MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLER NDE YAfiANAN SORUNLAR Doç Dr Cengiz ÇAVUfiO LU Ege Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyloji ve Klinik Mikrobiyoloji AB Dal Bornova, zmir Son on y l içinde mikobakterilerin hastal k örneklerinden saptanmas, kültürde üreyen mikobakterilerin tan mlanmas ve antitüberküloz ilaç direncinin saptanmas için çok say da nükleik asit temelli test kullan ma sunuldu (23). Bu yöntemler rutin uygulamada sa lad klar kolayl klar n ve yararlar n yan s ra birtak m sorunlar da beraberinde getirmifltir. Sunulan derlemede klinik örneklerden mikobakterilerin saptanmas nda, kültürde üreyen mikobakterilerin tan mlanmas nda ve ilaç direncinin belirlenmesinde kullan lan moleküler yöntemlerin rutin uygulamalar ve uygulmada karfl lafl lan sorunlar gözden geçirilmifltir. Kullan mdaki Ticari Direkt Amplifikasyon Testleri Klinik örneklerden mikobakterilerin saptanmas nda baflta polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve transkripsiyon arac l amplifikasyon (TMA) olmak üzere strand displacement amplification (SDA) ve ligaz zincir reaksiyonu (LCR) gibi çeflitli amplifikasyon yöntemleri kullan lmaktad r (23). Amplicor M.tuberculosis testi (Roche Molecular System, Branchburg, NJ) tüm mikobakteri türlerinde ortak olarak bulunan 16S rrna geninin (16S rdna) 584 bç lik bölgesinin PCR ile ço alt lmas ve oluflan DNA amplikonlar n n M.tuberculosis kompleks e özgü proplarla kolorometrik yöntemle saptanmas temeline dayan r. Yöntemin otomotize flekli Cobas Amplicor MTB olarak adland r lmaktad r. Testte internal amplifikasyon kontrolü bulunmakta ve test 6 saat içinde sonuçlanmaktad r. Amplicor direkt bak s pozitif solunum örneklerinde tan sal amaçla kullan lmas için FDA onay alm flt r (23). Amplified M.tuberculosis Direct (AMTD2) testi (Gen- Probe, Inc., San Diego, Calif.) 16S rrna n n 420C de izotermal olarak TMA ile ço alt lmas ve oluflan RNA amplikonlar n n M.tuberculosis kompleks e özgü acridinium esterle iflaretlenmifl DNA proplar ile kemilüminisens yöntemle saptanmas temeline dayan r. AMTD2-2.5 saat içinde sonuçlanmakta ve testte internal amplifikasyon kontrolü bulunmamaktad r. Yöntemin tüm solunum 81
örneklerinde tan sal amaçla kullan lmas FDA taraf ndan onaylanm flt r (23). BD ProbeTec energy transfer (ET) Direct TB System (DTB) testi (Becton Dickenson Biosciences Microbiology Products, Sparks, Md.) M.tuberculosis kompleks e özgü IS6110 ve mikobakteri türleri için ortak 16S rdna bölgesinin 52.50C de izotermal olarak SDA yöntemi ile ço alt lmas ve oluflan DNA amplikonlar n n M.tuberculosis kompleks e özgü floresan boya ile iflaretlenmifl DNA proplar ile florimetrik yöntemle saptanmas temeline dayan r. DTB de internal amplifikasyon kontrolü bulunmakta ve test 6 saat içinde sonuçlanmaktad r. DTB tan sal amaçla kullan lmas için henüz FDA onay almam flt r. LCx MTB testi (Abbott Laboratories, Abbott Park., III) LCR ile probe amplifikasyonu temeline dayanan bir yöntemdir. LCx MTB FDA tarf ndan onaylanmam fl ve 2002 y l ndan sonra Avrupa da da kullan mdan çekilmifltir (23). Klinik Uygulamadaki Deneyimler Ticari direkt amplifikasyon testlerinin klinik performanslar hakk nda elimizde yeterli veri bulunmas na karfl n veri toplanmas ve analizindeki farkl yan tutmalardan dolay çal flmalar n karfl laflt r lmas nda güçlükler yaflanmaktad r. Ayr ca, kültürün tüberküloz tan s nda alt n standart olarak kabul edildi i durumlarda basil ç karmayan, kültür negatif olgular alt n standartta bir duyarl l k sorunu yaratmaktad r. Bu durum duyarl l daha yüksek ancak kontaminasyona ba l olarak yanl fl pozitiflik riski de bulunan bir yöntemi alt n standartla karfl laflt r rken s k nt yaratmaktad r (16, 23). Direkt bak /kültür pozitif solunum örneklerinde Amplicor, AMTD2 ve DTB nin duyarl l genelilkle %95 in üzerindedir (8, 9, 16, 23). Direkt bak s negatif solunum örneklerinde ise Amplicor un duyarl l %50-71.7, AMTD2 nin %75-83, DTB in ise %33-100 aras nda de iflmektedir (2, 3, 13, 22, 23, 25). Direkt bak /kültür pozitif ekstrapulmoner örneklerde Amplicor un duyarl l %87.5-100 aras nda de iflirken direkt bak /kültür negatif örneklerde bu oran %17.2-70.8 olarak bulunmufltur (23). Solunum d fl örneklerde inhibitör maddelerin daha s k olmas nedeniyle özellikle plevral s v, gastrik aspiratlar, lenf dü ümü ve BOS da Amplicor la yetersiz sonuçlar al nmaktad r (23). Testin kültürle karfl laflt r ld çal flmalarda antitüberküloz tedavi alan hastalarda ve tüberküloz d fl mikobakteri enfeksiyonu 82
olan hastalarda yanl fl pozitif sonuçlar bildirilmifltir (4, 14, 25, 26, 28). nternal amplifikasyon kontrolünün bulunmas Cobas Amplicor un en önemli avantaj d r (23). Direkt bak /kültür pozitif ekstrapulmoner örneklerde AMTD2 nin duyarl l %92.3-100 aras nda de iflirken direkt bak /kültür negatif örneklerde %63.6-88.9 olarak bulunmufltur (1, 13, 22). AMTD2 de 30.000 RLU olan eflik de eri ile nisbeten s k yanl fl pozitiflikler saptanmas nedeniyle bu de er kitin üreticisi taraf ndan de ifltirildi ve sonucu 30.000-500.000 RLU aras ndaki ç kan örneklerde testin tekrarlanmas önerildi. Son yap lan çal flmalarda optimal eflik de eri 300.000 RLU olarak al nd nda duyarl l kta düflme olmadan özgüllükte düzelme sa land bildirilmifltir (17, 21). Testin kültürle karfl laflt r ld çal flmalarda tüberküloz d fl mikobakteri enfeksiyonu olan hastalarda yanl fl pozitif sonuçlar bildirilmifltir (1, 22, 24, 27). nhibitörleri saptayan internal amplifikasyon kontrolünün bulunmamas AMTD2 nin en önemli dezavantaj d r (23). Direkt bak /kültür pozitif ekstrapulmoner örneklerde DTB nin duyarl l %90-98.5 aras nda de iflirken direkt bak /kültür negatif örneklerde bu oran %40.3-85.7 olarak bulunmufltur (15, 19, 20). nternal amplifikasyon kontrolünün bulunmas, sistemin amplikon kontaminasyonunu en aza indirecek flekilde tasarlanm fl olmas, örnek ifllenmesi ve amplifikasyonun ayn ortamda gerçeklefltirilebilmesi ve testte kullan lan tüm reagenlerin oda s s nda saklanabilmesi testin avantaj d r. DTB ile tüberküloz d fl mikobakteri enfeksiyonu olan hastalarda yanl fl pozitif sonuç bildirilmemifltir. Örnek haz rlama ifllmelerinin emek yo un olmas sistemin en önemli eksikli idir. (23). Yanl fl Pozitif Sonuçlar Halen kullan mda olan ticari direkt amplifikasyon testleri canl ve cans z mikroorganizmay ay ramamaktad r. Tedaviye iyi yan t verip klinik düzelme sa lanan hastalarda bile tedavi s ras nda ve tedavi bitiminden sonra bu testlerle pozitif sonuçlar al nabilmektedir (9, 23). Yanl fl pozitifli in bir di er nedeni de tan da alt n standart olarak klinik kan tlar n yerine kültür pozitifli inin kabul edilmesidir. Direkt bak n n negatif oldu u az miktarda basil ç kar lan durumlarda 83
basilin örnek içinde dengesiz da l m na ba l olarak kültürde üreme olmad halde ticari direkt amplifikasyon testleri pozitif olarak saptanabilmektedir. Bu nedenle tek bafl na kültür sonuçlar yla ticari direkt amplifikasyon testlerinin performans n de erlendirmek çok do ru de ildir. Kültür sonuçlar n n klinik bulgularla birlikte de erlendirilmesi daha do ru sonuç vermektedir. yi e itilmifl personel, uygun ekipman ve yeterli fiziki koflullar amplikon kontaminasyonuna ba l gerçek yanl fl pozitif sonuçlardan kaç nmak için önemlidir. Ayr ca yanl fl pozitif sonuçlar önlemek için çal flma ortam %10 çamafl r suyu ile dezenfekte edilmeli, amplikon kontaminasyonunun kontrolü için belli aral klarla çal flma ortam ndan al nan örnekler test edilmelidir (23). Yanl fl Negatif Sonuçlar Kullan mdaki ticari direkt amplifikasyon testleriyle aktif tüberküloz hastalar ndan elde edilen klinik örneklerde yanl fl negatif sonuçlar elde edilebilir. Bu örneklerin ço u direkt bak s nda basil saptanamayan örneklerdir. Bu durumda çok az say da basil örnek içinde homojen olmayan bir flekilde da l m fl olabilir ve dekontaminasyon ifllemi s ras nda örnek uygun bir flekilde dilüe edilmezse yanl fl negatif sonuç al nabilir. Yanl fl negatifli in di er olas nedenleri ise örnekte bulunan inhibitörler ve hedefin yetersiz ekstraksiyonudur. Bazen örneklerin içinde bulunabilen nükleaz ve proteazlar amplifikasyonu inhibe ederek yanl fl negatifli e yol açabilirler. Örneklerde %1 den %20 lere kadar artan oranlarda inhibitör madde olabildi i bildirilmektedir. nhibitörler ço u kez direkt bak s negatif örneklerde görülmesine karfl n direkt bak s pozitif örneklerde de görülebilir. nternal amplifikasyon kontrolü içeren sistemlerde bu durum saptanabilir. nhibitörler hastan n bütün örneklerinde bulunmad için hastan n farkl bir örne inin çal fl lmas yla ço u kez bu sorun afl labilir. Ayr ca, günümüzde hedef ekstraksiyonu için fenol-kloroform yöntemi gibi kimyasal temelli yöntemlerinin yerine s tma, sonikasyon gibi fiziksel temelli yöntemlerin kullan lmas da hem ekstraksiyon ifllemini basitlefltirmifl hem de kimyasallara ba l inhibisyon riskini ortadan kald rm flt r (23). 84
Rutin Uygulmada Ticari Direkt Amplifikasyon Testleri: Temel Prensipler Ticari direkt amplifikasyon testlerinden Amplicor ve AMTD2 klinik tan da kullan lmas için FDA onay alm flt r. Bu onay Amplicor için yaln z direkt bak s pozitif solunum örneklerde geçerliyken, AMTD2 için tüm solunum örneklerinde geçerlidir. Bununla birlikte ticari direkt amplifikasyon testleri ekstrapulmoner örneklerde de tüberküloz tan s için kullan lmaktad r. Direkt amplifikasyon testleriyle antitüberküloz tedavi alan hastalarda yanl fl pozitif sonuçlar al nabilir. Bu nedenle bu testler 7 günden uzun süreyle antitüberküloz ilaç kullanan hastalarda ve antitüberküloz tedavi bitiminden sonraki 2 ay içinde uygulanmamal d r (23). Hastadan al nan her üç balgam örne inin direkt bak s n n negatif oldu u durumlarda direkt amplifikasyon testleri ilk toplanan örnekte uygulanmal, yoksa direkt bak s pozitif örnekte uygulanmal d r. Direkt bak s ve direkt amplifikasyon testinin pozitif saptand durumda tüberküloz tan s do rulan r. Direkt bak s pozitif bir örnekte direkt amplifikasyon testi negatif ise inhibitör varl aç s ndan test ikinci kez hastan n direkt bak s pozitif farkl bir örne i ile tekrarlan r. Test sonucu yine negatif ç karsa tüberküloz d fl mikobakteri enfeksiyonu olas l düflünülür. Direkt bak s negatif örnekte direkt amplifikasyon testi pozitif saptan rsa test tekrarlan r; ikinci kez pozitif ç karsa tüberküloz düflünülür. ki ard fl k örnekte hem direkt bak hem de direkt amplifikasyon testi negatif olarak saptan rsa hastan n tüberküloz olmad düflünülür (5, 23). Bununla birlikte kesin tan klinik bulgularla birlikte de erlendirilerek verilmelidir. Ticari direkt amplifikasyon testlerinin tüberküloz olma olas l çok yüksek olan hastalarda veya tüberkülozun çok düflük olas l k oldu u hastalarda kullan lmas sa l k kaynaklar n n uygunusuz kullan m na yol açmaktad r. Bu yöntemler temel olarak di er bulgularla birlikte hastan n tan sal de erlendirmesini ve tedavisini etkileyebilecek, tüberkülozun ne çok yüksek ne de çok düflük bir olas l k oldu u direkt bak s negatif ancak klinisyen taraf ndan tüberküloz kuflkulu olarak de erlendirilen hastalarda kullan lmal d r (23). Günümüzde kabul gören görüfle göre moleküler testler sadece Amerikan Toraks Cemiyeti nin seviye II ve III standartlar n yakalam fl, konvansiyonel 85
yöntemlerin kullan lmas nda yüksek standartlar yakalam fl labortuvarlar taraf ndan uygulanmal d r. Hasta izleminde moleküler testleri haftada bir kez çal flman n suboptimal oldu u düflünülmektedir. Bu nedenle bu yöntemler haftada iki, üç kez olacak flekilde çal fl lmal d r (23). Sonuç olarak yanl fl negatiflik, yanl fl pozitiflik, direkt bak s negatif örneklerde ve ekstrapulmoner örneklerde göreceli olarak düflük duyarl l k ve tüberküloz d fl mikobakterilerin saptanamamas ticari direkt amplifikasyon testlerinin temel sorunlar d r. Direkt bak s negatif olgularda pozitif sonuçlar bildirilirken dikkatli olunmal ve kuflkulu durumlarda test tekrarlanmal d r. Klinisyen böyle olgularda testin sonucunu kan tlardan biri gibi düflünülmelidir. Ayr ca, bu yöntemler uygun kalite güvencesi alt nda kullan lmal d r. Kültürde Üreyen Mikobakterilerin Tan mlanmas nda Kullan lan Testler H zl veya konvansiyonel yöntemlerle üretilen mikobakterilerin tan mlanmas mikobakteriyel enfeksiyonlar n tan s nda önemli bir aflamad r. Biyokimyasal yöntemler zaman al c ve zahmetlidir. Bu nedenle kültürde üreyen mikobakterilerin tan mlanmas nda moleküler yöntemler tercih edilmektedir. Tür tan mlamas nda 16S-23S rrna ITS gen bölgesini hedef alan ve insanlarda hastal k etkeni mikobakteri türlerinin önemli bir bölümünü saptayabilen INNO-L PA Mycobacteria v2 (Innogenetics NV, Zwijndrecht, Belgium) gibi reverz hibridizasyon testleri rutin uygulamalarda yayg n olarak kullan lmaktad r (12). Manuel ve otomatize olarak uygulanabilen reverz hibridizasyon testleri moleküler yöntemler için asgari koflullar n bulundu u laboratuvarlarda sorunsuz olarak kullan labilmektedir. Bu yöntemlerle günler, haftalar süren tan mlama ifllemleri 6 saat içinde tamamlanabilmektedir. Bu testler çok say da klinik çal flmada de erlendirilmifl h zl, duyarl ve özgül bulunmufltur (12). DNA dizi analizi mikobakteri türlerinin tan mlanmas nda alt n standart haline gelmektedir. Tür tan mlamas için genellikle hsp65 geni, 16S rrna geni ve 16S- 23S rrna ITS bölgesini hedef alan dizi analizleri kullan lmaktad r. Dizi analiziyle bilinen türlerin yan s ra yeni tür ya da alt türlerin tan mlanmas da mümkündür. Genel kullan ma aç k veri tabanlar nda mikobakteri türlerine ait DNA dizi havuzu 86
her geçen genifllemekte bunun sonucunda elde edilen dizilerin daha sa l kl de erlendirilmesi mümkün olmaktad r. laç Direncinin Saptanmas nda Kullan lan Testler Son on y l içinde M.tuberculosis in ilaç direncinin moleküler mekanizmalar n n anlafl lmas ndan sonra h zl ilaç direnci saptamaya yönelik moleküler uygulamalar gelifltirilmifltir. Özellikle rifampisin (RIF) ve izoniyazid (INH) direncini saptayan yöntemler klinik tan laboratuvarlar nda giderek artan oranlarda kullan lmaktad r. RIF direncinin tamam na yak n ndan rpob geninin 81 bç lik bölümündeki mutasyonlar sorumludur. Dahas rpob genindeki belli mutasyonlarla rifabutin direnci aras nda da kuvvetli bir birliktelik bulunmaktad r. Ayr ca bu kökenlerin yaklafl k %90 n nda RIF direnciyle birlikte INH direnci de saptanmaktad r. Bu nedenle RIF direnci ayn zamanda INH direncini de göstermektedir (10, 11). INH a dirençli kökenlerde farkl gen bölgelerinde mutasyonlar saptanabilmesine karfl n, direncin yaklafl k %90 n ndan katg ve inha bölgesindeki mutasyonlar sorumludur. INH a dirençli kökenlerde yap lan çeflitli çal flmalarda INH direncinin %34.6-62.2 sinden katg bölgesindeki mutasyonlar n sorumlu oldu u gösterilmifltir (18). Çavuflo lu ve ark.(7) taraf ndan Ege Bölgesi izolatlar nda yap lan çal flmada bu oran yaklafl k %70 olarak bulunmufltur. Direnç saptamada INNO-L PA RIF TB. (Innogenetics NV, Zwijndrecht, Belgium) ve GenoType MTBDR (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany) gibi reverz hibridizasyon testleri ve DNA dizi analizi rutin uygulamalarda kullan lmaktad r (7, 10). Manuel ve otomatize olarak uygulanabilen reverz hibridizasyon testleri moleküler yöntemler için asgari koflullar n bulundu u laboratuvarlarda sorunsuz olarak kullan labilmektedir. Bu yöntemlerle günler, haftalar süren duyarl l k testleri 6 saat içinde tamamlanabilmektedir. Bu yararlar na karfl l k moleküler testler hedefledikleri gen bölgesinin d fl nda kalan ve dirence yol açan mutasyonlar saptayamamaktad r. Ayr ca bu testlerle nadiren dirence yol açmayan sessiz (DNA dizi analiz için geçerli de il) ve nötral mutasyonlar da saptanarak yanl fl pozitif sonuçlar elde edilebilmektedir. 87
KAYNAKLAR 1. Alcala L, Ruiz-Serrano MJ, Hernangomez S, et al. Evaluation of the upgraded amplified Mycobacterium tuberculosis direct test (Gen-Probe) for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory and non-respiratory specimens. Diagn Microbiol Infect Dis. 2001; 41: 51 56. 2. Bergmann JS, Woods GL. Clinical evaluation of the BDProbe-Tec strand displacement amplification assay for rapid diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 1998; 36: 2766 2768. 3. Bogard M, Vincelette J, Antinozzi R, et al. Multicenter study of a commercial, automated polymerase chain reaction system for the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens in routine clinical practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001; 20: 724 731. 4. Bonington A, Strang JIG, Klapper PE, et al. Use of Roche Amplicor Mycobacterium tuberculosis PCR in early diagnosis of tuberculous meningitis. J Clin Microbiol. 1998; 36: 1251 1254. 5. Centers for Disease Control and Prevention. 2000. Update: nucleic acid amplification tests for tuberculosis. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 49: 593 594. 6. Cohen RA, Muzzafar S, Schwartz D, et al. Diagnosis of pulmonary tuberculosis using PCR assay on sputum collected within 24 hours of hospital admission. Am J Respir Crit Care Med. 1998; 156: 156 161. 7. Çavuso lu C, Bilgiç A. Evaluation of the GenoType MTBDR ASSAY for the rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates; Preliminary Study. European Meeting on Molecular Diagnostics. Abstract Book. 13-14 October, Scheviningen, the Hauge, the Netherlands. 2005; 16. 8. Çavuflo lu C, Çiçek-Saydam C, Tuncel M, Bilgiç A. Solunum örneklerinden Mycobacterium tuberculosis kompleks in saptanmas nda TMA (Gen-Probe MTD) ile Roche Amplicor PCR n etkinli inin karfl lflat r lmas. nfek Derg. 2001; 15: 21-24. 9. Çavuflo lu C, Güneri S, Suntur M, Bilgiç A. Clinical Evaluation of the FASTPlaqueTB for the rapid diagnosis of Pulmonary Tuberculosis. Turk J Med Sci. 2002; 32: 487-492 10. Çavuflo lu C, Hilmio lu S, Güneri S, Bilgiç A. Characterization of rpob mutations in rifampin-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey 88
by DNA sequencing and Line Probe assay. J Clin Microbiol. 2003; 40: 4435 4438. 11. Çavuflo lu C, Karaca-Derici Y, Bilgiç A. In-vitro activity of rifabutin against rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates with known rpob mutations. Clin Microbiol Infect. 2004;10: 662-665. 12. Çavuflo lu C, Karaca-Derici Y, Yayg n YE, Bilgiç A. Nontüberküloz mikobakteri izolatlar n n tan mlanmas. 3. Ulusal Moleküler ve Tan sal Mikrobiyoloji kongresi. Program ve Bildiri Özeti Kitab. 28 Haziran- 1 Temmuz 2004; 145. 13. Gamboa F, Fernandez G, Padilla E, et al. Comparative evaluation of initial and new version of the Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory and nonrespiratory specimens. J Clin Microbiol. 1998; 36: 684 689. 14. Gamboa F, Manterola JM, Lonca J, et al. Comparative evaluation of two commercial assays for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory specimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1998; 17: 151 156. 15. Johansen IS, Thomsen VØ, Johansen A, Andersen P, Lundgren B. Evaluation of a new commercial assay for diagnosis of pulmonary and non pulmonary tuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2002; 21: 455 460. 16. Katoch VM. Newer diagnostic techniques for tuberculosis. Indian J Med Res. 2004; 120: 418-428. 17. Kerleguer A, Koech JL, Fabre M, et al. Use of equivocal zone in interpretation of results of the amplified Mycobacterium tuberculosis direct test for diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 2003; 41: 1783 1784. 18. Kim SY, Park YJ, Kim WI, et al. Molecular analysis of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from South Korea. Diagn Microbiol Infect Dis. 2003; 47: 497 502. 19. Maugein J, Fourche J, Vacher S, Grimond C, Bebear C. Evaluation of the BDProbeTec TM ET DTB assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex from clinical samples. Diagn Microbiol Infect Dis. 2002; 44:151 155. 20. Mazzarelli G, Rindi L, Picccoli P, et al. Evaluation of the BDProbeTec ET system for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary and extrapulmonary samples: a multicenter study. J Clin Microbiol. 2003; 41: 1779 1782. 21. Middleton AM, Cullinan P, Wilson R, Kerr JR, Chadwick MV. Interpreting the results of the amplified Mycobacterium tuberculosis direct test for detection of M. tuberculosis rrna. J Clin Microbiol. 2003; 41: 2741 2743. 89
22. O Sullivan CE, Miller DR, Schneider PS, Roberts GD. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test by using respiratory and nonrespiratory specimens in a tertiary care center laboratory. J Clin Microbiol. 2002; 40: 1723 1727. 23. Piersimoni C, Scarparo C. Relevence of Commercial Amplification Methods for Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Samples. J Clin Microbiol 2003; 41: 5355-5365. 24. Piersimoni C, Scarparo C, Piccoli P, et al. Performance assessment of two commercial amplification assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex from respiratory and extrapulmonary specimens. J Clin Microbiol. 2002; 40: 4138 4142. 25. Reischl U, Lehn N, Wolf H, Naumann L. Clinical evaluation of the automated Cobas Amplicor MTB assay for testing respiratory and non-respiratory specimens. J Clin Microbiol. 1998; 36: 2853 2860. 26. Shah S, Miller A, Mastellone A, et al. Rapid diagnosis of tuberculosis in various biopsy and body fluid specimens by the Amplicor Mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction test. Chest. 1998; 113: 1190 1194. 27. Tjhie JHT, van Belle AF, Dessens-Kroon M, van Soolingen D. Misidentification and diagnostic delay caused by a false positive amplified Mycobacterium tuberculosis direct test in an immunocompetent patient with a Mycobacterium celatum infection. J Clin Microbiol. 2001; 39: 2311 2312. Tortoli E, Tronci M, Passerini Tosi C, et al. Multicenter evaluation of two commercial amplification kits (Amplicor, Roche and LCx, Abbott) for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary and extrapulmonary specimens. Diagn Microbiol Infect Dis. 1999; 33: 173 179. 90