HASTANEDE YATAN BİR HASTANIN İDRAR ÖRNEĞİNDEN İZOLE EDİLEN ESCHERICHIA COLI SUŞUNDA CTX-M-15 TİPİ GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZIN TANIMLANMASI

MİKROBİYOL MİKROBİYOLOJİ BÜLT 2005; 39: BÜLTENİ 421-429 421 HASTANEDE YATAN BİR HASTANIN İDRAR ÖRNEĞİNDEN İZOLE EDİLEN ESCHERICHIA COLI SUŞUNDA CTX-M-15 TİPİ GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZIN TANIMLANMASI DETECTION OF CTX-M-15 TYPE EXTENDED SPECTRUM BETA-LACTAMASE IN AN ESCHERICHIA COLI STRAIN ISOLATED FROM THE URINE SAMPLE OF A HOSPITALIZED PATIENT Zerrin AKTAŞ*, Nevriye GÖNÜLLÜ**, Ines SCHNEIDER*** Çiğdem BAL*, Adolf BAUERNFEIND*** ÖZET: Bu çalışmada, hastanede yatan bir hastanın idrar örneğinden izole edilen çoğul dirençli bir Escherichia coli suşunda CTX-M tipi genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL) enzimi tanımlanmıştır. İzolatın duyarlılığının araştırıldığı antibiyotiklerin MİK değerleri Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, eski adı NCCLS) önerilerine göre agar dilüsyon yöntemiyle tespit edilmiştir. Suş imipeneme duyarlı, kloramfenikole orta duyarlı, seftazidim, sefotaksim, aztreonam, siprofloksasin, tobramisin, tetrasiklin ve kotrimoksazole ise dirençli olarak saptanmıştır. Seftazidim/seftazidim-klavulanik asit ve sefotaksim/sefotaksim-klavulanik asit minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri oranı >8 olarak bulunmuş ve sonuç GSBL pozitifliği olarak değerlendirilmiştir. Sefotaksim MİK değeri (256 µg/ml) seftazidim MİK değerinden (64 µg/ml) dört kat daha yüksek bulunmuş ve suşta CTX-M tipi GSBL üretimi araştırılmıştır. Konjugasyon deneyinde sefotaksim direnci, tobramisin ve tetrasiklin direnci ile birlikte alıcı suşa aktarılmıştır. Bu izolatın sentezlediği beta-laktamaz enzimlerinin, izoelektrik odaklama (IEF) yöntemi ile pi değerleri 5.4, 7.5 ve 9.1 olarak belirlenmiştir. Bioassay yöntemi ile sefotaksimi, pi 9.1 de bant veren enzimin hidrolizlediği saptanmıştır. CTX-M geni, CTX-M grubuna özgül primerler ile amplifiye edilmiş ve dizi analizi yöntemi ile bu enzimin CTX-M-15 olduğu belirlenmiştir. Bu suşun ayrıca TEM- ve SHV-tipi ve OXA-10-benzeri beta-laktamazlara da sahip olduğu IEF ve polimeraz zincir reaksiyonu yöntemleriyle gösterilmiştir. Anahtar sözcükler: Escherichia coli, genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz, CTX-M, CTX-M-15. * İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul. ** İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul. *** Micoer Institute, Munich, Germany. Geliş Tarihi: 6.4.2005 Kabul Ediliş Tarihi: 5.12.2005

422 E.COLI'DE TANIMLANAN CTX-M-15 ENZİMİ ABSTRACT: In this study, a CTX-M type extended spectrum beta-lactamase (ESBL) enzyme has been detected in a multiresistant Escherichia coli strain which was isolated from the urine sample of a hospitalized patient. Minimum inhibitor concentrations (MIC) of the tested antibiotics were determined by the agar dilution technique according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS) guidelines. The isolate was found to be sensitive to imipinem, moderately susceptible to chloramphenicol and resistant to ceftazidime, cefotaxime, aztreonam, ciprofloxacin, tobramycin, tetracycline and trimethoprim/sulphamethoxazole. Ceftazidime/ceftazidime-clavulanic acid and cefotaxime/cefotaxime-clavulanic acid rates were found as >8 and the results were accepted as positive for an ESBL. The MIC of cefotaxime (256 µg/ml) was found four fold higher than that of ceftazidime (64 µg/ml) and the production of a CTX-M- type ESBL was investigated in the strain. Cefotaxime resistance, together with tobramycin and tetracycline resistance, was transferred to the recipient strain by conjugation. The pi s of the culture extracts of the isolate were found as 5.4, 7.5 and 9.1 by isoelectric focusing (IEF) method, but cefotaxime was hydrolysed only by the beta-lactamase focusing at a pi of 9.1 in the following bioassay. The bla-gene was amplified with the CTX-M group specific primers and sequencing of the polymerase chain reaction (PCR) product proved the enzyme to be CTX-M-15. This isolate was also found to harbor TEM- and SHV-type and OXA-10-like ESBLs, by IEF and PCR. Key words: Escherichia coli, extended spectrum beta-lactamase, CTX-M, CTX-M-15. G İ R İ Ş CTX-M tipi genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar (GSBL) dünyadan yaygın bir şekilde bildirilmekte ve Enterobacteriaceae de plazmidler üzerinde taşınmaktadır. En yüksek CTX-M prevalansı bugün için Latin Amerika, Doğu Avrupa ve Uzak Doğu ülkelerindedir 1,2. Günümüzde CTX-M ailesinde 40 tan fazla enzim bulunmaktadır ve bunlar aminoasit dizilerindeki benzerliklerine göre beş gruba ayrılmıştır (Tablo I) 1,3. Tablo I: CTX-M Enzim Ailesinde Sınıflandırılan Gruplar Grup Enzimler CTX-M-1 CTX-M-1, -3, -10, -11-12, -15 (UOE-1), -22, -23, -28, -29, -30 CTX-M-2 CTX-M-4, -5, -6-7, -20, Toho-1 CTX-M-8 Bu kategoride CTX-M-8 dışında enzim bulunmamaktadır CTX-M-9 CTX-M-9, -13, -14, -16, -17, -18,-19, -21, -27, Toho-2 CTX-M-25 CTX-M-25, -26 CTX-M-15, CTX-M-3 ten tek bir aminoasit değişikliği (Asp240 yerine Gly) ile farklılaşmaktadır 4. CTX-M tipi enzimlerin genel olarak sefotaksime karşı seftazidimden daha büyük hidrolitik aktivite gösterdiği bilinmektedir. Fakat Poirel ve arkadaşları 5 ile Kimura ve arkadaşlarının 6 yaptığı çalışmalarda, CTX-M-16 ve CTX-M-19 un seftazidimi daha etkin bir şekilde hidrolize ettiği bildirilmektedir.

MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ 423 Ülkemizde ilk bildirilen CTX-M-15 beta-laktamazı 2001 yılında bir Klebsiella pneumoniae suşunda saptanmıştır 7. Sunduğumuz bu çalışmada, ülkemizden ikinci CTX-M-15 bulgusu, bu kez bir Escherichia coli suşu için bildirilmekte ve CTX-M- 15 in farklı türler arasında yaygınlaşabileceği vurgulanmaktadır. Çalışmamızda çoğul dirençli olduğu gözlenen ve rutin çift disk sinerji yöntemi ile GSBL pozitifliği saptanan bu suştaki direnç mekanizmaları fenotipik ve genotipik olarak incelenmiştir. GEREÇ ve YÖNTEM GSBL üreten çoğul dirençli E.coli (EC 009) suşu İstanbul Tıp Fakültesi Hastanesi Üroloji Kliniği nde yatan benign prostat hipertrofili, TUR-P girişimi sonrasında gelişen üriner enfeksiyonun tedavisinde siprofloksasin kullanılan bir hastanın idrar örneğinden izole edildi. Bu suşun sefotaksim direnci, seftazidim direncinden daha yüksek olarak saptandı. Antimikrobiyal Duyarlılık: Çeşitli antibiyotiklerin minimum inhibisyon konsantrasyon (MİK) değerleri Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, eski adı NCCLS) önerilerine göre agar dilüsyon yöntemiyle belirlendi. E.coli ATCC 25922, E.coli ATCC 35218 ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 suşları kontrol suşlar olarak kullanıldı. GSBL varlığı çift disk sinerji testi ile araştırıldı. McFarland 0.5 standartı yoğunluğuna eşdeğer olarak hazırlanan bakteri süspansiyonu, Mueller-Hinton agar (Oxoid, Basingstone, UK) plağına yayıldı. Plağın ortasına bir amoksisilin-klavulanik asit diski (AMC; 20/10 µg) ile etrafına disk merkezleri arasındaki uzaklık 20 mm olacak şekilde seftazidim (30 µg) ve sefotaksim (30 µg) diskleri yerleştirildi. Bir gece 35 C de inkübasyondan sonra, AMC tarafındaki zon yarıçapının 5 mm genişlemesi veya arada bakterinin üremediği bir sinerji alanının bulunması, GSBL varlığı olarak değerlendirildi 8. Ayrıca suşun seftazidim, seftazidim-klavulanik asit, sefotaksim, sefotaksim-klavulanik asit duyarlılığı E-test yöntemiyle belirlendi ve klavulanat kombinasyonlu MİK değerinde 3 dilüsyon veya 8 kat azalma GSBL olarak değerlendirildi 8. Konjugasyon: Plazmid aktarımı için verici (EC 009) ve rifampisine dirençli laktoz negatif alıcı (E.coli K12 :W 3110 Rif R lac ) suşların Luria-Bertani buyyondaki 18-24 saatlik kültürlerinden 0.8 ml alınarak karıştırıldı ve 35 C de 8 saat bekletildi. Bu sürenin sonunda bakteri karışımından 50 µl alınarak antibiyotik içeren McConkey agara (Oxoid, Basingstone, UK) azaltma yöntemiyle ekildi ve 35 C de 18-24 saat inkübe edildi. Transkonjugatların seleksiyonu için rifampisin (64 mg/l) ve sefotaksim (2 mg/l) içeren McConkey agar kullanıldı 4. Rifampisin verici suşun, sefotaksim ise alıcı suşun üremesini engellemek ve konjugasyon gerçekleşmiş ise, yalnız transkonjugatın üremesini sağlamak amacıyla besiyerine ilave edildi. İzoelektik Odaklama Yöntemi (IEF): İzolatın içerdiği beta-laktamazların saptanması amacıyla IEF yöntemi kullanıldı. IEF, Matthew ve arkadaşlarına 9 ait modifiye yöntemin ileri modifikasyonu ile yapıldı 10. Bu amaçla; triptik soy agardaki (TSA; Oxoid, Basingstone, UK) EC 009 ve transkonjugat kültürlerinden 3-4 koloni alınarak 150 ml triptik soy buyyon içinde (Oxoid, Basingstone, UK) bakteri süspansiyonu hazırlandı ve çalkalamalı etüvde 37 C de 18 saat inkübe edildi. Bakteri kültürleri 4 C de 4000 rpm de 30 dakika santrifüj edilerek üst sıvılar atıldı, bakteri

424 E.COLI'DE TANIMLANAN CTX-M-15 ENZİMİ çökeltileri 750 µl %1 lik glisin (Merck) içinde süspanse edildi ve bu süspansiyonlar sonikatör cihazı (Elmasonic S, Germany) içindeki 4 C lik su banyosunda 10 dakika sonike edildi. Daha sonra sonikatlar 14.000 rpm de, 4 C de 30 dakika santrifüj edildi, beta-laktamaz enzimlerini içeren üst sıvılar alındı ve -70 C de saklandı. IEF için Poliakrilamid Jelin Hazırlanması: 9.5 ml distile su, 2 ml gliserin (%87) (Sigma), 4.3 ml akrilamid solüsyonu (Sigma), 1 ml pharmalyte (ph 3.5-9, Sigma), 500 µl %5 temed (Merck), 0.01gr/mL lik amonyum peroksidisulfattan (Merck) 425 µl olacak şekilde jel hazırlandı. Mini IEF Cell düzeneği yardımıyla 0.6 mm kalınlığında jel döküldü ve oda ısısında katılaşıncaya kadar bekletildi. Jelin anot tarafına aplikatör strip yerleştirildi. Beta-laktamaz içeren sıvılardan ikişer mikrolitre aplikatörün kuyucuklarına damlatıldı. Enzim ekstreleri amfolenli poliakrilamid jellerde [Model 111 Mini IEF Cell (Bio-Rad) cihazında] birinci aşamada 100 V, 6 ma, 5W 15 dakika; ikinci aşamada 200V 6mA 5W 15 dakika, üçüncü aşamada 450V 4mA 5W 60 dakika olacak şekilde yürütüldü. Bantları görüntülemek için, jelin üzerine %0.03 lük nitrosefin (Calbiochem, Darmstadt, Germany) çözeltisi emdirilmiş filtre kağıt kapatıldı ve bantlar görünmeye başlayınca filtre kağıdı kaldırıldı. Kırmızı olarak gözlenen beta-laktamaz bantlarının anoda olan uzaklıkları logaritmik kağıtta işaretlendi. İzoelektrik noktalar (pi), referans proteinler (IEF Standards, Bio-Rad) ve daha önce pi değerleri bilinen enzimler ile karşılaştırılarak saptandı. pi değerleri bilinen beta-laktamazları (TEM-1: 5.4, TEM-8: 5.6, SHV-3: 7, CMY-1: 8 ve CMY-2: 9) üreten kontrol suşlar Prof. Dr. Adolf Bauernfeind den (Micoer Institute, Munich, Germany) temin edildi. Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi (Bioassay): IEF yöntemini takiben bioassay yöntemi uygulandı. Sefotaksimi hidrolize eden enzimi tespit etmek amacıyla, 2 mg/l sefotaksim içeren yarı katı agar, yürütülmüş olan poliakrilamid jelin üzerine döküldü. 35 C de 2 saatlik inkübasyondan sonra ikinci bir katman olarak sefotaksime duyarlı endikatör bir suş (E.coli ATCC 25922) içeren yarı katı agar (%1.8) ilk katın üzerine döküldü. Bir gece 35 C de inkübasyondan sonra, hangi enzim bandının üzerinde bakteri ürediğine göre, o bandı veren beta-laktamazın sefotaksimi inaktive ettiğine karar verildi 11. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve DNA Dizi Analizi: DNA ekstraksiyonu GFX Genomic DNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) kullanılarak yapıldı. CTX-M-15 i de içeren 18 bla CTX-M geninin nükleotid dizileri göz önüne alınarak tanımlanan ve CTX-M enzimlerini kodlayan genleri amplifiye etmek için kullanılan universal oligonükleotid primerleri şu şekilde idi 4 : CTX-M-UNI-V (5 -CVATGTGCAGYACCAGTAA-3 ) ve CTX-M-UNI-R (5 -ARGTGACCAGAAYMAGCGG-3 ) (bağlanma ısısı: 61 C). CTX-M geninin baz dizilerinin saptanmasında P1c (5 -TCGTCTCTTCCAGAATAAGG-3 ) ve P2c (5 -AAGGAGAACCAGGAACCACG-3 ) oligonükleotid primerleri ve ABI 3700 (Applied Biosystems, Warrington, UK) cihazı kullanıldı. Ayrıca yine PCR yöntemiyle TEM-, SHV- ve OXA-10-benzeri gruplarına özgül primerler kullanılarak suşun sahip olduğu diğer beta-laktamaz enzimleri de araştırıldı 12-14. Primerler TEM için 5 -GAGTATTCAACATTTCCGTGTC-3 ve 5 -TAATCAGTGAGGCACCTATCTC-3 ; SHV için 5 -ACTGAATGAGGCGCTTCC-3 ve 5 -ATCCCGCAGATAAATCACC-3 ; OXA-10-benzeri için OPR1: 5 -GTC TTT CGA GTA CGG CAT TA-3 ve OPR2; 5 -ATT TTC TTA GCG GCA ACT TAC-3 idi.

MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ 425 Amplifikasyon: Toplam 50 µl olan amplifikasyon tüpünün içeriği, 100 µm 10X amplifikasyon tamponu, 10 mm dntp miks, 50 pmol her bir primer, 2.5 mm MgCl 2, 2.5 U Taq DNA polimeraz ve 5 µl DNA ekstraksiyon ürünü ile elde edildi. Amplifikasyon programı; a) CTX-M için: 95 C de 5 dakika; 94 C de 45 saniye, 61 C de 45 saniye, 72 C de 45 saniye toplam 35 siklus; 72 C de 10 dakika, b) TEM için: 95 C de 3 dakika; 94 C de 60 saniye, 42 C de 60 saniye, 72 C de 60 saniye toplam 30 siklus; 72 C de 3 dakika, c) SHV için: 95 C de 3 dakika; 95 C de 30 saniye, 55 C de 30 saniye, 72 C de 60 saniye toplam 30 siklus; 72 C de 3 dakika, d) OXA-10-benzeri için: 94 C de 10 dakika; 94 C de 60 saniye, 55 C de 60 saniye, 72 C de 60 saniye toplam 35 siklus; 72 C de 7 dakika olarak uygulandı. Amplifikasyon ürünleri 0.5X TBE (Sigma) ile hazırlanmış, etidyum bromür ile boyanmış %1 lik agaroz (Sigma) jelde yürütüldü ve UV ışık altında DNA moleküler ağırlık standardı (φx174 Hae III) ile karşılaştırılarak değerlendirildi. B U L G U L A R Antibimikrobiyal Duyarlılık Sonuçları: Test edilen antibiyotiklerin klinik izolat olan EC-009 suşu, alıcı E.coli K12 :W 3110 suşu ve transkonjugat suşu için MİK değerleri Tablo II de gösterilmiştir. Suş imipeneme duyarlı, kloramfenikole orta duyarlı, seftazidim, sefotaksim, aztreonam, siprofloksasin, tobramisin, tetrasiklin ve kotrimoksazole ise dirençli olarak saptanmıştır. Seftazidim/seftazidim-klavulanik asit ile sefotaksim/sefotaksim-klavulanik asit MİK değerleri oranı >8 olarak bulunmuş ve sonuç GSBL olarak değerlendirilmiştir. Sefotaksim MİK değeri (256 µg/ml) seftazidimin MİK değerinden (64 µg/ml) dört kat daha yüksek bulunmuştur. Konjugasyon Sonucu: Sefotaksim direnci tobramisin ve tetrasiklin direnci ile birlikte transkonjugata aktarılmıştır (Tablo II). Tablo II: CTX-M-15 Üreten Klinik İzolat, Alıcı Suş ve Transkonjugat İçin Antibiyotik MİK Değerleri (µg/ml) Suşlar** CAZ CAZ + CLAV CTX Antibiyotikler* CTX + CLAV AZT IMP CIP TOB TET SXT CML Klinik izolat 64 1 256 1 64 0.13 >128 32 256 128 16 Alıcı suş 0.13 0.13 0.06 0.06 0.06 0.25 0.03 0.5 1 2 8 Transkonjugat 4 0.25 32 0.25 4 0.25 0.06 16 128 8 8 * CAZ: Seftazidim; CLAV: Klavulanik asit; CTX: Sefotaksim; AZT: Aztreonam; IMP: Imipenem; CIP: Siprofloksasin; TOB: Tobramisin; TET: Tetrasiklin; SXT: Kotrimoksazol; CML: Kloramfenikol. ** Klinik izolat: CTX-M-15 üreten E.coli (EC-009), Alıcı suş: E.coli K12 :W 3110, Transkonjugat: E.coli K12 -W 3110- IEF ve Bioassay Sonuçları: Bu izolatın ve transkonjugatın beta-laktamazlarına ait pi değerleri 5.4, 7.5 ve 9.1 olarak saptanmıştır (Tablo III). Sefotaksim yalnız pi 9.1 deki bant tarafından hidrolize edilmiştir.

426 E.COLI'DE TANIMLANAN CTX-M-15 ENZİMİ Tablo III: CTX-M-15 üreten E.coli ve Transkonjugata Ait İzoelektrik Odaklama (IEF), Bioassay, PCR ve Dizi Analizi Sonuçları Suş IEF ile Enzimlerin pi Değerleri 5.4 7.5 9.1 Bioassay ile CTX M Hidrolizi ++ PCR Dizi CTX M TEM SHV OXA 10 benzeri Analiz Sonucu + + + CTX M 15 EC 009 Klinik izolat E.coli K12 W 3110 Transkonjugat 5.4 7.5 9.1 ++ + ND ND ND ND: Belirlenmedi. PCR ve Dizi Analizi Sonucu: PCR yöntemiyle CTX-M tipi için özgül primerler kullanılmış ve amplifikasyon ürünleri moleküler ağırlık standardı (φ174 Hae III) ile karşılaştırılarak 585 baz çifti (bp) hizasında bant saptanmıştır. Dizi analizi yöntemi ile baz sıraları saptanmış ve daha önce yayınlanmış diziler (AY044436) ile karşılaştırılarak bu enzimin CTX-M-15 olduğu belirlenmiştir. Bu suşun PCR yöntemiyle aynı zamanda TEM ve OXA-10-benzeri tipinde beta-laktamazlara sahip olduğu da görülmüştür. T A R T I Ş M A İlk GSBL oluşturan suş 1980 yılında Almanya dan bildirilmiş ve o zamandan günümüze kadar birçok GSBL enzimi tanımlanmıştır. TEM- ve SHV-tipi betalaktamazlar en yaygın olarak E.coli ve Klebsiella türlerinde bildirilmiştir. GSBL leri kodlayan genler genellikle birden fazla antibiyotiğe dirençten sorumlu 100 kb ve daha büyük konjugatif plazmidlerle taşınır ve Enterobacteriaceae ailesinin değişik türleri arasında kolaylıkla transfer edilir 15. Son yıllarda tanımlanmış bir ESBL türü, Kluvyera ascorbata nın kromozomal beta-laktamazından mutasyonla oluştuğu düşünülen CTX-M dir. CTX-M-tipi enzimler ilk olarak 1989 da Almanya dan, daha sonra dünyada birçok ülkeden bildirilmiştir 10. Bugüne kadar E.coli, K.pneumoniae ve Salmonella enterica serovar Typhimurium başta olmak üzere birçok Enterobacteriaceae üyesine ait çeşitli klinik izolatlarda 40 kadar farklı CTX-M enzimi saptanmıştır 16. CTX-M-15 Kamerun, Hindistan, Japonya, Rusya, İtalya, Polonya, Fransa, Bulgaristan, Romanya ve Türkiye den bildirilmiştir 17-20. Yalnız fenotipik özelliklere dayanarak CTX-M tipi beta-laktamazları diğer GSBL türlerinden ayırmak zordur çünkü dirençli suşlarda genellikle birden fazla enzim veya mekanizma bulunmaktadır ve fenotipik özellikler karmaşık bir direnç profili şeklinde ortaya çıkmaktadır. Öte yandan, çift disk sinerji testiyle GSBL tanımlamasında yalnız seftazidim diski kullanılan merkezlerde de bu enzimi saptamak ve prevalansını bildirmek mümkün değildir, zira CTX-M türü enzimler genel olarak seftazidimden çok sefotaksimi hidrolizler ve seftazidimle yapılan sinerji testlerinde belirlenemez. Bu bulgulardan yola çıkarak CLSI, GSBL tarama

MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ 427 ve doğrulama testlerine sefotaksimi de eklemiş ve test edilmesini zorunlu kılmıştır. Antibiyotik tedavisinin başarısını olumsuz etkileyen GSBL üretimi, mortalite, morbidite ve hastanede yatış süresi ve tedavi maliyetlerinde artışa neden olmaktadır; bu nedenle GSBL pozitif bakterilerin doğru tanımlanması önem taşımaktadır. Yoğun antibiyotik kullanımı ve özellikle üçüncü kuşak sefalosporin kullanılması ile GSBL oluşturan mikroorganizmaların yaygınlaşması arasında doğru orantılı bir ilişki olduğu çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir 21,22. Diğer risk faktörleri arasında uzun süreli hastanede kalma ve yoğun bakım ünitesinde yatma sayılabilir. Transplantasyon hastaları, onkoloji hastaları ve yenidoğanlar dirençli suşlarla enfeksiyon açısından daha yüksek risk altındadır 23. GSBL oluşturan bakterilerle oluşan enfeksiyonların tedavisinde karbapenemler ilk seçenek antibiyotiklerdir, ancak aminoglikozit ve kinolon grubu antibiyotiklerin de duyarlılık durumuna göre kullanılabileceği bildirilmektedir. Bununla birlikte GSBL üreten bakterilerde, GSBL oluşturmayanlara oranla bu antibiyotiklere direncin daha fazla olduğu görülmüştür 23. Türkiye nin de içinde olduğu 7 ülkeden 12 hastanenin katıldığı çok merkezli bir çalışmada, 440 hastanın kan kültürlerinden izole edilen 452 K.pneumoniae suşunun 83 ünde GSBL üretimi saptanmış ve bu suşların 15 i (%18) siprofloksasine dirençli olarak bulunmuştur 24. Yine aynı çalışmada siprofloksasin direnci Türkiye de %56 (5/9), Amerika da %33 (4/12), Tayvan da %33 (1/3) ve Arjantin de %25 (5/20) olarak saptanmıştır 24. Hastanemizde yapılan başka bir çalışmada, 258 E.coli suşunda siprofloksasin direnci %53 olarak bulunmuş, yedi suşta (%5) GSBL üretimi saptanmış ve bu değerin istatistiksel (p=0.015) olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir 25. Sunulan bu çalışmada, hastanemizde yatmakta olan bir hastanın idrar örneğinden üriner enfeksiyon etkeni olarak izole edilen bir E.coli suşunda CTX- M-15 tipi GSBL varlığı gösterilmiştir. İzolatımızın beta-laktam antibiyotik direncinin yanı sıra siprofloksasin, tobramisin, tetrasiklin ve kotrimoksazol e de dirençli olduğu gözlenmiş, tobramisin ve tetrasiklin direncinin sefotaksim direnciyle birlikte aktarılabildiği belirlenmiştir. Bu suşun ayrıca TEM- ve SHV-tipi ve OXA-10-benzeri beta-laktamazlara da sahip olduğu IEF ve PCR yöntemleriyle saptanmıştır. Çalışmamız, CTX-M-15 pozitif bir izolatın saptandığı ikinci çalışmadır. Ülkemizden bildirilen ilk CTX-M-15 pozitif izolat, yine İstanbul Tıp Fakültesi Hastanesinde yatan bir hastanın idrar örneğinden 2001 yılında izole edilen bir Klebsiella pneumoniae suşudur 7. Ülkemizde Ankara, İstanbul ve İzmir gibi merkezlerde yapılan diğer çalışmalarda da CTX-M grubu beta-laktamazlardan CTX-M-2 K.pneumoniae de, CTX-M-3 ise E.coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium ve Shigella sonnei de gösterilmiştir 7,26-30. Hastanemizde yapılan başka bir çalışmada, GSBL üreten 61 E.coli suşunun %87 si, 34 K.pneumoniae suşunun ise %35 i IEF ve PCR yöntemiyle CTX-M pozitif olarak bulunmuştur 31,32. Sonuç olarak, rutin laboratuvarlarda çift disk sinerji yöntemiyle GSBL pozitifliği saptanan izolatlarda CTX-M enzimlerinin daha ileri çalışmalarla tiplendirilmesi, ülkemizde CTX-M gruplarının ve tiplerinin belirlenmesinde önemli epidemiyolojik veriler sağlayacaktır. CTX-M-15 tipi GSBL ların da farklı türler arasında yaygınlaşabileceği ve klinikte tedaviye direnç sorunları oluşturabileceğinin göz

428 E.COLI'DE TANIMLANAN CTX-M-15 ENZİMİ önünde tutulması ve ülkemizde yaygın olduğunu düşündüğümüz bu enzimlerin varlığı ile ilgili daha geniş bölgeleri içine alan kapsamlı çalışmaların yapılması gerektiği inancındayız. KAYNAKLAR 1. Bonnet R: Growing group of extended-spectrum beta-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48: 1-14. 2. Tzouvelekis L, Tzelepi SE, Tassios PT, Legakis NJ: CTX-M-type beta-lactamases: an emerging group of extended-spectrum enzymes. Int J Antimicrob Agents 2000, 14: 137-142. 3. Pallecchi L Malossi M, Mantella A, et al: Detection of CTX-M-type beta-lactamase genes in fecal Escherichia coli isolates from healthy children in Bolivia and Peru. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48: 4556-4561. 4. Markovska R, Schneider I, Keuleyan E, Bauernfeind A: Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) CTX-M-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Sofia, Bulgaria. Clin Microbiol Infect 2004, 10: 752-755. 5. Poirel L, Naas T, Thomas I Le, Karim A, Bingen E, Nordmann P: CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamase that hydrolyzes ceftazidime through a single amino acid substitution in the omega loop. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45: 3355-3561. 6. Kimura S, Ishiguro M, Ishii Y, Alba J, Yamaguchi K: Role of mutation at position 167 of CTX-M- 19 in ceftazidime hydrolysis. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48: 1454-1460. 7. Lartigue MF, Poirel L, Heritier C, Tolun V, Nordmann P: First description of CTX-M-15 producing Klebsiella pneumoniae in Turkey. J Antimicrob Chemother 2003, 52: 315-316. 8. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 12 th Informational Supplement M100-S12, 2002. NCCLS, Wayne, Pa. 9. Mathew M, Harris A, Marshall M, Ross G: The use of analytical isoelectric focusing for detection and identification of beta-lactamases. J Gen Microbiol 1975, 88: 169-178. 10. Bauernfeind A, Grimm H, Schweighart S: A new plasmidic cefotaximase in a clinical isolate of Escherichia coli. Infection 1990, 18: 294-298. 11. Bauernfeind A, Schneider I, Jungwirth R, Sahly H, Ullmann U: A novel type of AmpC betalactamase, ACC-1, produced by a Klebsiella pneumoniae strain causing nosocomial pneumonia. Antimicrob Agents Chemother 1999, 43: 1924-1931. 12. Poirel L, Thomas I, Naas T, Karim A, Nordmann P: Biochemical sequence analyses of GES-1, a novel Class A extended-spectrum beta-lactamase, and Class 1 integron In52 from Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2000, 44: 622-632. 13. Aktas Z, Poirel L, Salcioglu M, et al: PER-1 and OXA-10 like beta-lactamase in ceftazidimeresistant Pseudomonas aeruginosa isolates from intensive care unit patients in Istanbul, Turkey. Clin Microbiol Infect 2005, 11: 193-198. 14. Gniadkowski M, Schneider I, Jungwirth R, Hryniewicz W, Bauernfeind A: Ceftazidime-resistant Enterobacteriaceae isolates from three Polish hospital: identification of three novel TEM and SHV- 5-type extended-spectrum beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 1998, 42: 514-520. 15. Sirot D, De Champs C, Chanal C, et al: Translocation of antibiotic resistance determinants including an extended-spectrum beta-lactamase between conjugative plasmids of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1991, 35: 1576-1581. 16. Eckert C, Gautier V, Allard MS, et al: Dissemination of CTX-M-type beta-lactamase among clinical isolates of Enterobacteriaceae in Paris, France. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48: 1249-1255. 17. Edelstein M, Pimkin M, Palagin I, Edelstein I, Stratchounski L: Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob Agents Chemother 2002, 47: 3724-3732.

MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ 429 18. Pagani L, Amico ER, Migliavacca R, et al: Multiple CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases in nosocomial isolates of Enterobacteriaceae from a hospital in Northern Italy. J Clin Microbiol 2003, 41: 4264-4269. 19. Schneider I, Keuleyan E, Markovska R, et al: Emergence of CTX-M-15 extended spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae in Bulgaria, Romania and Turkey. 13 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Glasgow, UK. Clin Microbiol Infect 2003, 9 (Suppl 1): 94. 20. Gangoue-Peiboji J, Miriagou V, Vourli S, Tzelepi E, Ngassam P, Tzouvelekis LS: Emergence of CTX-M-15-producing Enterobacteria in Cameroon and characterization of a bla CTX-M-15 -carrying element. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49: 441-443. 21. Ariffin H, Navaratnam P, Mohamed M, et al: Ceftazidime-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream infection in children with febrile neutropenia. Int J Infect Dis 2000, 4: 21-25. 22. Kim Y, Pai KH, Lee HJ, et al: Bloodstream infections by extended-spectrum beta-lactamaseproducing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in children: epidemiology and clinical outcome. Antimicrob Agents Chemother 2002, 46: 1481-1491. 23. Kang, CI, Kim SH, Park WB, et al: Bloodstream infections due to extended-spectrum betalactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae: risk factors for mortality and treatment outcome, with special emphasis on antimicrobial therapy. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48: 4574-4581. 24. Paterson DL, Mulazimoglu L, Casellas JM, et al: Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended-spectrum beta-lactamase production in Klebsiella pneumoniae isolates causing bacteremia. Clin Infect Dis 2000, 30: 473-478. 25. Tolun V, Kucukbasmaci O, Torumkuney-Akbulut D, Catal C, Ang-Kuçuker M, Ang O: Relationship between ciprofloxacin resistance and extended-spectrum beta-lactamase production in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains. Clin Microbiol Infect 2004, 10: 72-75. 26. Paterson DL, Hujer KM, Hujer, et al: Extended-spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae bloodstream isolates from seven countries: Dominance and widespread prevalence of SHV and CTX-M type beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 2003, 47: 3554-3560. 27. Ayhan Y, Gülay Z, Biçmen M, Gülfidan G, Meşe T, İnan S: Outbreak due to Salmonella enterica serovar Typhimurium producing SHV-12 and CTX-M-3 extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) at a children s hospital. Microbiologica Balcanica, 2003, Istanbul, Turkey. Abstract no: 356. 28. Acikgöz ZC, Gülay Z, Bicmen M, Göcer S, Gamberzade S: CTX-M-3 extended-spectrum betalactamase in a Shigella sonnei clinical isolate: first report from Turkey. Scand J Infect Dis 2003, 35: 503-505. 29. Gülay Z, Biçmen M, Atay T: Cefotaximase-M type beta-lactamase production in Escherichia coli isolated at a university hospital in Turkey. Microbiologica Balcanica 2003, Istanbul, Turkey. Abstract no: 1564. 30. Gülay Z, Terek B, Eraç B, et al: High prevalence of CTX-M type extended-spectrum beta-lactamases in members of Enterobacteriaceae in Turkey. 14 th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Disaeses, 2004, Prague, Czech Republic. Abstract no: 752. 31. Bal C, Gonullu N, Aktas Z, Salcioglu M: Dissemination of CTX-M type extended-spectrum betalactamases among clinical isolates of Escherichia coli in Istanbul, Turkey. International Congress of International Union of Microbiological Societies (IUMS), 2005. Bacteriology and Applied Microbiology, San Francisco, USA. Abstract no: B-751. 32. Bal C, Aktas Z, Gonullu N, Ang O: Prevalence of TEM-, SHV- and CTX-M-type extended spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae in Istanbul, Turkey. International Congress of International Union of Microbiological Societies (IUMS) 2005: Bacteriology and Applied Microbiology, San Francisco, USA. Abstract no: B-759.