Toxoplasma gondii Real-TM El Kitabı

In Vıtro Tanısal Kullanım İçin Sadece Profesyonel Kullanım İçin Toxoplasma gondii Real-TM El Kitabı Toxoplasma gondii nin kalitatif tespiti için Real Time PCR REF P1-50FRT 50

İSİM Toxoplasma gondii Real TM KULLANIM AMACI Toxoplasma gondii Real-TM PCR kiti klinik materyallerdeki (periferik kan, kordon kanı, periferik veya göbek kordon kanı beyaz hücreleri, biyopsi ve otopsi materyal, beyin omurilik sıvısı ve amniyotik sıvı) real-time hibridizasyon-floresans temeline dayanarak Toxoplasma gondii DNA sının tespit edilmesini sağlayan in vitro nükleik asit amplifikasyon testidir. PCR analizinin sonuçları hastalığın kompleks tanısı beraberinde dikkate alınır. TESTİN PRENSİBİ Polimeraz zincir reaksiyonu ile(pcr) Toxoplasma gondii tespiti spesifik primerler kullanarak patojen genomunun spesifik bölgelerinin amplifikasyonuna dayanır. Real-time PCR da amplifiye ürünler floresans boyalar kullanılarak tespit edilir. Bu boyalar, amplifiye ürüne spesifik olarak bağlanan oligonükleotit problara bağlanır. Floresans şiddetin real-time PCR süresince gerçek zamanlı görüntülenmesi reaksiyon tüplerinin PCR çalışmasının ardından tekrar açılmasına gerek kalmadan biriken ürünleri tespit eder. Toxoplasma gondii Real-TM PCR kiti spesifik olmayan primer reaksiyonlarını başarılı bir şekilde azaltan hot-start kullanır. Hot-start nükleotitlerin ayrılması ve 95 C de 15 dakika ısıtılarak aktive olan kimyasal olarak modifiye edilmiş polimeraz (TaqF) ile garanti altına alınır. Klinik örneklerden Toxoplasma gondii DNA tespit edilmesi (a) Periferik ve göbek kordon kanı beyaz kan hücrelerinden toplam DNA izolasyonu, biyopsi ve otopsi materyali,, beyin omurilik sıvısı ve amniyotik sıvı eksojen İç Kontrol ile aynı anda. (b) Toxoplasma gondii, bir protein ve rekabetçi olmayan dışsal iç kontrol olarak kullanılan faj içine klonlanmıştır. Yapay bir DNA fragmanı kodlayan bir yapısal olmayan tekrar geni (uzun 529 bp) DNA fragmanının Multipleks RT-PCR. Toxoplasma gondii DNA amplifikasyonu JOE/Sarı/HEX/Cy3, rekabetçi olmayan dışsal Internal Kontrol amplifikasyonu FAM/Yeşil kanalında tespit edilir. Dışsal Internal Kontrol PCR analizinin (DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyonu) ana basamaklarının izlenmesine izin verir. Rekabetçi olmayan dışsal Internal kontrolün en temel avantajı doğrusal algılama aralığının uzatılması ve bunun yanında test analitik duyarlılığında artış sağlamasıdır.

VERİLEN MATERYALLER Reaktif Açıklama Hacim, ml Miktar PCR-mix-1-FRT T.gondii Renksiz duru sıvı 0.6 1 tüp PCR-mix-2-FRT Renksiz duru sıvı 0.3 1 tüp Polimeraz (TaqF) Renksiz duru sıvı 0.03 2 tüp Pos Kontrol DNA T. gondii /STI (С+) Renksiz duru sıvı 0.1 1 tüp DNA-tamponu Renksiz duru sıvı 0.5 1 tüp Negatif Kontrol (C-)* Renksiz duru sıvı 1.2 1 tüp Internal Kontrol STI-87 (IC)** Renksiz duru sıvı 1.0 1 tüp * izolasyon prosedüründe EkstraksiyonunNegatif Kontrolü olarak kullanılmalıdır. ** direk olarak örnek/lizis karışımına DNA saflaştırma prosedürü boyunca her örneğe 10 µl Internal Kontrol ekleyin. GEREKLİ AMA VERİLMEYEN MATERYALLER DNA ekstraksiyon kit. Tek kullanımlık tozsuz eldiven ve laboratuvar önlüğü. Pipetler (ayarlanabilir). Aerosol bariyerli steril pipet uçları ( up to 200 µl). Tüp rakları. Vortex karıştırıcı. 2 mllik reaksiyon tüpleri için masaüstü rotorlu santrifüj. PCR kutusu. Real Time PCR termocycler (örneğin, Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen), iq5 (BioRad), Mx3005P (Agilent)). PCR veya PCR-plaka için polipropilen mikrotüp. 2-8 C için buzdolabı. -16 C için derin dondurucu. Kullanılan pipet uçları için atık kutusu. ÜRÜN KULLANIM KISITLAMALARI Tüm Reaktif sadece in vitro tanısal olarak kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonu (EN375) teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile tam uyum en iyi PCR sonuçları için gereklidir. Tüm bileşenlerin kutuları üzerindeki etiketler üzerinde yazılı son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Kitleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. KALİTE KONTROL Sacace s ISO 13485-Certified Kalite Yönetim Sistemi uyarınca, her lot tutarlı ürün kalitesini sağlamak için önceden belirlenmiş özellikleri karşı test edilir.

UYARI VE ÖNLEMLER In Vitro Tasıl Tıbbi Cihaz Sadece In Vitro Tanısal kullanım 1. Numuneler e reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven ve göz koruması kullanın laboratuvar önlüğü giyin. Sonrasında ellerinizi güzelce yıkayın. 2. Ağızla pipetleme yapmayın. 3. Çalışma alannda yemek yemeyin, sıvı tüketmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak lenslerinizi çıkarıp-takmayın. 4. Son kullanma tarihinden sonra bir kiti kullanmayın. 5. Tüm örnekler ve kullanılmayan reaktifleri yerel düzenlemelere uygun olarak atın. 6. Biyogüvenlik Seviyesi 2, bulaşıcı maddeler içeren veya içerdiğinden şüphelenilen malzemeler için kullanılmalıdır. 7. % 0,5 'lik sodyum hipoklorit ya da diğer uygun bir dezenfektan kullanılarak bütün numune veya reaktiflerin tüm döküntülerini temizleyin ve dezenfekte edin. 8. Deri, göz ve mukozanın örnek ve reaktiflerle temasından kaçının. Eğer özelti temas ederse, su ile yıkayınız ve hemen bir doktora başvurun. 9. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine sağlanır. 10. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonunda eğitilmiş personel ile sınırlı olmalıdır. 11. PCR reaksiyonları kontaminasyona karşı hassastır. Iyi laboratuvar uygulamaları uyarınca laboratuvarda kontaminasyon riskini en aza indirmek için PCR sürecindaki uygulamaların fiziksel ayrımı gereklidir. 12. Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve ardından tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek, ekipman ve reaktif taşımayın. Kitin bazı bileşenleri koruyucu olarak Sodyum azid içerir. Reaktifin taşınması sırasında metal tubing kullanmayın. PCR analizi, nakliye ve depolama için biyolojik maddelerin örneklemesi üreticinin el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu el kitabının işin başlamadan önce okunması tavsiye edilir. DEPOLAMA TALİMATLARI Toxoplasma gondii Real-TM PCR kitinin bütün bileşenleri (Polimeraz taqf, PCR-mix- 2-FRT ve PCR-mix-1-FRT Toxoplasma gondii hariç) 2-8 C de saklanmalıdır. Toxoplasma gondii Real-TM PCR kitinin bütün bileşenleri etiketin üzerinde yazan son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Aksi belirtilmediği sürece, reaktiflerin ilk kullanımdan önce ve sonraki raf ömrü aynıdır. Polimeraz (TaqF), PCR-mix-2-FRT ve PCR-mix-1-FRT Toxoplasma gondii 16 C nin altında saklanmalıdırlar. PCR-mix-1-FRT Toxoplasma gondii ışıktan uzak tutulmalıdır. KARARLILIK Toxoplasma gondii Real-TM Test kit etiketinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Ürün, etiketin üzerinde belirtilen kontrol tarihine kadar işlemeye devam edecektir. Işık, ısı ve neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerini etkileyebilir. Bu durumdan kaçınılmalıdır. Reaktiflerin sürekli dondurulup-çözülmesinden kaçınılmalıdır. Bu durum reaktiflerin hassasiyetine zarar verebilir. Etiketinin üzerinde bulunan talimatlara uygun saklanmayan reaktiflerin performansı etkilenebilir ve bu durum test sonuçlarını ileri derecede etkileyebilir.

ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, SAKLANMASI VE TAŞINMASI Toxoplasma gondii Real-TM PCR kiti aşağıdakilerden ekstraksiyon kitleri ile elde edilen DNA ekstraktlarını analiz etmektedir: Periferik veya göbek kordon tam kanı Çevre ve göbek kordon kanı beyaz hücreleri Biyopsi ve otopsi materyali Beyin omurilik sıvısı Amniyotik sıvı Periferik veya göbek kordon tam kanı. Kan bir gece açlık sonrası %6 lık EDTA çözeltisi içeren tüplerde oran 20:1 olmak üzere toplanmalıdır ( 20 porsiyon kana 1 porsiyon EDTA). Uygun bir karıştırma sağlamak için tüp birkaç kez ters çevirin. Tam kan örneğini dondurmayın! Beyaz kan hücreleri. Antikoagülant içeren tüplerin prosedürüne uygun olarak 2.5-10 ml kan örneği alın (önerilen antikoagülan EDTA dır.) örnekleri ~1500-2000 X g de 10-15 dakika santrifüj edin. Bu kanı üst plazma katmanı orta kırmızı kan hücreleri katmanı ve buffy coat olarak da adlandırılan ince bir yüzey halinde beyaz kan hücreleri katmanı halinde ayıracaktır. Plazmayı bir pipet ile ayırın, bunu yaparken beyaz kan hücrelerini dağıtmamaya dikkat edin. Beyaz kan hücresi sayısı yüksek olan örneklerde buffy coat daha kalın olacaktır. Açığa çıkmış beyaz kan hücrelerinden 1.5 ml veya daha az almak için bir pipet kullanın. Görünen bütün buffy coal materyalini yavaşça aspire edin. Beyaz kan hücrelerinin altta yatan kırmızı kan hücreleri ile kontamine olması olasıdır. Elde edilen lökosit örneği tüpüne 300 µl Lizis çözeltisi ekleyin (DNA/RNA-Prep protokolü için). Biyopsi ve otopsi materyali hasarlı doku veya hasarlı doku ile bitişik alandan patojenin beklenen konumu elde edilmektedir. Örnek 0.3 ml transfer ortamı içeren 2 ml tüpe toplanır. Örneği porselen havana aktarın üzerine eşit miktarda saline veya PBS ekleyin. Numuneyi porselen bir havan tokmağı ile iyice homojenize edin. 100-µl porsiyon alın DNA ekstraksiyonu için tüpe transfer edin. Beyin omurilik sıvısı standart bir prosedüre göre ve steril bir Eppendorf tüp içinde toplanmalıdır. Amniyotik sıvı standart bir prosedüre göre amniyosentez sırasında ve bir steril bir Eppendorf tüp içine toplanmalıdır. Elde edilen örnek tekrar Iyice süspansiyon edilmeli ve yeni bir steril tüp için 1 ml aktarılmalıdır. Tüpü 8,000 9,000 g de 10 dk santrifüj edin. Pelet üzerine 200 ul sıvı bırakarak süpernatantı atın. Aerosol bariyerli pipet ucu kullanın. Pelletini tekrar süspande edin. DNA İZOLASYONU Aşağıdaki kitler önerilir:

DNA-Sorb-C (Sacace, REF K-1-6/50): biyopsi ve otobiyopsi materyalleri DNA/RNA-Prep (Sacace, REF K-2-9): tam kan, beyin omurilik sıvısı, amniyotik sıvı, akyuvarlar DNA ekstraksiyonunu üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştiriniz. DNA izolasyonu prosedürü sırasında direk olarak örneğe/lizis karışımına 10 µl İnternal Kontrol ekleyin. PROTOKOL (Reaksiyon Hacmi 25 µl): 1. (N) örnek ve kontrol (N+2) için gerekli sayıda reaksiyon tüpü hazırlayın. 2. Prepare in the new sterile tüp for each sample 10*N µl of PCR-mix-1, 5,0*N of PCR-Tamponu-FRT and 0,5*N of TaqF Polimeraz. Vorteksleyin ve 2-3 sn süresince santrifüj edin. 3. Uygun tüplere µl Reaction Mix ve 10 µl ekstrakte edilmiş DNA örnek ekleyin. Pipetleyerek karıştırın. (*Maksimum hızda 2 dakika ekstrakte DNA içeren tüpleri yeniden santrifüj edin (12000-16000 g) ve dikkatli bir şekilde süpernatantı alın. N.B. peletti rahatsız etmeyin, sorbent reaksiyonu inhibe eder!) 4. Her panel 2 Kontorl için hazırlık; Amplifikasyon Negatif Kontrol ile etiketlenmiş tüpe 10 µl DNA-tamponu ekleyin. (NCA); C+ ile etiketli tüpe 10 µl Toxoplasma gondii C+ ekleyin; Toxoplasma gondii, JOE (Sarı)/HEX/Cy3 kanal da, IC,FAM (Yeşil) kanalda tespit edilir. Amplifikasyon Üretici tarafından verilen manuele göre real-time cihazının programını kurun. Rotor tipi araçlar için amplifikasyon programı 1 Basamak Sıcaklık, Floresans Süre С tespiti Tekrarlar Bekle 95 15 dak 1 95 5 s Döngü 60 20 s 5 72 15 s 95 5 s Döngü2 60 20 s FAM/Yeşil JOE/Sarı 40 72 15 s

Rotor tipi araçlar için amplifikasyon programı 2 Basamaklar Sıcaklık Floresans Süre С tespiti Tekrarlar 1 95 С 15 dak 1 95 С 5 s 2 60 С 20 s 5 72 С 15 s 95 С 5 s 3 60 С 30 s FAM, HEX/Cy3/JOE 40 72 С 15 s 1 Örneğin Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen) 2 Örneğin, iq5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) CİHAZ AYARLARI Rotor-tipi cihaz (RotorGene 3000/6000, RotorGene Q) Diğer Ayarlar / Kanal Eşik Aykırı Doğru eğim Temizleme FAM/Yeşil 0.03 10 % On JOE/Sarı 0.03 10 % On Plate-tipi cihaz (iq5, Mx300P, ABI 7500/7300) Kanal Eşik Eşik çizgisinin olumlu örneklerin sinyal birikimi sadece sigmoid eğrilerin çapraz olması gerekir ve temel çapraz olmamalıdır, aksi FAM halde, eşik seviyesi yükseltilmelidir. Floresan eğrileri doğrusal ve Negatif örneklerin eğrileri çapraz olmayan bir seviyede eşiği ayarlayın. VERİ ANALİZİ Toxoplasma gondii DNA amplifikasyon ürünü JOE/Sarı/HEX kanalda, Internal Kontrol amplifikasyon ürünü FAM/Yeşil kanalda tespit edilir. Sonuçlar eşik çizgisi ile floresan eğrisinin geçişi (veya kapısı) tarafından PCR cihazı, yazılımı tarafından yorumlanır. Analiz sonuçları, Konntrol örnekleri sonuçları aşağıdakiler ile uyumlu ise geçerli sayılır:

Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol için alan Ct in channel FAM/Yeşil JOE/Sarı/HEX Yorumlama NCE DNA ekstraksiyon 35 Neg OK NCA Amplifikasyon Neg Neg OK C+ Amplifikasyon 35 33 OK 1. Ct değeri, FAM/Yeşil içinde ve JOE/Sarı/HEX kanalı bu kanallar için Ct sınır değerinden daha az ( 38) tespit edildiğinde örnek pozitif kabul edilir. Floresan eğrisi tipik sigmoid bir şekle sahip ve sadece bir kez önemli floresan artış bölgede eşik çizgisinde olmalıdır. 2. Floresans eğrisi eşik çizgisi ile karşılaşmıyorsa (Ct değeri eksiktir) ve tipik şekli yoksa örnek Negatif sayılır. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontroller yanı sıra Ekstraksiyonun Negatif Kontrol için elde edilen sonuçlara uygun olarak, analiz sonuçları güvenilir olarak kabul edilir. KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ Her örneğin ekstraksiyon prosesini kontrol etmek ve olası reaksiyon inhibasyonlarını belirlemek için örnek hazırlığının başında belirlenmiş miktar Internal Kontrol (IC) her örneğe ve kontrole katılır. Örnek hazırlığını, Amplifikasyonu ve tespit basamaklarının doğru şekilde işlendiğinin doğrulanması için ekstraksiyonun Negatif Kontrolü (NCE), Negatif Amplifikasyon Kontrol (NCA), pozitif Amplifikasyon Kontrol (C+) gereklidir. Kontroller beklenen aralığın dışında ise (Kontroller için sonuçlar tablosuna bkz), bu çalışmada kullanılan bütün örnekler ve kontroller örnek hazırlık aşamasından başlanarak tekrarlanmalıdır. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Hassasiyet Toxoplasma gondii Real-TM PCR kitin analitik özgünlüğü, 400 Toxoplasma gondii DNA kopya/ml. Toxoplasma gondii Real-TM PCR kitinin talep edilen analitik özellikleri sadece ek Reaktif kit (DNA/RNA-prep or DNA-sorb-C)kullanıldığında garanti altındadır. Özgünlük Toxoplasma gondii Real-TM PCR kitin analitik özgünlüğü spesifik primerler ve problar olarak ve katı reaksiyon koşullarının seçimi ile sağlanır. Primer ve problar dizi karşılaştırma analizi ile gen bankalarında yayınlanan tüm dizilere mümkün benzerlikleri için kontrol edildi. Toxoplasma gondii Real-TM PCR kitin klinik özgünlüğü laboratuvar klinik testleri ile onaylanmıştır. Hedef bölge: 529bp ardarda tekrar

PROBLEMLERİN GİDERİLMESİ 1. IC (Fam/Yeşil) nin zayıf sinyali veya sinyali olmaması: örneğin yeniden test edilmesi gerekir. PCR inhibe edilmiştir. Önerilen bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarına uygun olduğundan emin olun. Ekstrakte DNA yı pipetlemeden önce bütün tüpleri maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca yeniden santrifüj edin ve supernatantı dikkatle alın. Pelleti dağıtmayın, sorbent reaksiyonu inhibe eder! Reaktiflerin saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Depolama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR koşulları kontrol edin ve IC tespiti için protokolde bildirilen floresan kanalı seçin. Yanlış DNA ekstraksiyonu. DNA ekstraksiyon aşamasından başlayarak tekrar analiz edin. Reaktiflerin pipetlenmesi sırasında örneğe IC eklenmemiştir. DNA ekstraksiyon işlemi sırasında dikkat edin. 3. Joe (Sarı)/Cy3/HEX kanalında zayıf sinyal (Ct > 38) : sonuç belirsiz olarak kabul edilir. Analizi iki kez tekrarlamak gerekir. Pozitif Ct değeri iki kez tespit edilirse, örnek pozitif olarak kabul edilir. 3. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü ile Joe (Sarı)/Cy3/HEX sinyali. DNA ekstraksiyon işlemi sırasında kirlenme. Tüm numuneler sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile tüm yüzeyleri ve aletleri dezenfekte edin. Ekstraksiyon prosedürü boyunca sadece filtreli pipet ucu kullanın. Tüpler arası pipet uçlarını değiştirin. DNA ekstraksiyonunu yeni bir set reaktif ile tekrarlayın. 4. Negatif PCR Kontrol ün herhangi bir sinyal vermesi. PCR prosedürü sırasında kirlenme. Tüm numuneler sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile tüm yüzeyleri ve aletleri dezenfekte edin. Positive Kontrolleri sonda pipetleyin. PCR hazırlığını yeni bir set reaktif ile tekrarlayın.

REFERANSLAR Detection of Toxoplasma gondii by PCR and tissue culture in cerebrospinal fluid and blood of human immunodeficiency virus-seropositive patients. Dupon, M. et al. J Clin Microbiol 1995: 33:2421-2426. Diagnosis of Toxoplasma parasitemia in patients with AIDS by gene detection after Amplifikasyon with Polimeraz chain reaction. Filice, GA. et al. J Clin Microbiol 1993; 31:2327-2331. PCR detection of Toxoplasma gondii DNA in CSF for the differential diagnosis of AIDS-related focal brain lesions. Antonella Cingolani, Andrea De Luca, Adriana Ammassari, Rita Murri, Angela Linzalone, Rita Grillo* and Andrea Antinori. J Med Microbiol December 1996 vol. 45 no. 6 472-476 Real-Time PCR for Quantitative Detection of Toxoplasma gondii. Mei-Hui Lin,1 Tse-Ching Chen,2 Tseng-tong Kuo,2 Ching-Chung Tseng,3 and Ching-Ping Tseng1, Journal of Clinical Microbiology, November 2000, p. 4121-4125, Vol.38, No.11 Detection of Toxoplasma gondii in cerebrospinal fluid from AIDS patients by Polimeraz chain reaction. S F Parmley, F D Goebel and J S Remington J Clin Microbiol. 1992 November; 30(11): 3000-3002 The detection of Toxoplasma gondii by comparing cytology, histopathology, bioassay in mice, and the Polimeraz chain reaction (PCR) Aristeu Vieira da Silva, Helio Langoni. Veterinary Parasitology, Hacim 97, Issue 3, 12 June 2001, Pages193-200 Detection by PCR of Toxoplasma gondii in blood in the diagnosis of cerebral toxoplasmosis in patients with AIDS.J Lamoril, J M Molina, A de Gouvello, Y J Garin, J C Deybach, J Modaï, F Derouin J Clin Pathol 1996;49:89-92 doi:10.1136/jcp.49.1.8

İŞARET LİSTESİ Liste Numarası DİKKAT! Lot Numarası <n> test için yeterli içerik In Vıtro Tanısal Kullanım için Sürüm Saklama sıcaklığı NCA Negatif Kontrol (Amp) Üretici C Negatif Kontrol (Ekst) Kullanım için talimatlara danışın. C+ Positive Kontrol (Amp) Son kullanma tarihi IC Internal Kontrol NOT *iq5, Bio-Rad Laboratories in ticari markasıdır. * Rotor-Gene Technology is a registered trademark of Qiagen * MX3005P is a registered trademark of Agilent Technologies *ABI is a registered trademark of Applied Biosystems * LineGeneK is a registered trademark of Bioer * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, 44 22100 Como Italy Tel +390314892927 Fax +390314892926 mail: info@sacace.com web: www.sacace.com