Hepatitlerde Laboratuvar Tanı

Hepatitlerde Laboratuvar Tanı Hepatit A virusu (HAV): Akut hepatitte, lökosit sayısı normal veya hafif düşük ve kısmen lenfositoz vardır. Hastalık daha ciddi seyrettiğinde lökositler 12000/mm 3 den daha yüksek olabilir. Atipik mononükleer hücreler nadirde olsa görülür ve infeksiyöz mononükleoz (İM) u düşündüdürebilir. Ancak atipik lenfositler lenfosit sayısının % 10 undan daha yüksek değildir. Glikoz 6-fosfat dehidrogenaz eksikliğinde hemolitik anemi görülebilir. Agranülositoz, trombositopeni, pansitopeni, ve aplastik anemi tabloları nadir de olsa ortaya çıkabilir. Pıhtılaşma faktörlerinin çok azalması fulminan hepatite geçişi düşündürebilir. Aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotranferaz (ALT) gama glutamil transferaz (GGT), serum bilirubinleri ve alkalen fosfataz (ALP) değerlerinde yükselmeler karaciğer hasarına bağlı olarak ortaya çıkar. AST ve ALT hepatoselüler hasarı oldukça iyi gösteren iki parametredir. Hepatositlerde AST nin % 80 i mitokondri ve sadece %20 si sitozol içindeyken ALT nin tamamı sitozol içindedir. Bu nedenle heptositlerdeki hasar durumunda ALT seviyesi AST ye göre daha yüksektir. Bu değerlerde bir oranlamanın olabileceği deritis tarafından belirtilmiş ve AST/ALT oranının 1 den küçük olduğu belirtilmiştir. Ancak ALT düzeyinin 400 IU/lt den yüksek olması akut hepatit için bu orandan daha değerlidir. Zira bu tür yükselmeler toksik hepatit düşünülmüyorsa çoğunlukla akut hepatite işaret eder.diğer klinik tablolarda genellikle bu tür yükselme olmaz. Transaminazlarda yükselme prodromal dönemde başlar, ve klinik belirtilerin ortaya çıkışını takiben 3-10 gün içinde pik yapar (Şekil-1). ALT seviyesi genellikle 400-2000 IU/lt arasındadır ve AST ALT den daha düşük seviyelerdedir. İkterik olgularda ALT 20.000 IU/lt seviyelerine kadar çıkabilir. ALP orta deredece yüksektir. Hem ALP hem de GGT normalin iki katını genellikle geçmez ve her ikisinin birlikte yükselmesi karaciğer (KC), ALP yüksekliğinin de KC kaynaklı olduğuna işaret eder. Zira ALP tek başına kemik, bağırsak, böbrek ve plasenta kaynaklı olarak da yükselebilir. Ancak immunohistokimyasal olarak ALP nin kaynağı ayırt edilebilir. Albumin plazma konsantrasyonları da prognoz ve tedavide yol gösterebilir. Ancak yarılanma ömrü 2-3 hafta olduğundan seviye düşüşü geç anlaşılır. Pıhtılaşma faktörlerinin çoğu da KC de sentezlenir ve hasar durumunda sentez bozulur. Bu faktörlerin plazma yarı ömürleri 5 saat-5 gün arasında değişir, bu nedenle intrensek yol için parsiyel tromboplastin zamanı, extrensek yol için protrombin zamanı izlenir ve uzadıkları gözlenir. Protrombin zamanı yaşamsal önemli kriterlerden biridir. Prealbumin değerleri de akut KC hasarını belirlemede önemlidir, zira yarılanma ömrü 5 saat civarındadır. Çocukluk çağı viral hepatitlerinde prealbumin düzeyi düşüklüğünün, ALT, AST, ALP ve bilirubin yüksekliği ile birlikte tanıya katkıda bulunduğu belirtilmektedir. Hepatit A virus (HAV) infeksiyonunda spesifik tanı, virusun veya virusa ait antijenlerin tespit edilmesi yada oluşan spesifik antikorların gösrerilmesi ile konur. Antikor tespiti sık kullanılan, yararlı yöntemlerden biridir. Oluşan IgM ve IgG antikorlar infeksiyonun dönemi hakkında oldukça faydalı bilgiler verir (Şekil-1). Anti-HAV IgM geçirilen yada yakın zamanda geçirilmiş bir infeksiyona işaret eder. Anti-HAV IgG antikorları ise infeksiyondan sonra yıllarca devam eder ve infeksiyonun geçirildiğinin bir göstergesidir. Bu testler Enzim immun assay (EIA) ile oldukça iyi çalışılmaktadır. Hem IgG hem de IgM antikorlarını ayırmadan birlikte total anti-hav olarak bakan testlerde aredışık iki serumda titrenin 4 kat artışı akut infeksiyona işaret eder. EIA testlerinin sensitivite ve spesifitesi oldukça yüksektir. EIA testlerinde hem strükturel hem de non strükturel proteinlere karşı antikorlar aranabilir. Yeni olarak, 3C proteinaz a karşı oluşan antikorlar araştırılabilir. Bu antikor replikasyonun bir işareti olup 1

yıllarca pozitif kalır, dogal infeksiyonu, inaktif aşı ile immunizasyon veya immunglobulin ile kazanılan pasif bağışıklıktan ayırt etmede yararlı olabilir. Anti-HAV IgM başlangıçtan itibaren 12 ay kadar pozitif kalabilir. Yanlış pozitiflik nadirdir, RF ve anti nükleer antikor (ANA) ya bağlı olarak oluşabilir. IgA cinsi antikorlar IgM ile paralellik gösterir, 2. ayda pik yapar, IgM e göre daha düşük seviyelerdedir ve yaklaşık 2 yıl içinde kaybolur. IgG cinsi antikorlar ise başlangıçtan itibaren yükselir ve 6-12 arasında en yüksek seviyelerdedir. Bazal bir değere düştükten sonra yaşam boyu pozitif kalabilir. Tükürükten Anti-HAV IgG yi ölçen EIA testleri de mevcuttur. Spesifite ve sensitivitesi %99 olan bu testler aşı öncesi ve aşı sonrası kontrol için invaziv olmadığından özellikle çocuklarda kullanılabilir. Semptomlar ortaya çıkmadan 1-2 hafta öncesinde virus partikülü ve viral antijenler dışkıda saptanabilir, ancak bunun tanısal değeri sınırlıdır. Ayrıca bu antijen tespitine yönelik kitler de çok yaygın değildir genellikle araştırma amaçlı kullanılmaktadır. Genellikle ilk semptomdan 2 hafta önce ve 2 hafta sonrasına kadar virus dışkıda mevcuttur. Preterm infantlarda bu süre daha uzun olabilir. HAV ın klinik numunelerden izole edilmesi ve kültürünün yapılması zor ve rutin de yarar sağlamıyacak kadar uzun sürelidir. HAV RNA sı moleküler yöntemler ile gösterilebilir. Revers transkriptaz polymerase chain reaction (RT-PCR) ve in-sutu hibridizasyon ile viral RNA gösterilebilir. Antijen capture PCR ile P1/P2 genom bölgeleri tespiti ile salgın tipi HAV lar tespit edilebilir. Akut viral hepatitilerde KC biyopsisi nadiren endikedir. Histopatolojik değişiklikler diğer akut viral hepatitilere benzer, hepatositler şiş, nukleus geniş ve balonlaşma dejenerasyonu gösterir, sitoplazmik membran kalınlaşmıştır. Hücreler büzüşmüş ve eozinofilik hale gelmiştir. Portal yollar ödem ve inflamatuar hücreler nedeniyle genişlemiştir. Hücreler hızla rejenere olur ve 2-3 ay içersinde genelde normale döner. İmmunofluoresan ve immunperoksidaz boyama yöntemleri ile ve ince kesitli elektron mikroskobisi ile infekte hücrelerin sitoplazmasında HAV antijeni ve viral partikül gösterilebilir. İnfeksiyonun geç döneminde abdominal lenf bezlerinde, dalakta ve böbrekte de viral antijenler saptanabilir. HAV infeksiyonu sırasında otoimmun reaksiyonlar ortaya çıktığında; beta 2 mikroglobulin, dolaşan immun kompleks, düz kas antikor pozitifliği, ve C 5 düşüklüğü tespit edilebilir. HAV ile birlikte süper infeksiyonların ortaya çıkışında, T lenfosit artışı, gama interferon, TNF-alfa gibi sitokinlerin salındığı, bunların da karaciğerdeki rahatsızlığı alevlendirdiği belirtilmektedir. Hepatit B virusu (HBV): Serum transaminazlarının ani yükselişi akut infeksiyonun ilk ve esas göstergesidir. Semptomlar ortaya çıkmadan yükselir ve semptomların ilk haftasında pik yapar. ALT, AST den daha yüksek ve genellikle 1000 U/ml nin üzerindedir. Transaminaz seviyeleri karaciğer hastalığı ile doğru orantılı olmakla birlikte prognostik değildir. Alkalen fosfataz hafif yükselebilir. Fulminan seyirde protrombin zamanı değişebilir ve 17 sn nin üzerinde olması kötü prognoza ve KC yetmezliğine işaret eder. Akut hepatitde bu tablo yaklaşık 3-4 ay sürer, bu sürenin uzaması durumunda kronik hepatitden ayırmak zor olabilir. Fulminan hepatitde son dönemde transaminaz seviyelerinde ani azalma ve protrombin zamanında uzama görülür. Bulaştan 1-12 hafta sonra yada inkübasyon döneminde, semptomlar ortaya çıkmadan 2-8 hafta önce HBsAg saptanır (Şekil-2). HBsAg nin 3 aydan uzun sürmesi, kronik hepatite geçiş olabileceğini düşündürür. Erişkinlerde HBsAg %95 oranında kaybolur. İnfeksiyon 2

sonrası kronik HBsAg taşıyıcılığı; yenidoğanlarda %90, bebeklerde %50, çocuklarda %20 ve erişkinlerde %5 oranında gelişir. Anti-HBs nin ortaya çıkışı ile HBsAg kaybolur ve anti-hbs iyileşmenin bir göstergesidir. Mekanizma tam olarak bilinmemekle birlikte, hastaların %10-40 ında HBsAg pozitif iken düşük titrelerde anti-hbs pozitifliği gösterilebilir, bu farklı subtiplerle eş zamanlı infeksiyona bağlı olabileceği gibi, çok duyarlı tanı kitlerine de bağlı olabilir. Anti-HBs anti- HBc IgG ile birlikte çoğu kişilerde hayat boyu kalıcıcıdır. HBsAg nin kaybolması ve Anti- HBs nin oluşması iyileşmeyi, anti-hbc IgG ise doğal infeksiyonu gösterir (Tablo-1). Anti-HBc IgM, anti-hbc IgG ile birlikte semtomlarla birlikte ortaya çıkar, anti-hbc IgM birkaç ay pozitif kalır, bu dönem HBsAg nin kaybolduğu ve anti-hbs nin henüz ortaya çıkmadığı pencere dönemine de denk gelir ve bu dönemde gösterilecek yegane markır anti- HBc IgM dir. Hastalığın başlangıcından 4-8 ay sonra anti-hbc IgM kaybolur, anti-hbc IgG pozitifliği ömür boyu devam eder. Anti-HBc IgM in pozitif olarak sebat etmesi kronik hepatite geçişe işaret eder, ve kronik hepatitde düşük seviyelerde saptanabilir. Anti-HBc IgM 19S formunun akut hepatit, 7-8S formunun kronik hepatitde dominant olarak ortaya çıktığı bildirilmektedir. Anti-HBc IgG, anti-hbs nin negatif ve HBsAg nin pozitif olduğu olgularda yüksek titrelerde iken, anti-hbs pozitif olgularda düşük titrelerde ömür boyu pozitif kalabilir ve geçirilmiş infeksiyonu gösterir. HBsAg den kısa bir süre sonra HBeAg gösterilebilir, anti-hbe çıkışı ile birlikte HBeAg kaybolur, eğer 10 aydan daha uzun sebat ederse kronikleşmeye işaret eder. HBeAg replikasyon ve infektivite göstergesi olarak kabul edilmekte, anti-hbe ise infektivitenin azalması ve iyileşmeye işaret eder. Ancak moleküler tekniklerin ortaya çıkışı ile HBV DNA ve RNA nın gösterilmesi ve viral yükün ortaya konulması ile replikasyon daha doğru olarak ortaya konulabilir. Kronik HBV infeksiyonunda ALT ve AST orta derecede yükselmiştir. Transaminazlar hastalığın ciddiyetini tam olarak yansıtmamakla birlikte, genellikle 100 ünitenin altında hafif, 100-400 arası orta ve 400 ünitenin üzerinde ağır klinik gidiş olarak değerlendirilir. Serum biluribinleri çok ciddi durumların dışında normaldir. Altı aydan daha uzun süre HBsAg nin sebat etmesi taşıyıcılığa işarettir. Sağlıklı taşıyıcı olarak tanımlanan kişilerde, KC hastalığı belirtileri yoktur ve serum transaminaz değerleri normaldir. Her yıl bu taşıyıcıların % 1-2 sinde HBsAg negatifleşir. HBeAg nin kaybolması replikasyonun durduğuna işaret eder. Bu kronik HBsAg taşıyıcıları bu durumda nonreplikatif dönemde olarak kabul edilir. Her yıl % 2.7-25 oranında HBeAg/anti-HBe serokonversiyonu görüldüğü bildirilmektedir. Özellikle mutant suşlarla infeksiyonda HBeAg negatif olmasına karşın HBV DNA pozitif olarak saptanabilir. Bu nedenle relikasyonun gerçek durumu moleküler yöntemlerle ortaya konur. Taşıyıcılarda anti-hbc IgG pozitiftir. HBV DNA nın, HBeAg pozitif olguların yaklaşık % 20 sinde negatif ve anti-hbe pozitif olguların % 20 sinde pozitif olması moleküler yöntemleri özellikle kronik hepatitlerin tanısında gerekli kılmaktadır. Kronik Hepatit B varlığında serumda HBsAg nin gösterilmesi en önemli kriterdir. Olguların çoğunun serumunda HBeAg ve HBV-DNA, ayrıca karaciğer hücrelerinde de HBcAg ni saptamak mümkündür. HBeAg ve HBV-DNA varlığı viral replikasyonun devamına işaret eder, spontan veya tedavi sonucu HBV-DNA nın kaybolması ve HBeAg /Anti-HBe serokonversiyonu gözlenebilir. Kronik HBV infeksiyonunun doğal seyrinde 3 farklı dönem tanımlanabilir ki bu dönemlerde beklenen laboratuvar bulguları farklıdır. a- Erken dönem (immun tolerans dönemi): HBV-DNA (+) ve HBsAg (+) titreleri yüksek ve transaminazlar normale yakın, HBeAg /anti-hbe serokonversiyonu nadir, HBcAg sadece hücre nükleusunda gösterilir. b- Aktif dönem (immun yanıt dönemi): HBV-DNA (+) ve HBsAg (+) titreleri düşük ve 3

transaminazlar yüksektir, HBcAg hem nükleusta hem de sitoplazmada gösterilebilir. HBeAg (+) dir, ancak spontan HBeAg/Anti-HBe serokonversiyonu gözlenebilir. c- Geç dönem (non replikatif dönem): Sağlıklı HBsAg taşıyıcısı olarak da tanımlanan bu dönemde HBsAg (+), HBeAg ve HBV-DNA (-), karaciğer hücrelerinde HBcAg görülmez, transaminazlar önceki döneme göre düşük tespit edilir. Atipik serolojik tablolar: HBeAg sentezlemeyen HBV: Bu varyantlar, moleküler olarak gösterilmiş ve çeşitli gen bölgelerindeki mutasyonlarla açıklanmaya çalışılmıştır. Bu durumda kronik hepatit B olgularında viral replikasyon mevcudiyetine (HBV-DNA(+)), HBeAg eşlik etmemektedir. Ancak anti-hbe eşlik edebilir. Bu tip olguların spontan non-replikatif faza geçme olasılıkları daha düşüktür. Interferon (IFN) ile tedavi başarısı da genellikle daha kötü beklenmektedir. HBsAg negatif kronik hepatit B : Bazı endemik bölgelerde kronik hepatit veya siroz tanısı almış HBsAg (-) olguların %30-40 ında HBV-DNA gösterilmiştir. Bu olgularda a determinant bölgesinin içinde veya dışında (örn: x geninde) ortaya çıkan mutasyonlar sonucu oluşan mutant HBV nin HBsAg i mevcut ticari kitler ile tanımlanamamaktadır. HBsAg/Anti-HBs immun kompleksi: Kronik Hepatit B infeksiyonunda da Anti-HBs antikorları sentezlenmektedir, ancak HBsAg/anti-HBs immun kompleksi oluşumu nedeniyle bazen HBsAg gösterilememektedir. Araştırmaya yönelik duyarlı kitler kullanılarak spesifik antijen varlığında da anti-hbe ve anti-hbs antikorlarını göstermek mümkündür. Anti-HBc negatif olgular: Kronik Hepatit B olgularında HBsAg nin yanısıra Anti- HBc antikorları mutad olarak bulunur. Ancak; a-selektif immun yanıt defekti, b-delesyon türü mutasyona uğramış viral protein sentezi sonucu, c-aşırı HBcAg sentezi sonucu ortaya çıkan HBcAg/anti-HBc kompleksi nedeniyle anti-hbc antikorlarının saptanamayacak düzeylerde olması gibi nedenlerle anti-hbc (-) ve HBsAg (+) olgular ortaya çıkabilir. Anti-HBc-IgM pozitif olgular: Duyarlı teknikler kullanıldığında akut olguların yanı sıra bazı taşıyıcılarda, hatta iyileşmiş olgularda Anti-HBc-IgM (+) olarak saptanabilmektedir. Anti-HBc-IgM titrelerinin akut/kronik ayrımında kullanılabileceği, tedaviye başlama ve takibinde önemli olabileceğini savunan çalışmalar olmakla birlikte tersini savunan görüşlerde mevcuttur. Bu nedenle kantitatif anti-hbc-igm araştırılmasının değeri net değildir. Anti-HBe/HBeAg serokonversiyonu: Kronik infeksiyonun kemoterapi ve immunsupresyon gibi nedenlerle reaktive olduğu durumlarda HBV-DNA titresinde artışla birlikte anti-hbe/hbeag şeklinde farklı bir serokonversiyon gözlenebilmektedir. HBV-DNA miktarı: Kronik hepatit B infeksiyonunda replikasyonu gösteren en önemli kriter HBV-DNA dır. Çeşitli moleküler yöntemler ile gösterilebilen HBV-DNA hem tedaviye başlamanın hem de tedaviye yanıtın takibi açısından önemlidir. HBV-DNA miktar tayini viremiyi belirlemede altın standart olarak kabul edilmektedir. Uygulanan yöntemler: Klasik hibridizasyon uygulamaları ile 10-500 pg/ml (10 6 genom), PCR ve benzeri çoğaltma yöntemleri ile 10-50 genom saptanabilmektedir. Bugün rutin olarak kullanılabilen ticari kitler mevcuttur. Tedavi etkinliğini belirlemede daha pratik ve ucuz olan hibridizasyon yöntemlerimi yoksa duyarlılığı artmış daha kompleks ve pahalı olan kantitatif amplifikasyon yöntemlerinden mi yararlanılmalı sorusu tartışmalıdır. Tedavi kriterlerinden sadece biri olan HBV-DNA miktarının 200 pg/ml nin neresinde olduğu yanıtı için hibridizasyon yöntemleri yeterli olmaktadır. Ayrıca PCR, duyarlılığı oldukça yüksek bir tekniktir, pozitif sonuçlar her zaman replike olan genoma işaret etmeyebilir (bu nedenle mrna yada çift iplikli DNA araştırılması daha yaralı olabilir) ve HBsAg kaybolsa bile kronik olguların örneklerinde uzun süre PCR ile HBV-DNA pozitif saptanabilir. Replikatif HBV infeksiyonlu (HBeAg (+) ve/veya hibridizasyon yöntemleri ile HBV- DNA(+)), serum ALT seviyeleri normal in 1.5 katından fazla, karaciğer(kc) biyopsisinde kronik hepatit tanısı almış hastalar ve histolojik olarak Kronik Hepatit B ve Anti-HBe (+) 4

hastada enzimler yüksek ve bu yüksekliği izah edecek başka bir neden yoksa, HBV-DNA PCR yöntemi ile araştırılır ve pozitif bulunursa tedaviye başlanır. Tedavi değerlendirilmesi HBV replikasyonunun durması; anti-hbe cevabının oluşması ve hibridizasyon ile HBV-DNA nın negatifleşmesi,hbv eradikasyonu; HBsAg nin negatifleşmesi ve Anti- HBs nin pozitifleşmesi, serumda ve karaciğer dokusunda PCR ile HBV-DNA nın negatifleşmesi. Yurt dışında yapılan çalışmalarda HBeAg (+) Kronik Hepatit B li hastalarda IFN a uzun süreli yanıt oranları %25-40 civarındadır ve Anti-HBe (+) olanlarda bu başarı oranı daha düşüktür. Ancak ülkemizde Anti-HBe (+) lerde de IFN a yanıt en az HBeAg (+) olanlar kadar iyi gözlenmiştir. Hepatit C virus (HCV): HCV nin replikasyonu konusunda bilinenler yeterli değildir. HCV nin kültür çalışmaları bugüne dek başarılı olmamış, yapılan çalışmalar uygulanabilir görülmemiştir. HCV nin immun elektron mikropskobisi ile gösterilebilmiştir. HCV genomu 5 ve 3 translasyon olmayan bölge uçları (UTR) ile her iki uçta bulunan genom bölgeleri ve bunların arasında kalan open reading frame (ORF) bölgelerinden organize olmuştur. Rutinde kullanılan tanı kitlerinin hepsinde hedef bölge 5 UTR olmuştur. HCV nin büyük ve tek bir proteini kodlaması ve bu poliproteinin viral ve konak proteinazlar ile kesilmesi sonucu işlevsel olarak farklı proteinler oluşur. Bunların hepsinin ne iş gördükleri tam olarak bilinmemektedir. Bu kesilme sonunda 3 adet yapısal ve 6 adet yapısal olmayan proteinler oluşur ( 5 - C - E1 - E2 - NS2a - NS2 - NS3 NS4b - NS5a NS5b 3 ). C, E1, ve E2 yapısal proteinlerdir. C kor proteinini (p22) kodlar. HCV ile infekte kişilerde bu proteine karşı antikorları göstermek mümkündür. E1 ve E2 genleri iki zarf proteinini (gp35 ve gp70) kodlar. E2 geninin önemli özelliği gp70 in ilk 27 amino asidine denk gelen bölgenin çok fazla değişkenlik göstermesidir. Bu bölge hyper variable region 1 (HVR-1) olarak adlandırılır. HCV nin genom düzeyindeki aşırı değişkenliği, RNA ya bağlı RNA polimerazların düzeltme (proofreading) aktivitelerinin olmamasındandır. Bunun sonucu olarak bir yada daha fazla nükleotid farkından oluşan farklı virusların oluşmasına (türümsü, quasispecies) neden olur. HCV infeksiyonu birbirlerinden değişkenlik gösteren bir grup virus dizisi populasyonu ile oluşmaktadır. Bugüne kadar yapılan filogenetik çalışmalara göre HCV de 70 subtip içeren 11 tip belirlenmiştir. Ancak 6 ana genotip ve a,b,c olarak tanımlanan subtipleri daha sık çalışılmıştır. Günümüzde HCV tanısında, ELISA ile anti-hcv araştırılması en sık kullanılan ve en pratik yöntemdir. HCV infeksiyonunun tanısında 2. ve 3. jenerasyon ELISA kitleri kullanılabilir, bu testlerle virusun çeşitli antijenlerine karşı oluşmuş IgG türü antikorlar araştırılır. Kitler geliştirilmeye başladığından buyana her geçen gün gelişmeler olmuş ve serokonversiyon zamanının kısaltılması, sensitivite ve spesifitenin artırılması amaçlanmıştır. Bu nedenle hem yapısal hem de yapısal olmayan bölgelerden antijenler kullanılarak kitler hazırlanmıştır. Üçüncü jenerasyon kitlerde (c-100-3, NS3, NS4 + c22-3, c33c + NS5) rekombinanat proteinler kullanılmıştır. Ancak 3. kuşak testlerde bile Serokonversiyon süresinin uzun olması dezavantajının yanı sıra immunsuprese kişilerde çelişkili sonuçlarla karşılaşmak mümkündür, ayrıca düşük risk grubundaki kişilerde yalancı pozitiflik gözlenebilir. Çalışmalar anti-hcv IgM in akut infeksiyon göstergesi olarak değerinin olmadığını göstermiştir. HCV tanısındaki bu sorun EIA testlerinin konfirmasyonu için kitlerin geliştirilmesini teşvik etmiştir. Özellikle kan donörleri gibi düşük risk gruplarında bu yalancı pozitifliğin moleküler yöntemlerle doğrulanması uygun değildir. Bu nedenle bazı testler geliştirilmiştir. Recombinant immunoblot assay (RIBA) bu testler içinde en çok bilinenidir ve her jenerasyon EIA kitine paralel olarak RIBA kitleri de kullanıma sokulmuştur. Western blot (WB) testinde 5

katı faz (nitroselüloz bant) üzerine, EIA da kullanılan antijenler ayrı bantlar şeklinde bağlanmıştır. Bu sistemde antijenlere karşı oluşmuş antikorlar ayrı ayrı tespit edilebilir. En az iki antijen bantı üzerinde pozitiflik saptanması, pozitif olarak kabul edilir, tek bir bantta pozitiflik ise indetermine sonuç olarak kabul edilir. Ancak bu tür katı faz testlerinin duyarlılığının, EIA daki polistren katı fazına göre daha düşük olması bir olumsuzluktur. Diğer bir doğrulama testi Abbott laboratuvarları tarafından geliştirilen, rekombinant E2 proteinine karşı oluşmuş antikorları saptamaya yönelik olarak hazırlanmış mikropartikül EIA testidir. Serokonversiyonu daha erken tanımlamakta ve RIBA ile indetermine durumlarda infeksiyonu doğruluyabilmektedir. Ayrıca bu testin pozitifliğinin viremi ile paralellik gösterdiği bildirilmiştir Serolojik testlerdeki problemler, HCV konusunda moleküler çalışmaları hızlandırmıştır. Hem HCV RNA nın gösterilmesi hem de viral yükün tespiti yönünde testler geliştirilmiştir. HCV-RNA nın serumda saptanması bugün tanı için sıklıkla kullanılmaktadır. Kantitatif moleküler yöntemler özellikle kronik HCV infeksiyonunda tedaviye başlanmasında, hastalığın ve tedavinin izlenmesinde oldukça yararlıdır. Bu yöntemleri PCR ve PCR dışı yöntemler olarak kabaca ikiye ayırmak mümkündür. Farklı çoğaltma yöntemleri kullanılsa bile, hedef HCV RNA dır. Sıklıkla kullanılan yöntemler; a- Amplicor HCV monitor (Roche diagnostics): PCR temelinde çalışır, internal standart içerir. Bu nedenle ekstraksiyon aşamasından sonuç aşamasına kadar her basamak kontrol edilebilir. Elde edilen ürünler mikroplaklarda seri sulandırımlar ile hibridize edilir ve ml de RNA kopyası olarak değerlendirilir. b- Branched DNA (dallanmış problar) (Quantiplex HCV RNA- Chiron diagnostics): nükleik asite bağlanan dallanmış problar ve problara bağlanan sinyallerin ölçümü yöntemine dayanır. Hedef çoğaltma yöntemine göre duyarlılığı düşük olmakla birlikte kontaminasyon riski daha düşüktür. c- Nucleic acid sequence based amplification (NASBA) (Organon Teknika): aynı ısıda birçok enzim ve primer kullanılır. Probla hibridizasyon ve lüminesans reaksiyonun ölçülmesi esasına dayanır. Moleküler yöntemlerle gösterilen viral RNA nın infektif yada defektif olduğu bilinemez. Ayrıca önceki ilk çalışmalarda genotiplere göre de duyarlılığın değiştiği bilinmektedir. Farklı yöntemler kendi içinde tekrarlanabilirliği yüksek olsa da yöntemler arasında farklı sonuçlar elde edilebilmektedir. Bu nedenle hasta hangi testle takibe başlandıysa o test ile devam edilmesi uygundur. Kantitatif testlerin kalitatif testlere göre oldukça pahalı olması da bir sorundur. Anti-HCV si pozitif ve aminotransferazların yüksek olduğu hastalarda HCV RNA nın bir kez negatif çıkması HCV infeksiyonunu ekarte ettirmez. Özellikle seronegatif kronik hepatitlerin tanısında ve Anti- HCV pozitif olmasına rağmen devamlı normal ALT seviyeleri gözlenmesinde replikasyonu göstermek için HCV-RNA saptanması kullanılabilir (Şekil-3). Aksi gösterilmediği sürece parenteral risk faktörü olan kişilerde anti-hcv pozitifliği ile birlikte ALT nin yüksek olması HCV infeksiyonuna işaret eder. Bu hastalarda tedaviye yanıtın önceden tahmin edilebilmesi ve tedavinin etkinliğinin izlenebilmesi için HCV-RNA nın PCR ile gösterilmesi gerekmektedir. Transplant hastaları, edinsel immun yetmezlik sendromu gibi anti-hcv geliştirme problemi olan hastalar için HCV-RNA araştırılması gereklidir. Ayrıca kronik karaciğer hastalığının ayırıcı tanısı, anneden bebeğe geçişi belirleme ve akut infeksiyonun erken tanısında da PCR yarar sağlar. HCV prevalansının düşük yada yüksek olduğu yer ve gruplara göre farklı algoritmalar düzenlenip kullanılabilir. Bu algoritmalar kurumlarave bölgelere göre özelleştirilebilir. HCV tiplemesinde PCR ve serolojik yöntemler kullanılabilir. PCR a dayalı yöntemler daha duyarlı olmakla birlikte, her iki yönteminde olumlu ve olumsuz yönleri vardır. Genotiplemede en detaylı ve doğru sonuç C, E1 yada NS5b bölgesinin PCR ile çoğaltılıp dizi analizi yapılmasıdır. Bunun yanısıra genotipe özgül primerler kullanılarak PCR, PCR sonrası RFLP, PCR sonrası genotipe özgü problarla revers hibridizasyon gibi yöntemlerle de genotipleme yapılabilmektedir. Genotiplerle korelasyonu iyi serotipleme içinde testler mevcuttur ve anti-hcv pozitif olanlarda uygulanabilir. 6

Tedavi almamış kronik hepatit C infeksiyonu olan kişilerde HCV-RNA minor dalgalalanmalar gösterir. Tedavi ile birlikte viremi düzeyi azalmasına ALT de eşlik etmektedir. Virüs ve aminotransferaz yarılanma ömürleri birbirine benzerdir. Moleküler tanı yöntemleri ve kalitatif HCV-RNA sonuçları tanıya büyük katkı sağlamıştır. Ancak viral yükün, kinetik döngünün bilinmesi için kantitatif moleküler yöntemlere gereksinim vardır. Ayrıca 2x10 6 kopya/ml HCV-RNA yükü taşıyanlarda IFN tedavisine yanıtın düşük olması kantitasyonu gerekli kılmaktadır. Hastalığın doğal seyrini izlemek, daha etkin tedavi protokolleri belirlemek, mevcut ajanlarla tedaviye daha iyi yanıt alınabilecek zamanı belirlemek, tedavi dozu ve süresini daha iyi ayarlamak ve relapslarda alternatif protokolleri belirlemek için kantitatif yöntemler gereklidir. Hepatit Delta virusu (HDV): HDV defektif bir virus olup ancak HBV varlığında infeksiyona neden olabilmektedir. İnfeksiyonun HBV ile birlikteliği koinfeksiyon ve süper infeksiyon olarak ortaya çıkar hem klinik hem de laboratuvar olarak çok farklı bulgular yoktur. HDV koinfeksiyonlarda % 3-10 ve süperinfeksiyonlarda % 90 oranında kronikleşebilmektedir. HDV tanısı için HBsAg ve anti-hdv varlığı yeterlidir. Ancak moleküler yöntemler ile serumda HDV-RNA nın gösterilmesi veya karaciğer hücrelerinde immunfloresans ve immunperoksidaz boyama teknikleri ile HDV antijenin gösterilmesi tanıyı doğrulayıcıdır. Anti-HDV IgM etken alındıktan yaklaşık 1 ay sonra gösterilebilir ve 2-4 hafta içinde kaybolur, bu markır HDV ilişkili KC hasarının bir göstergesi olarak kabul edilir. Daha geç ortaya çıkan anti-hdv IgG düşük titrelerde yaklaşık 6 ay kadar pozitif olarak saptanır. IgM türü antikorların devamı kronik infeksiyona geçişin işaretidir. Koinfeksiyonda bifazik ALT yükselmesi olabilir (Şekil- 4). Transaminazlar genellikle 2-5 hafta ara ile 2 kez yükselir. İlk yükselmenin HBV, ikincinin HDV ye bağlı olduğu sanılmaktadır. Koinfeksiyon esnasında HBV replikasyonu baskılanır ve HBsAg negatif olarak tespit edilebilir. Hastalığın başlangıcında HDV Ag serumda saptanabilir. Moleküler yöntemlerle viremi esnasında HDV RNA saptamak mümkündür. Bu değerli bir göstergedir ve HDV Ag ile genellikle paralellik gösterir. Anti HBc IgM ve anti- Delta antikorlarının birlikte gösterilmesi koinfeksiyon tanısını koydurur. Ancak Süperinfeksiyon tablosunda HBsAg i HDV Ag ve HDV RNA sı ile birliktedir (Şekil-5). Anti-Delta, anti-hdv IgM ve anti-hdv IgG antikorları da pozitif olarak saptanır. HDV serolojisi ve yorumları ile ilgili ayrıntılı bilgi tablo 2 ve 3 de verilmiştir. Anti-HDV titrelerinin akut/kronik ayrımında yardımcı olabileceğini ve Anti-HDV- IgM nin kronik infeksiyonlara işaret ettiğini savunan görüşler mevcuttur. Anti-HDV IgM persistansı devam eden HDV sentezini düşündürür. Hastalık sırasında anti HDV IgM ve IgG antikorları pozitiftir. Standart testlerde IgG ve IgM cinsi antikorlar (anti-delta) birlikte bakılmaktadır. Total anti-delta titresinin ELISA ve RIA ile 1/100 titrenin üzerinde olması da kronik delta hepatitini düşündürür. HDV-RNA nın RT-PCR ile araştırılması serumun ml sinde 10-100 genomu tespit edebilmektedir ve diğer yöntemlere göre daha değerlidir. Kronik Delta hepatinin izlenmesinde ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde de PCR önemli bir tekniktir. Hepatit E virus (HEV): Hepatit E Virus tek zincirli RNA virusudur. Klinik bulguları HAV a benzer. Hastalık daha çok genç yaşlarda görülmektedir, yaşlılarda ve çocuklarda seyrek görülür ve subklinik seyreder. Kronikleşme görülmez. HEV de tanı serolojik testler ile konmaktadır. Rekombinant antijen yada sentetik peptitlerin kullanıldığı ticari kitler mevcuttur. EIA, WB ve immunfloresan yöntemler kullanılabilir. EIA ile IgM ve IgG antikorları saptanabilir. IgM antikorları ALT nin pik yapmasından hemen önce pozitifleşir. Şekil 6 da ALT, anti-hev antikorlar ve HEV RNA sına ait detay verilmiştir. Akut dönemde anti-hev IgM 7

araştırılmalıdır. Bu dönemde IgG cinsi antikorlarda gösterilebilir. Hastaların % 96 sında akut infeksiyonun başlamasından 1-4 hafta sonra anti-hev IgM antikorları gösterilir. 3 ay sonra bu oran % 50 ye düşer, 6-12 ay içinde de genellikle kaybolur. Yirmi bir ay kadar pozitif kalabildiği bildirilmiştir. İlk 4 hafta IgM türü antikorlar pik yapar. Anti-HEV IgG ise akut infeksiyonun başlangıcından 2-4 hafta sonra pik yapar ve sonra hızla azalır. Yüksek titrede IgG türü antikor yeni geçirilmiş infeksiyonun göstergesidir. IgG antikorlar 20 aydan daha uzun süre gösterilebilir. Bazı olgularda serolojik olarak yanıt gösterilemiyebilir. Bu durumda fekal antijenik inceleme tanıya yardımcı olabilir. Bazı vakalarda anti-hev antikorların yıllarca pozitif kalabildiği bildirilmiştir. Anti-HEV IgA antikorlar da serumda gösterilebilir. Akut infeksiyonda hem serumda hem de safra ve feçeste HEV RNA gösterilebilir. Serolojik yöntemlerin yanı sıra PCR, RT-PCR ve WB gibi yöntemler de tanıda kullanılabilir. HEV mozaik protein EIA (MPr-EIA) ve rekombinant EIA (RPr-EIA) yöntemleride denenmektedir. IgM ve IgG antikorlarının hastalıktan koruyucu etkisi yoktur. Tanı seroloji çalışılamıyorsa epidemiyolojik ve klinik özellikler yanında diğer hepatit nedenlerinin ekarte edilmesi ile konur. Hepatit G Virus (HGV) / GB Virus C Hepatit G virus ilk olarak kronik hepatit C infeksiyonu olan hastaların plazmasında tanımlanmıştır. HCV ile aynı virus ailesinde (Flavivirus) yer alır. Yakın dönemde tanımlanmış olan GB viruslardan GBV-C ile % 85 nükleotid ve % 95-100 aminoasid (NS3 bölgesi) benzerliği göstermektedir. HGV infeksiyonu tanısı revers transkriptaz PCR yöntemi ile HGV RNA nın serumda saptanması ile konulmaktadır. Viral RNA nın serumda varlığı vireminin ve bulaştırıcılığın kesin göstergesi olmasına rağmen kan donörlerinde bu tür taramanın yapılması pratikte mümkün değildir. ELISA ile antikor testi araştırma amaçlı olarak kullanılmaktadır. Viremiyi gösterecek bir serolojik test geliştirilememiş iken zarf proteinine karşı antikor, E2, basitçe tespit edilebilir ve HGV/GBV-C infeksiyonun ve epidemiyolojik açıdan araştırılmasında kullanılır. E2 protenine karşı antikor tespit edilebilir ve geçirilmiş infeksiyonu gösterir. Viremi ile ilişikisi HBsAg ile anti-hbs arasındaki ilişki gibidir. Akut yada kronik HGV/GBV-C infeksiyonunun tanısında kullanılabilecek tek marker viral RNA nın PCR veya başka bir amplifikasyon tekniği ile gösterilmesidir. Transfusion Transmitted Virus (TTV) TTV İlk olarak Japonya dan bildirilen yeni bir hepatit virüsüdür. HGV/GBV-C gibi primer hepatit virüsü, fulminan ve kronik hepatite, siroza neden olup olmadığı tam olarak bilinmemektedir.tanısında kullanılabilecek serolojik bir test henüz geliştirilememiştir. HGV de olduğu gibi viremi moleküler tekniklerle gösterilebilir. Kaynaklar: 1. Akbulut A. HAV infeksiyonu. Kılıçturgay K, Badur S(Eds). Viral Hepatit 2001 Kitabı. 2001, s:57-84 8

2. Benvegnu L, Pontisso P, Cavalletto D, Noventa F, Chemello L, Alberti A. Lack of correlation between hepatitis C virus genotypes and clinical course of hepatitis C virusrelated cirrhosis. Hepatology 1997; 25:211-215 3. Feinstone SM, Gust ID. Hepatitis A virus. Mandell GL,Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases. 5 th edition, Philadelphia, Churchill Livingstone, 2000, s:1920-1940 4. Gretch DR. Diagnostic tests for hepatitis C. Hepatology 1997; 26(3 suppl 1):43s-47s 5. Günaydın M. Kronik aktif Hepatit: Tedavi Açısından Laboratuvarın Önemi ve Karşılaşılan Problemler. Özgüneş İ, Usluer G, Çolak H.(Eds). 9. KLİMİK kongresi Kongre Kitabı 1999, s:35-38 6. Köksal İ. HEV infeksiyonu (Klinik Bulgular, Tanı, Tedavi, Korunma). Kılıçturgay K., Badur S.(Eds). Viral Hepatit 2001 Kitabı, 2001, s:255-258 7. Krarup HB, Drewes AM, Madsen PH. A quantitative HCV-PCR test for routine diagnostics. Scand J Clin Lab Invest. 1998; 58(5):415-422 8. Kurt H. HBV infeksiyonu (Klinik Bulgular). Kılıçturgay K, Badur S(Eds). Viral Hepatit 2001 Kitabı 2001, s:129-134 9. Lazizi Y, Pillot J: Delayed clearence of HBV-DNA detected by PCR in the absence of viral replication, J Med Virol. 1993; 39:208 10. Leblebicioğlu H. HDV infeksiyonu (Tanı). Kılıçturgay K., Badur S.(Eds). Viral Hepatit 2001 Kitabı 2001, s:233-236 11. Lok AS, Gunaratnam NT. Diagnosis of Hepatitis C. Hepatology. 1997; 26(3 suppl 1):48s- 56s 12. Mahoney FJ. Update of Diagnosis, management and prevention of Hepatitis B virus infection. Clin. Microbiol. Rev. 1999;12:351-366 13. Mondelli MU,Cerino A, Bono F, Cividini A, et al.hepatitis C virus (HCV) core serotypes in chronic HCV infection. J Clin Microbiol. 1994; 32:2523-2527 14. Moussalli J, Opolon P, Poynard T. Management of hepatitis C. J Viral Hepat. 1998; 5(2):73-82 15. Poljak M, Seme K, Koren S. Evaluation of the automated Cobas Amplicor hepatitis C virus PCR system. J Clin Microbiol. 1997; 35(11):2983-2984 16. Purcell RH, Emerson SU. Hepatitis E virus. Mandell GL,Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases. 5 th edition, Churchill Livingstone, Philadelphia 2000, s:1958-1970 17. Robinson WS:Hepatitis B and Hepatitis D virus. Mandell GL,Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases. 5 th edition, Churchill Livingstone, Philadelphia 2000, s:1652-1684 18. Stephen K. N. Ho, Tak Mao Chan, Ignatius K. P. Cheng, Kar Neng Lai. Comparison of the second-generation diegene hybrid capture assay with the branched-dna assay for measurement of hepatitis B virus DNA in serum. J Clin Microbiol. 1999; 37(8):2461-2465 19. Şentürk H. HCV infeksiyonu (Klinik Bulgular ve Tanı). Kılıçturgay K, Badur S (Eds). Viral Hepatit 2001 Kitabı 2001, s:209-212 20. Thomas DL, Lemon SM. Hepatitis C virus. Mandell GL,Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases. 5 th edition, Churchill Livingstone, Philadelphia 2000, s:1736-1760 9

Şekil 1. HAV serolojisi Tablo 1. HBV İnfeksiyonunun Farklı Dönemlerinde Görülen Serolojik Göstergeler İnfeksiyon Durumu HBsAg AntiHBs Anti HBc HBeAg Anti-HBe IgG IgM Geç inkübasyon + - - - ± - Akut Hepatit B + - + + + - Akut Hepatit B - - + + - - HBsAg taşıyıcısı + - + - ± ± Kronik hepatit + - + - ± ± HBV aşısı - + - - - - 10

Şekil 2. HBV Serolojisi Şekil 3. HCV Serolojisi 11

Şekil 4. HDV Serolojisi (Koinfeksiyon) İkter Semptom ALT Anti HBc IgM IgG Anti Delta HB s Ag HDV RNA 1 2 3 4 5 6 12 Bulaşmadan sonra geçen süre (Ay) Şekil 5. HDV Serolojisi (Süperinfeksiyon) 12

Tablo 2. HDV Serolojisi Koinfeksiyon Süperinfeksiyon Kronik Delta HBs Ag + sonra - + + Anti HBc IgM + sonra - - - Anti HDV + sonra - ++ +++ HDV RNA + sonra - + + HDV Ag (Kc) + sonra - + + HDV Ag (S) + sonra - - - Tablo 3. HDV İnfeksiyonunda Serolojik Tanı Klinik HBsAg Anti- HDV HDV Anti-HD Total anti- Yorum HBc IgM Ag RNA IgM HDV Akut +/- + - - - - Akut HBV hepatit +/- + + + + + Koinfeksiyon + - + + + + Süperinfeksiyon Kronik + - - - - - Kronik HBV hepatit + - +/- + + + Kronik HBV- HDV Şekil 6. Hepatit E Virus Serolojisi 13