GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZ OLUŞTURAN ESCHERİCHİA COLİ SUŞLARINDA İKİ FARKLI YÖNTEMLE BİYOFİLM ARAŞTIRILMASI Brian Roy Ives, Elmas Tohumoğlu, Atike Gül, Nuh Can Koçak, Özen Taş, Damlasu S. Bağcaz Danışman: Doç. Dr. Müge Demirbilek ÖZET Bu çalışmada GSBL pozitif Escherichia coli suşlarında biyofilm oluşum oranlarının görülmesi ve iki farklı yöntemin kıyaslanması amaçlanmıştır. GSBL pozitif suşlardan biyofilm oluşumunu araştırmak için modifiye Christiensen mikroplak yöntemi ve BioTimer yöntemi kullanılmıştır. Mikroplak yönteminde triptik soy buyyonda üreyen bakterilerin 96 kuyucuklu U tabanlı plaklarda biyofilm oluşturması sağlanmıştır. Sonuçlar 24 saat sonra spektrofotometrik olarak değerlendirilmiş, optik yoğunluklarına (OD) göre kantitasyonu yapılmıştır. BioTimer yönteminde triptik soy buyyonda bakteri süspansiyonu hazırlanmış cam boncuklar üzerinde biyofilm oluşturulmuştur. Daha sonra bu boncuklar BioTimer-Fenol kırmızısı(bt-pr) besiyerine aktarılmıştır. Bu besiyerinde 24 saat inkübasyondan sonra biyofilm oluşumu; renk değişikliğine göre değerlendirilmiştir. Tüm deneyler 3 kere tekrarlanmış ve biyofilm oluşumu bilinen standart Enterococcus faecalis suşu çalışmaya dahil edilmiş ayrıca her plakta en az 3 negatif kontrol denenmiştir. Mikroplak yönteminde negatif cutoff esaslı değerlendirme yapıldığında suşların %68 nin BioTimer yöntemi ile %74 nün biyofilm oluşturduğu görülmüştür. BioTimer yönteminin Duyarlılığı %100, Özgüllüğü %81.2, Pozitif prediktif değeri %91.8, Negatif prediktif değeri %100 bulunmuştur. Çalışmamıza göre GSBL pozitiflik oranları oldukça yüksektir. Bu suşlar ile oluşan enfeksiyonların tedavisinin daha zor olduğu unutulmamalı ve birinci tercih ilaç olan karbapenemlerin biyofilmler üzerine etkisine bakılmalıdır. Cam boncuklarda biyofilm oluşturma temeline dayalı BioTimer yönteminin E.coli suşları için uygun olduğu görülmüş ve ileri biyofilm duyarlılık araştırmalarında büyük kolaylık sağlayacağı düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: Escherichia coli, biyofilm, biotimer yöntemi, GSBL GİRİŞ Bakterilerde antibiyotiklere direnç gelişmesi ile antibiyotik kullanımı arasında doğrudan bir ilişki vardır. Antibiyotik kullanımının çok fazla olması nedeniyle hastaneler, bakterilerde antibiyotik direncinin ortaya çıkması ve yayılması için en uygun ortamlardır. Hastane enfeksiyonlarında da saptanan etkenlerdeki antibiyotiklere direnç oranı, hastane dışında saptanan etkenlere göre daha yüksektir. Bakterilerde antibiyotik direncinin başta gelen nedenlerinden biri olan beta-laktamaz üretimi, endişe verici bir hızla yayılmakta ve çeşitlenmektedir. Öte yandan nozokomiyal 1
etkenlerde başta olmak üzere, plazmidler yoluyla bakteriden bakteriye direnç aktarımı beta-laktamazların yaygınlığına katkıda bulunmaktadır. Beta-laktamazlar arasında TEM ve SHV grubu enzimler, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında sık soyutlanan türlerde yaygın olmaları ve plazmidlerce taşınmaları nedeniyle klinik önem açısından ön plandadır. TEM-1 TEM-2 ve SHV-1 beta-laktamazları, penisilinler ve 1.kuşak sefalosporinleri etkin bir biçimde parçaladıkları halde; sefalotaksim, seftazidim ve aztreonam gibi geniş spektrumlu beta laktamlara kısıtlı etki gösterirler. Ana enzimleri kodlayan genlerdeki nokta mutasyonlara bağlı olarak yeni enzimler gelişmiştir. Geniş spektrumlu beta laktam ajanları inaktive edebildikleri için genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz(gsbl) olarak adlandırılmıştır. GSBL, en sık Klebsiella pneumoniae Escherichia Coli suşlarında bulunmakta ve bu türler ile oluşan enfeksiyonların tedavisinde sorun yaratmaktadır(3). GSBL ler sefotaksim, seftazidim, seftriakson gibi oksiimino betalaktamlara ve aztreonama direnç kazandıran ve genetik şifresi plazmid üzerinden taşınan enzimlerdir. İlk olarak 1983 yılında Avrupa da Klebsiella pneumoniae türlerine karşı, geniş spektrumlu beta-laktamların kullanılmaya başlanmasından hemen sonra, tanımlanan bu enzimler, daha sonra Enterobacteriaceae familyasının diğer üyelerinde de gösterilmiştir (2,4). Biyofilm, canlı veya cansız bir yüzeye yapışarak kendi ürettikleri polisakkarid bir matriks içine gömülü halde yaşayan mikroorganizmaların oluşturduğu topluluktur. Değişik mikrobial türlerin, kendilerini çevresel etkenlerden korumak ve besin kaynağını daha verimli kullanmak için oluşturdukları mikro-ekosistem olarak da tanımlanabilir. Biyofilmler; kateterler, eklem ve kalp protezleri gibi kalıcı ya da kalıcı olmayan tıbbi araçları veya kistik fibrozis gibi bazı hastalıklarda solunum yollarını kolonize eden bakterilerin oluşturduğu bir mikroorganizma topluluğudur. Biyofilmin büyük bir bölümünü oluşturan ekzopolisakkaritler (EPS) savunmada önemli rol oynayan moleküllerdir. Ekzopolisakkaritler bulunduğu bakteriyi enflamatuar hücrelerin fagositozundan ve antibiyotik etkisinden korurlar. Bir biyofilmin yapısı %97 su olmak üzere %2-5 mikroorganizma, %1-2 polisakkarid, %1-2 protein, %1-2 DNA ve iyonlardan oluşmaktadır. Sistemin yapısına, mikroorganizmanın türüne ve çevresel faktörlere bağlı olarak olgun bir biyofilmin oluşması birkaç saat ile birkaç hafta arasında zaman alır(7). Bu çalışmada GSBL pozitif suşlarda biyofilm oluşum oranlarının görülmesi E.coli de daha önce hiç denenmemiş bir yöntem olan BioTimer yönteminin denenmesi sonuçların geleneksel yöntemle kıyaslanarak, antibiyotik duyarlılık çalışmaları için model oluşumunun sağlanması amaçlanmıştır GEREÇ VE YÖNTEM GSBL pozitifliği CLSI kriterlerine uygun olarak çift disk sinerji yöntemi ile araştırılmıştır. Bu amaçla beta laktamaz inhibitörü olan klavulanik asit içeren disklerin 2 santim uzağına sefotaksim, sefoksitin diskleri koyulmuş ve aralarında sinerji görülenler yani inhibisyon zonunda genişleme olanlar GSBL pozitif kabul edilmiştir(8). 2
GSBL pozitif suşlardan biyofilm oluşumunu araştırmak için Mikroplak yöntemi ve BioTimer yöntemi kullanılmıştır. Mikroplak yönteminde Triptik Soy Agar da (TSA) 1 gece inkübe edilerek üretilmiş bakteriler 1-2 koloni olacak şekilde %0.25 glikozlu Triptik Soy Broth a (TSB) pasajlanmıştır. 18-24 saat inkübasyon sonrasında üreyen bakteriler 1/100 oranında sulandırılarak her bakteri 3 kuyucuğa denk gelecek şekilde mikroplaklara dağıtılmıştır. Hazırlanan plaklar 24 saat etüvde inkübe edilmiştir. Kuyucuklardaki besiyeri çok kanallı pipetle boşaltılarak ph 7.2 fosfat tamponlu su (PBS) ile 3 kez yıkanacak, tüm yıkanmış kuyucuklara %1 lik (w/v) 200 µl kristal viyole dağıtılmış, 20 dakika oda sıcaklığında bekleyen mikroplaklar 3 kez suyla yıkanmıştır. Kuyucuklara, %80 etanol ve %20 aseton karışımı 200 µl eklenmiş ve spektrofotometrik olarak değerlendirilmiştir. Optik yoğunluklarına (OD) göre 1+ ile 4+ arasında biyofilm oluşturma kantitasyonu yapılmıştır. BioTimer yönteminde cam boncuklar kullanılmıştır. Besiyeri olarak BioTimer-Fenol kırmızısı (BT-PR) besiyeri kullanılmıştır. Bu besiyerinde 21gr MHB+10gr glikoz+25gr Fenol kırmızısı, 1lt distile suyla karıştırılıp, ph sı 7.2 ye ayarlanmış 121 o C de 15 dakika otoklavlanmıştır(8). Biyofilm oluşum miktarını belirlemek için öncelikle E.coli ye özel korelasyon çizgisi elde edilmiştir. Bunun için cam tüplere 1 er ml BT-PR besiyeri dağıtılmış, birinci tüpte McFarland 0.5 ayarlanıp 1/10 oranında sulandırılmış BT-PR besiyerindeki bakteri süspansiyonu 1 ml eklenmiştir. Seri dilüsyonlar hazırlandıktan sonra 37 o C de inkübe edilen tüplerde, düzenli aralıklarla renk değişimi kontrol edilerek hangi dilüsyonda hangi zamanda renk değişimi gerçekleştiği not edilmiştir. Eş zamanlı olarak her dilüsyondan MHB besiyerine seri pasajlar alınarak bakteri kolonileri sayılarak mililitredeki koloni oluşturan birim (Colony Forming Unit-CFU) ler hesaplanmıştır. Böylece zamana karşı logcfu/ml olacak şekilde korelasyon eğrisi elde edilmiştir. BioTimer yönteminde 2 mm çapındaki steril cam boncuklar üzerinde bakterilerin biyofilm oluşturması sağlanmıştır. Suşların taze pasajları %0.25 glikozlu TSB besiyerinde üretilmiş ve aynı besiyerinde 1/100 oranında sulandırılıp mikroplaklara dağıtılmış ve üzerlerine boncuklar eklenmiştir. Her suş için 3 adet cam boncuk hazırlanmıştır. Daha sonra 37 C de çalkalamadan bir gece inkübe edilerek biyofilm oluşturulmuş cam boncuklar steril tuzlu su solüsyonunda 3 kere yıkanmış ve yapışmamış hücreler ayrılmıştır. Her suş için biyofilm oluşturmuş 3 boncuk yıkama sonrası BT-PR besiyerine aktarılmış ve 37 o de inkübe edilip renk değişikliği kontrol edilmiştir. Renk değişikliği gözle değerlendirilmiştir. İstatiksel değerlendirme; grup ortancalarının karşılaştırılmasında Menn- Whitney U testi kullanılmıştır. P<0.05 düzeyi istatiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. İstatiksel analiz SPSS 17.0 istatiksel paket programında yapılmıştır. Bu çalışma Başkent Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Araştırma Kurulu tarafından onaylanmış (Proje no:da11/14) ve Başkent Üniversitesi Araştırma Fonunca desteklenmiştir 3
SONUÇLAR Çifti disk sinerjiyöntemi ile GSBL oluşturduğu saptanan 100 suş çalışmaya dahil edilmiştir(şekil 1) Şekil 1. Çift dik sinerji yöntemi ile GSBL oluşturan E.coli suşu Mikroplak yönteminde kullanılan plaklar sabit optik yoğunlukta (OD) değerledirildiğinde OD<200 olan 90 suş biyofilm negatif, 200 OD 400 olan 5 suş ve Entereccocus suşu biyofilm orta pozitif, OD>400 olan 5 suş ise biyofilm kuvvetli pozitif olarak bulunmuştur(şekil 3). Her plak kendi içinde negatif kontrole göre değerlendirildiğinde OD OD NK olan 32 suş biyofilm negatif, OD NK < OD (2xOD NK ) olan 55 suş biyofilm zayıf pozitif, (2x OD NK ) < OD (4x OD NK ) olan 8 suş ve Entereccocus suşu biyofilm orta pozitif, OD > (4x OD NK ) olan 5 suş ise kuvvetli pozitif olarak bulunmuştur. Planktonik hücrelerde zamana karşı BT-PR besiyerinde renk değişimi korelasyon eğrisi şekil 2 de verilmiştir. Şekil 2. E.coli planktonik hücrelerinin BT-PR besiyerinde renk değişim zamanı ve bakteri sayısı (logcfu/ml) korelasyon eğrisi 4
BioTimer yöntemi sonuçları ise gözle değerlendirilmiştir (Şekil 3). Besiyerinde renk değişimi görülen kuyucuklar biyofilm pozitif, renk değişimi olmayan kuyucuklar biyofilm negatif olarak saptanmıştır. Buna göre suşların %74 ü biyofilm pozitif, %26 sı biyofilm negatif olarak elde edilmiştir. Mikroplak yönteminde elde edilen OD değerleri ile Biotimer testleri arasında istatiksel olarak güçlü bir ilişki olduğu görülmüştür (Tablo 1). Şekil 3. E.coli suşlarının mikroplak yöntemi ve BioTimer yöntemi ile biyofilm oluşturmaları Tablo 1. Mikroplak yönteminde elde edilen OD değerleri ile BioTimer yöntemi sonuçlarının karşılaştırılması Mikroplak Yöntemi BioTimer Yöntemi Pozitif BioTimer yöntemi Negatif OD Medyan (min/max) 88.83 * (77.67/96.00) 158.21* (93.33/751.33) Çeyrekler arası sapma (IQR) *p<0.05 7.00* 53.00* TARTIŞMA GSBL aracılı direnç, plazmidler aracılığıyla türler arasında aktarılabilmekte, hastanelerde salgınlar oluşturabilmekte ve mortalite oranlarını arttırabilmektedir (4). GSBL direncini bakteriler arasında taşıyan plazmidler, çoğunlukla diğer antibiyotiklere karşı direnci de taşımaktadır (3). Bu enzimler geniş spektrumlu penisilinazların türevleridir ve çoğu TEM ya da SHV enzimlerinden köken almaktadır (4). Hibridizasyon deneyleri ile GSBL lerin TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 beta laktamaz genlerinde meydana gelen basit nokta mutasyonları sonucunda ortaya çıktığı saptanmıştır (1, 2). Antibiyotiğin koruyucu dozları bu mikroorganizmaları kontrol ettiği halde biyofilmi etkilemez. Kalıcı tıbbi cihazlar üzerinde gelişen biyofilmler sürekli bir enfeksiyon odağı oluşturarak enfeksiyonun hematojen yolla yayılımı açısından da her zaman bir risk kaynağı sayılmaktadır. Biyofilmin yapısının ve oluş mekanizmalarının daha iyi anlaşılması muhtemelen mikroorganizmaların potansiyel tedavi hedeflerini de ortaya çıkartacaktır. 5
GSBL pozitif suşlarda çoğu zaman tek antibiyotik seçeneği karpenemlaer olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu suşların aynı anda biyofilm oluşturması ayrı bir problemdir. Çalışmamızda bu suşlarda yüksek oranda(%68, %74) biyofilm oluşumu saptanmıştır. E. coli lerde biyofilm araştıran yeterli çalışma yoktur. Maya ve arkadaşları, E. coli suşlarında %76.6 slime oluşumu ve suşların hidrofobisitesini %90 oranını saptamıştır. Bu iki faktörde biyofilm oluşumunda önemlidir(5). Yapılan bir çalışmada E.coli izolatlarındaki biyofilm oluşum oranları, patojen suşlarda çevre izolatlarına göre daha yüksek bulunmuştur(9). Bizim çalışmamızda tüm suşlarımız klinik izolat olduğu için böyle bir kıyaslama yapılmamıştır. Yang ve Zang(11) ise GSBL pozitif K.pneumoniae suşlarında biyofilm oluşumunu (%82) negatiflere göre çok daha yüksek oranda (%13.4) saptamıştır. Çalışmamızda GSBL negatif suş kullanılmamıştır. GSBL pozitiflerde biyofilm oluşumu yüksek oranda bulunmuştur. Bu diğer çalışmayla uyumlu ancak daha düşüktür. Bunun sebebi bakterilerin farklı olmasına bağlanmıştır. GSBL pozitif E.coli lerde biyofilm araştıran çalışmaya ulaşılamamıştır. EAEC suşlarında (62 suş) yapılan çalışmada 48 suşda (%77.4) biyofilm oluşumu saptanmış. Çalışmamızdaki oranın bununla uyumlu olduğu görülmüştür(10). E.coli suşlarında yapılan bir çalışmada; metod bağımlı (kullanılan besiyeri, süre, hesaplama) olarak biyofilm oluşum oranlarının değişeceği bildirilmiştir(6) ve bizim çalışmamızda da metoda bağlı olarak değişen %68 ve %74 lük pozitif sonuç gözlemlenmiştir. Mikroplak yöntemi çeşitli koşullardan etkilendiği için sabit OD ile değerlendirmenin hata payı yüksek bulunmuştur. Negatif kontrol cutoff esaslı değerlendirmeye göre mikroplak yöntemi ile karşılaştırıldığında BioTimer yönteminin; duyarlılığı %100, özgüllüğü %81.2, pozitif prediktif değeri %91.8 ve negatif prediktif değeri %100 olarak değerlendirilmiştir. Değişik yüzeylerin biyofilm oluşumunu etkilediği görülmüştür. Yöntemler arasındaki farklara değinilecek olunursa, E. coli nin glikozu hızlı fermente etmesi sebebi ile BioTimer yönteminde az sayıda bakteri yeterli iken, Mikroplak yönteminde kuvvetli yapışma gerektiğinden dolayı, Biyofilmin görünür hale gelmesi için çok sayıda bakteri gereklidir. Çalışmamızda GSBL pozitif E.coli suşlarında yüksek oranda biyofilm oluşumu saptanmıştır. Bu sonuçlar GSBL pozitif suşlarda ilk tercih olan karbapenemlerin biyofilm üzerine etkisine bakılmasının tedavi başarısı açısından önemli olduğunu düşündürtmüştür. BioTimer yöntemi ile tüm boncuklarda eşit oranda biyofilm oluşturulduğunun gözlenmesi biyofilm duyarlılık çalışmaları açısından önem taşımaktadır. GSBL pozitif E.coli biyofilmlerine karşı karbapenemlerin etkinliğinin invitro ve invivo koşullarda araştırılması başlıklı öğrenci projesi kapsamında yürüteceğimiz çalışma için yol gösterici olmuştur. Biyofilm araştırmalarında halen standart bir yöntem geliştirilmemiştir. Bu çalışma E. coli suşlarında BioTimer yöntemi ile biyofilm araştıran ilk çalışma olduğu için önemlidir. Çalışmamız bu yöntemin özellikle mikroplak yönteminde saptanan OD değerleri ile kıyaslandığında güvenilir sonuçlar verdiğini (p<0.05) göstermiştir. 6
KAYNAKLAR 1. Abdi-Ali A, Mohammadi-Mehr M, Alaei YA. Bactericidal activity of various antibiotics against biyofilm-producing Pseudomonas aeruginosa, International Journal of Antimicrobial Agents, 2006; 27(3):196-200. 2. Demir N. Gram negatif bakterilerde genişlemiş spektrumlu betalaktamaz (GSBL) üretimine katkıda bulunançeşitli risk faktörlerinin araştırılması. Uzmanlık Tezi, 2006; Danışman: Serap Gençer. Dr. Lütfi Kırdar Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi, İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği. 3. Gür D:Beta-Laktamazlar,Flora 1997; 2 (Ek3) 4. Jacoby GA, Medeiros AA: More extended-spectrum beta-lactamases, Antimicrob Agents Chemother. 1991; 35:1697. 5. Maya A.S et al. Phenotypic and Genotypic Characterization of Extended Spectrum β- Lactamase Producing Escherichia coli Clinical Isolates from Semiurban Area J Phar Res. 2011 4:4-10 6. Naves P, del Prado G et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 2008;105(2):585-90. 7. Olson ME, Ceri H, Douglas W. et.al. Biyofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics, Can J Vet Res. 2002; 66(2): 86 92. 8. Pantanella F, Valenti P, Frioni A, Natalizi T, Coltella L, Berlutti F. BioTimer Assay, a new method for counting Staphylococcus spp. in biyofilm without sample manipulation applied to evaluate antibiotic susceptibility of biyofilm. J Microbiol Methods. 2008; 75(3):478-84 9. Reisner A, Krogfelt KA et al. In vitro biofilm formation of commensal and pathogenic Escherichia coli strains: impact of environmental and genetic factors. J Bacteriol. 2006;188(10):3572-81. 10. Wakimoto N et al. Quantitative biofilm assay using a microtiter plate to screen for enteroaggregative Escherichia coli. Am J Trop Med Hyg. 2004;71(5):687-90. 11. Yang & Zhang. Biofilm-forming Klebsiella Pneumoniae strains have greater likelyhood of producing extended-spectrum β- Lactamases. J Jhin. 2008; 369-371 7