BİYOBENZER ÜRÜNLERDE KALİTE KONTROLÜ Biyofarmasötikler ve Biyobenzerler 7 Mayıs 2012, Ege Palas, İzmir Doç. Dr. Ercüment Karasulu Ege Üniversitesi İlaç Geliştirme ve Farmakokinetik Araştırma- Uygulama Merkezi (ARGEFAR)
İRDELEME
İRDELEME Bu ürünlerin üretimi ülkemizde yapılamamaktadır, ihtiyaç ithalat ile karşılanmaktadır. Türkiye de 2011 yılında 10 milyar dolarlık ilaç harcamasının yaklaşık %5 bu ilaçlara ayrılmıştır. Ancak bu ilaçlar kutu bazında ancak 1.7 milyar kutuda 9 milyon kutu yani %0.5 ine karşılık gelmektedir.
İRDELEME İnsülin için Türkiye de harcanan kutu 2010 yılında 6.5 milyon kutu,195 milyon dolar 2011 yılında 7.5 milyon kutu, 180 milyon dolar olmuştur.
İRDELEME Kanser tedavisinde kullanılan mabslar ( trastuzumab vb.) ve trosinkinaz inhibitörleri için, Türkiye 2011 yılında 240 milyon dolar para harcamıştır. Bunun sadece 67.2 milyon doları Trastuzumab için harcanmıştır.
Biyobenzer Bir Ürün Geliştirmesi Bu konuda devlet politikası ve desteğinin olması şarttır. Destek verilmediği durumda Türkiye yeni gelecek biyoteknoloji ürünlerinin maliyetini belki de karşılayamayacak, Belkide SGK bütçesi bu ilaçlara kaynak ayıramayacaktır.
Biyobenzer Bir Ürünün Geliştirme Yaklaşımı Hücre Bankası Karakterizasyonu Fiziko Kimyasal Karakterizasyon Preklinik ve Toksikolojik Değerlendirme Klinik Değerlendirme
Referans Bir Ürünle Kıyaslamada Biyofarmasötikler Yapının Konfirmasyonu Biyobenzerler Yapının Tanımlanması
Yapısal Karakterizasyon ve Doğrulama Analizleri Aminoasit Analizleri Peptid Karakterizasyonu Haritası Sülfidril Grupları ve Disülfid Köprüleri Karbonhidrat Yapıları (Glikan Tayini)
1.793 3.786 5.276 5.455 5.684 5.851 6.038 6.303 6.940 7.167 7.498 7.699 8.704 8.887 11.257 11.494 11.662 11.887 12.006 12.092 12.441 8.236 10.027 13.119 13.300 13.493 14.125 14.586 16.650 0.806 17.060 - SAR 17.654 - PRO 14.959 - HYP 1.077 3.314 6.936 - GLN 1.792 - ASP 3.790 - GLU 7.166 - HIS 12.437 - NVA 6.038 - ASN 6.304 - SER 7.503 - GLY 7.699 - THR 8.239 - ARG 8.889 - ALA 10.027 - TYR 11.494 - CY2 11.887 - VAL 12.092 - MET 12.895 - TRP 13.300 - PHE 13.493 - ILE 14.125 - LEU 14.586 - LYS 1-Aminoasit Analizleri Amaç referans ürün ile test ürünün aminoasit yapıları, dizilişleri ve N-terminal / C-terminal yapılarının belirlenmesi ve karşılaştırılmasıdır. Yapının aydınlatılması ve ayni zamanda parçalanmasının izlenmesinde kullanılır. mau DAD1 A, Sig=338,10 Ref=390,20 (AMINO3\AA6-0003.D) 40 30 20 10 0 mau 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 DAD1 B, Sig=262,16 Ref=324,8 (AMINO3\AA6-0003.D) min 40 30 20 12.745 12.895 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min HPLC UV / FLD, LC MS/MS
2- Peptide Karakterizasyonu/Haritası Çok sayıda aminoasitin birleşmesinden oluşan peptidlerin yapılarının tayini protein karakterizasyonunda son derece önemlidir. Burada proteinleri oluşturan peptid zincirlerinin belirlenerek referans ve test ürüne ait peptid haritalarının çıkarılması ve karşılaştırılmasıdır. Araştırma/Geliştirme ve üretim süreçlerinde izlenir.
Peptid Kütle Doğruluğu Sequence Name Label Mass Target Sequence Mass Match Difference (ppm) light chain A(1-19) 1996.088 1996.0841 1.98 light chain A(26-47) 2438.1986 2438.1979 0.31 light chain A(48-56) 992.5656 992.5655 0.15 light chain A(64-93) 3388.5238 3388.5194 1.31 light chain A(94-107) 1538.7191 1538.7154 2.43 light chain A(112-130) 2101.1245 2101.1208 1.76 light chain A(113-130) 1945.0199 1945.0197 0.09 light chain A(131-146) 1796.8922 1796.888 2.38 light chain A(150-173) 2676.2669 2676.2627 1.55 light chain A(150-187) 4160.01 4160.0033 1.61 light chain A(154-173) 2134.9657 2134.9615 1.99 light chain A(193-211) 2140.0778 2140.0735 1.99 light chain A(195-211) 1874.9254 1874.9197 3.06 Target Sequence Match Difference Sequence Name Label Mass Mass (ppm) heavy chain A(1-19) 1880.0511 1880.048 1.65 heavy chain A(20-38) 2126.9587 2126.9554 1.56 heavy chain A(39-67) 2927.4492 2927.4414 2.68 heavy chain A(39-65) 2714.3216 2714.3188 1.05 heavy chain A(44-65) 2233.0584 2233.0539 2 heavy chain A(44-67) 2446.1802 2446.1765 1.51 heavy chain A(66-72) 835.4663 835.4664-0.11 heavy chain A(68-72) 622.3431 622.3439-1.28 heavy chain A(73-87) 1768.8812 1768.8778 1.93 heavy chain A(77-87) 1324.6816 1324.6809 0.51 heavy chain A(88-98) 1317.5937 1317.5911 2 heavy chain A(99-105) 714.4018 714.4024-0.94 heavy chain A(106-129) 2531.2534 2531.2479 2.2 heavy chain A(107-129) 2375.1509 2375.1468 1.74 heavy chain A(130-141) 1185.6426 1185.6394 2.72 heavy chain A(142-155) 1320.6705 1320.6708-0.21 heavy chain A(156-218) 6712.309 6712.3072 0.27 heavy chain A(156-221) 7054.4995 7054.4975 0.28 heavy chain A(156-222) 7182.5962 7182.5925 0.52 heavy chain A(227-256) 3333.643 3333.6349 2.45 heavy chain A(231-256) 2843.4544 2843.4503 1.45 heavy chain A(257-263) 834.4274 834.4269 0.55 heavy chain A(264-282) 2138.0249 2138.0202 2.22 heavy chain A(283-296) 1676.7985 1676.7947 2.25 heavy chain A(297-309) 3115.3418 3115.3315 2.13 heavy chain A(310-325) 1807.0038 1806.9992 2.51 heavy chain A(310-328) 2227.2034 2227.2001 1.5 heavy chain A(335-342) 837.496 837.496 0 heavy chain A(347-368) 2509.3347 2509.3289 2.32 heavy chain A(349-368) 2310.1993 2310.1968 1.08 heavy chain A(353-363) 1285.6677 1285.6667 0.79 heavy chain A(353-368) 1871.9648 1871.9629 1.03 heavy chain A(369-378) 1160.6228 1160.6223 0.4 heavy chain A(379-400) 2543.1289 2543.1241 1.9 heavy chain A(401-417) 1872.9184 1872.9146 2.06 heavy chain A(423-447) 3043.3964 3043.393 1.12 heavy chain A(425-447) 2800.2679 2800.2598 2.89 heavy chain A(448-454) 659.3488 659.349-0.35
3- Sülfidril Grupları ve Disülfid Köprüleri Disülfid köprüleri bir proteinin çeşitli peptid zincirlerini birbirine bağlayarak, proteinin üç boyutlu yapısının doğruluğuna ve stabilitesine önemli katkıda bulunur. Buradaki amaç referans ve test üründe yer alan serbest sülfidril gruplarının ve disülfid köprülerinin tayini ve bunların karşılaştırılmasıdır.
4- Karbonhidrat Yapıları (Glikan Tayini) Glikoproteinler polipeptid iskeletlerine kovalent olarak bağlı oligosakkarit (glikan) zincirlerini içeren proteinlerdir. Glikan zincirleri glikoproteinlerin karakterizasyonunda önemli bir yer tutmaktadır. Buradaki amaç referans ve test ürünün glikan içeriklerinin (nötral şekerler, aminoşekerler ve sialik asit ile bunların oluşturduğu oligosakkarit zincirler) tespit edilip karşılaştırılmasıdır. Ürünün stabilitesinin izlenmesini sağlar. Belli glikan yapılarının ilaç etkililiğini düşürdüğü ve agregasyona neden olduğu bilinmektedir.
Fizikokimyasal Özellikler Molekül Ağırlığı / Boyutu Tayini İzoform Deseni Elektirik Yük Değişimi Molar Soğurum Katsayısı
1- Molekül Ağırlığı / Boyutu Tayini Molekül ağırlığı (ve ya boyutu), küçük organik bileşiklerden glikoproteinlere kadar tüm sınıflar için kimlik tanılamasında kilit rol oynayan bir özelliktir. Buradaki amaç referans ve test ürünün molekül ağırlıklarının belirlenerek karşılaştırılmasıdır. Calculated mass (A) = 148812.81 Measured mass (A) = 148811.95 Mass Accuracy = 5.7 ppm MALDI/ Q TOF, Size Exclusion Chromatography
2- İzoform Deseni Proteinlerin, amino asit bakımından çok az farklı olan, aynı ya da farklı genler tarafından kodlanan, genel aktiviteleri aynı olan çeşitli formları izoform olarak adlandırılır. Buradaki amaç referans ve test ürünün amino asit açısından (izoform desenleri) karşılaştırılmasıdır. IEF - Isoelectric Focusing (Elektroforez yöntemi)
3- Yük Değişimi Ürün gelişimi sürecinin konfirmasyonunda kritik bir süreçtir. Potensiyel parçalanma ürünlerinin aydınlatılmasında geliştirme ve üretim sürecinde izlenmelidir. IEF - Isoelectric Focusing (Elektroforez yöntemi),iexc,lc-uv
Elde Edilen Yük Profili Kıyaslaması Farklı Safsızlıkların İzolasyonu LC/MS esaslı karakterizasyon Benzer
4-Molar Soğurum Katsayısı Proteinlerin yapılarına bağlı olarak UV absorbansları farklı olacaktır. Bu bakımdan molar soğurum katsayısı protein karakterizasyonunda yardımcı bir ögedir. Buradaki amaç referans ve test ürünleri UV absorpsiyon katsayıları bakımından karşılaştırmak olacaktır. UV/VIS NIR
Safsızlıklar Truncated Düzeni Diğer Modifiye Formlar Agregatlar
1- Truncated Düzeni Hidrolitik enzimler ve ya kimyasallar peptid bağlarının ayrılmasını katalizleyebilir. Bu şekilde oluşan formlar, uygun bir yöntem ile tespit edilip referans ve test ürün bu formlar açısından karşılaştırılır. HPLC, SDS Page Elektroforez
2- Diğer Modifiye Formlar Diğer modifiye formlar: Amid bağı çıkarılmış, isomerize, uygun düzende olmayan S-S bağı, oksitlenmiş veya değiştirilmiş konjuge yapılar (yani, glycosylation, phosphorylation) saptanabilir. Kromatografik, elektroforetik ve/veya diğer ilgili analitik yöntemlerle karakterize edilebilir.
3- Agregatlar Uygun bir yöntem ile protein agregatlarının (biraraya gelmesi) tespit edilmesi ve referans ve test ürününün agregatlar açısından karşılaştırılması amaçlanmaktadır. Biyolojik agregasyon ilaç etkililiğinin düşmesine ve hastalarda immun cevabın oluşmasına sebep olur. Üretim, formülasyon ve stabilite testleri boyunca serbest ilacın agregasyon oranı düşük oranlarda aynı kalmalıdır.
Diğer Kalite Kontrol Analizleri Sekonder ve Tersiyer Yapı Tayini Isıl Stabilitelerin Onaylanması
1- Sekonder ve Tersiyer Yapı Tayini Proteinlerin sekonder ve tersiyer yapılarının tespit edilmesi karakterizasyonda önemli faktörlerden bir diğeridir. Amaç test ve referans ürünün sekonder ve tersiyer yapılarının tayinlerinin yapılmasıdır ve karşılaştırılmasıdır. 26
2- Isıl Stabilitelerin Onaylanması Proteinlerin ısıl stabiliteleri de karakterizasyonda yardımcı bir diğer öğedir. Burada amaç test ve referans ürünün ısıl stablitelerinin tayin edilmesi ve bu açıdan karşılaştırılmalarıdır. Diferantial Scaning Colorimetry (DSC)
TEŞEKKÜRLER..