Anti-HCV Antikor Pozitif Hastalar m zda ANA, AMA ve Anti-LKM-1 Antikorlar n n Varl ğ

Anti-HCV Antikor Pozitif Hastalar m zda ANA, AMA ve Anti-LKM-1 Antikorlar n n Varl ğ Metin SİNGAN, Erdal ESKİOĞLU, Yücel ÜSTÜNDAĞ, Tankut KÖSEOĞLU, Enver ÜNER, Kerem SEZER S.B. Ankara Numune Eğitim ve Araşt rma Hastanesi, 2. İç Hastal klar Kliniği, ANKARA ÖZET Amaç: Bu çalışmada, antihepatit C virüsü (anti-hcv) antikor pozitif hastalarımızda otoantikorların varlığı araştırıldı. Yöntem: Çalışmaya 2. jenerasyon ELISA ile anti-hcv antikor pozitif (yaş ortalaması 53.42 ± 14.20; kadın erkek oranı 12/19), hepatit B virüsü (HBV) serolojisi negatif, hepatotoksik ilaç kullanmayan 31 hasta dahil edilmiştir. Kontrol grubu olarak 31 sağlıklı birey (yaş ortalaması 51.65 ± 14.12; kadın erkek oranı 12/19) alınmıştır. Antinükleer antikor (ANA) ve antimitokondriyal antikor (AMA) indirekt immünfloresan teknikle, anti-lkm-1 antikor ise ELISA ile çalışıldı. Bulgular: Hasta ve kontrol grupları arasında yaş ve cinsiyet açısından istatistiksel farklılık yoktu. Kontrol grubunda ANA 1 hastada pozitif olup, AMA veya anti-lkm-1 antikor pozitifliği mevcut değildi. Hasta grubunda, toplam 16 hastada bu 3 antikordan biri pozitif olup (%51), anti-lkm-1 antikor 13 (%42.93), ANA 5 (%16), AMA 4 (%12.9) hastada pozitif idi. Hasta ve kontrol grupları arasında ANA ve AMA pozitifliği açısından fark yok iken (p> 0.05), anti-lkm-1 antikor pozitifliği açısından anlamlı farklılık vardı (p< 0.01). Yorum: Anti-HCV antikor pozitif hastalarımızda dış literatüre göre çok daha yüksek olan anti-lkm-1 antikor varlığının, kullanılan ölçüm tekniği ile ilişkili olduğunu düşünmekteyiz. Daha geniş hasta grubunda ve immünfloresan yöntem ile bulgularımızın araştırılması gerektiğine inanmaktayız. Anahtar Kelimeler: Anti-HCV pozitifliği, otoantikorlar SUMMARY ANA, AMA and Anti-LKM-1 Antibodies in Anti-HCV Positive Patients Objective: To detect the presence of autoantibodies in anti-hcv positive cases, we enrolled 31 patients (mean age 53.4 ± 14.2, female/male ratio 12/19) with no serological evidence of hepatitis B virus (HBV). Method: They did not have any use of hepatotoxic drugs or alcohol and also had no signs of autoimmune disease presentation. Control group included 31 healthy subjects (mean age 51.6 ± 14.2, female/male ratio 12/19). ANA and AMA were studied by indirect immunfleuroscent (IF) technique. Anti-LKM-1 antibody was tested by solid phase ELISA. 161

Singan M, Eskioğlu E, Üstündağ Y, Köseoğlu T, Üner E, Sezer K Results: There was no difference between the anti-hcv positive patients and controls in respect to age and sex distributions. While ANA was positive in one of controls, AMA and anti-lkm-1 antibodies were not present in any of controls. A half of anti-hcv positive patients had one of these 3 autoantibodies. ANA was present in 5 (16%), AMA in 4 (12.9%) and anti-lkm-1 antibodies in 13 (42.93%). Conclusion: Though, there was no difference in respect to positivity of ANA and AMA between the controls and anti-hcv positive patients, the difference was significant for the presence of anti-lkm-1 antibody. Such a high percentage of anti-lkm-1 antibody positivity compared to those reported in the literature may be due to methodologic differences. On a larger sample of HCV infected patients, we have to test anti-lkm-1antibody positivity by using IF technique. Key Words: Anti-HCV antibody positivity, autoantibodies GİRİŞ Hepatit C virüsü (HCV) tüm dünyada s k olarak rastlanan bir infeksiyon etkenidir. HCV nin, hepatit B virüsüne (HBV) nazaran daha yüksek oranda kronikleşme özelliğinin olmas, karaciğer sirozu ve hepatoselüler karsinoma yol açmas bu virüsün önemini daha da artt rmaktad r. Hepatik bulgular n yan nda, HCV olgular nda karaciğer d ş otoimmün kökenli patolojiler de s k olarak saptanmaktad r (1). Diğer önemli bir nokta ise henüz netlik kazanmam ş olmakla beraber baz yazarlarca ileri sürüldüğü üzere, otoantikor varl - ğ ile seyreden HCV infeksiyonlu olgularda karaciğer parankim hasar daha belirgin olmakta ve kronikleşme süreci h zlanmaktad r (1). Bu çal şmada, kronik HCV infeksiyonu olgular m zda serum otoantikorlar n n varl ğ n araşt rmay planlad k. HASTALAR ve YÖNTEM Kas m 1999-May s 2000 tarihleri aras nda Ankara Numune Eğitim ve Araşt rma Hastanesi, Gastroenteroloji Polikliniği ne başvuran HCV ile ilişkili kronik hepatit saptanm ş 31 (12 kad n 19 erkek) hasta çal şmaya dahil edilmiştir. Kontrol grubu; herhangi bir infeksiyonu ya da otoimmün hastal ğ olmayan ve fizik muayeneleri normal s n rlarda saptanan 31 bireyden (12 kad n 19 erkek) oluşturulmuştur. Hastalar n hepsinde anti-hcv antikor pozitifliği (2. jenerasyon ELISA) ile beraber en az 6 ayd r transaminaz ölçümleri normalin 1.5 kat olarak saptanm şt r. Hiçbir hastada, interferon, antiviral ve/veya kortikosteroid ilaç kullan m yoktu. Ayr ca gebelik, tan konmuş romatizmal ve/veya endokrin hastal ğ olan veya sirozu gelişmiş hastalar çal şmaya al nmad. Kontrol grubu olarak genel dahiliye polikliniğine başvuran sağl kl bireyler al nd. Tüm hasta serumlarda rutin kan biyokimyas total bilirubin, direkt bilirubin, aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), gama glutamil transferaz (GGT), alkalen fosfataz (ALP) ve laktat dehidrogenaz (LDH) ölçümleri çal ş ld. Tüm hastalardan elde edilen serum örneklerinde antinükleer antikor (ANA), antimitokondriyal antikor (AMA), antiliver/kidney mikrozomal-1 antikor (anti-lkm-1a) varl ğ araşt r ld. ANA ve AMA Testlerinin Yap l ş IMMCO kiti (New York, USA) ile ANA ve AMA tayinleri yap ld. Substrat olarak ANA tayininde Hep- 2 Cells, AMA tayininde ise Hep-2/Mouse Kidney COMVI kullan ld. Tarama test 1/40 ve 1/10 dilüsyonda çal ş ld. Kit ve serumlar n oda s s na gelmesi beklendi. Kitler numaraland ktan sonra kurumalar n önlemek için su ile nemlendirildi, inkübasyon haznesine yerleştirildi. Kontrol ve test serumlar 50 ml godelere dağ t ld. Hasta serumlar 50 ml olarak godelere taş rmadan konuldu. Otuz dakika oda s s nda inkübe edildi. Lamlar Phosphate Buffer Solution (PBS) ile y kand ve Coplin jar na al n p 10 dakika daha y kand. Kurutma kağ d ile fazla miktarda PBS al nd. Lam inkübasyon haznesine konuldu. Her godeye 50 ml konjugat damlat ld. Oda s s nda 30 dakika inkübe edildi. Fazla miktardaki konjugat PBS içeren beaker da temizlendi. Lamlar PBS ile 10 dakika y kand. Fazla miktarda PBS kurutma kağ d ile al nd. Lamlar nemli iken coverslip ile kapat ld. Üç damla mounting medium eklendikten sonra ters çevrildi, hava kabarc klar uzaklaşt r ld. Lamlar immünfloresan (İF) mikroskopta x 400 büyütmede incelendi. Negatif kontrol floresan almamal, pozitif kontroller floresan almal bilgisine göre, hasta serumlar Tablo 1 de görüldüğü gibi değerlendirildi. AMA için; kobay böbrek tübülü epitel hücrelerin sitoplazmas nda floresan görünüm veren serumlar pozitif olarak kabul edildi. Diğer selüler organeller veya proksimal tübülülere ait lumen k sm n n granüler olmayan floresan vermesi pozitif olarak kabul edilmedi. Böbrek tübülü hücre sitoplazmas nda floresan 162

veren görüntünün olmamas negatif olarak değerlendirildi. ANA için; Hep-2 hücrelerinin üzerinde boyanma yap lar na dikkat edilerek alt gruplar saptand. Anti-LKM-1A Testinin Yap l ş IMMCO kiti (New York, USA) ile anti-lkm-1a tayin edildi. Bekleme işlemi + 2 C ve + 8 C de yap ld. Test solid faz ELISA yöntemiyle yap ld. Godeler anti-lkm-1 antijenleriyle kapl yd. Kontrol, kalibratör ve hasta serumu örnekleri olabilecek anti-lkm-1 antikorlar ile inkübe edildi. Bağlanmayan antikorlar ve serum proteinleri y kanarak uzaklaşt r ld. Bağlanm ş antikorlar anti-igg konjugatlar ile inkübe edildi. Bağlanmayan konjugatlar y kanarak uzaklaşt r ld. Özgün enzim substrat (pnpp) godelere eklendi, sar renk vermeleri ile reaksiyon gözlendi. Reaksiyon bittikten sonra antikor konsantrasyonuyla doğru orant l olarak renk değişikliğinin yoğunluğu 405 nm de spektrofotometre ile okundu. ANA için antikor titresi 1/40 tan yüksek, AMA için 1/10 dan yüksek pozitif ise anlaml pozitif kabul edildi. Anti-LKM-1A ölçüm değeri 17 EU/mL den yüksek olan hastalar pozitif olarak kabul edildi. İSTATİSTİK Araşt rmam zda Z istatistik analizi kullan ld. Z istatistiğinin %99 güvenilirlik düzeyindeki tablo değeri (eşik değeri) ± 2.575 dir. Z istatistiğinin %95 güvenilirlik düzeyindeki tablo değeri (eşik değeri) ± 1.96 d r. p olas l k değerinin %99 güvenilirlik düzeyindeki eşik olas l k değeri p= (0.01)/2 dir. p olas l k değerinin %95 güvenilirlik düzeyindeki eşik olas l k değeri p= (0.05)/2 dir. BULGULAR Çal şmaya al nan hasta grubu ile kontrol grubu aras nda yaş ve cinsiyet bak m ndan anlaml bir fark bulunmad (Tablo 1). ANA pozitifliği hasta grubunda %16.129 (5/31), kontrol grubunda %3.225 (1/31) idi. Kontrol grubu ile hasta grubu aras nda ANA pozitifliğinde istatistiksel olarak bir fark saptanmad. (p= 0.042). AMA hasta grubunda %12.9 (4/31), kontrol grubunda %9.68 (3/31) olarak bulundu. Kontrol grubu ile hasta grubu aras nda AMA pozitifliğinde istatistiksel olarak anlaml bir farkl l k bulunmad. (p= 0.34). Anti-LKM-1A varl ğ, hasta grubunda %41.93 (13/31) bulunurken, kontrol grubunda anti-lkm-1 varl ğ saptanmad %0 (0/31). Kontrol grubu ile hasta grubu aras nda anti-lkm-1a pozitifliğinde istatistiksel olarak anlaml fark bulundu (p= 0.001). Hastalarda ve kontrol grubunda AST, ALT ölçümleri aras nda istatistiksel olarak anlaml farkl l k mevcut idi. Otoantikorlar olan hasta grubunda ALT, AST otoantikorlar negatif hastalara göre daha yüksek olmas na rağmen arada istatistiksel olarak anlaml farkl l k yoktu (Tablo 2). Tablo 1. Kontrol grubu ile anti-hcv antikor pozitif hasta gruplar n n karş laşt r lmas. Kronik hepatit C grubu (n= 31) Kontrol grubu (n= 31) p Cinsiyet (K/E) 9/22 9/22 > 0.05 Yaş (yıl) 53.419 (30-79) 51.645 (25-80) > 0.05 AST (IU/L) 81.354 (26-341) 24.000 (14-64) > 0.05 ALT (IU/L) 94.096 (16-300) 25.870 (11-50) > 0.05 ALP (IU/L) 203.677 (46-568) 110.987 (46-156) > 0.05 GGT (IU/L) 55.424 (17-354) 48.419 (7-124 ) > 0.05 ANA pozitif hasta (n) 5 1 > 0.05 AMA pozitif hasta (n) 4 3 > 0.05 Anti-LKM-1A pozitif hasta (n) 13 0 < 0.05 Tablo 2. ANA ve AMA için değerlendirme kriterleri. Kronik hepatit C hastalar Otoantikor pozitif Otoantikor negatif p ALT (ortalama) (IU/L) 102 ± 94 (35-300) 92 ± 88 (26-341) > 0.05 AST (ortalama) (IU/L) 92 ± 88 (26-341) 69 ± 36 (27-170) > 0.05 163

Singan M, Eskioğlu E, Üstündağ Y, Köseoğlu T, Üner E, Sezer K TARTIŞMA HCV etkeninin konakç da s k olarak karaciğer d ş immünolojik olaylara neden olduğu bilinmektedir. Bu immünolojik etkilerin spektrumu, basit olarak organ özgünlüğü olmayan antikorlar n (ANA, anti-düz kas antikorlar, anti-lkm-1 antikorlar), kriyoglobulinler, antitiroid antikorlar oluşumundan, glomerulonefrit, liken planus, lenfositik sialadenit ve miks esansiyel kriyoglobulinemi gelişimi ile sonuçlanabilmektedir (2-16). Bu etkileşim zinciri lenfotropik bir virüs olan HCV nin uygun genetik zeminde hepatoselüler hücre hasar ile artan anormal immün sistem uyar m na yol açmas sonucunda olmaktad r (17). Bu etkileşimin epidemiyolojik kan tlar da gösterilmiş, interferon tedavisi ile otoantikorlar bulunan kronik C viral hepatit olgular nda hastal k aktivitesinde biyokimyasal ve histolojik olarak ortaya konmuş artm ş aktivite nedeni ile de dikkati çekmiştir (1). İnterferonun immün sistem üzerindeki etkileri nedeni ile otoantikorlar pozitif olan kronik HCV olgular nda otoimmünitenin daha da indüklenebileceği ileri sürülmüştür (18). Kronik hepatit C li hastalar n en az %30-69 unda bir tane otoantikor pozitifliği rapor edilmektedir (1). Ancak, kronik hepatit C li hastalarda otoimmün hepatitli hastalara nazaran otoantikorlar n daha düşük titrede pozitif olduğunu belirtilmektedir. Literatürde, kronik HCV infeksiyonunda ANA %9-20, ASMA %10-22, AMA %0.4-10.2 ve anti-lkm-1a %0-13 oranlar nda rapor edilmektedir (1,2,4,11,19,20,21). ANA ve AMA antikorlar n n pozitifliği bizim çal şma grubumuzda literatür verileri ile uyuşmaktad r. Ayr ca, çal şma grubumuzda hastalarda saptanan ANA benekli denilen boyanma tipinde idi. Bilindiği gibi homojen boyanma otoimmün hepatit olgular nda saptanmaktad r (1). Anti-LKM-1A n n reaksiyon verdiği sitokrom P450 DII6 n n yap s HCV ye ait genomun bir dizilim segmentine benzemektedir. Bu nedenle HCV nin anti- LKM-1 üretimine neden olabildiği ileri sürülmektedir (24). Serimizde saptad ğ m z anti-lkm-1a pozitifliği halen bu konuda literatürde mevcut en yüksek yüzdedir (%42.93). Literatürde, HCV infeksiyonlu olgularda serum otoantikorlar n prevalans farkl l klar epidemiyolojik nedenlere bağlanmakta, anti-lkm- 1A ile HCV ilişkisinin coğrafi farkl l klar gösterdiği ileri sürülmektedir (5). Ayr ca, metodolojik ve hasta seçim kriterlerindeki değişiklikler, ortaya ç kan prevalans farkl l klar ndan sorumlu tutulmaktad r (1). Türkiye de Akarca ve arkadaşlar taraf ndan yap lan bir araşt rmada, kronik HCV infeksiyonunda anti- LKM-1A pozitifliği olgular n %1.3 ünde saptanm şt r (23). Bu çal şmada IF yöntem kullan lm şt r. Bizim çal şmam z ise solid faz ELISA ile yap lm şt r. Epidemiyolojik farkl l ğ n bulunmad ğ farzedilerek, bizim çal şmam z ile Akarca ve arkadaşlar n n araşt rmas aras nda saptanm ş olan anti-lkm-1a prevalans farkl l ğ n n metodolojik nedenli olduğunu düşünmekteyiz. Anti-LKM-1A ölçümlerinin ELISA ile değil de, IF testi ile yap lmas gerektiğini, ELISA ile yanl ş pozitiflerin s k olabileceğini düşünmekteyiz. Bu çal şma ile kronik hepatit olgular nda otoantikorlar için uygun metodolojik seçimin IF olmas gerektiği anlaş lmaktad r. Serum otoantikorlar pozitif olan hastalar n transaminaz ölçümleri, otoantikorlar negatif hasta grubuna göre daha yüksek olmakla beraber, aradaki fark istatistiksel olarak anlaml bulunmam şt r. Literatürde, kronik C hepatitli olgularda HCV otoantikorlar pozitif olanlar n biyokimyasal ve histolojik hastal k aktivitelerinin daha fazla olduğu, interferon tedavisi s ras nda otoimmün klinik bulgular n ortaya ç kabildiği ve transaminazlarda aş r yükselmeler görülebilmesi nedenleri ile daha yak n takiplerinin gerekli olduğu rapor edilmiştir (21). Bu nedenle kronik C viral hepatit olgular nda, interferon tedavisi öncesi otoantikorlar n rutin taranmas gerekmektedir. Olgular m z n hiçbirinde otoimmmün bir hastal k bulgusu mevcut olmamakla beraber, interferon tedavisi başlanan ve otoantikorlar pozitif hasta grubumuz daha s k aral klarla takip edilmektedir. Ayr ca, ELISA ile anti-lkm-1a pozitif hastalar m - z n serum örneklerinin IF yöntem ile tekrar test edilmesi planlanm şt r. KAYNAKLAR 1. Cassani F, Vataleta M, Valentini P, et al. Serum autoantibodies in chronic hepatitis C: Comparison with autoimmune hepatitis and impact on the disease profile. Hepatology 1997; 26: 561-6. 2. Lenzi M, Johnson PJ, McFarlane IG, et al. Antibodies to hepatitis C virus in autoimmune liver disease: Evidence for geographic heterogenity. Lancet 1991; 338: 277-80. 3. Cassani F, Muratori L, Manotti P, et al. Serum autoantibodies and the diagnosis of type-1 autoimmune hepatitis in Italy: A reappraisal at the ligtht of hepatitis C virus infection. Gut 1993; 33: 1260-3. 4. Abuaf N, Lunel F, Giral P, et al. Nonorgan spesific autoantiboides assocaited with chronic C virus hepatitis. J Hepatol 1993; 18: 359-64. 5. Fried MW, Draguesku JO, Shindo M, et al. Clinical and serological differentiation of autoimmune and hepatitis C virus related chronic hepatitis. Dig Dis Sci 1993; 38: 631-6. 164

6. Clifford BD, Donahue D, Smith L, et al. High prevalance of serological markers of autoimmunity in patients with chronic hepatitis C. Hepatology 1995; 21: 613-9. 7. Meyer zum Buschenfelde KH, Lohse AW, Gerken G, et al. The role of autoimmunity in hepatitis C infection. J Hepatol 1995; 22(suppl 1): 93-6. 8. Cjaza AJ, Carpenter HA, Santrach PJ, et al. Evidence against hepatitis viruses as important cause of severe autoimmune hepatitis in the United States. J Hepatol 1993; 18: 342-52. 9. Reddy KR, Kravitt EL, Homberg JC, et al. Absence of LKM-1 antibody in hepatitis C viral infection in the United States. J Viral Hepatol 1995; 2: 175-9. 10. Lunel F, Abuaf N, Frangeul L, et al. Absence of LKM-1 antibody in hepatitis C viral infection. Hepatology 1992; 16: 630-6. 11. Cjaza AJ, Manns MP, Homburger HA. Frequency and significance of antibodies to liver/kidney microsome type 1 in adult with chronic hepatitis. Gastroenterology 1992; 103: 1290-5. 12. Ferri C, Greco F, Longobardo G, et al. Antibodies to hepatitis C virus in patients with mixed cryoglobulinemia. Arthritis Rheum 1991; 34: 1606-10. 13. Tran A, Quaranta JF, Benzaken S, et al. High prevalance of thyroid autoantibodies inn a prospective series of patients with chronic hepatitis C before interferon therapy. Hepatology 1993; 18: 253-7. 14. Johnson JR, Gretch DR, Yamabe H, et al. Membranoproliferative glomerulonephritis associated with hepatitis C virus infection. New Eng J Med 1993; 328: 465-70. 15. Pawlowsky JM, Ben Heyia M, Andre C, et al. Immunological disorders in C virus chronic active hepatitis: A prospective case control study. Hepatology 1994; 19: 841-8. 16. Haddad J, Deny P, Munz-Gotheil C, et al. Lymphocytic sialolympadenitis of Sjogren s syndrome associated with chronic hepatitis C virus liver disease. Lancet 1992; 339: 321-3. 17. Muratori L, Giberillini D, Lenzi M, et al. Quantification of hepatitis C virus infected peripheral blood mononucleer cells by in situ reverse transcriptase polymerase chain reaction. Blood 1997; 88: 2768-74. 18. Mc Murrayy RW, Elbourne K. Hepatitis C virus and autoimmunity. Semin Arthritis Rheum 1997; 26: 689-701. 19. Pawlotsky JM, Roudot-Thoraval F, Simmonds PP, et al. Extrahepatic immunologic manifestationed in chronic hepatitis C virus serotypes. Ann Intern Med 1995; 122: 169. 20. Lenzi M, Bellentani S, Saccocci G, et al. Prevalance of nonorgan specific autoantibodies and chronic liver disease in the general population: A nested case control study of the Dionysos Cohort. Gut 1999; 45: 435-41. 21. Todros L. Efficacy and safety of interferon alpha therapy in chronic hepatitis C with autoantibody to liverkidney microsomes. Hepatology 1995; 22: 1374-8. 22. Uygun A, Çetin C, Ateş Y ve ark. Kronik hepatit C virüs infeksiyonlu hastalarda otoantikor prevalans ve interferon alfa ilişkisi. Turk J Gastroenterol 1998; (Suppl 1): 97. 23. Akarca US, Vardar R, Karasu Z ve ark. Kronik C hepatitli olgular n serumlar nda otoantikorlar n s kl ğ ve klinik önemi. Turk J Gastroenterol 1998 (Suppl 1): 17. 24. Manns MP, Grifftih KJ, Sullvian KF, et al. LKM-1 autoantibodies recognize a short lineer sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J Clin Invest 1991; 88: 1370-8. YAZIŞMA ADRESİ: Dr. Yücel ÜSTÜNDAĞ Bağc lar 5. Sokak No: 7/4 Ceren Apartman 06700, Gaziosmanpaşa-ANKARA 165