Tralleis Elektronik Dergisi http://dergi.etralleis.com e-tralleis 1 (2013) 11-17 ADÜ Aydın İlinde Üretilen Zeytinyağlarının Aflatoksin İçerikleri 1 Aslı YORULMAZ 1 Cavit BİRCAN 1 1 Adnan Menderes Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Aydın ESER BİLGİSİ Araştırma Makalesi Tarım Bilimleri Sorumlu Yazar: Aslı YORULMAZ, asliyorulmaz@adu.edu.tr Yayına Kabul Tarihi: 12 Aralık 2012 Özet: Çalışmanın amacı Aydın ilinde üretilen zeytinyağlarının aflatoksin içeriğinin tespit edilmesidir. Bu amaçla 2008/2009 ve 2009/2010 hasat yıllarında farklı zeytinyağı fabrikalarından toplam 50 adet örnek temin edilmiştir. Aflatoksin içeriğinin belirlenebilmesi için örnekler metanolle ekstrakte edilip, immunoaffiniti kolondan geçirilerek RP-HPLC de analiz edilmiştir. Kromatografik ayırım nükleosil dolgu maddeli kolonda, potasyum bromür ve nitrik asit içeren su:metanol (53:47) mobil fazında gerçekleşmiştir. Türevlendirme için Kobra Cell kullanılmış ve örneklerde G 1, G 2, B 1 ve B 2 aflatoksinleri tanımlanmıştır. Elde edilen sonuçlar örneklerin % 96 sında hiçbir aflatoksin bulaşısının olmadığını, sadece iki örnekte ortalama 0,10 ppb düzeyinde aflatoksin B 1 bulunduğunu ortaya koymuştur. Tespit edilen bu miktar Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğ de Bulunması muhtemel riskli gıdalar için belirlenen limitlerin altındadır. Sonuçlar zeytinyağı üreten fabrikaların işleme sırasında gösterdikleri özeni ortaya koyabileceği gibi, zeytinyağında bulunan fenolik maddelerin olası koruyucu etkisini de düşündürmektedir. Anahtar Kelimeler: Aflatoksin, HPLC, zeytinyağı Aflatoxin Content of Olive Oils Produced in Aydın Province Abstract: The aim of the study is to determine the aflatoxin content of olive oils produced in Aydın province. For this purpose 50 olive oil samples produced in 2008/2009 and 2009/2010 harvest years were obtained from olive oil plants. To determine the aflatoxin content, samples were extracted with methanol, applied to immunoaffinty column and analysed with RP-HPLC. Chromatographic elution was performed in nucleosil column with water:methanol (53:47) mobil phase including potassium bromide and nitric acid. Elctrochemically generated Kobra Cell was used for post-column derivatization and G 1, G 2, B 1, B 2 aflatoxins were qualified in samples. Results have shown that 96% of the samples were not contaminated with aflatoxins; while only two of the samples were contaminated with aflatoxin B 1 at 0,10 ppb level. This level of contamination is within the limits of Turkish Food Codex, Communique on determining the maximum levels of certain contaminants in foodstuffs determined for Other foodstuffs. Results may either note the careful attention of olive oil factories during production or they may point out the protective effects of phenolics present in olive oil. Key words: Aflatoxin, HPLC, olive oil 11
Giriş Gıda maddelerinde veya tarımsal ürünlerde bulunan küfler, uygun şartlar oluştuğu takdirde istenmeyen değişikliklere ve bozulmalara neden olabilmektedir. Bunun yanında geliştikleri ürünlerde toksik özellikte olabilecek çeşitli metabolitleri de üretebilmektedirler. Bu metabolitlere mikotoksin adı verilmekte olup, bunlar insan ve hayvanlarda mikotoksikosiz adı verilen bazı hastalıklara yol açmaktadır. Birçok küf çeşidi tarafından üretilen mikotoksinler içinde en toksik olduğu bilinen grup aflatoksinler dir (Dıraman, 2003). Aflatoksinler, Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus ve Aspergillus nomius un toksijenik suşları tarafından üretilen toksik, immunosupresif, mutajenik, teratojenik metabolizma ürünleridir (Concon, 1988; Castegnaro ve Mcgregor, 1998). Aflatoksinler, aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2, M 1, M 2 olmak üzere başlıca altı ana bileşikten oluşur (Van Egmond, 1977; Concon, 1988). Ayrıca gerek küflü kültürlerden, gerekse hayvan vücudundan elde edilmiş metabolitleri ile (aflatoksin B 2α, G 2α, P 1, Q 1 ve aflatoksikol gibi) bu sayı 17 yi bulmaktadır (Concon, 1988; Pitter, 1998). Aspergillus flavus sadece B toksinlerini üretirken, Aspergillus paraciticus ve Aspergillus nomius hem B hem de G toksinlerini üretirler. Aflatoksinler arasında en yüksek toksik etkiye sahip olan fraksiyon aflatoksin B 1 dir ve sırayla bunu aflatoksin M 1, G 1, B 2 ve G 2 takip etmektedir (Gourama ve Bullerman, 1995). Ayrıca aflatoksin B 1`in birinci dereceden kanserojen olduğu tespit edilmiştir (Akiyama, 2001). Uzun yıllardan beri yapılan araştırmalar sonucu aflatoksinlerin insan ve hayvanlarda akut aflatosikosiz, karaciğer kanseri, Hint çocuk sirozu, Rye sendromu, encefalopati, iç organlarda yağ dejenerasyonu, mutajenite ve nefrotoksisiteye sebep oldukları tespit edilmiştir (Palmgreen ve Hayes, 1987). Bundan dolayı çoğu ülkelerde alınan ve satılan ürünlerde izin verilen aflatoksin seviyesi kanunlarla sıkı denetim altına alınmıştır (Van Egmond, 1989; Akiyama, 2001). Örneğin Avrupa Birliği Yönetmeliği, insan tüketimine hazır kuru gıdalarda aflatoksin B 1 için en çok 2 ppb, toplam aflatoksin için ise en çok 4 ppb seviyesine izin vermektedir (Anonim, 2002). Ülkemizde yürürlükte olan Gıda Maddelerindeki bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğ de işlenmiş ürünlerin de dahil olduğu birçok gıdada aflatoksin B 1, toplam aflatoksin (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) ve aflatoksin M 1 için sırasıyla en çok 5, 10 ve 0,5 μg kg -1 ile sınırlandırılmıştır (Anonim, 2009). Aflatoksinler tahıllar, kuru yemişler, meyveler, yağlı tohumlar, kuru meyveler, baharatlar gibi pek çok bitkisel ürünü depolama sırasında etkileyebilmektedir (Weidenbörner, 2001). Yüksek sıcaklık ve nem, küflerin gelişmesi ve toksin oluşumu için optimum koşulları oluşturmaktadır. Ayrıca aflatoksinler coğrafi bölge, tarımsal uygulamalar ve ürünün hasat öncesi ve/veya sonrası fungal enfeksiyona duyarlılığına bağlı olarak da gıda ürünlerinde farklı konsantrasyonlarda bulunabilmektedir. Zeytin ve ürünlerinde toksin riski de birçok araştırıcı tarafından bildirilmiştir ( Bircan, 2006; Heperkan ve ark., 2006). Zeytin ve zeytin ürünleri daha çok Akdeniz havzasında üretilen, bu nedenle Akdeniz ülkeleri diyetleri, ekonomileri ve kültürlerinde önemli yeri olan gıda maddeleridir. Özellikle zeytinyağı özel aroması, lezzeti, yüksek oksidatif stabilitesi ve sağlık üzerine yaptığı olumlu etkiler nedeniyle son yıllarda giderek artan bir ilgi görmektedir. Türkiye, sahip olduğu coğrafi konum ve iklim özellikleri nedeniyle dünyanın önde gelen zeytin ve zeytinyağı üreticilerindendir. Zeytinin anavatanı olarak kabul edilen ülkemizde 100 milyon civarında zeytin ağacı bulunmaktadır. Son yıllarda sağlanan teşvik ve desteklerle zeytin ağacı sayısında önemli artışlar kaydedilmektedir. Bu artışların devam edeceği ve gelecekte ülkemizin gerek zeytin, gerekse zeytinyağı üretiminde daha üst sıralarda yer alacağı öngörülmektedir. Aydın ili % 20 lik dikili alan ve % 22.2 lik üretim hacmiyle ülkemizde zeytin yetiştiriciliği yapan iller arasında ilk sırada yer almaktadır. Ülkemizde yetiştirilen zeytinlerin bir kısmı sofralık olarak değerlendirilmekte, fakat büyük kısmı yağa 12
işlenmektedir. Yağlık olarak değerlendirilecek zeytinler ekim-ocak ayları arasında hasat edilerek, genellikle çuvallarla ya da plastik kasalarla zeytinyağı fabrikalarına taşınmaktadır. Fabrikaya ulaştırılan zeytinlerin ideal olarak hemen işlenmesi gerekmektedir. Ancak hasatta karşılaşılan güçlükler, periyodisite gösteren bir ürün olması, zeytinlerin 2-3 ay gibi kısa bir süre içinde hasat edilme zorunluluğu zeytinlerin depolanmasını gerekli kılmaktadır. Bu nedenle zeytinler çoğunlukla yağa işlenmeden önce bir süre depolanmaktadır. İdeal depolama, zeytinlerin düz ve beton zeminli bölmelerde veya kerevetlerde, 25 C sıcaklıkta ve % 75 nem düzeyinde, 20 cm yükseklikte bir yığın olarak en fazla birkaç gün tutulmalarıdır (Rahmani, 2000). Fakat ülkemizde yaygın olarak uygulanan yöntem, zeytinlerin yığınlar halinde yada çuvalların üst üste konarak depolanmasıdır. Bu şekilde günlerce bekletilen zeytinlerde meyvelerin solunumu sonucu meydana gelen sıcaklık artışı hem mikrobiyel gelişimi ve mikotoksin oluşumunu teşvik etmekte hem de lipaz enziminin faaliyeti sonucu yağın asitliğinin artışına neden olmaktadır. Zeytinlerde bu şekilde mikotoksin kirliliği meydana gelmekte ve söz konusu mikotoksinlerin, özellikle aflatoksinlerin işleme sırasında zeytinyağına transferi mümkün olabilmektedir. Zeytinyağı üretim yöntemlerinden biri olan presleme yöntemi, zeytinden yağa aflatoksin bulaşısı için uygun zemin hazırlayan bir yöntem olarak dikkat çekmektedir. Meyvede veya yeterince temizlenmemiş presleme sistemindeki zeytin hamuru kalıntılarında küf gelişimi ve mikotoksin oluşumu meydana gelmektedir. Mahjoub ve Bullerman (1990), presleme yöntemiyle zeytindeki aflatoksinlerin % 18-47 oranında zeytinyağına geçtiğini bildirmişlerdir. Zeytinyağlarının aflatoksin içeriğini tespit etmeye yönelik çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Letutour ve ark. (1983) klasik ince tabaka kromatografi yöntemi ile zeytinyağlarında aflatoksin B 1 (AFB 1 ) ve okratoksin A nın eş zamanlı olarak tespitini yapmışlardır. Bu yöntem ile örneklerde belirlenen en düşük miktar sınırı, okratoksin A için 40 μg kg -1 olmuş, AFB 1 ise 4 μg kg -1 olarak bulunmuştur. Daradimos ve ark. (2000) yapmış oldukları araştırmada 50 adet Yunanistan orijinli 1985 ve 1998 yılları ürünü zeytinyağlarında AFB 1 analizi yapmışlardır. Örneklerin % 72 nde AFB 1 olduğu görülmüş ve AFB 1 değişim sınırları 2.8 15.7 ng kg -1 olarak bulunmuştur. Ancak bir zeytinyağı örneğinin 46.3 ng kg -1 AFB 1 içerdiği tespit edilmiştir. Ferracane ve ark. (2007 ), Daradimos ve ark. (2000) tarafından geliştirilen metodu modifiye ederek İtalya ve Kuzey Afrika dan aldıkları 30 ayrı zeytinyağı örneğinin AFB 1 ve okratoksin A içeriğini tespit etmişlerdir. Elde ettikleri sonuçlar örneklerdeki okratoksin A düzeyinin 17.0 ng g -1, AFB 1 düzeyinin ise 2.4 ng g -1 düzeyine kadar çıkabildiğini göstermiştir. Humeid ve Abu Blan (1987) yapmış oldukları araştırmada depolama süresince zeytinlerde gelişen küflerin, yağın asitliği ve AFB 1 üretimi üzerine etkilerini incelemiştir. Çalışmada zeytinyağındaki asitlik düzeyinin zeytindeki küf türlerine göre değişkenlik gösterdiği ve küfler ile infekte edilen bütün zeytinyağlarının ultraviole lamba altında floresans spot göstermesine rağmen Aspergillus flavus ile infekte olmuş örneklerin hiçbirinde aflatoksin bulunmadığı görülmüştür. Zeytin danelerinin yağ çıkarılması öncesinde uygun olmayan bekletme şartları altında tutulması halinde, çeşitli mikroorganizmaların saldırısına maruz kalmaya eğilimli oldukları ve bunların yağ kalitesi üzerine asitlik artışı, tat ve koku bakımından büyük bir kusur olarak etkilediği ve zeytinlerde küf gelişmesinin etkisini azaltmak için depolama süresince zeytinlerin korumasına özen gösterilmesi gerektiği deneysel olarak bu çalışma sonuçlarında verilmiştir. Cavaliere ve ark. (2007) zeytinyağındaki aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 nin tespiti için sıvı kromatografi-ardışık kütle spektrometresi-elektrosprey iyonizasyon (LC/ESI-MS/MS) yöntemini geliştirmişlerdir. Örneklerdeki aflatoksin içeriği 0.04 and 0.12 ng g -1 arasında değişen değerler almıştır. Mahjoub ve Bullerman (1988) yapmış oldukları b ir çalışmada zeytinyağındaki AFB 1 in stabilitesi üzerine kızartma işlemi, sıcaklık, güneş ışığı ve depolama zamanının etkilerini incelemişlerdir. Araştırıcılar 13
depolama sonucunda mevcut AFB 1 in % 50 den daha çoğunun geri kazanıldığını, güneş ışığına maruz bırakma işleminin herhangi bir etkisinin görülmediğini, 250 C deki uygulamanın ise toplam AFB 1 in % 65 ini azalttığını belirlemişlerdir. Sızma zeytinyağı ham halde (rafine edilmeden) tüketilen bir üründür. Parker ve Melnick (1996) yaptıkları çalışmada rafinasyonun ham zeytinyağlarındaki aflatoksini kısmen uzaklaştırdığını ifade etmişlerdir. Bu çalışmada Türkiye de en fazla zeytin yetiştiriciliği yapılan il olan Aydın da üretilen zeytinyağlarından iki farklı hasat yılında 50 adet örnek toplanarak, zeytinyağların genel aflatoksin içeriğini tespit edilmiştir. Ülkemiz zeytinyağlarının aflatoksin içeriğine ilişkin hiçbir veri bulunmamaktadır. Bu çalışma varolan bilgi eksikliğini gidermede yapılacak diğer çalışmalar için zemin oluşturmayı hedeflemiştir. Bununla beraber bu çalışmaya ait sonuçlar insan sağlığına önemli etkileri olan zeytinyağının elde edilmesinde, dalından koparılıp, işlenip sofralarımıza gelene kadar geçen sürecin ne kadar hijyenik olduğu konusunda fikir vermektedir. Materyal ve Yöntem Materyal Çalışmada 2008/2009 ve 2009/2010 hasat yıllarında üretilmiş toplam 50 adet zeytinyağı örneği farklı zeytinyağı fabrikalarından temin edilmiştir. Çalışmada kullanılan zeytinyağı örneklerinin tümü 3 fazlı santrifüj yöntemiyle elde edilmiştir. Yöntem Yöntem yağ örneklerinden aflatoksin ekstraksiyonu ve elde edilen ekstrenin ters faz-yüksek performans sıvı kromatografide (RP-HPLC) analizi aşamalarından oluşmaktadır. Aflatoksinlerin ekstraksiyonu için 50 g yağ örneğine 100 ml metanol ilave edilmiş, karışım 2 dk yüksek hızda karıştırıldıktan sonra 15 dk boyunca 4000 rpm dönüş hızı ile santrifüj edilmiştir. Elde edilen üst faz filtre edildikten sonra 5 ml hacmindeki ekstre, 14 imminoaffiniti kolondan (R -Biopharm Rhone Ltd.) geçirilmiş, kolon ayrıca 50 ml PBS (Phosphate buffer saline), 1250 μl metanol, 1250 μl suyla yıkanmıştır. Süzüntü 0.45 μm çapındaki teflon filtreden geçirildikten sonra viallere alınarak Shimadzu marka HPLC de analiz edilmiştir. Bütün örnekler ikişerli paraleller halinde analiz edilmiştir. HPLC sistem özellikleri ve çalışma koşulları aşağıda verildiği gibidir: Sistem kontrolör: SCL-10A İzokratik pompa: LC-10AT Dedektör: Floresans dedektör RF-10AXL Kolon fırını: CTO-10AS Otoenjektör: SIL-10AD Kolon: Nucleosil Macherey Nagel (250x 4.6 mm I.D 5 μm) Akış hızı: 1.0 ml/dk Mobil faz: Su ( %53) + Metanol ( %47) + 0.12 g potasyum bromür + 100 μl nitrik asit Kolon sıcaklığı: 35 C Enjeksiyon hacmi: 20 μl Excitation: 362 nm Emission: 425 nm En küçük analiz limiti (limit of detection): 0.11 En küçük belirleme limiti (limit of quantification): 0.2 Aflatoxin B 1 ve G 1 in UV altında daha iyi floresan etki vermesi ve konsantrasyonunun belirlenmesi için elektrokimyasal olarak üretilen KBr (Kobra Cell, 100 µa) (R -Biopharm Rhone Ltd., Glasgow, UK.) kullanılarak aflatoksinler floresan dedektörler vasıtasıyla tespit edilmiş ve G 1, G 2, B 1 ve B 2 aflatoksinleri tanımlanmıştır. RP-HPLC (Shimadzu, Tokyo, Japan) cihazının kalibrasyonu, analiz edilecek aflatoksin türleri (B 1, B 2, G 1, G 2 ) için 7 noktalı olarak gerçekleştirilerek korelasyon katsayısı değeri her bir tür aflatoksin için hesaplanmıştır. Aflatoksin B 1 için korelasyon katsayısı (r 2 ) 0.999806, aflatoksin B 2 için 0.99995, aflatoksin G 1 için 0.999987, aflatoksin G 2 için 0.999922 dir.
Geri kazanım çalışması Bu metodun laboratuar validasyonunda, aflatoxin içermeyen zeytinyağı örnekleri toplam 8 µl kg -1 seviyede toplam aflatoksin ile kontamine edilerek, ortalama geri kazanım aynı prosedürün üç defa çalışılması ile gerçekleştirilmiştir (Çizelge 1). Çizelge1. Zeytinyağında geri kazanım çalışması Geri kazanım oranı 1 % Materyal 8 ng g -1 (toplam) Zeytinyağı 2 78.75±21.5 RSD 3 % 27.30 1 Değerler 3 analizin ortalaması şeklinde verilmiştir. 2 Aflatoksinlerin ortalama oranları (B 1 + B 2 + G 1 + G 2 ) 3 Rölatif standart deviasyonu Bulgular Bu çalışma temel olarak Aydın ilinde üretilen zeytinyağlarının aflatoksin içeriklerinin belirlenmesini, bunun yanında zeytinyağlarındaki aflatoksin miktarının tayini için de bir analitik yöntem geliştirilmesini amaçlamıştır. Geri kazanım çalışmalarında elde edilen % değerler B 1, B 2, G 1 ve G 2 için sırasıyla % 95, 80, 92 ve 48 olarak tespit edilmiştir. Analiz edilen 50 adet örneğin % 96 sında hiçbir aflatoksin bulaşısı tespit edilememiştir. Sadece iki örnekte aflatoksin B 1 varlığı saptanmıştır. Her iki örnekte de ortalama 0.10 ppb düzeyinde aflatoksin B 1 belirlenmiştir. Tespit edilen bu miktar Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerindeki Bulaşanların Maksimum Limitleri Hakkında Tebliğ de Bulunması muhtemel riskli gıdalar için belirlenen limitlerin altındadır. Yunanistan da üretilen 50 adet zeytinyağı ile yapılan bir çalışmada örneklerin % 72 nde AFB 1 varlığı tespit edilmiş ve değişim sınırları 2.8 5.7 ng kg -1 olarak belirlenmiştir (Daradimos ve ark., 2000). İtalya ve Kuzey Afrika zeytinyağları için yapılan bir çalışmada ise yağ örneklerinde 17.0 ng g -1 kadar okratoksin A ve 2.4 ng g -1 AFB 1 kadar varlığı saptanmıştır (Ferracane ve ark., 2007). Letutour ve ark. (1983) ise klasik ince tabaka kromatografi 15 yöntemi ile zeytinyağlarında aflatoksin B 1 (AFB 1 ) ve okratoksin A nın eş zamanlı olarak tespitini yapmışlar; bu yöntem ile en düşük miktar sınırını, okratoksin A için 40 μg kg -1 ; AFB 1 için ise 4 μg kg -1 olarak belirlemişlerdir. Cavaliere ve ark. (2007) zeytinyağındaki aflatoksin B 1, B 2, G 1, G 2 nin tespiti için sıvı kromatografi-ardışık kütle spektrometresielektrosprey iyonizasyon (LC/ESI-MS/MS) yöntemini geliştirmişlerdir. Örneklerdeki aflatoksin içeriği 0.04 and 0.12 ng g -1 arasında değişen değerler almıştır. Tartışma ve Sonuç Zeytinyağı, bileşiminde % 98 oranında bulunan trigliseritlerle birlikte, % 2 oranında fenolik maddeler, serbest yağ asitleri, steroller, hidrokarbonlar, alifatik ve triterpenik alkoller, uçucu bileşenler ve antioksidanları içerir (Kayahan ve Tekin, 2006 ). Zeytinyağının temel antioksidanları karotenler ile hidrofilik ve lipofilik fenolleri içeren fenolik maddelerdir ( Boskou, 1996). Bu çalışma kapsamında incelenen 50 örneğin % 96 sında aflatoksin tespit edilemeyişinin nedenleri üretici fabrikaların üretimden önce zeytinleri uzun süre depolamayıp mikroorganizma faaliyetini engellemeleri ve hijyenik koşullara çok dikkat etmeleri olabileceği gibi; diğer bitkisel rafine yağlarda bulunmayıp sadece natürel zeytinyağında bulunan fenolik maddelerin olası koruyucu etkisinin de olabileceği düşünülmektedir. Yapılan bilimsel çalışmalar zeytin ve zeytinyağında bulunan fenolik maddelerin antimikrobiyel ve antifungal aktiviteye sahip olduklarını (Tuck ve Hayball, 2002; Del Rio ve ark., 2003) ve aflatoksin üretimini engelleyici etkileri olduğunu ortaya koymuştur (Sinha ve Singh 1981; Paster ve ark., 1988). Gerçekleştirilen bu çalışma, Türkiye de üretilen zeytinyağlarının aflatoksin içeriğiyle ilgili bilgi veren bir başlangıç araştırmasıdır. Yapılacak ileri çalışmalarda farklı süreler bekletilen zeytinler araştırma kapsamında yağa işlenmeli, yağa işleme sırasında farklı mikotoksinlerin yağa ne kadar transfer olduğu, farklı fenolik yapısına sahip farklı çeşitlerde bu transferin nasıl gerçekleştiği ortaya konulmalıdır.
Kaynaklar Akiyama, H., Goda, Y., Tanaka, T., Toyoda, M. 2001. Determination of aflatoxins B1, B2 and G2 in spices using multifunctional column clean-up. Journal of Chromatography A, 932: 153-157. Anonim, 2002. Survey of nuts, nut products and dried tree fruits for mycotoxins. Joint Food Safety and Standard Group, Food Surveillance Information Sheet, No: 21/02. Anonim, 2009. Türk gıda kodeksi, gıda maddelerindeki bulaşanların maksimum limitleri hakkında tebliğ. 24885 Sayılı Resmi Gazete. Bircan, C. 2006. Determination of aflatoxins in olives by immunoaffinity column extraction using HPLC,J. Food Quality, 29: 126 138. Boskou, D. 1996. Olive oil chemistry and technology. AOCS Press, Champaign, IL, 161 p, USA. Castegnaro, M., Mcgregor, D. 1998. Carcinogenic risk assesment of mycotoxins. Rev. Vet. Med. 149: 671-678d. Cavaliere, C., Foglia, P., Guarino, C., Nazari, M., Roberto, S., Lagana, A. 2007. Determination of aflatoxins in olive oil by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal. Chim. Acta, 596: 141-148. Concon, J. M. 1988. Contaminants and additives. In Food Toxicology, Part B, Marcel-Dekker Inc. New York, 667-743. Daradimos, E., Marcaki, P., Koupparis, M. 2000. Evalution and validation of two flouremetric HPLC methods for the determination of aflatoxin B1 in olive oil. Food Additivies and Contaminants. 17 (1):65. Del Rio, A.J., Baidez, G.A., Botia, M.J., Ortuno, A. 2003. Enhancement of phenolic compounds in olive plants (Olea europaea L.) and their influence on resistance against Phyphthora sp. Food Chem. 83, 75 78. Dıraman, H. 2003. Zeytinyağlarında mikotoksin problem. Türkiye 1. zeytinyaği ve sofralik zeytin sempozyumu bildirileri, 211-215. Ferracane, R., Tafuri, A., Logieco, A., Galvano, F., Balzano, D., Ritieni, A. 2007. Simultaneous determination of aflatoxin B1 and ochratoxin A and their natural occurrence in Mediterranean virgin olive oil. Food Addit. Contam., 24 (2): 173-180. Gourama, N., Bullerman, L., B. 1995. Aspergillus flavus and Aspergillus paraciticus: Aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds: A review. Journal of Food Protection, 58: 1395-1404. Heperkan, D., Meriç, B.E., Şişmanoğlu, G., Dalkılıç, G., Güler, F.K. 2006. Mycobiota, mycotoxigenic fungi, and citrinin production in black olives. In Advances in Food Microbiology, AD Hocking, JI Pitt,RA Samson, U Thrane (eds), pp. 203-210, Springer, New York. Humeid, M.A., Abu Blan, H. A. 1987. Effect of molds invading olive fruits during storage on oil acidity and aflatoxin (B1) production. Dirasat ( Jordan ) 14 (11) 191. Kayahan, M., Tekin, A. 2006. Zeytinyağı üretim teknolojisi. TMMOB Gıda Mühendisleri Odası Kitaplar Serisi:15, Filiz Matbaacılık San. Tic. Ltd, 198 s, Ankara. Letutour, B., Tantouı-El Irakı, A., Hılal, L. 1983. Simultaneus detection lof aflatoxin B1 and ochratoxin A in olive oil. J. Of the American Oil Chemists Society. 60 (4) : 835. Mahjoub, A., Bullerman, L. B. 1988. Effects of storage time, sunlight, temperature, and frying on stability of aflatoxin B1 in olive oil. Lebensmittel Wissenscahft und Technologie. 21 (1) :29. Mahjoub, A., Bullerman, L.B. 1990. A method for aflatoxin B1 determination in olives. Revue Francaise de Corps Gras. 37, 245-246. Palmgreen, M.S., Hayes, A.W. 1987. Aflatoxin in food. In: Mycotoxin in Food. P. Krough(Ed).,Academic Press. Inc. pp: 65. Parker, W.A., Melnick, D. 1996. Absence of aflatoxins from refined vegetable oils. J. Am. Oil Chem. Soc., 43: 635-638. Paster, N., Juven, B.J., Harshemesh, H. 1988. Antimicrobial activity and inhibition of aflatoxin B1 formation by olive plant tissue constituents. J. Appl. Bacteriol. 64, 293 297. Pitter, A. 1998. Natural occurrence of mycotoxins in foods and feeds an updated review, Revue de Medicine Veterinaire, 149: 479-492. Rahmani, M. 2000. HACCP quality control in the production of virgin olive oil. Olivae (English Edition) 84 :50. Sinha, K.K., Singh, P. 1981. Effect of some phenolics on aflatoxin production and growth of Aspergillus parasiticus. Indian Phytopathology.34, 530 531. Tuck, L.K., Hayball, J.P. 2002. Major phenolic compounds in olive oil: Metabolism and health effects. J. Nutr. Biochem. 13, 636 644. 16
Van Egmond, H.P., Paulsch, W.E., Veringa, H.A., Schuller, P.L. 1977. The effect of processing on the aflatoxin M1 content of milk and milk products. Archieves of the Institute Pasteur (Tunis), 4: 381-390. Van Egmond, H.P. 1989. Aflatoxin M1: Occurrence toxicity regulation. In: Mycotoxins in Dairy Products, Van Egmond, H.P. (Ed.). Elsevier, London, pp: 11-55. Weidenbörner, M. 2001. Encyclopedia of food mycotoxins. Springer-Verlag Berlin, Hiedelberger, 294 s, Germany. 17