BAŞKENT ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ. Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

1993 BAŞKENT ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı HEMOKÜLTÜRLERDEN İZOLE EDİLEN KANDİDALARIN FLUKONAZOL DUYARLILIKLARI VE FLUKONAZOL İLE SİPROFLOKSASİN, LEVOFLOKSASİN VE DOKSİSİKLİN ETKİLEŞİMİNİN ARAŞTIRILMASI UZMANLIK TEZİ Dr. Melek Kaya Ankara, 2010

BAŞKENT ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı HEMOKÜLTÜRLERDEN İZOLE EDİLEN KANDİDALARIN FLUKONAZOL DUYARLILIKLARI VE FLUKONAZOL İLE SİPROFLOKSASİN, LEVOFLOKSASİN VE DOKSİSİKLİN ETKİLEŞİMİNİN ARAŞTIRILMASI UZMANLIK TEZİ Dr. Melek Kaya Tez Danışmanı: Doç. Dr. Müge Demirbilek ANKARA, 2010 Tez çalışması Başkent Üniversitesi Araştırma Fonu Tarafından KA09/60 Proje Numarası ile Desteklenmiştir. iv

TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim süresince bilgi ve tecrübeleri ile her zaman yanımda olan Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı başkanı sayın Doç. Dr. Füsun Can a; uzmanlık eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerini esirgemeyen, ilk asistanı olmaktan gurur duyduğum, tez danışmanım sayın Doç. Dr. Müge Demirbilek e; Enfeksiyon Hastalıkları Anabilim Dalı başkanı sayın Prof. Dr. Hande Arslan a teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım. Tez çalışmama destek veren Kırıkkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi sayın Prof. Dr. Sedef Göçmen e teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım. Tez çalışmalarımda kullandığım suşları temin ettiğim, Ankara ve Adana Başkent Üniversitesi hastanesinin görevli Yrd. Doç. Dr. Şule Çolakoğlu na, Yrd. Doç. Dr. Hikmet Eda Alışkan a, Doç. Dr. Özlem Kurt Azap a, Doç Dr. Funda Timurkaynak a ve her iki mikrobiyoloji laboratuvarında çalışan tüm personele teşekkür ederim. Uzmanlık eğitimine beraber başladığım, tez çalışmalarımda her zaman yanımda olan, manevi desteğini esirgemeyen, en yakın dostum Dr. Fulya Bayındır Bilman a; uzmanlık eğitimim ve tez çalışmalarımda desteklerini esirgemeyen, 4 yıl boyunca birlikte çalışmaktan onur duyduğum laboratuvar teknisyenleri, Sayın Murat Ural ve Serdar Kurşunlu ya teşekkürlerimi bir borç bilirim. Tezimin ortaya çıkışında gösterdiği büyük emek ile istatistik çalışmalarındaki desteklerinden dolayı Yrd. Doç. Dr. Canan Yazıcı ya teşekkürlerimi sunarım. Yetişmemde büyük emekleri olan, hayatım boyunca iyi ve kötü günde hep yanımda olan, uzakta olsalar da manevi olarak desteklerini esirgemeyen değerli annem ve babama, kardeşlerime; tez çalışmamda her zaman yanımda olan değerli eşim Mustafa Kaya ya teşekkür ederim. Başkent Üniversitesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında araştırma görevlisi olarak başladığım günden beri; ondan çaldığım vakitleri esirgemeyen, sevgisi ile bana her zaman güç veren, en değerli varlığım oğlum Davut Can Kaya ya sonsuz teşekkür ederim. Dr. Melek Kaya v

ÖZET Hemokültürlerden izole edilen kandidaların flukonazol duyarlılıkları ve flukonazol ile siprofloksasin, levofloksasin ve doksisiklin etkileşiminin araştırılması. Bu çalışmada kandan izole edilen kandida suşlarının invitro flukonazol duyarlılık sonuçlarının değerlendirilmesi ve seçilecek duyarlı ve dirençli kandidalarda flukonazol ün levofloksasin, siprofloksasin, doksisiklin kombinasyonları ile oluşan invitro ilaç etkileşiminin araştırılması hedeflendi. Çalışmamızda, Başkent Üniversitesi Hastanesi nde çeşitli ünitelerde yatan hastalardan alınan kan kültürlerinden izole edilen 300 kandida suşu kullanıldı. Tüm suşlar germ tüp oluşumu, mısır-unlu Tween 80 besiyerindeki morfolojik görünümleri, API 20C AUX (Biomerieux, Fransa) kiti kullanılarak biyokimyasal özellikleri incelenerek tiplendirildi. Tüm suşlarda flukonazol ün standart toz formları ile CLSI standartlarına uygun olarak mikrodilüsyon (M27-A3) yöntemi ile antifungal duyarlılıkları çalışıldı. İlaç etkileşimleri çalışmasına flukonazole dirençli dört C. albicans, iki C. glabrata, iki C. tropicalis ve duyarlı dört C. albicans ve C. krusei, C. parapsilosis standart suşlarıyla birlikte toplam 14 suş dahil edildi. Suşlarda, flukonazolün siprofloksasin, levofloksasin ve doksisiklin ile kombinasyonlarının invitro etkinliği, checkerboard mikrodilüsyon yöntemi kullanılarak çalışıldı. İlaç etkileşimlerinin sonuçları, flukonazol-doksisiklin etkileşimi FİK indeksle ve hem flukonazol-doksisiklin hemde flukonazol-kinolon etkileşim isobolografik analiz yöntemleri ile değerlendirildi. Çalışmamızda, levofloksasin ve siprofloksasinin kandidalar üzerinde antifungal etkisi saptanmadı. Ancak doksisiklinin, duyarlı kandida suşlarında dirençlilere göre daha düşük MİK değerleri elde edildi. Flukonazol - siprofloksasin kombinasyonlarında sinerji saptanmadı. Levofloksasin ile kombinasyonlarda ise iki suşta sinerji saptandı. Buna karşılık beş suşta siprofloksasin ile dört suşta ise levofloksasin ile antagonizma görüldü. Flukonazol- doksisiklin kombinasyonlarının FİK indeks sonuçlarına göre; duyarlı bir suşta antagonizma elde edildi, diğer suşlarda ilaç etkileşimi saptanmadı. Ancak isobolografik analiz yöntem ile değerlendirildiğinde; suşların yarısında antagonizma ve bir suşta sinerji saptandı. Tüm kombinasyonlarda ilaç etkileşimleri suşa göre değişkenlik gösterdi. iii vi

Sonuç olarak; bulgularımız invivo ve invitro çalışmalar ile desteklenirse kandida enfeksiyonlarında ilaç etkileşimlerinin mekanizmasının anlaşılmasında ve tedavide yeni kombinasyon seçeneklerinin geliştirilmesinde yardımcı olacaktır. Anahtar kelimeler; Candida spp, sinerji-antagonizma, FİK analizi, Isobolografik analiz, flukonazol-antibiyotikler iv vii

ABSTRACT Fluconazole susceptibility of Candida species isolated from blood cultures and drug interactions of ciprofloxacin, levofloxacin and doxycycline with fluconazole In this study, it was aimed to evaluate the results of the invitro fluconazole susceptibility of Candida strains isolated from blood culture and to investigate drug interactions on fluconazole susceptible and resistance strains formed by the combination of levofloxacin, ciprofloxacin, doxycycline with fluconazole. In our study, 300 Candida strains isolated from blood cultures of patients hospitalized in various units of Baskent University Hospital were used., germ tube formation, morphologic appearance in Tween 80 corn-meal agar of all strains were tested and their biochemical characteristics were examined using the API 20C AUX (biomerieux, France) kit. Antifungal susceptibility tests were performed by microdilution method according to CLSI standards (M27-A3) with fluconazole standard powder for all strains. Total 14 candida strains including fluconazole resistance four C. albicans, two C. glabrata, two C. tropicalis and fluconazole sensitive four C. albicans and reference strains of C. krusei and C. parapsilosis, were included to drug interaction studies. Invitro efficacy of the combination for fluconazole, with ciprofloxacin, levofloxacine and doxycycline were assessed using checkerboard microdilution method and the result analysis by FIC index for fluconazole-doxycycline and isobolographic methods for both fluconazole-doxycycline and Fluconazole-quinolone. In our study, we determined that ciprofloxacin and levofloxacine had no effect on candida strains. MIC values of doxycycline were significantly higher in fluconazole resistance strains than susceptible strains. No synergistic effect obtained from fluconazoleciprofloxacin combinations and only two from fluconazole-levofloxacin while antagonistic effects were detected in five fluconazole-ciprofloxacin and four fluconazole-levofloxacin combinations. antagonistic effect obtained from fluconazole-doxycycline combinations in one fluconazole susceptible strain with FIC index analyze. On the other hand antagonistic v viii

interactions were obtained from half of all strains and synergistic interaction was determined in one strain with isobolographic analyze. As a result, more invivo and invitro studies needed to support our findings to understand mechanisms of drug interactions and to generate new combinations for antifungal therapy. Key words; Candida spp, synergy-antagonisms, FIC analyze, Isobolographic analyze, fluconazole-antibiotics vi ix

İÇİNDEKİLER Sayfa Özet iii İngilizce özet v İçindekiler dizini vii Kısaltmalar ve simgeler dizini ix Şekiller dizini x Tablolar dizini xi 1. Giriş 1 2. Genel Bilgiler 2 2.1. Kandida Enfeksiyonları 2 2.2. Epidemiyoloji 3 2.3. Tanı 4 2.3.1. Direkt Mikroskobi 4 2.3.2. İzolasyon 4 2.3.3. Tiplendirme 5 2.3.4. Diğer Tanı Yöntemleri 6 2.4. Antifungal İlaçlar 6 2.4.1. Azol Grubu Antifungaller: Flukonazol 7 2.4.2. Flukonazol Direnç Mekanizmaları 7 2.4.3. Diğer Antifungaller 8 2.5. Antifungal Duyarlılık Testleri 8 2.5.1. Dilüsyon Yöntemleri 9 2.5.2. Difüzyon Yöntemi 9 2.5.3. E test 9 2.6. Kandida Enfeksiyonlarında İlaç Etkileşimleri 9 2.6.1. Antifungal-Antifungal İlaç Etkileşimi 10 2.6.2. Antifungal Diğer İlaç Etkileşimleri 11 2.7. İlaç Etkileşimlerinde Araştırma Yöntemleri 13 vii x

3. Gereç ve Yöntem 14 3.1. Maya izolatları 14 3.2. Tiplendirme 14 3.2.1. Germ Tüp Testi 14 3.2.2. Mısır Unlu Tween 80 Agarda Mikroskobik Morfoloji İncelenmesi 15 3.2.3. Biyokimyasal Tiplendirme 16 3.3. Flukonazol Duyarlılık Testleri 17 3.3.1. Besiyeri 17 3.3.2. Flukonazol ün Stok Solüsyonu 17 3.3.3. Maya Süspansiyonu 17 3.3.4. Plakların Hazırlanması 18 3.3.5. Sonuçların Değerlendirilmesi 18 3.4. Flukonazol ile İlaç Etkileşimlerinin Checkerboard Yöntemi ile Araştırılması 18 3.4.1 Stok Solüsyonlar 18 3.4.2. Maya süspansiyonları 19 3.4.3. Plakların Hazırlanması 19 3.5. Sonuçların Değerlendirmesi 26 3.5.1. FİK İndeks Analizi 26 3.5.2 İsobolografik Analiz 26 3.6. İstatiksel Analiz 28 4. Bulgular 29 4.1.1. Tür Düzeyinde Dağılım 29 4.2. Flukonazol Duyarlılık Sonuçları 29 4.3. Checkerboard Sonuçlarının Değerlendirilmesi 31 4.3.1 FİK İndeks Analizi 31 4.3.2 İsobolografik Analiz 33 5. Tartışma 40 6. Sonuç 51 7. Kaynaklar 54 viii xi

KISALTMALAR VE SİMGELER DİZİNİ AmB CLSI D FİK F I L MİK S SAP SDA Amfoterisin B Clinical and Laboratory Standarts Institute Doksisiklin Fraksiyonel İnhibitör Konsantrasyon Flukonazol İnteraksiyon İndeks Levofloksasin Minumum İnhibitör Konsantrasyon Siprofloksasin Secreted Aspartic Proteases Sabouraud Dekstroz Agar ix xii

ŞEKİL DİZİNİ Sayfa Şekil 3.1. C.albicans suşunun, mısır-unlu Tween 80 kültür plaklarında mikroskobik 15 görünümü Şekil 3.2. C.glabrata suşunun, mısır-unlu Tween 80 kültür plaklarında mikroskobik 16 görünümü Şekil 4.1. Kandidalarda tür dağılımı 29 Şekil 4.2. Albikans ve albikans dışı kandidaların konsantrasyonlarına göre MİK dağılımı 30 x xiii

TABLO DİZİNİ Sayfa Tablo 2.1. Kandidemi gelişmesinde rol alan risk faktörleri 3 Tablo 2.2. Kandida enfeksiyonlarında kullanılan antifungal ilaçlar 7 Kutu 3.1. Germ tüp test yöntemi 14 Kutu 3.2. Mısır Unlu Tween 80 besiyerinin hazırlanması ve ekim yöntemi 15 Kutu 3.3. RPMI 1640 besiyerinin hazırlanması 17 Tablo 3.1. Duyarlı suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve Siprofloksasin 20 konsantrasyonları Tablo 3.2. Duyarlı suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve Levofloksasin 21 konsantrasyonları Tablo 3.3. Duyarlı suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve Doksisiklin 22 konsantrasyonları Tablo 3.4. Dirençli suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve Siprofloksasin 23 konsantrasyonları Tablo 3.5 Dirençli suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve Levofloksasin 24 konsantrasyonları Tablo 3.6. Dirençli Duyarlı suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve 25 Doksisiklin konsantrasyonları Tablo 4.1. Kandida türlerinin MİK 50 ve MİK 90 dağılımı 30 Tablo 4.2. Duyarlılık sonuçlarının türlere göre dağılımı 31 Tablo 4.3. Duyarlı ve dirençli suşlarda FİK indeks analiz sonuçları 32 Tablo 4.4. Duyarlı suşlarda sabit konsantrasyonlarda Flukonazol ve Doksisiklin 33 kombinasyonunun interaksiyon indeksleri Tablo 4.5. Dirençli suşlarda sabit konsantrasyonlarda Flukonazol ve Doksisiklin 34 kombinasyonunun interaksiyon indeksleri Tablo 4.6. Test edilen suşlarda Flukonazol-Doksisiklin kombinasyonlarının etkileşim 34 sonuçları Tablo 4.7. Duyarlı suşlarda sabit konsantrasyonlarda Flukonazol ve Siprofloksasin 35 kombinasyonunun interaksiyon indeksleri Tablo 4.8. Dirençli suşlarda sabit konsantrasyonlarda Flukonazol ve Siprofloksasin 36 kombinasyonunun interaksiyon indeksleri Tablo 4.9. Test edilen suşlarda Flukonazol-Siprofloksasin kombinasyonlarının etkileşim 36 sonuçları Tablo 4.10. Duyarlı suşlarda sabit konsantrasyonlarda Flukonazol ve Levofloksasin 37 kombinasyonunun interaksiyon indeksleri xi xiv

Tablo 4.11. Dirençli suşlarda sabit konsantrasyonlarda Flukonazol ve Levofloksasin 37 kombinasyonunun interaksiyon indeksleri Tablo 4.12. Test edilen suşlarda Flukonazol-Levofloksasin kombinasyonlarının etkileşim 38 sonuçları Tablo 4.13. Yapılan tüm analiz sonuçlarının suşlara göre dağılımı 39 xii xv

1. GİRİŞ Kandida türleri doğada yaygın olarak bulunan ve hastane kaynaklı önemli enfeksiyonlara yol açan etkenlerdir. Hastane enfeksiyonlarında etken olan kandida türlerinin oranı son yirmi yılda belirgin artış göstermiştir (1). Kandidemiler, nozokomiyal kan dolaşımı enfeksiyonları içinde dördüncü, yoğun bakım ünitelerinde gelişen enfeksiyonlar içinde üçüncü sırada yer almaktadırlar (2). Kandidemilerde tedavi mortalite ve morbidite yönünden önem kazanmakta flukonazol ilk tercih olarak karşımıza çıkmaktadır. Uzun süreli antifungal ilaç tedavisi alan hastalarda flukonazol duyarlılığı azalmakta ayrıca daha dirençli olan albikans dışı kandida enfeksiyon oranlarında artışa neden olmaktadır (3). Flukonazol direnç oranlarındaki bu artış, tedavi rejimlerinin değişmesine ve kombine ilaç tedavisine olan gereksinimi arttırmaktadır. Son yıllarda antifungal-antifungal ilaç kombinasyonlarının yanında, antifungaller ile farklı grup antibakteriyel ilaçlar arasındaki ilaç etkileşimi gösterilmiştir (4, 5, 6, 7). Antimikrobiyal ilaç etkileşiminin invitro olarak checkerboard yöntemi ile araştırılması ve sonuçların fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FİK) indeks analiz yöntemi ile değerlendirilmesi araştırmacılar tarafından yıllardır kullanılmaktadır (8, 9, 10). FİK indeks analiz yöntemi, antifungal ilaçlar ile kandidalar üzerinde etkisi olmayan farklı grup antibakteriyel ilaçlar arasındaki ilaç etkileşiminin araştırılmasında yeterli olmadığından aktif ve inaktif ilaç arasındaki ilaç etkileşiminin araştırılmasında Loewe etkileşim teorisine dayalı isobolografik analiz yöntemi tercih edilmektedir (6, 11, 12, 13). Bu çalışmanın amacı, kandan izole edilen kandida suşlarında en sık kullanılan antifungal olan flukonazolun, invitro duyarlılık profilini değerlendirmek ayrıca flukonazole dirençli ve duyarlı suşlarda, flukonazolun, kinolonlar ve doksisiklin kombinasyonları ile oluşan etkileşimlerini göstermektir. Elde edilen sonuçlar, kandida enfeksiyonları nedeniyle hastanede uzayan yatış sürelerinin kısaltılmasında ve özellikle tedavide sorun yaratan dirençli suşların elimine edilmesinde yol gösterici olacaktır. 1

2. GENEL BİLGİLER Kandidalar 4-6 μm çapında, tek hücreli, tomurcuklanarak çoğalan gerçek / yalancı hifler oluşturabilen, 80S ribozomları olan ökaryot hücre yapısında fakültatif anaerop doğada ve başta gastrointestinal sistem olmak üzere tüm mukozal yüzeylerde ve deride normal flora elemanı olarak bulunabilen mikroorganizmalardır (1). Kandidalar 200 den fazla tür içermektedir. Bunlardan C. albicans başta olmak üzere C. guillermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. lusitaniae, C. dubliniensis, C. glabrata, C. kefyr, C. stellatoidea, C. rugosa gibi türlerin insanlarda patojen oldukları bilinmektedir (1). 2.1. Kandida Enfeksiyonları Kandida enfeksiyonları tüm dünyada yaygın görülen basit, invaziv olmayan mukokutanöz kandidiyazdan sistemik invaziv kandidiyaza kadar değişen, endojen ve ekzojen kaynaklı fırsatçı enfeksiyonlardır. Endojen enfeksiyon özellikle hastaların florasında bulunan kandidalardan kaynaklanmaktadır. Ekzojen enfeksiyondan ise, başta sağlık personelinin elleri olmak üzere, kontamine biyomateryaller ve sıvılar, hastane ortamında kullanılan kataterler sorumlu tutulmaktadır (2, 14, 15). Santral venöz kataterlerin, periferik venöz kataterlere göre daha yüksek enfeksiyon riskine neden olduğu saptanmıştır. Kandida türlerinin biyolojik materyallerde biyofilm oluşturması, sürekli enfeksiyon odağı olarak rol oynamasına ve antifungal tedavinin etkisinden kurtulmasına neden olmaktadır (2, 15). Mukokutanöz kandidiyazda C. albicans en önemli etken olup; oral kandidiyaz (pamukçuk), kandida özefajiti, vulvovajinit ve balanit, primer kutanöz kandidiyaz, onikomikoz ve kronik mukokutanöz kandidiyaz şeklinde karşımıza çıkmaktadır. Kandidemi basit olarak kanda kandidaların bulunması olarak tanımlansa da klinikte, ateş (>38 C), hipotermi (< 36 C), lökositoz, lökopeni, taşikardi, takipne, hipotansiyon (sistolik kan basıncı 90 mmhg) ve oligüri (< 20 ml/saat) bulgularından en az biri olan olguların en az bir kan kültüründe kandida izole edilmesidir. Tanı ve tedavisi zor %40 oranında mortaliteye sahip ciddi bir klinik tablodur (2). 2

Kandidemilerin %95-97 sinden C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis ve C. krusei, %3-5 inden ise C. lusitaniae, C. guillermondii, C. rugosa gibi farklı türler sorumlu tutulmaktadır. Ülkeler arasında tür dağılımı yönünden farklılık görülmektedir (14). Avrupa ülkelerinde ve Türkiye de C. parapsilosis ve C. tropicalis, C. albicans tan sonra en sık kandidemi yapan türler arasında yer almaktadır (15). Kandidaların kan dolaşımına ulaşmaları GİS mukozasından, damar içi kataterler yoluyla, pyelonefrit gibi lokalize enfeksiyon kaynağından olmaktadır. Hem yoğun bakım ünitelerinde yatan hastalarda hem de nötropenik hastalarda kandidaların kan dolaşımına en fazla geçiş yolunun gastrointestinal sistemden penetrasyonla olduğu kabul edilmektedir (2). Tablo 2.1 de kandidemi gelişiminde rol oynayan başlıca risk faktörleri özetlenmiştir. Tablo 2.1. Kandidemi gelişmesinde rol alan risk faktörleri (2) Erişkinde risk faktörleri Geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı Santral venöz katater Total parenteral nutrisyon Mekanik ventilasyon İmmünosupresyon Yenidoğanda risk faktörleri Düşük gestasyonel yaş Gastrointestinal hastalık Konjenital malformasyonlar Şok 2.2. Epidemiyoloji Candida albicans 1990 lı yıllardan önce en sık kandidemi etkeni olmasına rağmen, son yıllarda albikans dışı kandida türlerinde artış olduğu gösterilmiştir. Bu artışın nedeni olarak proflaktik ve ampirik olarak antifungallerin yaygın kullanımı gösterilmektedir (14, 15, 16). Albikans dışı kandidalarda ilk sıralarda yer alan C. parapsilosis, ekzojen patojendir ve deri üzerindeki kolonizasyon oranlarının, mukozal yüzeylere göre daha fazla olduğu gösterilmiştir (14). Kataterler üzerinde biyofilm oluşturarak tedaviye direnç gelişmesine neden olmakta, hastanede yatan hastalar arasında nozokomiyal yolla veya hastane personelinin elleri ile taşınmaktadır (16). Bir diğer etken olan C. glabrata suşlarının onkoloji hastalarında insidansının arttığı gösterilmiştir (14). Sık görülen diğer albikans dışı kandidalardan C. tropicalis ve C. krusei kan ve kemik iliği transplantasyonu yapılacak olan hastalarda önemli enfektif patojenlerdir (14). Candida guillermondii hastanede yatan 3

hastalarda kolonize olan, flukonazol duyarlılıklarında görülen azalma ile önem kazanmaktadır. Yapılan birçok çalışmada, kandidemi etkenlerinin dağılımı ve insidansının ülkeden ülkeye, aynı ülkede yıllar arasında hatta hastaneler arasında değiştiği bildirilmiştir (15). 2.3. Tanı Kandidalar, normal cilt florasında yer almaları nedeni ile birçok örnekte bulunmaları tek başına tanı koydurucu olmamaktadır. Enfeksiyon kolonizasyon ayrımı için mutlaka klinik bulgularla beraber değerlendirilmelidir. Hemokültürlerden izole edildiğinde kesin kandidemi tanısı koyulamamakta, ayrıca kandidemili hastalarda izolasyon şansı düşük olmaktadır. Kandida tanısının hızlı ve doğru bir şekilde koyulması için örnekler uygun koşullarda laboratuvara gönderilmeli ve saklanmalıdır. Klinik örnekler aseptik koşullar altında ve antifungal tedavi öncesinde alınmalı en geç 2 saat içinde laboratuvara ulaştırılmalıdır (17). 2.3.1. Direkt Mikroskobi Kandida şüphesi ile gönderilen hasta materyallerinden hazırlanan preparatlar lam lamel arası incelenebileceği gibi gram veya histolojik boyalar ile boyanabilmektedir. Mikroskobik değerlendirme öncesi %10 luk potasyum hidroksit kullanılması, epitel hücrelerinin lizise uğramasını sağlayarak, daha iyi tespit edilmesini sağlar. Mikroskobik inceleme ile psödohif yapılarının görülmesi özellikle mukokutanöz kandida enfeksiyonlarının tanısında değerlidir (1). 2.3.2. İzolasyon Kandidalar, rutin laboratuvarlarda kullanılan kanlı agar, MacConkey agar gibi besiyerlerinde kolaylıkla 24-48 saatte üreyebilmektedirler. Maya kolonileri kültür plaklarında beyaz-opak renkte nemli görünümdedir ve kendisine özel bir kokusu ayrılmaktadır (18). Klinik örneklerden kandida izolasyonunda kullanılan Sabouraud dekstroz agara (SDA), bakterilerin ve hızlı üreyen küflerin üremesini baskılamak ve seçici özellik sağlamak için sikloheksimid, gentamisin ve kloramfenikol gibi antimikrobiyal ajanlar eklenebilmektedir (18). 4

Yapılan çalışmalarda kromojenik besiyerleri de kandidaların izolasyonunda kullanılmaya başlanmıştır. En sık kullanılan CHROMagar besiyerinde kandida türlerinin koloni morfolojileri ve rengine göre ayrılmaktadır. Bu besiyerinde C. albicans yeşil, C. tropicalis mavi, C. krusei toz pembe, C. glabrata mor renkte, C. parapsilosis ise parlak beyaz koloniler oluşturmaktadır (19). Otomatize hemokültür sistemlerinden olan BacT/ALERT3D (biomerieux) veya BACTEC 9240 (Becton Dickinson) ayrıca isolator gibi sistemler kandida izolasyonunda kullanılabilir (1). 2.3.3. Tiplendirme Kandidaların tiplendirilmesinde ilk olarak hızlı sonuç veren ve uygulaması kolay olan germ tüp testi yapılmaktadır. Bu test C. albicans ın albikans dışı kandidalardan ayrılmasını sağlamaktadır. C. albicans dışında C. stellatoidea ve C. dubliniensis de germ tüp oluşturan kandida türlerindendir. Diğer albikans dışı kandidalardan ise C. tropicalis, C. kefyr, C. krusei de psödogerm tüp oluşumu görülebilmektedir (1). Kandidaların morfolojik yapılarını incelemek amacı ile mısır unlu tween 80 besiyeri kullanılmaktadır. Bu besiyeri kandidaların blastokonidya, klamidospor ve yalancı hif üretimini arttırmaktadır (18). Biyokimyasal tanıda karbonhidrat asimilasyon ve fermantasyon testleri kullanılmaktadır. Karbonhidrat asimilasyon testinde, mayaların oksijen varlığında tek karbon kaynağı olarak çeşitli karbonhidratları kullanabilme özelliği, karbonhidrat fermantasyon testinde ise mayaların farklı karbonhidratları fermente ederek gaz oluşturup oluşturmadıkları araştırılmaktadır. Biyokimyasal tanıda kullanılmak üzere ticari olarak piyasada çok sayıda test bulunmaktadır. Bu testlerden en sık kullanılanlar API 20C AUX (BioMerieux, Franca), API ID 32C (BioMerieux, Franca), Auxader (Sanofi Diagnostics Pasteur, France) ve Uni- Yeast Tek (Remel Laboratories, Lenexa, Kan.) kitleridir (20). 5

2.3.4. Diğer Tanı Yöntemleri Kültür ve biyokimyasal identifikasyon yöntemlerinden başka serolojik ve moleküler tanı yöntemleri de kandida enfeksiyonlarında kullanılmaktadır. Serolojik Tanı Antikor arayan testler başarılı sonuç vermemekte bu nedenle antijen testleri tercih edilmektedir. Bu amaçla; mannan, D-arabinitol, enolaz ve -D-glukan en çok tercih edilenlerdir. Manan antijeni, kandida hücre duvarında bulunmakta olup kandida enfeksiyonlarında kanda saptanabilmektedir. Fakat bu antijenin kandaki seviyelerinin hızla düşmesi nedeniyle bu testin sık olarak tekrarlanması gerekmektedir (21). Kandidaların hücre duvarında bulunan diğer antijen 1-3 β-d-glukandır. Bu antijenin kanda saptanabilmesi için 2004 yılında FDA tarafından onaylanmış Fungitell testi piyasada ticari olarak bulunmaktadır (1). Moleküler Tanı Candida albicans gen sekansı 2004 yılında tanımlanmış (22) ve moleküler tanı yöntemleri hızla uygulanmaya başlamıştır. Moleküler tanı yöntemleri direkt klinik materyalden (kan, serum, plasma, steril vücut sıvıları ve doku örnekleri) kandidiyaz tanısı koyulabilmesine olanak sağlarken pahalı olması, standardizasyonun olmaması nedeni ile rutin laboratuvarlarda tercih edilmemektedir (17). Moleküler tanıda kullanılan Real-time PCR, floresan ile işaretlenmiş türe spesifik probların kullanıldığı yeni bir yöntemdir. Bu yöntemin kısa sürede sonuç vermesi, kontaminasyon riskinin az olması ve tür düzeyinde identifikasyon yapması gibi avantajları bulunmaktadır (23). 2.4. Antifungal İlaçlar Kandida enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılan 4 grup antifungal ilaç tablo 2.2 de özetlenmiştir. 6

Tablo 2.2 Kandida enfeksiyonlarında kullanılan antifungal ilaçlar Poliyen grubu antifungal ilaçlar Azol türevi antifungaller Yeni azol antifungaller Nükleik asit sentez inhibitörleri Hücre duvarına etkili ajanlar (Ekinokandinler) AmB Ketokonazol Flukonazol Itrakonazol Vorikonazol Posakonazol Ravukonazol İsavukonazol Albakonazol 5-fluorositozin Kaspofungin Mikafungin Anidulafungin 2.4.1. Azol Grubu Antifungaller: Flukonazol Azoller, fungustatik etki gösteren antifungallerdir. Bu etkilerini, lanosterolden ergosterol sentezinde rol alan bir enzim olan sitokrom P450 ye bağlı 14α-demetilaz enzimini inhibe ederek göstermektedirler (1). Kandida enfeksiyonlarının proflaksi ve tedavisinde en sık kullanılan azol flukonazoldür. Fungustatik etkisini sitoplazmik membran üzerinden göstermektedir. Candida albicans türleri flukonazole duyarlı iken, albikans dışı kandidalarda flukonazol direnç oranları daha yüksektir. Albikans dışı kandida türlerinden özellikle C. krusei, flukonazole doğal dirençli iken C. glabrata suşları flukonazole genellikle dirençli veya doza bağlı duyarlıdır (24). 2.4.2. Flukonazol Direnç Mekanizmaları Son yıllarda flukonazolun tedavi ve proflakside yaygın olarak kullanımı direnç gelişmesine neden olmaktadır. Yapılan çalışmalarda flukonazol direncinin birden fazla mekanizma ile meydana geldiği gösterilmiştir (25). Bu mekanizmalar aşağıda maddeler halinde özetlenmiştir. 1. Sterol sentezinde rol alan 14α-demetilaz enziminin inhibe edilmesi ile kandidaların plazma membranında biriken steroller membranın akışkanlığının ve fonksiyonlarının bozulmasına neden olmaktadır (25). 2. Sterol sentezinde rol alan 14α-demetilaz enzimini kodlayan ERG11 genindeki mutasyonlar, substrat ve inhibitörün enzime bağlanmasını etkilemektedir (25). 7

3. ERG11 geninin aşırı ekspresyonu ile protein miktarı artmakta ve flukonazolun yetersiz kalmasına neden olmaktadır (25). 4. Membran transport protein genlerinden olan CDR1, CDR2, MDR1 genlerinin aşırı ekspresyonu antifungal ilaçların efflüksünü artırmaktadır. Bu genlerin inaktive olması antifungallerin hücre içinde birikmesine neden olmaktadır. CDR1 gen inaktivasyonu C. albicans larda çoklu ilaç direncinden sorumlu iken, MDR1 gen inaktivasyonu sadece flukonazol direncinde önemini korumaktadır. CDR2 gen mutasyonlarının hücre içi flukonazol birikimi üzerine olan etkisi gösterilememiştir (26). 5. Biyofilm oluşumu, kandidalarda ilaç penetrasyonunu azaltmakta ve ilacın matriks dışına atılmasına neden olmaktadır (27). 6. Kandida patogenezinde rol oynayan secreted aspartic protease (SAP), 10 üyeden oluşan SAP gen ailesi tarafından kodlanmaktadır. SAP, C. albicans dışında C. dubliniensis, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. lusitaniae tarafından salgılanarak konak doku invazyonu ve adezyonu sonucunda konağın hücre ve moleküllerini parçalayarak antimikrobiyallere direnç gelişmesine neden olmaktadır (27). 2.4.3. Diğer Antifungaller Kandida tedavisinde en sık kullanılan ilaçlardan Amfoterisin B (AmB), fungal membranda yer alan en önemli sterol olan ergosterole bağlanarak fungusidal etki göstermektedir. Ekinokandinler, fungal hücre membranında protein yapısında bir makromolekül olan ve hücre duvarının yapısal bütünlüğünü sağlayan β-1,3 D glukan sentezini inhibe ederek fungusidal etki gösteren ilaçlardır (29). Flusitozin, sentetik florlanmış pirimidin analoğudur ve mantar hücrelerinde aktif metaboliti 5-florourasile dönüşmektedir. 5-FU protein ve DNA sentezini inhibe etmektedir (1). 2.5. Antifungal Duyarlılık Testleri İnvitro antifungal duyarlılık testleri, epidemiyolojik çalışmalarda ve rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında sık olarak kullanılmaktadır. Direnç oranlarındaki artış, antifungal duyarlılık testlerinin standardizasyon çalışmalarına olan gereksinimi arttırmıştır (30). National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) yeni adı ile Clinical and 8

Laboratory Standarts Institute (CLSI) ın antifungal duyarlılık alt komitesi 1982 yılından beri kandidalarda standardizasyon çalışmalarını sürdürmektedir (28). İlk olarak 1992 yılında M27, daha sonra sırası ile 1995 de M27-T, 1997 de M27-A, 2002 de M27-A2 ve son olarak 2009 yılında M27-A3 antifungal duyarlılık test kriterleri yayınlanmıştır (31, 32, 33, 34, 28). CLSI tarafından mayaların antifungal duyarlılıklarının araştırılması için önerilen referans yöntemde kandidalarda azol grubu ilaçlar, ekinokandinler ve flusitozin için direnç sınır değerleri belirlenmiş, amfoterisin B (AmB) içinse henüz saptanmamıştır (34). 2.5.1. Dilüsyon Yöntemleri CLSI M27-A3 kriterlerine göre, mikrodilüsyon ve makrodilüsyon yöntemlerinin standardizasyonu en son halini almıştır. Sıvı mikrodilüsyon yöntemi, antifungal duyarlılık testleri içinde en yaygın kullanılan yöntem haline gelmiştir. (28). 2.5.2. Difüzyon Yöntemi Tüm dünyada antibakteriyel duyarlılık testleri için en sık kullanılan yöntem disk difüzyon yöntemidir. CLSI M44-A kriterlerine göre standart disk difüzyon yönteminde flukonazol (25μg) ve vorikonazol (1μg) diskleri kullanılarak kandidalarda da bu yöntem geliştirilmiştir. Kandida izolatlarının flukonazol için disk difüzyon yöntemi ile sınır değerleri; duyarlı suşlarda 19 mm, orta duyarlılarda=15-18 mm, dirençli suşlarda ise 14 mm olarak belirlenmiştir (28). 2.5.3. E Test: Etest şeritleri, üzerinde dengeli bir şekilde giderek artan konsantrasyonda antifungal ilaç içermektedir. Bu antifungal duyarlılık yöntemi, difüzyon temeline dayanmaktadır. AmB, flukonazol, 5- flusitozin, ketokonazol, itrakonazol, vorikonazol ve kaspofungin için Etest şeritleri ticari olarak bulunmaktadır. Yapılan çalışmalarda standart mikrodilüsyon yöntemi ile karşılaştırıldığında Etest yöntemi ile elde edilen sonuçlar benzer bulunmuştur (35, 36). 2.6. Kandida Enfeksiyonlarında İlaç Etkileşimleri İnvaziv kandidiyazda hızlı ve etkili tedavi ihtiyacı her geçen gün artış göstermektedir. Kandida enfeksiyonlarında özellikle invaziv formlarında özellikle biyofilm oluşumu gibi nedenlerden dolayı bazen monoterapiler başarılı olamamaktadır (37). İlaç kombinasyonlarının önemli avantajları arasında sinerjistik etkinin oluşması, ilaçların etki 9

spektrumlarının artması ve direnç oranlarındaki azalma yer almaktadır. Antagonistik etkinin saptanması, toksik etki ve maliyetin artması kombine ilaç tedavilerinin kullanımını kısıtlamaktadır (10, 38). Kombine kullanım için İnvitro ilaç etkileşimlerinin araştırılmasında sinerji, antagonist veya aditif etki saptanabilmektedir (8). Sinerji; ilaçların kombinasyonlarda tek başlarına oluşturdukları etkilerin toplamından daha fazla etki oluşturması olarak tanımlanmaktadır. Antagonizma; ilaçların kombinasyonlarda tek başlarına oluşan etkilerinin toplamından daha az etki oluşturmalarıdır. Aditif etkileşim ise kombinasyonlarda tek başına kullanıldıklarında elde edilen etkilerinin toplamının saptanmasıdır (8). Rastlantısal olarak bazı antibiyotikler ile antifungal ilaçların birlikte kullanılması kandidalarda antifungal etkiyi arttırdığı klinik çalışmalar ile gözlenmiştir. Antifungallerin, antifungaller ve antibiyotiklerle kombine etkilerinin araştırılması kandidalarda artan direnç oranları nedeniyle önem kazanmaktadır (38). 2.6.1. Antifungal - Antifungal İlaç Etkileşimi Antifungallerin kandidalarda farklı hedefleri etkileyerek antifungal etki göstermektedirler (30). Kombine edildiklerinde klinik sonuçlarının yüz güldürücü olması nedeniyle çok sayıda invitro çalışma yapılmaktadır. Kandida enfeksiyonlarında en sık kullanılan antifungal ajanlardan olan, azoller ve AmB nin invitro ortamda kombinasyon etkileri araştırıldığında antagonistik etki elde edilmiştir. Antagonistik etkiden, azollerin ergosterol sentezini azaltması ve AmB nin ergosterole bağlanamaması sorumlu tutulmaktadır (39, 40). Son yıllarda artan direnç nedeniyle özellikle flukonazole dirençli kandida izolatlarına fungusidal etkili ekinokandin grubu yeni antifungaller geliştirilmiştir. Ekinokandinler, hepatik sitokrom enzimlerini kullanmamaları nedeniyle flukonazol ile antagonistik etki göstermezler (29). Kaspofunginin AmB ile kombine etkisi kandan izole edilen C. parapsilosis klinik izolatlarında invivo ve invitro olarak araştırılmış ve sinerji saptanmıştır. Kaspofungin hücre duvar sentezini inhibe ederek AmB nin hücre membranından geçişini arttırmaktadır (42). 10

Ekinokandinlerden mikafunginin kandan izole edilen C. albicans ve albikans dışı kandida suşlarında flukonazol ile kombine etkileri araştırılmış, öncelikle ilaç etkileşimi saptanmazken C. albicans ve C. tropicalis de özellikle aditif etki görülmüştür (44). Mikafunginin; flukonazol, vorikonazol, AmB ve flusitozin ile kombinasyonunda, C. glabrata suşlarında azoller ile sinerjistik saptanmamıştır (45). Kandida enfeksiyonlarında kullanılan ajanlarla etkileşim gösteren bir diğer antifungal olan terbinafin aslında dermatofit enfeksiyon tedavisi için geliştirilmiştir. Bir çalışmada flukonazole dirençli C. albicans suşlarında; terbinafinin, AmB ile kombinasyonlarında, azollere göre daha yüksek oranlarda sinerjistik etki saptanmıştır (41). Kaspofungin terbinafin kombinasyonları, C. albicans, C. kefyr, C. krusei suşlarında invitro araştırılmış; C. albicans ve C. keyfr suşlarında sinerjistik etki saptanırken, C. dubliniensis de ilaç etkileşimi saptanmamıştır (43). 2.6.2. Antifungal ve Diğer İlaç Etkileşimleri Kandida enfeksiyonlarının tedavisinde en sık kullanılan azol grubu antifungaller sitokrom P450 üzerinde ergosterol sentez inhibisyonu yapmaktadırlar. Çalışmalarda sitokrom P450 enzim aracılığı ile metabolize edilen ilaçların, azollerle kombinasyonlarında toksik etkilerinin arttığı gösterilmiştir. Bir çalışmada itrakonazol, ketokonazol ve posakonazolün midazolam ile kombinasyonlarında midazolamın toksik etkilerinde artış saptanmıştır (46). Yücesoy ve arkadaşları (48), flukonazol-nonsteroid antiinflamatuarları kombine ettikleri çalışmada sinerjistik etki saptamışlardır. Azollerden; flukonazol, itrakonazol ve vorikonazolün amiodoron ile kombinasyonlarında sinerjistik etki saptanmıştır. Bu etki amiodoronun ergosterol sentezini engellemesi ve kandidalarda apoptozise neden olması olarak gösterilmiştir (49). Yapılan bir çalışmada biyofilm oluşturan albikans dışı kandidalardan C. parapsilosis, C. krusei, C. glabrata suşlarında rifampisin-amb kombinasyonlarının etkisini araştırılmış ve bu kombinasyonların, kandidalarda biyofilm oluşumunu azalttığını saptanmıştır (49). 11

Antifungal-Kinolon Etkileşimi Kinolonlar nalidiksik asitin sentetik analoğu, geniş spektrumlu antibakteriyel etkili ajanlardır. Florokinolonlar, DNA giraz enziminin gyra kısmına bağlanarak etki gösterirler ve antifungal aktiviteleri yoktur. Ancak fungal topoizomeraz I ve topoizomeraz II enzimlerine bağlanarak fungal DNA replikasyonunu bozduğu gösterilmiştir (51, 52). Antifungaller ile beraber kullanıldıklarında antifungal etkinliği artırabilecekleri öne sürülmüş ve bunun nedeni olarak, flurokinolonların ATP bağımlı efflux pompası aracılığı ile antifungallerin hücre içi konsantrasyonunu arttırması olduğu belirtilmiştir (4). Diğer bir çalışmada azol dirençli suşlarda ofloksasin tek başına antifungal etki göstermezken, ofloksasin+flukonazol kombinasyonu ile sinerjistik etki saptanmış, aynı çalışmada ofloksasin+flukonazol kombinasyonunun invivo ortamda etkisi araştırıldığında farelerin yaşam sürelerinin uzamadığı ancak böbrek ve dalaklarında kandida sayılarının azaldığı saptanmıştır (51). Stergiopoulou ve arkadaşları (6); Siprofloksasin (S)+Flukonazol (F), S+AmB ve S+CAS kombinasyonlarının duyarlı kandida izolatlarında etkilerini araştırmış siprofloksasinin tek başına antifungal etkisini saptamamışlardır. Bu çalışmada ilaç etkileşimi, kombinasyonlardaki ilaç konsantrasyonlarına göre farklılık göstermiştir. Başka bir çalışmada, siprofloksasin, trovafloksasin ile AmB ve flukonazol kombine edildiğinde, hastaların yaşam sürelerinin arttığı gösterilmiştir (7). Antifungal-Tetrasiklin Etkileşimi Tetrasiklinler bakterilerin 30S ribozomal alt birimine bağlanıp, trna nın ribozomun A bölgesine bağlanarak protein sentezini inhibe ederek bakteriyostatik etki göstermektedir (1). Araştırmacılar tarafından kandidalar üzerindeki antifungal+tetrasiklin kombinasyon etkilerinin araştırıldığı çalışmalar yapılmaktadır. Tetrasiklin+AmB kombinasyonlarının C. albicans suşunun AmB duyarlılığını 32 kat arttırmasından eflüks pompasındaki ekspresyon inhibisyonu sorumlu tutulmuştur (7). Muhamed El-Azizi (50), Doksisiklin (D)+AmB kombinasyonlarının, albikans dışı kandidalarda AmB nin antifungal etkisini arttırdığını, aynı zamanda biyofilm oluşumunu azalttığını saptamıştır. 12

2.7. İlaç Etkileşimlerinde Araştırma Yöntemleri Aynı veya farklı grup antibiyotikler arasında ilaç etkileşimlerinin araştırılmasında birden fazla yöntem bulunmaktadır. İlaç etkileşimlerinin araştırılmasında en sık checkerboard yöntemi kullanılmaktadır. Bir diğer yöntem minumum fungusidal konsantrasyon değerlerini ölçen time-kill yöntemidir (36). Checkerboard yöntemi ile elde edilen verilerin fraksiyonel inhibitör konsantrasyon (FİK) indeksleri hesaplanmaktadır. FİK indeks değerlerinin hesaplanması uzun yıllardır en sık kullanılan yol olmuştur. FİK modelinde, 1= (MİK kombinasyondaki A ilacı / MİK tek başına A ilacı) + (MİK kombinasyondaki B ilacı / MİK tek başına B ilacı) eşitliği doğru olduğunda indiferans söz konusudur yani etkileşim yoktur. FİK 0.5 ve daha az olduğunda sinerjistik etki, 4 ten büyük olduğunda ise antagonistik etki olarak değerlendirilmektedir (38). FİK indeksini hesaplamak için kombinasyonda kullanılan her iki ajanın MİK değerlerine gereksinim olduğundan, antifungal ilaçlar ve antifungal aktivitesi olmayan ilaçlar arasındaki ilaç etkileşiminin araştırılmasında, yeni analitik yöntemlere olan ihtiyaç artmıştır. Son yıllarda FİK indeks hesaplama yöntemine alternatif olarak isobolografik analiz yöntemi geliştirilmiştir (8). İsobolografik analizlerin ilaç etkileşimlerinde kullanılması ilk olarak Loewe tarafından 1927 yılında geliştirilen etkileşim yok teorisine dayanarak gerçekleştirilmiştir (8, 10, 11, 13). Önceleri iki ilacın birlikte kullanıldığında oluşan artan veya azalan etki doğrusal isobologramlar ile değerlendirilmiştir. Daha sonra bu etkileşimin doğrusal isobologramlar ile gösterilmesinin yanlış sonuçlara neden olabileceği anlaşılmış ve doğrusal olmayan isobologramlar kullanılmaya başlanmıştır (4, 6, 12). İsobolografik analiz yönteminin temeli, kombine ilaçlarla oluşan konsantrasyon-etki regresyon eğrilerinin, ilaçların tek başlarına etkilerinden elde teorik kombinasyon eğrileri ile kıyaslamasına dayalı analizdir (12). Bu yöntem, antimikrobiyal ajanların etkileşiminin araştırılmasında kullanıldığında checkerboard plaklarının sonuçları esas alınmakta, analizlerin yapılmasını birçok istatistik yazılım programı ile desteklemektedir. Bu yöntem ile hem iki aktif ilacın hem de ilaçlardan sadece birinin aktif olduğu kombinasyonlarda ilaç etkileşim analizleri yapılabilmektedir (6, 12). 13

3. GEREÇ ve YÖNTEM Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Araştırma Kurulu tarafından 11.03.2009 tarihinde onaylanmış (Proje no: KA 09/60) ve Başkent Üniversitesi Araştırma fonunca desteklenmiştir. 3.1. Maya izolatları Projede 300 kandida suşu kullanıldı. Tüm suşlar Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Ankara ve Adana hastanelerinin çeşitli ünitelerinde yatan hastaların hemokültürlerinden izole edildi. İdentifiye edilen suşlar çalışılıncaya kadar %0.25 gliserollü Brucella buyyon besiyerinde -86 C de saklandı. 3.2. Tiplendirme Tüm suşlar germ tüp oluşumu, mısır-unlu tween 80 deki mikroskobik morfolojilerine ve API 20C AUX kitinde karbonhidratlara etkilerine bakılarak tiplendirildi. 3.2.1. Germ Tüp Testi Tüm suşlara germ tüp testi kutu 3.1 de verildiği şekilde uygulandı. Mikroskobik incelemenin sonucunda, ana hücreden orijin alan ve başlangıç noktasında boğumlanma yapmaksızın filament şeklinde uzantı yapan oluşumlar izlendi. Bu oluşumlar germ tüp pozitif olarak değerlendirildi. Germ tüp pozitif olan maya kolonileri Candida albicans/dubliniensis olarak tiplendirildi. Kutu 3.1. Germ tüp test yöntemi Gerekli Malzemeler SDA da üremiş saf maya kültürleri İnsan serumu Lam, lamel Öze Etüv Işık mikroskobu Deneyin Yapılması Saf maya kolonisinden 0.5 ml insan serumu içinde süspansiyon hazırlandı. 35 C de 3 saat inkübe edildi. Lam lamel arası preperat hazırlandı. 14

3.2.2. Mısır Unlu Tween 80 Agarda Mikroskobik Morfoloji İncelenmesi Tüm suşlar mısır unlu Tween 80 agardaki morfolojik yapılarına göre tiplendirildi. Testin yapılışı kutu 3.2.de verildi. Kutu 3.2. Mısır Unlu Tween 80 besiyerinin hazırlanması ve ekim yöntemi Formül: Mısır unu (Sigma) Agar Tween 80 Distile su Besiyerinin Hazırlanması: 40gr 20gr 10ml 1000ml Mısır unu tartıldı. Distile su içinde eritildi. Su banyosunda 65 C de 1 saat bekletildi. Kağıt filtre yardımı ile süzüldü. ph 6.6+/- 6.8 ayarlandı. Agar ve Tween 80 eklendi. Otoklavda 121 C de 15 dakika steril edildi. Ekim Yöntemi Saf maya kolonilerinden mısır unlu besiyerine birbirine paralel olacak şekilde 3 çizgi ekimi yapıldı. Lamel alevden geçirilerek steril edildi ve soğutuldu. İki alana yerleştirildi. Plakların etrafı parafin ile kapatıldı. Plaklar oda ısısında 72 saat inkübe edildikten sonra ışık mikroskobundaki morfolojik görünümlerine göre değerlendirildi. Mısır-unlu Tween 80 kültür plaklarındaki pasajlar yalancı hif, gerçek hif yapıları, klamidaspor oluşumu, blastokonidyum yapıları açısından incelendi. Şekil 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 de kandidaların 10 luk objektifdeki mikroskobik görüntüleri verildi. X10 Şekil 3.1. C. albicans suşunun, mısır-unlu Tween 80 kültür plaklarında mikroskobik görünümü 15

X10 Şekil 3.2. C. glabrata suşunun, mısır-unlu Tween 80 kültür plaklarında mikroskobik görünümü 3.2.3. Biyokimyasal Tiplendirme Albikans dışı kandidaların morfolojik yapılarının incelenmesinden sonra API 20C AUX kiti ile karbonhidratlara etkisine bakıldı. API 20C AUX kiti 19 u karbonhidrat asimilasyon testleri ve biri üreme kontrol olmak üzere 20 mikrokuyucuktan oluşmaktadır. Test edilen karbonhidratlar: glukoz, gliserol, 2-keto-D-glukonat, L-arabinoz, D-ksiloz, adonitol, ksilitol, galaktoz, inozitol, sorbitol, α-metil-d-glukosid, N-asetil-D-glukozamin, selobiyoz, laktoz, maltoz, sükroz, trehaloz, melibiyoz ve rafinozdur (20). Taze maya kolonisinden serum fizyolojik içinde McFarland 2 olacak şekilde maya süspansiyonu hazırlandı. Maya süspansiyonu kitin içindeki ampüllerde hazır olarak bulunan sıvılara 100 erμl aktarıldı. Daha sonra apilerdeki mikrokuyucuklara dağıtıldı ve 35 C etüvde 48 saat inkübe edildikten sonra kitin prosedürüne uygun olarak okundu. Zayıf üreme gösteren suşların inkübasyonları bir gün daha uzatıldıktan sonra değerlendirildi. 16

3.3. Flukonazol Duyarlılık Testleri Flukonazol duyarlılıkları mikrodilüsyon yöntemi ile CLSI in M27-A3 kriterlerine uygun olarak invitro olarak yapıldı. C. krusei ATCC 6258 ve C. parapsilosis ATCC 22019 suşları kalite kontrol amacıyla her teste dahil edildi (28). 3.3.1. Besiyeri Mikrodilüsyon yöntemi ile duyarlılık çalışmadan önce MOPS (0.165 M morfolinpropananasulfonik asit, Sigma) ile tamponlanmış (ph: 7.0) L-glutamin içeren RPMI 1640 (Sigma) besiyeri hazırlandı (28) (kutu 3.3.). Kutu 3.3. RPMI 1640 besiyerinin hazırlanması Formül RPMI 1640 tozu MOPS buffer Distile su ph 7,0 +/- 0,1 Besiyerinin Hazırlanması: 10,4 g 34,5 g 1000 ml RPMI tartıldı ve 900ml steril distile suda eritildi. MOPS 34,5 gr tartılarak eklendi ve eritildi Karışımın ph ı 10 molar NaOH ile ph 7.0 a ayarlandı. Toplam hacim steril distile su ile 1000ml ye tamamlandı. Çapı 0,2μm olan membran filtreden (marka) süzülerek steril edildi. Not: Sıvı RPMI + 4 C de en fazla 3 ay saklandı. 3.3.2. Flukonazol ün Stok Solüsyonu Stok solüsyonların hazırlanmasında, flukonazol ün (Pfizer) standart toz formları kullanıldı. Flukonazol stok solüsyonu 2560 mg/l konsantrasyonunda steril distile suda hazırlandı ve -86 C de testler yapılıncaya kadar saklandı. 3.3.3. Maya Süspansiyonu Açılan suşlar iki kere pasajlandı. Saf maya kolonilerinden PhoenixSpec (BD, France) cihazı kullanılarak serum fizyolojik ile 0,5 MacFarland bulanıklığında süspansiyonlar hazırlandı. 17

3.3.4. Plakların Hazırlanması Besiyeri olarak MOPS ile tamponlanmış RPMI 1640 kullanıldı. Stok solüsyonları ilk kuyucukta 64 mg/l olacak şekilde RPMI ile sulandırıldı ve standart protokole uygun olarak 96 çukurlu U tabanlı steril mikroplaklarda (TPP, İsviçre) birinci sütuna 100 er μl dağıtıldı. Flukonazol ün çift kat seri dilüsyonları yapıldı. Her sıradaki 12. kuyucuklar üreme kontrol olarak bırakıldı. Maya süspansiyonları tüm kuyucuklara 100 er μl dağıtıldı. Öncelikle flukonazol konsantrasyonları 64 0,06 mg/l olarak ayarlandı. Direnç saptanan suşların MİK değerlerini görebilmek için flukonazol konsantrasyonu 256 mg/l ye çıkarılarak tekrar çalışıldı. 3.3.5. Sonuçların Değerlendirilmesi Plaklar 37 C 48 saat inkübe edildi ve sonuçlar görsel olarak değerlendirildi. Standartlara göre üremenin %50 olarak azaldığı kuyucuktaki flukonazol konsantrasyonu MİK değeri olarak kabul edildi. Suşların flukonazol dirençlerine CLSI standartlarında belirlenen sınır değerlere göre karar verildi. Kandidalarda flukonazol için MİK değerleri 8 mg/l ise duyarlı, 16-32 mg/l arasında doza bağlı duyarlı, 64 mg/l ise dirençli kabul edildi. 3.4. Flukonazol ile İlaç Etkileşimlerinin Checkerboard Yöntemi ile Araştırılması Dirençli 8, duyarlı 4 suş rastgele seçilip C. krusei, C. parapsilosis standart suşları dahil edilerek toplam 14 suşta çalışıldı. Bu suşlarda; flukonazolün kinolon grubu antibiyotiklerden siprofloksasin ve levofloksasin, tetrasiklinlerden ise doksisiklin ile etkileşimi standart checkerboard yöntemi modifiye edilerek araştırıldı (8, 10). 3.4.1 Stok Solüsyonlar Flukonazol ün duyarlılık çalışması için hazırlanan stok çözeltileri kullanıldı. Siprofloksasin (Fako, 3585), doksisiklinin (Sigma, K0598) standart toz formları steril distile su ile sulandırılarak stok çözeltileri sırası ile 2560 mg/l, 16000 mg/l konsantrasyonlarında hazırlandı. Levofloksasinin (BD, France) standart toz formları 0,1 mol/l NaOH ile çözündükten sonra steril distile su ile sulandırılarak stok çözeltisi 5120 mg/l konsantrasyonunda hazırlandı. Stok solüsyonlar -86 C de testler yapılıncaya kadar saklandı. 18

3.4.2. Maya süspansiyonları Açılan suşlar iki kere pasajlandı. Saf maya kolonilerinden serum fizyolojik ile süspansiyonları hazırlandı. Bu süspansiyonlar ELx800 (Bio-Tek Instruments, INC) cihazı kullanılarak 530nm de okutuldu ve %80 OD değeri olacak şekilde ayarlandı. Bu şekilde hazırlanan süspansiyonlar plaklarda son inokulüm konsantrasyonu 5 10 2-2,5 10 3 CFU/ml olacak şekilde RPMI 1640 besiyeri ile sulandırıldı. 3.4.3. Plakların Hazırlanması Besiyeri olarak duyarlılık testlerinde olduğu gibi MOPS ile tamponlanmış RPMI 1640 besiyeri kullanıldı. Çalışmaya başlamadan önce stok ilaç çözeltileri dirençli ve duyarlı suşlar için farklı konsantrasyonlarda olacak şekilde bu besiyeri ile sulandırıldı. Standart protokole uygun olarak hazırlanan ilaç sulandırımları 96 kuyucuklu U tabanlı mikroplaklarda kombine edildi. Hazırlanan kombinasyonlar 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6.no lu tablolarda verildi. A1 kuyucuğu üreme kontrol, H12 kuyucuğu ise sterilite kontrol olarak bırakıldı. Plaklar parafinlenip 37 C etüvde 48 saat inkübe edildi. İnkübasyonun ardından OD değerleri ELx800 spektrofotometre cihazında 405 nm de okutuldu. 19

Tablo 3.1. Duyarlı suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve Siprofloksasin konsantrasyonları A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 ÜK S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 S32 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 F0,06 F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 S32 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 F0,125 F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 S32 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 F0,25 F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 S32 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F0,5 F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 S32 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F1 F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 S32 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 F2 F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 S32 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 F4 F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ SK S 0,03 S0,06 S0,125 S0,25 S0,5 S1 S2 S4 S8 S16 F: Flukonazol S: Siprofloksasin ÜK: Üreme kontrol SK: Sterilite kontrol Tüm kuyucuklardaki antibiyotik konsantrasyonlarının birimi mg/l dir. F0,06=0,06 mg/l flukonazol, S 0,03=0,03 mg/l siprofloksasin içermektedir. 20

Tablo 3.2. Duyarlı suşlarda plaklardaki tüm kuyucuklarda Flukonazol ve Levofloksasin konsantrasyonları A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 ÜK L0,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 L32 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 F0,06 F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ F0,06+ L0,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 L32 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 F0,125 F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ F0,12+ L0,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 L32 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 F0,25 F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ F0,25+ L0,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 L32 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F0,5 F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ F0,5+ L0,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 L32 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F1 F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ F1+ L,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 L32 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 F2 F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ F2+ L0,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 L32 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 F4 F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ F4+ SK L0,03 L0,06 L0,125 L0,25 L0,5 L1 L2 L4 L8 L16 F: Flukonazol L: Levofloksasin ÜK: Üreme kontrol SK: Sterilite kontrol Tüm kuyucuklardaki antibiyotik konsantrasyonlarının birimi mg/l dir. F0,06=0,06 mg/l flukonazol, L0,03=0,03 mg/l levofloksasin içermektedir. 21