PROTEİNLERİN İ İ ALTBİRİM SAYI VE STÖKİOMETRİSİNİN BELİRLENMESİ Suna TİMUR Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü, Bornova/İzmir. suna.timur@ege.edu.tr
Proteinler Amino asitlerin kopolimerleri AA 1 AA 2 AA 3 AA 4 20 farklı amino asit: birçok kombinasyon Bir veya daha fazla polipeptid zinciri; Bir polipeptid zinciri i i - monomerik protein Birden fazla - multimerik protein Homomultimer tek tip zincir Heteromultimer iki veya daha fazla farklı zincir.
Proteinler Amino asit Polipeptid Protein Aminoasitlerin birinin α-karboksil grubu ile diğer aminoasidin α-amino grubu arasında 1 mol su ayrılmasıyla oluşan kovalent bağa peptid bağı denir. Bu bağ amid bağı karakterindedir. Karboksil Amino grubu grubu Peptid Bağı AA 1 AA 2 Dipeptid
Yapıya giren aminoasit sayılarına göre; 2 aminoasit : dipeptid <10 aminoasit : Oligopeptid 3 aminoasit : tripeptid 4 aminoasit : tetrapeptid <100 aminoasit : Polipeptid 5 aminoasit : pentapeptid >100 aminoasit : Proteinler
Proteinler Sınıflandırma * Farklı tipteki proteinlerin karakteri * tam olarak doğru tek bir sistem yok Fiziksel; çözünürlük (tuz çözeltilerinde) Kimyasal Yapılarına Göre; -Basit proteinler sadece amino asitleri içeren -Konjuge proteinler protein olmayan kısımlar içeren; proteid
Konjüge Proteinler Proteinler Sınıflandırma Eğer protein olmayan kısım protein fonksiyonunda önemli ise prostetik grup olarak tanımlanır. Glikoprotein, lipoprotein, nükleoprotein, fosfoprotein, metalloprotein, hemoprotein, flavoprotein. Fonksiyonel Proteinler Biyolojik aktivite a) Pasif Yapısal Proteinler b) Dinamik - enzimler (katalizörler), reseptörler, membran kanalları, transkripsiyon faktörleri, aktivite
Proteinler; Şekillerine Göre 1. Skleroproteinler: Fibriler proteinler; Suda çözünmezler, ipliksi ve lifsi yapıdadırlar. Destek ve iskelet materyalidirler. (örn: keratin (tırnak, saçvb vb.) 2. Globüler proteinler: Nötral tuz çözeltisinde çözünürler, küresel yapılıdırlar. Hücrelerdeki kimyasal işin(sentez, transport ve metabolizma) çoğunu küresel yapılı globüler proteinler gerçekleştirir. Genellikle proteine kovalent veya nonkovalent olarak bağlanan bir prostetik grup taşırlar.
Organizasyon.. Primer Yapı (1º) Amino asitlerin dizilimi Sekonder Yapı (2º) R-grupları dikkate alınmaksızın zincirin uzaydaki yönelimi Tersiyer Yapı (3º) R-grupları da dikkate alınarak zincirin uzaydaki üç boyutlu yapısı Kuarter Yapı (4º) Birden fazla polipeptid zincirinin bir arada bulunmasıyla oluşan yapı; (alt birim / subunit)
Primer Sekonder Tersiyer Kuarter Yapı Yapı Yapı Yapı Amino asitler α Helix Polipeptid zinciri Altbirimlerin biraraya gelmesi
Primer Yapı.. Protein Dizileri 20 farklı amino asit: bir çok kombinasyonon n sayıda AA içeren bir protein; 20 n mümkün olan dizi! 100 AA lik protein; 20 100 olasılık = 1.3 X 10 130! İnsan genomu yaklaşık 30,000-40,000 dizi Farklı kurallar olmalı! l
Protein Dizileri.. Dizi, her bir protein için karakteristiktir. Amino terminalden başlayarak karboksi terminale doğru ğ okunur. Dizi ve kompozisyon; protein fonksiyonu hakkında bilgi verir. Farklı organizmalardaki homolog proteinler homolog dizilere sahiptir.
Sekonder Yapı Sekonder yapıda başlıca iki tip tekrarlayan yapı vardır. α-heliks ve β-tabaka. İskelet atomları arasındaki hidrojen bağları sekonder yapıdan birincil derecede sorumludur. Hidrofobik etkileşimler de sekonder yapının oluşumunda etkindir. Tek bir zincirde: α-heliks İki zincir arasında: β-tabaka o paralel o antiparalel
Sekonder Yapı Tipleri Heliks α-heliks(3.6 13 ) 3 10 heliks Beta Tabaka Paralel Anti-paralel Düzensiz sarmal Beta Döngü α-heliks β-tabaka β-döngü Düzensiz Sarmal
Süper sekonder Yapı (2 ve 3 Yapı Arası) Protein Motifleri ve Domainleri Protein motifleri α-helikslerin ve/veya β zincirlerin tekrar organize olmaları ile oluşan yapılardır; genelde sekonder yapıların olası agregatları, (Helix-loophelix, Coiled coil, Helix bundle, βαβ unit, Hairpin, β Meander, Greek key, β Sandwich) Protein domainleri büyük proteinlerdeki farklanan bölgelerdir ve birbirlerinden bağımsız olarak katlanırlar(yapıdan bağımsız üniteler)
Tersiyer Yapı R-grupları da dikkate alınarak zincirin uzaydaki üç boyutlu yapısı Sekonder yapıların/ motiflerin/domainlerin organizasyonu (Sekonder yapıların katlanması ve paketlenmesi: genelde globular şekil) AA lerin R grupları arasındaki etkileşimler ş ve bağlar ğ ile stabilitesini korur.
Proteinlerin Tersiyer Yapısı Kararlılığı etkileyen faktörler Hidrojen bağları İyonik etkileşimler; İyon çifti / tuz köprüleri Van der Waals etkileşimleri: fiks veya indüklenmiş dipoller arasındaki zayıf, geçici elektrostatik etkileşimler. Hidrofobik etkileşimler: non-polar R- gruplarının, molekülün iç kısımlarına yönlenmesi ile su entropisinin artması Disülfit bağları: kovalent etkileşimlerdönüşümlü
Amino Asitler Arasındaki Etkileşim Tipleri
Proteinlerin Kuarter Yapısı Çoklu tersiyer yapıların tek bir fonksiyonel kompleks oluşturmak için düzenlenmeleri Birden fazla polipeptid zincirinin tersiyer yapıyı kararlı kılan etkileşimler (iyonik etkileşimler, hidrojen bağları, van der Waals etkileşimleri, hidrofobik etkileşimler ve disülfit bağları) ğ ) ile bir arada bulunması ile kuarter yapılı proteinler oluşur. Böyle proteinlerdeki her bir peptid zincirine alt birim(subunit) denir.
Kuarter Yapı Protein-protein etkileşimleri Multimerler Homomultimerler/ heteromultimerler Alt birimler arasındaki etkileşimler kooperatif çalışmaya olanak sağlar (domino etkisi)
Kuarter Yapı: MultimerikYapılar Bir çok farklı olasılık mümkün. homotetramer α 4 hekzamer α 3 β 3 ; (αβαβαβ) hekzamer α β γ hekzamer α 2 β 2 γ 2 Homodimerlerin trimeri Heterodimerlerin trimeri (αβ) 3
Kuarter yapı: Düşük yüzey/hacim oranı, yüksek stabilite (Agregasyona eğilim daha az) Daha büyük komplekslerin oluşumunu ş kolaylaştıran ş etki Katalitik aktiviteyi kolaylaştıran yapıların oluşumu Geniş yüzey alanlarında küçük substratların aktif merkeze ulaşması!! Problem Küçük moleküllerde kataliz için Küçük moleküllerde kataliz için farklı yapılara gereksinim!!
Proteinler; Fonksiyon Biyolojik bir kompartımanda bulunan proteinlerin sayısı, fonksiyonların kompleksliği ile orantılıdır. Canlı yaşamını ilgilendiren hemen hemen her konuda proteinlerin önemli olması nedeni ile yapılarının ve biyokimyasal özelliklerinin i i araştırılması zorunludur.
Bir proteinin amino asit kompozisyonu ve dizisinin aydınlatılması öncelikle ilgili proteinin saf olarak eldesini gerektirir.
Protein Saflaştırılması; Planlama- Strateji Protein Kaynağı Protein Üretimi Genel Yaklaşım Protein Kazanımı (Ekstraksiyon) k Ön Saflaştırma Konsantrasyon Kaba Fraksiyonlama İleri Düzeyde Ayırma Yüksek Rezolüsyon Kromatografik ve Elektroforetik Teknikler Saflık Kontrolü Karakterizasyon
Karakterizasyon
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Kimyasal analiz (Kompozisyon analizi i vb) Molekülün bir kuvvet karşısında transportu Işık saçılımı SEÇİM KRİTERİ?? Protein miktarı, saflık düzeyi, çözgen gereksinimi, protein yapısının seçilen yöntem ile uygunluğu YÖNTEMLERİN KOMBİNASYONU: Kimyasal kompozisyon+ SDS jel elektroforezi
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Kimyasal analiz (Kompozisyon analizi i vb) Molekülün bir kuvvet karşısında transportu Işık saçılımı PROTEİN AGREGASYONU??? Nörodejeneratif hastalıklar yada terapatik proteinlerin üretimi.. PROTEİN-PROTEİN ETKİLEŞİMLERİ?? Ş MOLEKÜLER KÜTLE + STOKİOMETRİ = KARAKTERİZASYON +..
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Kimyasal Metodlar Kompozisyon analizi: Sadece Minimum i kütle!!!
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Kimyasal l Metodlar Kompozisyon analizi A.A lerin ve/veya spesifik prostetik grupların molar kuantifikasyonu İyi bir analiz için; A.A analizi, N- yada C- terminal analizi, prostetik grupların kantitatif analizi Kullanılan yöntemin sensitivitesi: nano-pikomol düzeyinde analiz Farklı yöntemlerin kullanımıyla sonuçların desteklenmesi, Kütle ve kompozisyon analizinin birbirini doğrulaması gerekir Kompozisyon analizi; Minimum moleküler kütle hakkında bilgi verir. Protein kütlesinin analizi ile mutlaka desteklenmelidir.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Kimyasal l Metodlar Kompozisyon analizi: Sadece Minimum kütle!!! KOMBİNASYON!!! A.A A analizi+ i SDS Jel Elektroforezi METOD Kuru kütle analizi-amonyum bikarbonat tamponu vb ya da?? Protein tayini-refraktometrik, spektrofotometrik Standardizasyon?? Gliko-, lipo-proteinler için güç
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Transport Metodları Sedimentasyon dengesi!! Jel filtrasyon Işık saçılımına dayalı metodlar DLS, SLS Mikroskobik teknikler Elektron mikroskobu AFM
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Transport Metodları Sedimentasyon dengesi!! KUARTER YAPI HAKKINDA BİLGİ
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon dengesi- analitik ultrasantrüfügasyon (AUC-SE) Çözelti fazında; Proteinin moleküler ağırlığı Protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon dengesi- analitik ultrasantrüfügasyon (AUC-SE) Bir proteinin alt birim sayısının (monomer, dimer vb) Protein assosiasyonun dolayısıyla self-assosiasyon sonucunda oligomerlerin tersinir olarak bir araya gelmesini ifade eden denge sabiti (Kd) nin Kompleks protein (iki yada daha fazla sayıda farklı protein, reseptör ligand, antikor-antijen) yada protein ligand yapılarına ve etkileşimlerine ilişkin stökiometrinin belirlenmesine ilişkin kullanımları söz konusudur
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon dengesi- analitik ultrasantrüfügasyon (AUC-SE) Temel olarak, dengenin assosiasyon yada dissasiasyona kaydığı durumdaki molekül boyutunu belirleyen bir yaklaşımdır. Analitik bir ultrasantrüfüj sisteminde, protein örneğinin UV yada refraktif indeks duyarlı sistemin kombinasyonuyla y optik olarak belirlenebilmesi Uygulanan santrüfüj kuvvetinin sonucu olarak oluşan rotasyon profil eksenine karşı örnek konsantrasyonu arasında ilişki kurulabilinir.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon dengesi- analitik ultrasantrüfügasyon t (AUC-SE) Bu yaklaşım ile hem sedimentasyon hızı hemde sedimentasyon dengesini temel alan cihazlar geliştirilmiş olup, sedimentasyon dengesi durumunda deneme sonucunda konsantrasyon gradientine karşı difüzyon ile oluşan sedimentasyon dengesi söz konusudur ve zamandan bağımsız bir konsantrasyon profili oluşmaktadır.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon dengesi- analitik ultrasantrüfügasyon (AUC-SE) Sedimentasyon denge dağılımı bir santrüfüj alanında Boltzmann dağılımları ile karakterize edilmektedir. Makromolekülün şeklinden bağımsız bilgi verip mol kütlesi ve kimyasal reaksiyona giren karışımlar için ise kimyasal dengenin direkt belirlenme yöntemi olarak ifade edilmektedir.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon dengesi- analitik ultrasantrüfügasyon (AUC-SE) TASARIM: Optik Sistemler ile İntegrasyon 200-800 nm arasında ölçüm Güçlü kromofor içeren makromoleküllerin belirlenebilmesi Dezavantaj: Kromofor içermiyor ise, örnek hazırlığında girişim yapan maddeleri içeren tamponlar kullanılırsa??
AUC AUC = preparatif US+ optik dedektör Örnek konsantrasyonunun santrüfüj hücresinde sedimentasyon süresince yada sonrasında ölçümü Santrüfüj parametreleri ve veri toplanmasında bilgisayar kontrollü sistem Deneme süreleri uzun!!
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar http://www-bioc.rice.edu/bios576/au/au%20page_files/image022.jpg
AUC-SE Daha düşük rotor hızları sedimentasyon ve difüzyon kuvvetleri arasında denge net transport yok molekül şeklinden bağımsız Determination of M: In ntensity Diffusion Sedimentation c(r) = c 0 e 2 M(1 v ρ0 ) ϖ0 r 2 R T 2 0 Cell radius http://www.kolloidanalytik.de/uz/equil/hequil.pdf
AUC-SE Termodinamik sabitlere ilişkin bilgi Deneysel olarak belirlenen parametreler: Moleküler kütle: M Denge sabiti: K Assosiasyon dengesine ilişkin serbest enerji Ve diğer termodinamik parametreler
Grafiğer bağlı veri analizleri için ln(c) ve r 2 eğim M ile orantılı: c(r) = c 0 e 2 M(1 v ρ0 ) ϖ 0 r 2 R T 2 0 dln(c) = 2 dr 2 M (1 v ρ0) ϖ 2 R T Daha kompleks sistemler için alternatif: Sedimentasyon denge konsantrasyon gradientlerinin matematiksel fonksiyonlara uyarlanması
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon dengesi- analitik ultrasantrüfügasyon (AUC-SE) Stökiometrinin belirlenebilmesi eğer protein aynı Stökiometrinin belirlenebilmesi, eğer protein aynı moleküler kütleye sahip alt birimlerden oluşuyor ise denatüre haldeki moleküler kütlenin non denatüre koşullara elde edilen kütleye oranıyla olasıdır ancak her iki koşulu kapsayan farklı yöntemlerden elde edilen verilerin kıyaslanması gerekmektedir.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon hızı- analitik ultrasantrüfügasyon t (AUC-SV) Heterolog protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde sedimentasyon hızı (SV), sedimentasyon dengesi (SE), kullanılabilmekte olup, SE daha çok moleküler kütle, assasiasyon sabitleri ve stökiometri hakkına bilgi verirken SV molekül boyutu ve şekli hakkında bilgi sunmaktadır.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Sedimentasyon hızı- analitik ultrasantrüfügasyon (AUC-SV) AUC-SV ile özellikle dimerden heptamere kadar küçük miktarlarda protein agregatlarının ve altbirimlerinin analizi mümkün olabilmektedir. Denemeler süresince sıcaklık, rotor hızı ve sabit geometri kullanılmalı, kontrollu, tanımlanmış koşullar altında çalışılmalıdır. Uygun dedektörlerin kullanımları, girişimlerden uzak analizi olanaklı kılması açısından önemlidir.
SE Daha düşük hızlarda sedimentasyon kuvveti ve difüzyon arasındaki denge durumunda sadece molekül kütlesine bağlı bir dağılım mevcut. SV Maksimum hızda, protein hücre dibine çökelecek k buda protein in şekliyle l ayrıca orantılı olacaktır.
AUC-SV of solute ntration o Meniscus of solution Plateau conc. Conce Meniscus of solvent Sedimentation front Cell radius Modified from http://www.kolloidanalytik.de/uz/sed/uzsedhr.gif
AUC-UYGULAMALARUYGULAMALAR SV Biomolecular Shape Biomolecular l Conformational Changes Assembly and Disassembly of Biomolecular Complexes Molecular Mass and Subunit Stoichiometry Equilibrium Constants for Self-Associating Systems SE Molecular Mass and Subunit Stoichiometry Equilibrium Constants for Hetero-associating Systems Equilibrium Constants for Self-Associating System
Molekül Boyutu/Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Transport Metodları Jel filtrasyon!!!
Jel Filtrasyon Kromatografisi Geçirgenlik / Moleküler Elek Kromatografisi Proteinlerin Boyutlarına Göre Ayrılması:
Jel Filtrasyon Kromatografisinin Uygulamaları Ekstraktın deriştirilmesi Grup ayırmaları(desalting) Fraksiyonlama(analitik, preparatif) p Moleküler kütle tayini Protein bağlanması ve kompleks k oluşumu için i denge sabitlerinin hesaplanması Agregat oluşumu, proteinlerin ve denatürasyonunun analizi
Jel Filtrasyon Kromatografisi Protein agregatlarının ve moleküler boyutlarının belirlenmesinde en sık kullanılan analitik yöntemdir. Farklı özellikteki kolon dolgu materyallerinin HPLC ile kombinasyonu sonucunda makromoleküllerin 5-1000 kda aralığında şekil ve boyutuna göre selektif ve hızlı bir ayrımını mümkün kılar. Bu tip fraksiyonlama oligomer yapıların matriks porlarından penetre olamayacak kadar büyüklükte olup yapıdan dışlanarak elue olmalarıyla gerçekleşmektedir. Agregat yada alt birimlerin boyut analizi moleküler boyutun büyüklüğüne ğ göre farklı SEC metodları ile analizlenebilir.
Jel Filtrasyon Kromatografisi Çözünmeyen agregatlar için örnek hazırlığı aşamasında ön işlem uygulaması gerekmektedir. Öncelikle sistemin iyi tanımlanmış, ş suda çözünen globüler proteinlerden oluşan standartlar ile kalibre edilmesi elzemdir. SEC kullanımı sadece UV yada floresans dedektörlerd ile sınırlı olmayıp, LS gibi farklı dedektörlerinde başarıyla kullanımları olasıdır. Sonuç olarak jel filtrasyon ile elde edilen non-denatüre koşullardaki protein ağırlığı, SDS jel elektroforeziyle denatüre koşullarda elde edilen sonuçlar ile kıyaslandığında assosiasyon ve dissasiasyon durumundakid totalt kütlenin belirlenerek, l stökiometri t i hakkında bilgi edinilmesi mümkündür.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Işık saçılımına dayalı metodlar
Molekül Ağırlığı Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Statik ışık saçılımı (Static light scattering; SLS) Light scattering (LS) 1-100 nm aralığında değişen çözünür agregatların karakterizasyonu ve belirlenmesinde kullanılan bir teknik olup kinetik çalışmaların gerçekleştirilebilmesi mümkündür. Statik LS (SLS), aynı zamanda quasielastik LS (QELS) yada foton korelasyon spektroskopi (PCS) olarak da adlandırılan Dinamik LS (DLS), ve lazer difraksiyonu (LD) olarak tanımlanan farklı tiplerde LS uygulamaları mevcuttur.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Statik ışık saçılımı (Static light scattering; SLS) Temel prensip partiküllerin oluşturduğu saçılımın ve ışık absorbsiyonunun belirlenmesi şeklinde özetlenebilir. Bu durumda saçılan ışığın şiddeti partikül boyutu ve gelen ışıgın dalga boyu arasındakı oran ile ilişkilidir. Bu tekniğin başarıyla uygulanabilmesindeki en önemli husus girişim yapabilecek kontaminantların uzaklaştırılması olup, filtrasyon yada santrüfüj adımı örnek hazırlığına eklenmelidir.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Statik ışık saçılımı (Static light scattering; SLS) Protein agregatları yada altbirimler ve benzer biyolojik moleküllerin boyutu hakkında fikir veren klasik teknik SLS dir. Bu teknikde makromolekülleri içeren bir çözeltiden yüksek şiddetli monokromik bir ışık geçirilerek farklı dedektörler ile bir yada daha fazla noktadan saçılımın şiddeti tespit edilir. Sonuç olarak LS analizi özellikle proteinin kendi assasiasyonunun belirlenebilmesinde önemli bir araç olmaktadır.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Dinamik ışık saçılımı (Dynamic light scattering; DLS) Bir süspansiyon içerisindeki partikül, emülsiyon yada moleküller Brownian hareketleri sergilemektedirler. Bu hareket solvent molekülleriyle indüklenmekte olup, bu moleküller ise kendi termal enerjileriyle hareket etmektedirler. Bu sisteme laser uygulandığında ışığın saçılım hızı tamamen moleküler boyutla ilişkili ş olmaktadır.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Dinamik ışık saçılımı (Dynamic light scattering; DLS) DLS daha çok 5 mikrometre çapına sahip partiküllerin saçılımından kaynaklı kısa süreli dinamiğe bağlı ışık saçılımını ölçmekte olup, daha küçük partiküller için difüzyon temelli Brownian hareketleri etkindir. DLS ile belirlenen partikülün hidrodinamik çapı olup, partikülün sıvı içersisinde ne kadar difüzlenebildiğiyle bağlantılıdır.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Dinamik ışık saçılımı (Dynamic light scattering; DLS) Bu metodun en büyük avantajı, çok farklı yapıdaki proteinlere, kompleks bir önişlem gerektirmeksizin uygulanabilir olmasıdır. Ancak toz, hava kabarcığı vs etkilere karşı son derece hassas olup, santrüfüj, filtrasyon ve seyreltme gerekliliği söz konusu olabilmektedir.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Mikroskopik yöntemler Elektron mikroskobu moleküler boyutu ve büyük proteinler yada assosiye kompleks k yapıların şeklini i direkt olarak veren görüntüleme yöntemidir. İlk olarak hemosiyanin agregatlarının daha sonraki süreçde membran proteinlerinin kristal array yapısının tanımlanmasında kullanılmıştır. ş Proteinin doğal ğ yapısı yada şekli hakkında aydınlatıcı bilgiler sağlamaktadır.
Molekül Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Alt birimlerin i i Analizi i Jel elektroforezi Alt birim analizinde en pratik uygulanabilen yöntem olup, amaca yönelik olarak hem non-denatüre hemde ardından denatüre koşullarda uygulamayı gerektirmektedir. ki k Denatüre koşullar altbirim ve assasiasyon tipiyle ilişkili olarak değişebilir. Örneğin, ğ ekstrem ph, SDS yada üre kullanımı vb. Tampon koşullarının farklanmasına paralel olarak mobilite farklanacaktır ki buda diğer yönde dikkate alınmalıdır dolayısıyla l analizin i assasiasyon ve dissasiasyon i durumunda yapıldığından emin olunmalıdır.
Molekül Boyutu/Kütlesi Analizi için MtdljikYkl Metodolojik Yaklaşımlarl Alt birimlerin i i Analizi i Jel elektroforezi Disülfid köprülerinin varlığı dikkate alınarak, bu bağları indirgeyici ajanın varlığında ve yokluğunda olacak şekilde SDS jel elektroforezi gerçekleştirilmelidir. Elde edilen bantlar karşılatırıldığında alt birim sayısı ve molekül kütlesi hakkında bilgi edinilmesi olasıdır.
Saflık Kontrolü ve Karakterizasyon Elektroforetik Teknikler Saflık kontrolü Fraksiyonlama Molekül Kütlesi Tayini İzoelektrik l Nokta Tayini i Alt birimlerin Belirlenmesi İzoenzimlerin belirlenmesi vb.
PAGE Tipleri 1. Doğal-PAGE Biyolojik(enzim) aktivite kaybı yok. 2. Denaturing-PAGE Biyolojik(enzim) aktivite kaybı var. *SDS SDS-PAGE(Molekül kütlesi)
Molekül Kütlesi Tayini (Mr)
Molekül Boyutu/Kütlesi Analizi için Metodolojik Yaklaşımlar Mikroskopik yöntemler Atomik kuvvet mikroskobu k (AFM) ile yine moleküler büyüklük yapı ve agregat yada alt birimlerin dağılımına ilişkin atomal düzeyde bilgi edinmek mümkündür. Bu yaklaşım ş ile, amiloid β-protein p düşük ş moleküler kütleli oligomerlerinin, insülin fibrillerinin ve konjuge IgG agregatlarının yapısı tanımlanabilmiştir. Burada dikkate edilmesi i gereken en önemli nokta ise homojen bir örnek hazırlanması ve doğru bölgeden görüntü alınabilmesidir.
Trimerik amonyum transporter AMTB EMBO reports VOL 5 NO 12 2004 Ki Kristalizasyon + AFM
Ki Kristalizasyon + SEM
ETKİLEŞİMLERİN SİMETRİSİ HAKKINDA BİLGİ!!
KUARTER YAPI-FONKSİYON OLİGOMERLERİN A.A DİZİSİ OLASI KUARTER YAPILARIN TAHMİNİ