parçalanması hücre parçalanmasıyla aynı anlamda kullanılır. Hücrelerin kendi lizozomları tarafından sindirildiği görülmemiştir. Fakat komşu hücreler tarafından fagosite edildiği de kesin değildir. Schweichel ve Merker, hücre ölümünün bu çeşidini mineralizasyon esnasında vakuoler kıkırdak alanlarında gördüler. Bu olay kıkırdakta sadece kalsifiye hücre içi maddenin rezorpsiyonundan önce gerçekleşir. Bu tip hücre ölümü aynı zamanda mezenkimin bazı izole hücrelerinde de ortaya çıkar (23). b-sitoplazmik tip parçalanma: Bu tip hücre ölümü Schwechel ve Merker in tanımladığı tip-3a da tarif edilen hücre ölümüne organellerin genişlemesi ve sitoplazmanın vakuolleşmesi yönüyle benzer, fakat çekirdek dejenerasyonu anlamında farklıdır (37). Bu tip hücre ölümünde çekirdekte ve zar içeriğinde parçalanmadan ziyade karyoliz, ödem ya da diffüz dejenerasyon görülür. Sitoplazmik tip hücre ölümü, tip-1 hücre ölümünden nükleusun erken evrede kondanse olmayışı ile ayrılır. Hücrede, küçük elementlerde parçalanma ve ribozomlarda sayıca azalma görülmez. Bu tip hücre ölümünün Tip-2 ve Tip-3a da anlatılan hücre ölüm şekillerine benzerliği ise düz yüzlü endoplazmik retikulum ile mitokondriyal seyrelme içermesidir. Fakat bu tipte, tip-2 hücre ölümünün karakteristik özelliği olan otofajik vakuoller görülmez. Bu tip hücre ölümü mitokondriyal şişme ve endoplazmik retikulumda genişleme ve geç karyoliz görülmesi açısından nekroza benzer (38). Bu benzerlik tip-3b hücre ölümünün gelişim esnasında nekrozdan farklılaştığı ihtimalini artırmıştır. Bununla ilgili çalışmalar hala sürmektedir. Aşağıdaki tabloda hücre ölümünün üç temel tipi özetlenmiştir (tablo-3). Elbette hücre tahribatında hücresel litik enzimlerin fonksiyonu da büyüktür. Örneğin nadiren bazı vakalarda apoptotik bir uyaran olmasına rağmen hücre tahribatı ilginç bir şekilde gerçekleşir. Tahminen bu işlem ya sitoplazmadaki litik enzimlerden ya da sitoplazmik enzimlerin lizozom membranıyla temas etmesinden kaynaklanır (39). Fakat bu olayın en azından 3 farklı yolu vardır: 1-Lizozom tarafından bu enzimlerin salınması (intihar çantası hipotezi) 2-Lizozomdan serbestleşmeksizin farklı yollarla sitoplazmada bol miktarda enzim bulunması. Engellemenin bu türünde sitoplazmik hidrolazların ve asit fosfatazların artışı söz
Apoptoz 97 Tablo 3: Apoptotik hücre ölümünün tiplerini özetlemektedir. Tip Nükleus Hücre Zarı Sitoplazma Heterofajik Eliminasyon Apoptoz, daralan nekroz, nükleer tip hücre ölümü Nükleer yoğunlaşma, yığılma Kabartılar Ribozom kaybı ve içerikte yoğunlaşma Otofajik hücre ölümü Bazen piknoz Kısmi kabartı Otofajik vakuoller, endoplazmik retikulum ve mitokondride genişleme, sıklıkla Golgi organelinde de genişleme Non-lizozomal tip Geç vakuolizasyon Parçalanma Organellerin boş olarak gözükmesi Sitoplazmik tip Kromatin granüllerinin artışı Pürtüklü yüzey Endoplazmik retikulum ve nükleusta genişleme, Golgi ve mitokondride boşluklar Önemli Geç ve kısmen önemli Yok Yok konusudur. Örneğin tükürük bezlerinde sık görülür (40). 3-Sitoplazmada zaten bulunan enzimlerin aktivasyonu Apoptozun Genetiği Son yıllarda apoptozun genetiği çok ilgi çekmiştir. Apoptoz olayını gerçekleşmesi esnasında gözlenen genetik olaylar hem en toksik ilaçların hücre ölümünü bu yolla gerçekleştirdiği açık olduğundan, hem de bu işlemde tümör supresör genleri ile onkoproteinlerin birlikte iş görmesi açısından önemlidir. Her hücresel işlemde olduğu gibi apoptozun genetiğinde de belli aşamalar görülür: 1- Ölüme karar verme 2- Hücre ölümünü gerçekleştirme 3- Parçalanma 4- Fagositoz Bcl-2 ve P53: Bcl-2: Bcl-2 ailesi antiapoptotik ve proapoptotik üyelerden oluşan ve apoptozu düzenlemede en önemli role sahip olan onkoprotein grubudur. Bcl-2 ve Bcl-XL apoptozu engelleme fonksiyonunu ya kaspasların öncü formlarını durdurarak ya da kaspas akışını direkt olarak aktive eden sitoplazmadaki apoptoz uyarıcı faktör (AIF) ve sitokrom-c gibi apoptogenik faktörlerin mitokondriden serbestleşmesini engelleyerek gerçekleştirir (41). Bax ya da Bak gibi proaoptotik üyeler heterodimerizasyon yoluyla kaspas serbestleşmesini uyarır ve mitokondri zarının geçiş porlarının açıklığını değiştirerek sitokrom- C yi serbestleştirir. Dolayısıyla kaspas aktivasyonuna yol açar (41, 42). Bir hücrenin apoptoza eğilimli oluşu heterodimer ya da homodimer formundaki Bcl-2 ailesi genlerinin etkisine bağlıdır. Bcl-2 salgılanması sonucu Bcl-2 homodimerleri şekillenir. Böylece apoptoz inhibe edilir (Şekil 4). Oysa aşırı Bax apoptozu aktive eder (43). Şekil 4: Bcl-2 onkoproteininin apoptoz üzerine etkisini göstermektedir. PARP: poli ADP riboz polimeraz ı sembolize etmektedir. P53: p53 apoptozu uyarıcı bir proteindir. Birçok anti-tümör ilaç, hedef olarak hücre DNA sını seçer ve p53 seviyesini artırır. Bu aktivasyon ya hasarın tamirine ya da apoptoza yol açar (11, 44). Bu aktivasyon aynı zamanda kromozom-17 nin kısa kolundaki bir genin (17p53) üretimi ile ilgilidir (45). Bu genin mutasyonu p53
98 Altunkaynak ve Özbek salgılanmasına büyük ölçüde katkıda bulunur. Bu katkı hasarı onarabilir veya apoptozu uyarabilir. Bu ihtimallerin ikisi de Bax, p53, p21 ve farklı birkaç gene bağlıdır (46). Sadece p53 geninin mutasyonundan kaynaklanan birkaç tür tümör belirlendiğinden ve bu mutasyon tüm tümör türlerinde de gerçekleşen en yaygın mutasyon olduğundan önemlidir (45). p53, genomun içeriğini sürdürerek görev yapar. Hücrenin belli noktalarında malign tip p53 bulunması, DNA tamir mekanizmasının doğru hasarı tamir etmesinde kontrolör olarak rol oynar (Şekil 5) (47). Mutant p53 geni taşıyan hücreler, artık genom içeriğini garanti edemez. Çünkü onlar artık hücre döngüsünün durma sinyallerini alamazlar. Sonuç olarak hücre genomu stabil değildir ve bütün hücreler potansiyel olarak tümör oluşturabilir (46). Ek olarak p53 ile aynı işlevi gören p63 ve p73 genleri de tespit edilmiştir (48). Şekil 5: p53 proteininin apoptoz üzerine etkisini göstermektedir. Yani Bcl-2 hücrede aşırı miktardaysa ve p53 de mutasyona uğrarsa apoptoz gerçekleşemez (49). Yapılan araştırmalarda Ras geninin de kanser olaylarının %10-20 sinden sorumlu olduğu görülmüştür (50). Apoptozda Rol Oynayan Diğer Genetik Mekanizmalar Bazı omurgasız hayvanlarda ve memelilerde yapılan deneysel çalışmalardan edinilen genetik sonuçlar şöyledir: Ces-1 ve Ces-2 gibi spesifik genler hücrede apoptozu uyarırlar. Ced-3,Ced-11 ve Ced-9 genleri ise hücrede ölüm defektleri oluşturur. Apoptozda temel olay sistein proteazların aktivasyonudur (51). Kaspaslar proteolitik olarak aktif enzimleri parçalayan ve normalde hücrede inaktif olan proenzimler olarak sentezlenirler (52). Ced-3 geni ise özel aspartik asit sistein proteazı kodlar (53, 54). Yani Ced-3 e bağlı proteolitik akış apoptozda önemli role sahiptir. Ced-3 ün substratlarından biri de apoptoz boyunca parçalanan poli ADP riboz polimerazdır (PARP) (12). Bu enzim DNA tamirinde rol oynar ve bu enzimin proteolitik yıkımı DNA onarımını engeller (55). PARP aynı zamanda Ca/Mg ye bağlı ve DNA yı apoptoz boyunca parçalayan endonükleazları inhibe eder (56) Ced-3 tarafından parçalanan PARP apoptozu ortaya çıkaran iki anahtar fonksiyonu inhibe eder (56). Bu genler plazma membranındaki karbonhidrat kaybı ve membran fosfolipid simetrisindeki azalmayla aktive olur. Bu yolların ikisi de hücreyi apoptoza dolayısıyla da fagositoza götürme yeteneğindedir (57). Bcl-2 ye paralel fonksiyonlu bir diğer protein de C-myc dir ve bu proteinin hücrede aşırı miktarda artışıyla apoptoz bloke edilebilir (58). Ayrıca memeli hücrelerinde döngünün düzenlenmesinde Cdc-2 nin rolü de bulunmuştur (59). Benzer şekilde Siklin-A (S/G2 siklin), Siklin-B (M siklin), Siklin-E ve Siklin-D nin çeşitli fazların düzenlenmesindeki rolü de araştırılmaktadır (60, 61). Aynı zamanda PCNA nın (proliferasyon hücre çekirdeği antijeni) katalitik DNA polimeraz alt ünitelerinin sentezindeki rolü de açıktır (61). Apoptotik bir hücrede Cdc-2, PCNA, Siklin-A, C-myc ve p53 hep artar. Hücre iskelet proteinleri olan aktin, vimentin ve tubulin ise hep azalır. Yapılan birçok araştırmadan edinilen sonuçlara dayanarak Siklin-A, PCNA, Cdc-2, P53, C- myc nin yüksek seviyeleri sürekli olursa ve bu durum hücrenin G1/S fazında durması olayı ile birleşirse hücrenin apoptotik döngüye girdiği söylenebilir. Bu proteinlerin yüksek seviyelerinin sürekli hale gelmesi bir protein ailesi ya da özel bir proteinin kendine özgü alanının maskelenmesinin bir sonucu olarak gerçekleşir. Bu suretle bahsi geçen proteinlerin yarı ömrünün artması bu proteinlerin hücrenin farklı bölümlerinde yeniden dağılmasından kaynaklanabilir. Bu proteinlerden PCNA ve Cdc- 2 çekirdekte diğerleri ise sitoplazmada bulunur. Ayrıca hücrede apoptotik işaretleri kontrol edebilen ve membranda yerleşmiş ölüm reseptörleri vardır (56). Bu reseptör ailesi aynı zamanda tümör nekroz faktörleri (TNF) olarak da bilinir ve bu ailenin 6 farklı reseptör içeren 24 üyesi vardır (TNF-R, FAS, DR3, DR4, DR5, DR6). Ölüm alanı olarak bilinen, hücre membranda yerleşmiş 80 aminoasitlik sisteinden zengin bir zincir bulunmaktadır ve bu bölgenin
Apoptoz 99 Şekil 6: Hücre ölüm reseptörlerinden bazılarının apoptozdaki rolünü göstermektedir (62). apoptoz aktivasyonunda büyük önemi vardır (Şekil 6). Kaspaslar: Daha önce de belirtildiği gibi kaspaslar, sitoplazmada normalde inaktif proenzimler olarak bulunur. Fakat proteolitik parçalanmadan sonra aktif hale geçerler ve böylece kaspas aktivasyon zinciri başlar. Başlangıçta, kaspaslar mitokondride membran hasarı oluşturur ve bu olayların sonucunda; zar değişimleri, hücre iskeleti ve çekirdek değişimine yol açan hasarlar ortaya çıkar (9, 62). Ayrıca sitokrom-c nin prokaspas zimogenlerini aktive etmesi de ilginçtir. Bununla birlikte insan hücrelerinde apoptozun nasıl inhibe edildiğine dair kesin bir kanıt yoktur. Şekil 7: Mitokondrinin apoptozdaki rolünü göstermektedir (64). Mitokondri: Bazı kaspaslar mitokondride inhibe edilir. Bcl- 2 ve Bax mitokondri dış zar geçirgenliğini ayarlar. Apoptotik uyarıda mitokondriyal bir protein olan sitokrom-c, apoptotik proteaz aktive etme faktörünü (APAF-I) aktive eder ve kaspasların aktive edildiği yer olan sitoplazmaya salar (Şekil 7) (63). Apoptoz ve Patoloji Hücre ölümü nekroz ve apoptoz olmak üzere iki farklı şekilde gerçekleşir (65). Nekroz: Hücrenin kendi içinde gerçekleşen olaylardan ziyade dış faktörler sonucu ortaya çıkar. Bu faktörler ise sıklıkla olumsuz şartlar anlamına gelir. Nekroz, eş zamanlı gerçekleşen iki olaydan kaynaklanır (66). 1- Hücrenin enzimatik sindirimi a- Hücrenin kendi enzimleri tarafından sindirimi (otoliz) b- Hücrenin lökositler tarafından sindirimi (heteroliz) 2- Protein denatürasyonu Hücre Ölümünün Morfolojisi Sitoplazma Değişiklikleri: a. Eozinofili artışı (asitlik artar) olur. b. Hücre içi protein yapısı bozulur. c. Sitoplazmik RNA miktarı (bazofili) azalır. d. Sitoplazmada vakuolizasyon olur. e. Hücre içi organel parçalanması görülür. Çekirdek Değişiklikleri
100 Altunkaynak ve Özbek Karyoliz: Piknotik çekirdeğin parçalanmasıdır. 1-2 gün içinde çekirdek tamamen ortadan kaybolur. DNAaz aktivitesi artar. Çekirdek bazofilisi azalır. Piknoz: Çekirdeğin büzülmesi ya da DNA nın parçalanmasıyla oluşan DNA fragmentlerinin difüzyonla çekirdek dışına çıkmasıyla gerçekleşen bir nevi çekirdek değişimidir. Kromatin yoğunlaşması da belirgin olarak görülür. Karyoreksis: Piknotik veya kısmen piknotik çekirdeğin parçalanmasıdır. Yukarıda anlatılanların aksine apoptoz fizyolojik hücre ölümüdür. Genetik olarak kontrol edilen hücre intihar programının aktivasyonu ile yönetilir. Bu nedenle apoptoz programlanmış hücre ölümü olarak tanımlanır. Apoptoz, yaşayan dokularda artık ihtiyaç duyulmayan ya da hasara uğramış olan hücrelerde en sık ortaya çıkan ölüm şeklidir (15, 16, 67, 68). Şekil 8 ve 9 da, sırasıyla apoptoza uğramış bir hücrenin ışık ve elektron mikroskobik görüntüleri izlenmektedir. Şekil 8: Hücrede gerçekleşen apoptoz olayının ardından ortaya çıkan apoptotik cisimlerin ışık mikroskobik görünümü izlenmektedir. Oklar; hücre içerisinde görülen lipid damlacıklarını, ok başı; heterokromatik ve koyu eozinofil sitoplazmalı bir hücreyi, yıldız; apoptotik cisimleri işaret etmektedir (67). Şekil 9: Apoptotik bir hücrenin elektron mikroskobik görünümü izlenmektedir. N; nükleusu simgelemektedir (67). Nekroza Karşı Apoptoz Hem nekroz hem de apoptoz, yöntem olarak hücre ölüm şekli olmalarına rağmen bu iki ölüm şeklinin hem histolojik hem de fizyolojik nedenlerinde büyük farklılıklar vardır (15,16). Nekrozun karakteristik özelliği ölümün hücre gurubunda ortaya çıkmasıdır ve nekrozun en yaygın nedeni oksijen yetersizliği anlamına gelen hipoksi dir. Bununla birlikte arsenik, siyanid, insektisitler gibi toksik maddeler ve ağır metaller de nekroza neden olabilir (4). Nekroza neden olan olaylar, hücre ve organel parçalanmasına yol açan membran geçirgenliğinin artmasında ve bunun sonucunda da sitoplazmanın ve çekirdek içeriğinin hücreler arasındaki boşluğa salınmasında rol oynar (4, 15, 16). Hücre ölümünü takiben hücre içeriğinin hücreler arası boşluğa salınması yangı (enflamasyon, iltihaplanma) olayına sebep olur. Bu olayın karakteristik özelliği makrofaj ve nötrofillerin nekrotik dokuya göç etmesidir. Göç eden bu hücreler nekrotik dokuyu fagosite eder. Bu nedenle enflamasyon nekrozun önemli bir işaretidir. Nekroz Tipleri 1. Koagülasyon Nekrozu: Apoptozla sık sık aynı paralelde tartışılan nekroz şekli koagülasyon nekrozudur. Bu ise en yaygın nekroz şekli olup hipoksik hücre ölümünün tipik örneğidir ve protein denaturasyonu sonucu gerçekleşir. Ayrıca bu olayda organel yıkımı da görülür. Aşağıda koagülasyon nekrozu ile apoptozun kıyaslaması şu şekilde yapılmıştır (66). a Öncelikle apoptoz fizyolojik ve patolojik olaylar sonucunda gen ve enzimlerin aktivasyonundan kaynaklanır. Yani transdüksiyonun kesin işaretini takip eden fizyolojik bir uyaran vardır. Nekrozda ise bu uyaran ekzojen kaynaklıdır. Bu dış etken hipoksi ya da çeşitli toksinler olabilir. b Apoptoz tek hücrede ortaya çıkan bir olaydır ve bu olay sonucu apoptotik cisim oluşumu vardır. Apoptotik hücre, hücre olma özelliğini kaybeder ve tamamen cansız bir kitle haline dönüşür. Nekrozda ise organellerin parçalanması, şişme, zar zedelenmesi ve serbest radikal hasarı gibi olaylar söz konusudur ve nekroz belli bir hücre gurubunu etkiler. c Apoptozda enflamasyon yoktur. Oysa enflamasyon, nekrozun en belirgin özelliklerindendir. d Dokuda apoptoza uğrayan hücreler komşu hücreler tarafından fagosite edilir.
Apoptoz 101 Nekrozda ise immünolojik bir fagositoz söz konusudur (4,15,16). Bu kıyaslamada da gördüğümüz gibi bu iki olay gerek uyarım ve gelişme gerekse sonuç aşamalarının bütünü açısından birbirinden farklıdır. Apoptotik değişimler hücrede patoloji ile sonuçlanır (2). Virüsler ise konağın apoptotik cevabından kaçınmak için birçok yönteme sahiptir. Kimi Bcl-2 ye benzer proteinler, kimi Fas a bağlı hücre ölümünü engelleyen proteinler üretir. Kimi ise P53 gibi apoptozu engelleyen proteinleri inhibe eder. Örneğin Epstein Barr virüsü nün saldığı protein olan BHFRI, Bcl-2 ile homologdur (27). Cowpax virüsü ise ICE aktivitesini inhibe eden ve bu şekilde apoptozu engelleyen Crm-A proteinini üretir. Human Adenovirüs EIB geni ise tümör supresör proteini P53 ün pasifize edilmesini sağlayan bir protein kodlar. Birkaç Herpes virüsündeki gibi bir viral inhibitör ailesi (V flips) FAS ölüm reseptörleriyle apoptozu bloke eder. Böylece apoptozu düzenleme yolları hücre ölümünü de düzenleyerek kanserden Aizheimer e kadar anormal hücre çoğalması ya da ölümünden kaynaklanan birçok hastalığı tedavi etme şansı sağlar. Apoptozu Belirleme Yöntemleri Hücrede apoptozu belirlemek için kullanılan bu yöntemleri aşağıdaki gibi sınıflandırılır: A-Hücrede Apoptozu Belirleme Yöntemleri: 1. Elektron mikroskopi 2. DNA Ladder 3. Tunel Tekniği 4. FACS Analizleri 5. MTT Yöntemi 6. Annexin Yöntemi B-Proapoptotik ve Anti-apoptotik Gen Ürünlerinin Ölçümü: 1. İmmünohistokimya 2. İmmünoblot yöntemi 3. Semi-kantitatif mrna analizleri 4. Rnaz Üretim metodu 5. Fas Analizi 6. Fas Ligand Analizi 7. TRAİL/TRAİL R 8. Bcl-2 Üretimi 9. Bcl-XL Üretimi 10. Kaspaslar 11. Sitotoxite Biz bu yöntemlerden kısaca bahsedeceğiz: 1. Elektron Mikroskopi Alınan hücreler sırasıyla gluteraldehit ve osmium tetraoksitle fikse edilir. Örnekler daha sonra dereceli alkol ya da aseton serilerinden geçirilir, propilen oksitle yıkanır ve Epon-resinle bloklanır. Alınan 50-80 nm kalınlığında kesitler uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyanır. Gözlenen hücrelerde ki yoğunlaşmış ve küçülmüş çekirdekler apoptozun karakteristik özellikleridir (69). Aşağıdaki şekilde apoptotik bir hücrenin elektron mikroskobik görünümü izlenmektedir (Şekil 10). Şekil 10: Elektron mikroskobu altında apoptotik bir hücre görülmektedir (68). 2. DNA Ladder Genomik DNA fragmantasyonu ölüme giden bir hücrenin kesin kanıtı olduğundan bu yöntem önemlidir (70). Bu yöntemde apoptotik hücre kitlesi bağlayıcı lizis tamponu ile eşit hacimde inkübe edilir. Daha sonra kolayca cam iplikli örtü ile kaplı tüp filitrelerden geçirilir. Santifürüj ile DNA Lysate bileşiklerinden cam fibrilli örtüye bağlanarak ayrılır. Yıkamadan sonra DNA filtreli tüpten kurtarılır ve jel üzerinde yürütülür. 3. Tunel Metodu DNA parçalarının serbest 3 OH kısmı biotin, digoxigenin ya da florescein gibi nükleotidler vasıtasıyla modifiye edilmiş enzimatik etiketler ile belirlenebilir (71). Bu teknikte flovsitometriyle apoptotik hücrelerin yüzdeleri ölçmek mümkündür. DNA kaybından kaçınmak için kesitler dondurma mikrotomuyla alınabilir. Parafinle bloklanan kesitler ise sırasıyla deparafine ve dehidrate edilir sonra birçok tampon ve çözeltinin kullanıldığı bir dizi işlemden geçirilir. Doku kesitleri üzerinde genellikle hematoksilen ile zıt boyama yapıldıktan sonra preparatlar incelenir. Çokça kullanılan bir yöntemdir. 4. İmmünohistokimya Dondurma veya parafin bloklamayla alınan kesitler rutin bazı işlemlerden sonra farklı
102 Altunkaynak ve Özbek aşamalarda bağlanmayı belirlemek için PBS ve TBS içeren %1 lik bovin serum albumin ile yıkandıktan sonra oda sıcaklığında en az 1 saat özel monoklonal/poliklonal antikorlarla ya da izotip kontrol antikorlarla inkübe edilir. Böylece bir dizi işlemden sonra antikora özgü antijen ya da bakteri tesbit edilir. 5. Ligand-Reseptör İşaretleme Yöntemi Hücresel fonksyonlarda ligand-reseptörlerin birbiri ile etkileşiminin düzenlenmesinin hücre içerisinde transdüksiyon işareti olduğu bilinmektedir. Reseptör işaretleme yöntemi farklı üç akıştan oluşur: 1. G proteinine bağlı proteinkinaz-a ve proteinkinaz-c yolu 2. Katalitik reseptör protein tirozinkinaz ve protein serin/treoninkinaz yolu 3. İntraselüler nükleer reseptör süperailesi yolu Bu yolların her birinin düzenlenişi oldukça komplekstir. Üstelik bu reseptör yollarının tek başına gerçekleşmesi ya da birbirini pozitif ya da negatif olarak etkilemesi hücre fonksiyonlarını etkileyebilir. Reseptör işaretleme kavramının az da olsa tersi de söz konusu olabilir. Çünkü hücre ölümünü kontrol eden hücre içi işaretleme yoluyla birçok reseptörün birleşerek apoptozu düzenleyebileceği düşünülebilir. Bu durum inhibisyonla aktivasyon arasındaki denge demek olduğundan önemlidir. Böylece muhtemelen verilen herhangi bir apoptotik uyarı bu etkiyi sağlayabilir ya da diğer ligand reseptörlerle birleşebilir (72, 73). 6. Fas ve Apoptotik İşaretleme Yöntemi Hücrelerin liganda bağlanma yoluyla öldürüldüğüne dair kanıtlar mevcuttur. Apoptozun düzenlenmesi hakkında bildiklerimizin çoğu Fas analizi ile hücre reseptörlerini incelemeyle edinilir (56). Fas aynı zamanda APC-1/CD-95 olarak da adlandırılır. Bu reseptör hücre yüzeyinde bulunur ve hedef hücrelerde apoptozu tetikleyebilir. Ayrıca yine bu reseptör TNF-alfa ve sinir büyüme faktör(ngf) reseptör süper ailesinin yani apoptoz belirleyen moleküllerin bir üyesidir. Fas ın ve TNF-alfa reseptörlerinin(tnf-r1) bulunduğu alanlar apoptoz uyaran önemli 80 aminoasit lik korunmuş bir bölgeyi (ölüm alanı) içerir. Fas ın etkileri hücre membranında ikincil haberci seramid i oluşturan fosfolipid-sfingomiyelin in hidrolizini başlatır (74). Fas liganda spesifik bağlanmanın fonksiyonel sonucu apoptozun uyarılmasını koordine eden ve substratların proteolizini gerçekleştiren sistein proteaz akışının aktivasyonudur. Fas ligand ya plazma zarında bulunan ve biyolojik olarak aktif bir proteindir ya da hücre dışında çözülmüş Fas-L olarak bulunur (56). Fas kaynaklı ölümün önemi lenf nodüllerinde ve dalakta Fas ın nullisomik mutantların oluşumunda ve beyaz kan hücrelerinin kitlesel büyüklüğünde önemlidir. Bu etki Fas-L den sorumlu, apoptoza maruz kalan hücrelerin düşük kapasitelerinden kaynaklanır. Böylece Fas yönteminin bir hücre yüzeyi ligand reseptörü ile başlatılabilen fizyolojik apoptozu belirlemede kullanılabileceği gösterilmiştir. Kaynaklar 1. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972; 26(4): 239-57. 2. Searle J, Kerr JF, Bishop CJ. Necrosis and apoptosis distinct modes death with fundamentally different significance. Pathol Annu. 1982; 17: 229-259. 3. Thompson EB. Apoptosis and steroid hormones. Mol Endocrinol. 1994; 8: 665-73. 4. Schwartzman RA, Cidlowski JA. Apoptosis: the biochemistry and molecular biology of programmed cell death. Endocrine Review 1993; 14: 133-150. 5. Ballian N, Hu M, Liu SH, Brunicardi FC. Proliferation, hyperplasia, neogenesis, and neoplasia in the islets of Langerhans. Pancreas. 2007 Oct;35(3):199-206. 6. Lumachi F, Basso S. Apoptosis: life through planned cellular death regulating mechanisms, control systems, and relations with thyroid diseases. Thyroid 2002; 12(1): 27-34. 7. Evan G, Littlewood T. A matter of life and cell death. Science 1998; 281: 1317-1321. 8. Toubi E, Shoenfeld Y. Protective autoimmunity in cancer. Oncol Rep. 2007; 17(1): 245-51. 9. Saikumar P, Dong Z, Mikhailov V, Denton M, Weinberg JM, Venkatachalam MA. Apoptosis definition, mechanism and relevance to disease. Am J Med. 1999; 107: 489-506. 10. Carson DA, Ribeiro JM. Apoptosis and disease. Lancet 1993; 341: 1251-1254. 11. Thompson CB. Apotosis in the pathogenesis of autoimmune disease. Clin İmmunol İmmunopathol. 1995; 267: 1456-1462. 12. Mountz JD, Zheu T, Su X, Wu J, Cheng J. The role of programmed cell death as an emerging new concept for pathogenesis of autoimmune disease. Clin İmmunol İmmunopathol. 1996; 8: 2-14.