T.C TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI TIBBİ ONKOLOJİ BİLİM DALI Tez Yöneticisi Doç. Dr. Hakan KARAGÖL SİSPLATİNE BAĞLI BÖBREK DOKUSUNDA MEYDANA GELEN HASARI ÖNLEMEDE KARNİTİNİN ETKİNLİĞİNİN STANDART SİTOPROTEKTİF AJAN OLDUĞU BİLİNEN AMİFOSTİNİN ETKİNLİĞİ İLE KARŞILAŞTIRILMASI (Yan Dal Uzmanlık Tezi) Dr. Sernaz UZUNOĞLU EDİRNE 2009 1
TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim süresince engin tecrübe ve mesleki bilgi birikiminden yararlandığım Bilim Dalı başkanımız ve tez danışmanım Doç. Dr. Hakan Karagöl'e öncelikle teşekkür ederim. Aynı zamanda uzmanlık eğitimime katkı sağlayan tüm İç Hastalıkları ABD öğretim üyelerine; eğitimimdeki katkılarından dolayı Doç. Dr. Kazım Uygun'a, Uzman Dr. İrfan Çiçin e; çalışmaktan büyük zevk aldığım tüm çalışma arkadaşlarıma, tezimin hazırlanması aşamasında yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Ruşen Coşar Alas ve Yrd. Doç. Dr. Vuslat Yürüt Çaloğlu na teşekkür ederim. Ayrıca her zaman katkı ve desteklerini gördüğüm İÜ Onkoloji Enstitüsü öğretim üyelerine de teşekkür ederim. 2
İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER... 3 BÖBREĞİN FİZYOLOJİK ANATOMİSİ... 3 SİSPLATİN... 4 SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR... 7 AMİFOSTİN... 8 KARNİTİN... 11 GEREÇ VE YÖNTEMLER... 14 BULGULAR... 18 TARTIŞMA... 32 SONUÇLAR... 38 ÖZET... 40 SUMMARY... 42 KAYNAKLAR... 44 EKLER 3
SİMGE VE KISALTMALAR ALP AMF CDDP DNA İP İV KAR KT RT SC SF SR : Alkaline Phosphatase (Alkalen Fosfataz) : Amifostin : Cis-dichlorodiamneplatinum (Sisplatin) : Deoxyribonucleic acid : İntraperitoneal : İntravenöz : Karnitin : Kemoterapi : Radyoterapi : Subcutaneous (Subkutan) : Serum Fizyolojik : Serbest Radikal 4
GİRİŞ VE AMAÇ Kanser, normal hücrelerin kontrolsüz şekilde çoğalması, invaziv nitelik kazanarak uzak organlara yayılması ile ilerleyen ve sonuçta ölüme neden olan bir hastalıktır (1). Kemoterapinin (KT), özellikle 1950 li yıllardan sonra ivme kazanan gelişimi, başta hematolojik malignitelerde olmak üzere bazı ileri evre solid tümörlü hastalarda küratif tedavi yapılabilmesine olanak sağlamıştır. Kemoterapi ile tümör hücreleri tamamen yok edilir veya büyüme ve çoğalmaları önlenir. Ancak, normal hücre ile tümör hücresi arasında KT ajanının etki yeri açısından yapısal belirgin bir fark olmaması, tümör hücreleri kadar normal hücrelerin de KT ile hasarlanmasına ve sonuç olarak ciddi toksisite ile karşılaşılmasına neden olur (2). Kemoterapi ajanlarının kullanımı ile ilgili diğer bir konu bu ilaçlar ile doz arttıkça artan etkinliğin beraberinde toksisiteyi de arttırmasıdır. Bu durum sonuçta, yüksek dozlarda toksisite, düşük dozlarda ise yetersiz tedavi ikilemi yaşatmaktadır. Bu nedenle normal dokularda KT ile oluşan toksisitesini azaltmaya yönelik sitoprotektif farmakolojik ajanların geliştirilmesi önemlidir. Sitoprotektif ajanların kullanımı ile KT dozlarının yükseltilmesi ve böylece etkinliğin artması sağlanabileceği gibi, hastaların tedavi toleransları arttırılarak yaşam kaliteleri de iyileştirilebilecektir. Ayrıca, sitoprotektif ajanların kullanımı ile komplikasyonlar nedeniyle artan tedavi maliyetlerinde de önemli düzelme sağlanabilecektir (3). Sisplatin pek çok malign hastalığın tedavisinde kullanılan etkili bir KT ajanıdır (4). Bu ilacın renal toksisitesi en önemli doz kısıtlayıcı yan etkisidir. Renal toksisite primer olarak proksimal tübül hasarlanması ile oluşmaktadır. Sisplatinin proksimal tübül hücrelerine selektif hasarının hangi mekanizma ile gerçekleştirdiği tam olarak açıklanamamaktadır (5). Ancak, çeşitli mekanizmalar ileri sürülmüştür. Bunlar arasında oksidatif stres üzerinde en çok 1
çalışılan ve durulan mekanizmadır (6). Sisplatinin standart kullanımında diürez veya uzun süreli infüzyon ile toksisite minimuma indirilmeye çalışılır. Toksisite tam olarak önlenemeyecek ise doz azaltılır veya ilaç kesilir. Bu önemli ilaç ile tedaviye devam edilebilmesi amacıyla birlikte renal toksisiteyi önleyici ajanların kullanılması son zamanlarda önem kazanmıştır. Amifostin (AMF) dokudaki alkalen fosfotaz enzimi (ALP) tarafından fosforile edilerek aktif metaboliti olan serbest tiyole dönüşen öncül bir ilaçtır. Serbest tiyol, oksijen serbest radikallerini bağlayarak etki eder. Seçici olarak normal hücreleri KT nin ve radyoterapinin (RT) öldürücü etkilerinden koruduğu ve doz sınırlayıcı toksik etkileri azaltarak bazı kanser türlerinde tedaviyi daha etkin kıldığı yapılan bazı preklinik çalışmalarda belirlenmiştir (7-10). Karnitin (KAR), öncelikle mitokondride bulunan, mitokondrial toksik ajanlara karşı güçlü protektif etkilere sahip olduğu düşünülen bir maddedir. Endojen olarak böbrek, kalp, kas ve karaciğerde sentezlenebilen, ayrıca eksojen olarak da diyetle alınabilen suda eriyen küçük bir moleküldür (11). Karnitinin ortamdaki serbest radikalleri uzaklaştırıcı etkisi vardır. Sisplatine bağlı renal ve ince barsak toksisitesi, gentamisine bağlı nefrotoksisite ve kronik renal yetmezlik gibi çeşitli modeller üzerinde karnitinin böbrek dokusu üzerindeki koruyucu etkisi gösterilmiştir (12-14). Bizim bu çalışmamızda, amifostin ile karnitinin sisplatine bağlı böbrek hasarlanmasını önleme açısından etkinlikleri karşılaştırılmıştır. 2
GENEL BİLGİLER BÖBREĞİN FİZYOLOJİK ANATOMİSİ Böbrekler retroperitoneal bölgede bulunan her biri yaklaşık 120-150 gr ağırlığında olan organlardır. Böbreğin makroskopik incelemesinde en dışta fibröz bir kapsül, kapsülün altında korteks ve en içte medulla bulunur. Kortekste, glomerüller, proksimal ve distal tubuluslar ve dış korteksteki nefronların henle kulpları bulunur. Medullada ise, toplayıcı kanallar, henle kulpları ve vasa rektalar bulunur. Medullada bulunan toplayıcı kanallar sırasıyla küçük kaliks, büyük kaliks ve pelvise açılır. Nefronun tubuler bölümü henle kulpuyla birbirine bağlanan proksimal ve distal tubulden oluşmaktadır. Toplayıcı kanallar tubuler sistemi izleyerek sonunda renal papillaların uçlarından renal kaliksler aracılığı ile renal pelvise açılırlar (15). Glomerül birbirine paralellik gösteren, birbiriyle anastomozları olan ve epitelyal hücrelerle kaplı kapillerlerden oluşan bir yumaktır. Bowman kapsülü adı verilen bir yapı içinde yer alır. Glomerüldeki kan basıncı bowman kapsülü içine sıvının süzülmesini sağlar ve bu sıvı, böbreğin kortikal kısmında yer alan proksimal tubul içine, oradan sonra ise böbreğin medüller kusmında bulunan henle kulpuna doğru ilerler. Henle kulpundan sonra sıvı distal tubule girer. Korteks düzeyinde sekiz kadar distal tubul birleşerek toplayıcı tubulü oluşturur. Toplayıcı tubuller, tubuler sistemi izleyerek sonunda renal papillaların uçlarından renal kaliksler aracılığıyla renal pelvise açılırlar (15). Böbreğin tüm tubuler sistemi çevresinde peritubuler kapiller ağ vardır. Bu kapiller sisteme kan, efferent arteriolden yani glomerülden geçmiş kandan gelir. Peritubuler kapiller ağın önemli bir bölümü kortekste olakla birlikte vasa rekta adı verilen uzantılar ile henle kulpunun derindeki kısımlarına da eşlik ederler (16). 3
Glomerül filtrat tubullerden geçerken su içeriğinin %99 u ve solüt içeriğinin değişen miktarı vasküler sisteme emilir. Az sayı ve miktardaki bazı maddeler de tubuller içine sekrete edilir. Bu işlemler sonunda tubuler içinde kalan su ve solütler idrarı oluşturur (15). SİSPLATİN Yapı ve Etki Mekanizmaları Sisplatin (cis-dimminedichloroplatinum II, CDDP) inorganik divalent, suda çözünebilen platinum içeren bir kompleksdir. İki değerlikli bir merkez atomuna bağlı iki amonyum ve iki klor bağı içerir (Şekil 1). Şekil 1. Sisplatinin kimyasal yapısı (4) Bileşik cis ve trans olmak üzere iki izomere sahiptir. Sadece cis formu sitotoksik özelliğe sahiptir. Sisplatin hücrelere difüzyon yolu ile girer. Klorid atomları, thioller gibi nükleofillerle reaksiyona girerek çok kısa zamanda yer değiştirebilir. Kloridin su aracılığı ile yer değiştirmesi sonucu pozitif olarak yüklenen molekül oluşur. Muhtemelen bu da ilacın nükleik asit ve proteinlerle reaksiyona giren aktif şeklinin oluşmasından sorumludur (17). Sisplatin, deoksiribonükleik asit (DNA) ile etkileşerek, zincir içi ile zincirler arasında ve en fazla da aynı DNA zincirindeki komşu guaninler arasında çapraz bağ oluşturur. Bu bağlar, DNA nın transkripsiyon ve replikasyonunu inhibe eder. Bu da kopma ve yanlış kopyaya neden olur. Ortaya çıkan DNA hasarı apopitozisi başlatır. Sisplatin ayrıca, hücre mitokondirisine zarar verir, ATPaz aktivitesini inhibe eder, hücreyi G2 fazında hapseder ve hücresel transport sistemini inhibe eder. Preklinik çalışmalar; platinum-adenosin-guanosin çarpraz bağ oluşumunun sitotoksisite açısından en önemli bağ olduğunu göstermektedir (18). Sisplatin mide bağırsak kanalından absorbe olmadığından sadece intravenöz (İV) veya intraperitoneal (İP) yolla uygulanır. İlacın %90 dan fazlası plazma proteinlerine bağlanır. 4
Böbrek, karaciğer, barsak ve testis gibi organlara yüksek oranda geçmesine karşın kan beyin bariyerinden geçişi çok azdır. İlk 6 saatte ilacın çok az bir kısmı böbreklerden atılır. 24 saate kadar %25 i elimine olur ve 5 güne kadar alınan dozun %43 kadarı idrarda saptanabilir. İlaç, hızlı enjeksiyon yerine infüzyon şeklinde verilirse, plazma yarılanma ömrü daha kısa ve elimine edilen ilaç miktarı daha çok olur. Biliyer ve intestinal atılımı çok azdır (17). Nefrotoksisitesi Sisplatinin toksik etkileri; nefrotoksisite, ototoksisite, nörotoksisite ve kemik iliği depresyonudur. Ancak, belli başlı doz kısıtlayıcı yan etkisi nefrotoksisitedir. Rutin hidrasyon ve mannitol kullanımına rağmen hala böbrek yetmezliği insidansı anlamlı derecede yüksek bulunmaktadır. Hastaneye yatırılan akut böbrek yetmezlikli hastaların %20 sinde sebep sisplatindir. Yoğun proflaktik önlemlere rağmen geri dönüşümsüz böbrek hasarı sisplatin ile tedavi edilen hastaların üçte birinde ortaya çıkmaktadır (19). Sisplatin toksisitesi kümülatif ve doza bağımlıdır. Ancak, 40-100mg\m² lik tek doz sonrası hastaların çoğunda üre ve serum kreatininde anlamlı ve geçici bir artış gözlemlenmektedir. Nefrotoksisite ile fonksiyonel olarak renal perfüzyon azalmakta, konsantrasyon defektleri ve nitrik oksit düzeyinde azalmayı içeren renal hemodinamide değişiklikler gelişmektedir. Morfolojik olarak özellikle proksimal tubullerin S3 bölümünde ve distal nefron hücrelerinde nekroz ve apoptozis ile proksimal, distal ve henle kulpu hücrelerinde büyük ölçüde harabiyete yol açmaktadır. Sisplatin enjeksiyonu sonrası oluşan sitotoksik yanıtlar renal inflamatuar ve fibroproliferatif olayları takiben gelişmektedir (19-21). Sisplatinin böbrek fonksiyonlarını ne yolla bozduğu tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak; bu toksisitede birden fazla olayın rol aldığı düşünülmektedir. Bu mekanizmalardan en önemlilerini şöyle sıralayabiliriz; 1. Temel hasar yapıcı etkinin renal kan akımındaki azalma ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Renal kan akımı azalması, glomerül filtrasyon hızı düşüşünden önce olur. Bu da ilacın tubuler nekroz oluşumuna yol açan primer etkisinin vaza rektada dolaşımı azaltmasından kaynaklandığı, bunun sonucunda da komşu S3 segmentlerinde hasar oluşturduğunu düşündürmektedir (22). 2. Sisplatin, renal vasküler yapıdan bağımsız bir in vitro sistem olan tübül kültüründe de apoptozis yolu ile tübüler hücre ölümüne yol açmaktadır. Bu, sisplatinin direkt olarak da tübüler hasara yol açabileceğini göstermektedir (22). 3. Sisplatin, renal hücreler içinde ATPaz aktivitesini anormal olarak azaltarak; mitokondrial hasara, hücre siklusunda duraklamaya ve hücresel transport sisteminin 5
bozulmasına yol açabilmektedir (20). 4. Sisplatin nefrotoksisitesinde, çok aktif bir renal endonükleaz olan DNAaz-1 enziminin önemli rolü olduğunu düşündüren bulgular vardır. Bu enzimin içinde yer aldığı kombine reaksiyonlar sonucunda apopitozis ve\veya nekrotik hücre ölüm gerçekleşmektedir (23). 5. Sisplatin, thiol grupları ve makromoleküller ile etkileşime girmektedir. Bu ajanın nefrotoksik etkileri; lipid, protein ve nükleik asit gibi hücresel makromoleküllerin oksidatif hasarına direkt olarak yol açan süperoksit anyon radikali, hidrojen radikali, singlet oksijen ve nitrik oksiti içeren reaktif oksijen radikalleri ile çok yakın ilişkilidir (24). Çeşitli proteinler (metallothionin) ve küçük moleküller (glutatyon, GSH) bu ajanların metabolizması için gereklidir. Platinum kompleksleri, hızlı bir bağlanma mekanizması ile bu bileşikleri detoksifiye eden GSH ın sistein parçasına karşı oldukça reaktiftirler (21, 25). Reaktif oksijen metabolitlerinin içinde yer alan sitokrom P 450 2E1 ün sisplatin nefrotoksisitesine sebep olduğu ve apoptozisi başlattığı ileri sürülmektedir (26). Nitrik oksit modülatörleri normal böbrek fonksiyonunun devam etmesinde önemli rol oynarlar. Sisplatin nefrotoksisitesinde nitrik oksit veya nitrik oksit sentez inhibitörlerinin rolü henüz tam olarak açık değildir. Saad ve ark. (27) nitrik oksit sentez inhibitör kullanımının sisplatin nefrotoksisitesini attırdığını rapor etmişlerdir. Srivastavata ve ark. (28) çalışmalarında, sisplatin tedavisi sonrası serum üre ve serum kreatinin düzeylerinin ve hedef organlardaki lipid peroksidasyonunun nitrik oksit sentaz enzim inhibitörü tarafından önemli ölçüde azaldığını ve bu nedenle böbrek nitrik oksit regülasyonundaki bozulmanın sisplatin nefrotoksisitesinin altında yatan mekanizmalarından biri olduğunu söylemişlerdir. Nitrik oksit prekürsörü L-Argininin nefroprotektif etkileri vardır ve sisplatin nefrotoksisitesi ile ilişkili biyokimyasal değişikliklerinin ve lipid peroksidasyonunun azaltılmasında etkili olduğu düşünülmektedir (20). Çetin ve ark (29), sisplatinin böbrekte ksantin oksidaz aktivasyonu yoluyla ve antioksidan savunma sistemini bozarak oksidan yükünü arttırarak hasarlanma oluşturduğunu göstermişlerdir. Melatonin, selenyum, vitamin E, N-asetil sistein gibi antioksidan ajanların sisplatin nefrotoksisiteni engellediği veya iyileştirdiği çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (20, 30-33). 6. Sisplatin nefrotoksisitesinde adenosin modülatörlerinin rolü çok net değildir. Sisplatin tedavisi ile hem böbrek hem de testiste Adenosin A reseptörlerinin ekspresyonunda artma gözlemlenmiştir. Ancak adenosinin bu reseptörlere etkisi tartışmalıdır. Bu reseptörlerin hem sitoprotektif hem de nefrotoksiksik etkiye sahip olduğu gösterilmiştir (20). 6
SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR Serbest Radikaller Oksijen, aerobik hücrelerde enerji üretimi için oksidatif fosforilasyon işleminde zorunlu olarak kullanılır. Ancak bu madde bazı kimyasal formlarda son derece toksiktir. Oksijen moleküllerinin büyük bir kısmı mitokondride oksidatif fosforilasyon sırasında sitokrom oksidaz enzimleri ile suya dönüşmekte ve adenozin trifosfat eldesiyle enerji üretilmektedir. Ancak oksijen molekülünden suya indirgeme sırasında %1-5 oranında bazı toksik reaktif oksijen serbest radikalleri oluşmaktadır (34,35). Serbest radikaller (SR), bir atom ya da molekül yörüngesinde eşleşmemiş bir elektron içeren yüksek oranda reaktif kimyasal türlerdir. Bu bileşikler organizmanın normal metabolik işleyişi sırasında ortaya çıkabileceği gibi, radyasyon, ilaçlar gibi çeşitli dış etkenlerin etkisiyle de oluşabilmektedir. Yaşam süreleri çok kısa olmakla birlikte diğer atom ve moleküllerle kolayca reaksiyona girebilmeleri nedeniyle son derece reaktiftirler (36). Biyolojik sistemlerde, önemli serbest radikallerin çoğu oksijene dayanır. Bedenimizde doğal metabolik yollarla SR ler oluşur, ancak radikal parçalayan (antioksidan) sistemlerle bu oluşan serbest radikaller bertaraf edildiğinden, herhangi bir sitotoksisite ortaya çıkmaz. Ancak, bu işleyişin radikaller lehine bozulduğu durumlarda patolojik olaylar ortaya çıkar. Bu zararlı etkileri, DNA nın tahrip olması, tiyollere bağlı enzimlerin yapı ve fonksiyonlarının bozulması, mukopolisakkaritlerin yıkımı, kollagan ve elastin gibi proteinlerin oksiredüksiyonunun bozulması sonucu kapillerlerde aterofibrotik değişikliklerin oluşumu vb. şeklinde sıralayabiliriz. Oluşan tüm bu hasarlara oksidatif stres adı verilir (36). Antioksidanlar Protein, karbonhidrat, lipid ve DNA gibi okside olabilecek maddelerin oksidasyonunu önleyen veya geciktiren maddeye antioksidan denir. Normal koşullarda, aerobik metabolizmanın ürettiği SR antioksidan maddeler tarafından sürekli olarak inaktive edilirler. Organizmada yer alan antioksidan savunma sistemleri inaktivasyon işlemini yapabildikleri sürece patolojik bir durum ortaya çıkmaz. Ancak denge antioksidanların aleyhine bozulduğunda potansiyel bir hasar meydana gelir ki buna oksidatif stres adı verilir. Oksidatif stres, lipid, karbonhidrat ve proteinler üzerine etki ederek, hücrede membran hasarı, karsinojenez veya mutajenez gibi olumsuz gelişmelere yol açabilir. Bu nedenle, SR ve antioksidanlar arasındaki dengenin korunması organizmanın canlılığını sürdürmesi açısından önemlidir (37). 7
Antioksidanların SR üzerine etkisi dört şekilde olur: 1. Serbest oksijen radikallerini tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme şeklindeki toplayıcı etki. Antioksidan enzimler, trakeobronşiyal mukus ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler, 2. SR e bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme şeklindeki bastırıcı etki. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler, 3. SR zincirlerini kırarak fonksiyonlarını engelleyen zincir kırıcı etki. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler, 4. SR ın oluşturdukları hasarın onarılması şeklinde onarıcı etkidir (38). Antioksidanlar, endojen veya eksojen kaynaklı olabilirler. Endojen kaynaklı antioksidanlar arasında süperoksid dismutaz, katalaz, mitokonrial sitokrom oksidaz, melatonin, transferin, hemoglobin, albümin sayılabilir. Askorbik asit, folik asit, α-tokoferol, allopurinol, demir şelatörleri, barbitüratlar gibi vitamin, ilaç ve gıdalarda bulunan çeşitli maddeler ise eksojen kaynaklı antioksidanları oluştururlar (37). AMİFOSTİN İnaktif bir ön ilaç olan ve WR-2721 olarak da bilinen amifostin, alkilleyici ajanları özellikle de sisplatin bazlı kemoterapiyi alan hastaları sitotoksisiteden koruyan önemli bir ajandır. Sisteamin analoğu fosforile olmuş bir ön ilaç olan amifostinin formül yapısı: H2N- (CH2)3-NH-(CH )2-S-PO3-H2 şeklindedir. Suda çözünebilen beyaz kristalize toz şeklinde, molekül ağırlığı 214.22 Da olan bir moleküldür. Amifostin, vücuda girdikten sonra hızlı bir şekilde ALP tarafından defosforile edilerek aktif ve en önemli metaboliti olan WR-1065 formuna geçer. WR-1065 in oksidasyonu ile en yüksek oranda oluşan metabolit WR-33278 (simetrik disülfid) olup, az miktarda mikst disülfidler de oluşur (39). WR-1065 sitoprotektif etkilerini; sitotoksik ilaçların aktif formlarını direkt olarak detoksifiye ederek ya da bağlayarak, serbest radikalleri temizleyerek veya hidrojen bağışı sayesinde DNA hasarını onararak gösterir. Amifostinin karaciğer, böbrek ve ince barsakta WR-!065 ve diğer thiyol metabolitlerine dönüşerek bu dokuları KT ye bağlı DNA hasarından koruduğu düşünülmektedir (40). Amifostin normal dokuları tümör dokularına nazaran daha fazla koruyabilme yeteneğine sahiptir. Selektif sitoprotektif etkisi molekülün bir takım özelliklerine bağlıdır. Hücre membranına bağlı amifostin aktivasyonunu sağlayan ALP enzim konsantrasyonu, normal dokularda tümör dokularından 275 kat daha fazladır. Ayrıca, amifostin normal 8
dokulardan aktif transport ile absorbe edilirken tümör hücrelerinde pasif difüzyon yolu ile olmaktadır. Bu özellikler amifostinin normal dokuları neden tümör dokusundan daha fazla koruyabildiğini açıklayabilmektedir. Böbrek, tükürük bezi, kemik iliği, karaciğer, kalp, akciğer ve ince barsak dokularında amifostin tutulumu seçici olarak daha yüksek, beyin ve spinal kanalda ise konsantrasyonu daha düşük saptanmıştır (41). Amifostin ve metabolitlerinin, sitotoksik ajan-dna kovalan bağlanmasını ve SR lerin DNA ile etkileşimini engelleyerek, özellikle normal hücreleri akut ve geç yan etkilerden koruması, sekonder malignite riskinde de azalma yapacağı hipotezini güçlendirmektedir (39). Preklinik hayvan çalışmaları, amifostinin özellikle sisplatine bağlı nefrotoksisite ve nörotoksisite, siklofosfamide bağlı pulmoner toksisite gibi çeşitli KT ile ilişkili toksisitelere karşı koruyucu etkisinin olabileceğini göstermektedir (42,43). Amifostin; koruyucu etkinliğini ilacın antitümöral etkinliğini azaltmadan yapar. İlacın kısa aralıklarla KT ajanından 5-30 dakika önce verilmesi koruyucu etkinliğini arttırmaktadır (39). Amifostinin tolere edilebilen doz aralığı 740-910mg/m² olarak belirlenmiştir. Oral kullanıldığında aktif değildir. 15 dakikalık İV infüzyon sonrası ortalama maksimum plazma konsantrasyonu 0,1-0,235mmol/L dir (39). Farelerde amifostinin İV verilmesi, sonraki 15 dakika içinde aktif metabolit olan WR- 1065 maksimum doku konsantrasyonuna ulaşması ile sonuçlanır. Dokulara çok hızla dağılmakla birlikte beyine geçişi kan beyin bariyeri nedeniyle çok azdır. Plasentadan geçişi kolay olmaktadır. Yapılan çalışmalarda ilacın eliminasyon yarı ömrü ise 8,8 dakika olarak saptanmıştır. Bu nedenle, maksimum yararın sağlanabilmesi açısından amifostin uygulaması KT den 20-30 dakika önce olmalıdır (44). Amifostinin doz sınırlayıcı yan etkisi infüzyona bağlı hipotansiyondur. Amifostin, 1000-1500mg dozunda %40 ve daha fazla hastada hipotansiyona neden olur. Ancak, infüzyona ara verildiğinde 2-15 dakika içinde hızla düzelir. Hipotansiyon mekanizması net değildir. WR- 1065, nitrik oksit ve prostaglandin üretiminden, alfa adrenerjik reseptörlerden, siklik nükleotid ve kalsiyum kanal aktivitesinden bağımsız olarak küçük arterlerin düz kaslarında gevşemeye sebep olur (39). Amifostin uygulamasını takiben 2-3 gün sürebilen geçici bulantının da eşlik ettiği asteni gelişebilir. Uzamış dozlarda verilmesi sonucu asteni % 30 hastada gelişebilir. Bazı hastalarda asteni gittikçe kötüleşen progresif bir seyir gösterir (39,40). Ematojenik etkisi oldukça yüksek olan amifostin ilk 30 dakika içinde %10-40 hastada grade 2-3 bulantı kusmaya neden olur. Hipokalsemi amifostin tedavisinin nadir görülen bir komplikasyonudur ve paratiroid hormon sekresyonunun inhibisyonuna bağlıdır. Hipoglisemi, 9
1000mg ve üzeri amifostin tedavisi alan hastalarda verilişini takiben 15-30 dakika sonra %1-2 oranında gelişebilir. Sıcak basması, hıçkırık, samnolans, infüzyon sırasında metalik tat, baş ağrısı, yüzde kızarılklık ve titreme de amifostine bağlı diğer yan etkiler arasında sayılabilir (39,40). Günümüzde halen bir çok klinik çalışma amifostinin KT ve RT alan, değişik tip ve farklı organ tümörü olan hastalar üzerinde sitoprotektan etkinliğini araştırmaktadır. Geniş spektrumlu sitoprotektif özellikleri olan amifostinin yapılan faz II ve faz III çalışmalar ile; siklofosfamid, karboplatin, mitomisin-c, fotemustin ve RT ye bağlı gelişen myelotoksisitede (45-48), sisplatine bağlı böbrek ve periferal sinir toksisitesinde (49), RT ye bağlı tükürük bezi, mukozal ve deri toksisitesinde seçici koruyucu etkinliği gösterilmiştir (50). Preklinik çalışmalar, amifostinin malign transformasyonu da engellediğini göstermektedir (51, 52). Amifostin bu özelliği ile KT ve RT ye bağlı gelişen ikincil malignitelerin önlenmesinde de büyük ölçüde yararlı olabilir. Preklinik ve klinik çalışma sonuçlarına göre Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi 1995 yılında amifostini, siklofosfamid ve sisplatin alan ileri evre over kanserli hastalarda sitoprotektan olarak kullanımını onaylamıştır. Yetişkinler için onaylanan doz; KT den 30 dakika önce, 15 dakikalık infüzyon şeklinde 910mg\m² dir. Hipotansiyon gelişmesi durumunda doz 740mg\m² ye düşülmelidir. Karboplatin gibi yarılanma ömrü uzun KT ilaçlarıyla kullanımında doz tekrarları gerekebilir (53). Amifostinin sitoprotektan etkinliği, yapılan çalışmaların pek çoğundan gelen sonuçlar doğrultusunda yaygın şekilde kabul görmüş ise de bu etkinlik bazı çalışmalarda gösterilememiştir. Örneğin, metastatik meme kanserli hastalarda Gradishar ve ark. (54) ile Ramnath ve ark. (55) tarafından yapılan 2 klinik çalışmada sisplatine eklenen amifostinin, oluşan toksisitede azalma sağlamadığı belirlenmişti. Sisplatin dışındaki diğer alkilleyici ajanlarla yapılan bazı çalışmalarda da amifostinin nefrotoksisiteyi önlemede etkisi gösterilememiştir (56). KT ajanlarına benzer mekanizmalar ile nefrotoksisite oluşturan bazı maddelerin toksisitelerini azaltmada amifostinin etkinliği araştırılmıştır. Bu maddelerden birisi gliseroldur. Barun ve ark. (57) tarafından ülkemizde yapılan bir çalışmada, gliserol ile tavşanlarda oluşan akut böbrek hasarlanmasını amifostinin beklenenin tam aksine daha da kötüleştirdiği, bu duruma direk etki ile renal vasküler pefüzyonu azaltarak yol açtığı belirlenmiştir. Ancak tüm bunlara rağmen amifostin, KT ve RT nin toksisitesini azaltmada halen umut verici bir ilaç olarak görülmekte ve klinikte kullanımı ile ilgili araştırmaları çeşitli kanser türlerinde ve farklı kemoterapi ajanları ile devam etmektedir. 10
KARNİTİN L-Karnitin (beta-hydroxy-gama-trimethylaminobutyrate), uzun zincirli yağ asitlerinin, enerji üretimi için beta oksidasyona uğrayabilmeleri amacıyla sitoplazmadan mitokondri iç matriks membranına taşınması için gerekli doğal endojen bir kofaktördür. Fizyolojik formu L izomeri yani levokarnitindir. Propionyl-L-carnitine ve acetyl-l-carnitene, L-karnitinin kısa zincirli esterleridir. Vitamin benzeri bir maddedir ve yapısal olarak aminoasitlere benzemektedir (58). L-Karnitin, endojen olarak lisin ve metioninden özellikle böbrek ve karaciğerde sentez edilir, eksojen kaynak ise diyetteki et ve süt ürünleridir. Normal fizyolojik şartlar altında, filtre edilen L-Karnitinin %90 ı proksimal tubulden reabsorbe edilmekte ve degredasyona uğramamaktadır. Sağlıklı bireylerdeki plazmadaki serbest karnitin düzeyi 40-50 µmol\l dir. Toplam vücut karnitininin %90 nından fazlası iskelet kasında tutulur, çünkü kaslarda karnitin sentezi yoktur. Geri kalan kısmı ise karaciğer, böbrek ve kalp gibi organlardadır. %1 den azı ise plazma ve eritrositlerde bulunur (59). L-Karnitin, primer olarak mitokondride bulunmaktadır. Oksidatif stresin neden olduğu mitokondrial hasarı ve çeşitli hücre tiplerinin mitokondri bağımlı apoptozisini etkili bir şekilde inhibe eder. L-Karnitinin intrasellüler başlıca fonksiyonları (60): 1- Uzun zincirli yağ asitlerinin mitokondri membranına transferini sağlayarak yağ asiti oksidasyonunda kofaktör, 2-Karaciğerde, beta oksidasyon ile kısa zincirli hale gelmiş açil kısmının peroksizomların dışına çıkarılması, 3- Açil-CoA\Coa sülfhidril oranının ayarlanması 4- Dallı zincirli alfa keto asit oksidasyonunu kolaylaştırma Ayrıca, karnitin çeşitli metabolik amaçlar için kullanılabilir. Bunlar, ketogenezisin regülasyonu, mitokondrial enerji kontrol adaptasyonu, uzun zincirli yağ asiti transportu ve temizlenmesi. Hücre membran stabilizasyonunda, kas kontraktibilitesinde etkilidir. Karnitin sayesinde uygun miktarda mitokondrial uzun zincirli yağ asiti düzeyi sağlanarak; metabolik asidoz, hipoksemi veya bozulmuş glukoz toleransı gibi bazı durumlarda gözlenen beta oksidasyon down-regülasyonu önlenmektedir (61). L-karnitin sitosolik demir konsantrasyonunda azalma sağlayarak şelatör görevi görür ve lipid peroksidasyon son ürünlerinin birikimini engelleyerek oksijen SR lerinin temizlenmesinde antioksidan olarak rol oynar. SR temizleme özellikleri sayesinde, adenozin trifosfat yapımında artış ve mitokondrial fonksiyonlarda düzelme yaptıkları gözlenmiştir (62). Karnitin, çeşitli hastalıkların tedavisinde başarı ile kullanılır. L- karnitinin böbrek 11
üzerine koruyucu etkinliği kronik böbrek yetmezliği (63), sisplatine bağlı böbrek ve ince barsak hasarı (13), gentamisine bağlı nefrotoksisite (12), doksorubisine bağlı nefrotik sendrom (64) gibi çeşitli modellerde gösterilmiştir. Karnitin, paklitaksel ve sisplatine bağlı gelişen nörotoksisiteye karşı koruyucu etkinliğe sahiptir (65). Böbrek ve ince barsak karnitin taşıyıcıları açısından zengin dokular olduklarından sisplatinin sebep olduğu bu dokulardaki mitokondrinin oksidatif hasarı ve hücre ölümünün karnitin tarafından inhibe edilebileceği düşünülmektedir (13). RT nin plazma total antioksidan kapasitede azalmaya ve oksidatif streste artışa neden olduğu bilinmektedir. Karnitinin radyasyonun sebep olduğu SR ler ile oluşan hücresel hasarda modülatör bir rol oynadığı düşünülmektedir (13). Aleise ve ark. (59) karnitin ile sisplatine bağlı nefrotoksisite arasındaki ilişkiyi araştırdıkları çalışmada; sisplatin sonrası böbrek dokusunda total nitrat\nitrit düzeylerinde artış, total karnitin düzeylerinde ise azalma olduğunu bildirmişlerdir. Srivastavata ve ark. (28) çalışmalarında, sisplatin tedavisi sonrası nitrik oksit sentaz artışı ile beraber serum üre ve kreatinin düzeylerinin ve hedef organlardaki lipid peroksidasyonunun önemli ölçüde arttığını, bu durumun nitrik oksit sentaz enzim inhibitörü tarafından önlenebildiğini ve bu nedenle böbrek nitrik oksit düzeylerindeki değişikliğin sisplatin nefrotoksisitesinin altında yatan mekanizmalarından biri olduğunu söylemişlerdir. Yapılan bir başka çalışmada D-Karnitin verilerek karnitin eksikliği oluşturulan ratlarda sisplatine bağlı nefrotoksisitenin çok daha ağır şekilde ortaya çıktığı gösterilmiştir. Bu çalışmada sisplatinin, böbrek dokusunda hücreleri sitotoksisiteden koruyan glutatyon (GSH) düzeylerinde ve total karnitin düzeylerinde önemli ölçüde düşüşe sebep olduğu vurgulanmıştır (66). Çeşitli çalışmalarda sisplatinin hücre içi reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin artışına sebep olduğu gösterilmiştir (23,26,35,67,68). Karnitinin böbreğin de içinde olduğu değişik organ ve dokularda antioksidan ve koruyucu etkileri gösterilmiştir (69). Karnitin ve esterleri oral yolla alındıklarında iyi tolere edilir. Oral olarak besinlerle alınan karnitinin biyoyararlanımı %54-87 gibi oldukça yüksek düzeydedir. Atılımı esas olarak renal yolla olmaktadır. Normal diyetle alınan L-karnitinin insandaki tüm vücut siklus süresi ortalama 38-119 saattir (70). 12
GEREÇ VE YÖNTEMLER Bu çalışma, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi (TÜTF) Medikal Onkoloji Bilim Dalı tarafından planlandı. Çalışma, TÜTF Etik Kurulu tarafından TÜTFEK-2008\003 protokolü ile 02.02.2008 tarihinde onaylandı ve Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Merkezi tarafından 09.09.2008 tarihinde 5266-13951 proje protokolü ile desteklendi (Ek1, Ek2). Ayrıca 24.12.2008 tarihinde ise ek iki grup için etik kurul onayı alındı (Ek3). ÇALIŞMA GRUPLARI VE DENEY Çalışmada, TÜTF Deney Hayvanları Araştırma Laboratuarı ndan sağlanan, ortalama ağırlıkları 213g olan, 24 haftalık Wistar Albino cinsi 54 adet erkek rat kullanıldı. Tüm ratlara deney süresi boyunca optimum koşullar altında (ısı;21±1ºc, bağıl nem oranı;%40-60, ışık periyodu 12\12 saat aydınlık\ karanlık, uygun havalandırma sistemi), günlük içme suyu ve %21 ham protein içeren pelet yemlerle (purina) beslenerek bakıldı. Aynı biyolojik ve fizyolojik koşullar altında tutulan bu 54 denekten; her biri 11 rat içeren 3 deney grubu kafesi ile her biri 8 rat içeren 3 kontrol grubu kafesi olmak üzere toplam 6 grup oluşturuldu. Gruplar şu şekillerde idi; Deney Grubu I (Grup I) Amifostin ardından sisplatin (AMF 200+CDDP) uygulanan 11 rat. Grup I deki ratlara 200 mg\kg dozunda amifostin ve amifostinden 30 dakika sonra 7 mg\kg sisplatin intraperitonel injeksiyon yoluyla verildi. 13
Deney grubu II (Grup II) Karnitin ardından sisplatin (KAR+CDDP) uygulanan 11 rat. Grup II deki ratlara 300 mg\kg dozunda karnitin ve karnitinden 30 dakika sonra 7 mg mg\kg sisplatin intraperitoneal injeksiyon yoluyla verildi. Deney grubu III (Grup III) Serum fizyolojik ardından sisplatin (SF+CDDP) uygulanan 11 rat. Grup III deki ratlara 5 ml serum fizyolojik ve serum fizyolojikten 30 dakika sonra 7 mg\kg sisplatin intraperitoneal injeksiyon yolu ile verildi. Kontrol grubu I (Grup IV) Yalnız amifostin (AMF200) uygulanan 8 rat. Grup IV deki ratlara tek başına 200mg\kg amifostin intraperitoneal injeksiyon yolu ile verildi. Kontrol grubu II (Grup V) Yalnız karnitin (KAR) uygulanan 8 rat. Grup V deki ratlara tek başına 300 mg\kg karnitin intraperitoneal injeksiyon yolu ile verildi. Kontrol grubu III (GrupVI) Yalnız serum fizyolojik (SF) uygulanan 8 rat. Grup VI daki ratlara tek başına 5 ml serum fizyolojik intraperitoneal injeksiyon yolu ile verildi. Tedavi öncesi tüm ratların ağırlıkları ölçüldü. Beş gün boyunca izleme alınan ratların izlem boyunca genel durum takibine devam edildi. Deneyin beşinci gününün sonunda tüm ratların deney sonu ağırlıkları tekrar ölçülerek hayvanlara yüksek doz anestezi ile ötenazi uygulandı. Ratların batın bölgesi ve torakal bölgeleri açıldı ve kan örnekleri sakrifikasyon uygulanan deney hayvanının kalbinden direkt ponksiyon yolu ile alındı. Sağ ve sol böbrek çıkartılarak ve dekapsüle edilerek histopatolojik inceleme için formalin içine konuldu. Çalışma sonucunda histopatolojik değişiklikler açısından literatür gözönüne alındığında beklenenden farklı olarak AMF(200)+CDDP kolunun SF+CDDP kolundan istatistiksel olarak anlamlı şekilde daha nefrotoksik olduğunun belirlenmesi üzerine, bu durumunun en muhtemel nedeni olarak düşünülen Amifostin Dozunda Fazlalık ihtimalini ortadan kaldırmak için, etik kurul onayı da alınarak iki yeni çalışma kolu daha oluşturuldu. On bir rat içeren 1. ek koldaki (AMF25+CDDP) deneklere 25 mg\kg dozunda amifostin ve amifostinden 30 dakika sonra 7mg\kg sisplatin intraperitoneal injeksiyon yolu ile verilirken, 8 rat içeren 2. ek koldaki (AMF25).deneklere tek başına 25 mg\kg amifostin intraperitoneal yolla uygulandı. 14
ÖTENAZİ YÖNTEMİ Denekler, 250 mg\kg intramuskular (İM) Ketamin ( Ketasol, Richter Pharma AG, Avusturya) ve 250 mg\kg İM Xylazine (Rompun, Bayer Türk Kimya San.Ltd.Şti.Türkiye) uygulaması ile sakrifiye edildi. BİYOKİMYASAL İNCELEME YÖNTEMİ Kalbin direkt ponksiyonu ile alınan kan örnekleri, santrifüj cihazı ile dakikada 1500xg de 15 dakika çevrilerek serumları ayrılmıştır. Serum örneklerinde üre ve kreatinin düzeyleri T.Ü. Tıp Fakültesi Merkez Labaratuarında bulunan otoanalizörde spektrofotometrik olarak bakılmıştır. (Konelab, Prime 60i, Thermo Scientific, Finlandiya). HİSTOPATOLOJİK İNCELEME YÖNTEMİ Böbrekler formaldehit solüsyonunda 24 saat bekletildikten sonra vertikal olarak yarıya kesilerek doku takibine alındı. Doku takibi sonrası parafine gömülerek 4 mikron kalınlığında kesitler alındı. Hematoksilen-eozinde boyanarak ışık mikroskopisinde incelendi. Glomerüler hasar; mezengial proliferasyon, bazal membran kalınlaşması, fibrinoid değişiklik değerlendirilerek derecelendirildi. Tubuler hasar; vakuoler dejenerasyon, deskuamasyon, tubuler dejenerasyon, proksimal tubuler nekroz ve cast formasyonu değerlendirilerek derecelendirildi. Tubulointerstisyel inflamatuar infiltratlar iltihabi hücrelerin interstisyumda yaygınlığı ve tubulus epitelyum hücrelerine girip girmediği değerlendirilerek derecelendirildi. Hasarın derecelendirilmesi Tablo 1-3 de belirtildiği şekilde yapıldı. Nefrotoksisite sınıflaması, hasar dereceleri toplanarak elde edilen skorlama sistemi sonuçlarına göre yapıldı (Tablo 4). İSTATİSTİKSEL ANALİZ Veriler kodlanarak bilgisayara girildikten sonra istatistiksel analizleri Minitab paket programı (Lisans No: Wcp 1331.00197) ile yapıldı. Gruplar arasındaki farkın istatistiksel önemlilik derecesini belirlemek için Kruskal-Wallis testi kullanıldı. p değerinin 0,05 in altında olması durumunda, gruplar arasındaki fark anlamlı kabul edildi. Tedavi öncesi ile tedavi sonrası kilo değerleri arasındaki farklılık Wilcoxon T testi ile değerlendirildi. Üre ve kreatinin değerlerinin Kolmogorov-Smirnov testi ile normal dağılım uygunluğu araştırıldı. Her ikisi de normal dağılıma uygunluk göstermediği için gruplar arası karşılaştırmalarda Kruskal-Wallis testi kullanıldı. Tanımlatıcı istatistikler median (%25-75) persantil olarak gösterildi. Çoklu karşılaştırma testi olarak Dunn testi kullanıldı. Glomerüler hasar, tubuler 15
hasar, tubulointersitisyel inflitratlar ve total nefrotoksisite skoru Kruskal Wallis testi ile karşılaştırıldı. Tablo 1. Glomerüler hasar (59) Hasar Derecesi Hasar Tanımı 0 Hasar yok 1 < % 25 den az glomerülde nonspesifik hasara ait değişikikler 2 % 25-50 glomerülde nonspesifik hasara ait değişiklikler 3 % 50-75 glomerülde nonspesifik hasara ait değişiklikler 4 > %75 den çok glomerülde nonspesifik hasara ait değişiklikler Tablo 2. Tubuler hasar (59) Hasar Derecesi Hasar Tanımı 0 Hasar yok 1 Tüm renal parenkim tubuluslarının %25 inden azında tubuler hasar 2 Tüm renal parenkim tubuluslarının %25-50 inde tubuler hasar 3 Tüm renal parenkim tubuluslarının %50-75 inde tubuler hasar 4 Tüm renal parenkim tubuluslarının %75 inden fazlasında tubuler hasar Tablo 3. Tubulointerstisyel inflamatuar infiltratlar (59) İnfiltrasyon Derecesi İnfiltrasyon Tanımı 0 Hiçbir bulgu yok 1 Lökositler interstisyuma sınırlı 2 Lökositler hem interstisyumda hem de tubuler epitelyal hücrelerde Tablo 4. Nefrotoksisiteyi belirlemede kullanılan total skorlama sistemi (59) Hasarlanma ve infiltrasyon derece toplamı Nefrotoksisite derecesi 0-2 Yok/Hafif 3-6 Orta 7-10 Yüksek 16
BULGULAR Deneklere çalışma başlangıcında belirlenen protokol doğrultusunda ilaç uygulaması yapıldı. Çalışma, ilaç uygulanan deneklerin 5 günlük takip sonunda sakrifiye edilmesi ile tamamlandı. Deney süresince gruplarda hiçbir ölüm görülmedi. Deney sonunda elde edilen histopatolojik veriler incelendiğinde, literatürle uyumlu olmayacak şeklide AMF(200)+CDDP kolunun SF+CDDP koluna göre daha nefrotoksik olduğu belirlendi. Bu duruma neden olabilecek faktörlerden biri olarak düşünülen amifostin dozuyla ilgili bir sorun olup olmadığının belirlenmesi amacıyla, etik kurul onayı da alınarak, 8 ratta tek başına 25mg\kg amifostin ve 11 ratta 25mg/kg amifostin+sisplatin uygulanmasını içeren yeni iki kol ile ek bir çalışma daha yapıldı. VÜCUT AĞIRLIĞINDAKİ DEĞİŞİKLİKLER Çalışma başlangıcında tüm gruplardaki hayvanların ağırlıkları ölçüldü. Tedavi öncesi ve tedavi sonrası ortalama kilolar sırasıyla şu şekilde bulundu; AMF(200)+CDDP grubunda 223 ve 213gr, KAR+CDDP grubunda 219 ve 215gr, SF+CDDP grubunda 230 ve 223gr, KAR grubunda 209ve 216gr, AMF(200) grubunda 201 ve 204gr, SF grubunda 194 ve 199gr. Bu sonuçlar incelendiğinde; deney grubundaki kollarda ratların kilolarında azalma, kontrol grubundaki kollarda ise artış olduğu görüldü (Şekil 2). Deney kollarında en fazla kilo kaybı AMF(200)+CDDP kolunda %4,5 ile görülürken, en az değişiklik KAR+CDDP kolunda %2 şeklinde oldu. SF+CDDP kolundaki kilo değişiklik oranı ise %3,1 idi. Kilo değişimleri açısından AMF(200)+CDDP kolu ile KAR+CDDP kolu arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p>0.05). 17
Tedaviye Bağlı Kiloda Görülen Değişiklikler 0,24 0,23 0,22 Kilo (kg) 0,21 0,2 Tedavi Öncesi Tedavi Sonrası 0,19 0,18 0,17 AS KS SS A K S Tedavi Türü Şekil 2. Tedavi öncesi ve sonrası tüm ratların ortalama kilo değişimleri AS: AMF(200)+CDDP, KS: KAR+CDDP, SS: SF+CDDP, A:AMF(200), K:KAR, S: SF. ÜRE SONUÇLARI Sakrifikasyon sonrası elde edilen serumlarda belirlenen üre değerleri Tablo 5 de sunulmuştur. Medyan üre değerleri (%25-75 persantil) sırasıyla; AMF(200)+CDDP grubunun 88(56-213)mg/dl, KAR+CDDP grubunun 60(49-100)mg/dl, SF+CDDP grubunun 57(53-82)mg/dl, AMF(200) grubunun 52(44-54)mg/dl, KAR grubunun 47(42-48)mg/dl, SF grubunun 44(41-47)mg/dl idi. Sonuçlar karşılaştırıldığında; AMF(200)+CDDP grubunun medyan üre değeri sayısal olarak KAR+CDDP ve SF+CDDP gruplarından yüksek olmasına rağmen bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. AMF(200)+CDDP grubu, AMF(200), KAR ve SF gruplarından istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek üre değerlerine sahipti. KAR+CDDP grubunun üre değerleri, istatistiksel olarak sadece KAR ve SF gruplarından farklı idi. Aynı şekilde, SF+CDDP grubunun üre değerleri de istatistiksel olarak sadece KAR ve SF gruplarından anlamlı derecede yüksek bulundu. AMF(200), KAR ve SF grupları üre değerleri açısından karşılaştırıldığında aralarında anlamlı istatistiksel farklılık olmadığı görüldü (Tablo 6). Grupların üre değerleri Dunn çoklu karşılaştırma testi ile istatistiksel olarak karşılaştırıldığından p değerleri verilmemiştir. 18
Tablo 5. Sakrifikasyon sonrası alınan serumda belirlenen üre değerleri GRUPLAR AMF(200)+CDDP (mg\dl) KAR+CDDP (mg\dl) SF+CDDP (mg\dl) AMF(200) (mg\dl) KAR (mg\dl) SF (mg\dl) Denek 1 150 105 68 53 33 47 Denek 2 213 54 49 39 46 44 Denek 3 87 49 97 54 40 47 Denek 4 88 69 42 56 47 40 Denek 5 258 108 55 45 47 44 Denek 6 177 42 110 43 47 54 Denek 7 214 100 53 52 48 44 Denek 8 53 58 54 52 51 38 Denek 9 56 60 82 - - - Denek 10 59 45 57 - - - Denek 11 41 73 64 - - - AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. 19
Tablo 6.Gruplar arasında üre değerleri açısından farklılıkların karşılaştırılması AMF(200)+ CDDP KAR+ CDDP SF+ CDDP AMF(200) KAR SF AMF(200)+CDDP - - + + + KAR+CDDP - - - + + SF+CDDP - - - + + AMF(200) + - - - - KAR + + + - - SF + + + - - AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. +: Dunn çoklu karşılaştırma testi ile karşılaştırıldığında iki kol arasında istatistiksel anlamlı farklılık var, -: Dunn çoklu karşılaştırma testi ile karşılaştırıldığında iki kol arasında istatistiksel anlamlı farklılık yok. KREATİNİN SONUÇLARI Sakrifikasyon sonrası elde edilen serumlarda belirlenen kreatinin değerleri Tablo 7 de sunulmuştur. Medyan kreatinin değerleri (%25-75 persantil) sırasıyla; AMF(200)+CDDP grubunun 0,6(0,6-0,7)mg/dl, KAR+CDDP grubunun 0,6(0,5-0,7)mg/dl, SF+CDDP grubunun 0,6(0,6-0,7)mg/dl, AMF(200) grubunun 0,55(0,5-0,6)mg/dl, KAR grubunun 0,55(0,5-0,6)mg/dl, SF grubunun 0,5(0,5-0,58)mg/dl idi. Sonuçlar karşılaştırıldığında; AMF(200)+CDDP, KAR+CDDP ve SF+CDDP grubunun kreatinin değerleri SF kolundan istatistiksel olarak anlamlı derecede yüksek bulundu. AMF(200)+CDDP, KAR+CDDP, SF+CDDP grupları arasında kreatinin değerleri açısından istatistiksel açıdan anlamlı bir fark olmadığı görüldü. Yine, AMF(200), KAR ve SF gruplarının aralarında da kreatinin değerleri açısından istatistiksel fark olmadığı belirlendi (Tablo 8). Grupların kreatinin değerleri Dunn çoklu karşılaştırma testi ile istatistiksel olarak karşılaştırıldığından p değerleri verilmemiştir. 20
Tablo 7. Sakrifikasyon sonrası alınan serumda belirlenen kreatinin değerleri N AMF(200)+CDDP (mg\dl) KAR+CDDP (mg\dl) SF+CDDP (mg\dl) AMF(200) (mg\dl) KAR (mg\dl) SF (mg\dl) 1 0,7 0,7 0,6 0,6 0,5 0,5 2 0,6 0,6 0,6 0,5 0,5 0,5 3 0,6 0,6 0,7 0,5 0,5 0,5 4 0,6 0,6 0,5 0,5 0,5 0,5 5 0,7 0,6 0,6 0,6 0,6 0,5 6 0,5 0,7 0,7 0,6 0,6 0,6 7 0,7 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 8 0,6 0,7 0,6 0,5 0,6 0,5 9 0,6 0,5 0,6 10 0,5 0,6 0,6 11 0,6 0,5 0,6 AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. Tablo 8. Gruplar arasında kreatinin değerleri açısından farklılıkların karşılaştırılması AMF(200)+ CDDP KAR+ CDDP SF+ CDDP AMF (200) KAR AMF(200)+CDDP - - - - + KAR+CDDP - - - - + SF+CDDP - - - - + AMF(200) - - - - - KAR - - - - - SF + + + - - AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. +: Dunn çoklu karşılaştırma testi ile karşılaştırıldığında iki kol arasında istatistiksel anlamlı farklılık var, -: Dunn çoklu karşılaştırma testi ile karşılaştırıldığında iki kol arasında istatistiksel anlamlı farklılık yok. SF 21
HİSTOPATOLOJİK BULGULAR İlaçlar verildikten 5 gün sonra sakrifiye edilen tüm ratların böbrek kesitleri ışık mikroskopisinde incelendiğinde şu sonuçlara ulaşıldı; Glomerüler Hasarlanma Tüm grupların glomerüler hasarlanma derecelerinin dağılımları Tablo 9 da verilmiştir. Bu tabloya bakıldığında glomerüler hasarlanmanın hiçbir grupta 1.dereceden kötü olmadığı görüldü (Tablo 9). Hafif mesangial proliferasyon dışında belirgin ışık mikroskopik değişiklik gözlenmedi. Medyan glomerüler hasar dereceleri (%25-75 persantil) sırasıyla; AMF(200)+CDDP grubunun 1(1-1), KAR+CDDP grubunun 0(0-1), SF+CDDP grubunun 0(0-0), AMF(200) grubunun 0(0-0), KAR grubunun 0(0-0), SF grubunun 0(0-0) idi. Gruplar karşılaştırıldığında, AMF(200)+ CDDP grubunda diğer gruplardan istatistiksel olarak daha kötü glomerüler hasarlanma olduğu belirlendi (p<0.001). Diğer gruplarda görülen hasarlanmalar ise kendi aralarında anlamlı bir farklılık göstermiyordu (Tablo 10) Tablo 9. Tüm grupların glomerüler hasarlanma derecelerinin dağılımları HASARLANMA GRUPLAR DERECESİ AMF(200)+CDDP (n) KAR+CDDP (n) SF+CDDP (n) AMF(200) (n) KAR (n) SF (n) 0 2 7 9 7 8 8 1 9 4 2 1 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. 22
Tablo 10. Glomerular hasarlanma açısından grupların karşılaştırılması AMF(200)+CDDP KAR+CDDP SF+CDDP AMF(200) KAR SF AMF(200)+CDDP + + + + + KAR+CDDP + - - - - SF+CDDP + - - - - AMF(200) + - - - - KAR + - - - - SF + - - - - AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. (+): p <0.001, (-): p>0.05. Tubuler Hasarlanma Tüm grupların tubuler hasarlanma dereceleri Tablo 11 de verilmiştir. Medyan tubuler hasar dereceleri (%25-75 persantil) sırasıyla; AMF(200)+CDDP grubunun 4(2-4), KAR+CDDP grubunun 1(1-2), SF+CDDP grubunun 2(1-2), AMF(200) grubunun 1(1-1), KAR grubunun 1(1-1), SF grubunun 0(0-1) idi. Gruplar karşılaştırıldığında, AMF(200)+CDDP grubunda diğer tüm gruplardan istatistiksel olarak anlamlı derecede daha kötü tubuler hasarlanma olduğu belirlendi (p<0.001). Ayrıca, KAR+CDDP ve SF+CDDP gruplarında, SF grubundan istatistiksel olarak anlamlı derecede daha kötü tubuler hasarlanma olduğu görüldü (p<0.001). Diğer gruplarda görülen hasarlanmalar ise kendi aralarında anlamlı bir farklılık göstermiyordu (Tablo 12). 23
Tablo 11. Tüm grupların tubuler hasarlanma derecelerinin dağılımları HASARLANMA GRUPLAR DERECESİ AMF(200)+CDDP (n) KAR+CDDP (n) SF+CDDP (n) AMF(200) (n) KAR (n) SF (n) 0 0 0 0 0 2 5 1 0 6 4 7 6 3 2 3 3 6 1 0 0 3 2 2 1 0 0 0 4 6 0 0 0 0 0 AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. Tablo 12. Tubuler hasarlanma açısından grupların karşılaştırılması AMF(200)+CDDP KAR+CDDP SF+CDDP AMF(200) KAR SF AMF(200)+CDDP + + + + + KAR+CDDP + - - - + SF+CDDP + - - - + AMF(200) + - - - - KAR + - - - - SF + + + - - AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. (+): p <0,001, (-): p>0.05 Tubulointerstisyel İnflamatuar İnfiltratlar Tüm grupların tubulointerstisyel inflamatuar infiltrat gelişim dereceleri Tablo 13 de verilmiştir. Medyan tubulointersitisyel inflamatuar infiltrat gelişim dereceleri (%25-75 persantil) sırasıyla; AMF(200)+CDDP grubunun 1(1-2), KAR+CDDP grubunun 1(0-1), SF+CDDP grubunun 1(1-1), AMF(200) grubunun 1(1-1), KAR grubunun 1(1-1), SF grubunun 0(0-1) idi. Gruplar karşılaştırıldığında, AMF(200)+CDDP grubunda AMF(200) grubu dışında diğer tüm gruplardan istatistiksel olarak anlamlı derecede daha kötü derecede tubulointersitisyel inflamatuar infiltrat gelişimi olduğu belirlendi (p<0.01). AMF(200) 24
grubundaki tubulointersitisyel inflamatuar infiltrat gelişim derecele ise sadece SF grubundan istatistiksel olarak farklı bulundu (p<0.01). Diğer gruplarda görülen hasarlanmalar ise kendi aralarında anlamlı bir farklılık göstermiyordu (Tablo 14). Tablo 13. Tüm grupların tubulointersitisyel inflamatuar infiltrat gelişim derecelerinin dağılımları TUBULER GRUPLAR İNFİLTRAT GELİŞİM AMF(200)+CDDP (n) KAR+CDDP (n) SF+CDDP (n) AMF(200) (n) KAR (n) SF (n) DERECELERİ 0 0 3 1 0 2 4 1 6 7 9 6 6 4 2 5 1 1 2 0 0 AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. Tablo 14. Tubulointersitisyel inflamatuar infiltratlar gelişimi açısından grupların karşılaştırılması AMF(200)+CDDP KAR+CDDP SF+CDDP AMF(200) KAR SF AMF(200)+CDDP + + - + + KAR+CDDP + - - - - SF+CDDP + - - - - AMF(200) - - - - + KAR + - - - - SF + - - + - AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. (+): p <0.01, (-): p>0.05. 25
Nefrotoksisite Total Skorlama Sonuçları Tüm grupların nefrotoksisite total skorları açısından dağılımları Tablo 15 de verilmiştir. Medyan nefrotoksisite skorlar değerleri (%25-75 persantil) sırasıyla; AMF(200)+CDDP grubunun 6(5-7), KAR+CDDP grubunun 2(1-4), SF+CDDP grubunun 3(2-3), AMF(200) grubunun 2(2-3), KAR grubunun 2(1,25-2), SF grubunun 1(1-1,75) idi. Gruplar karşılaştırıldığında, nefrotoksisite total skorları AMF(200)+CDDP grubunda tüm gruplardan istatistiksel olarak anlamlı derecede kötü bulundu (p<0,001). Ayrıca, KAR+CDDP ve SF+CDDP grupları, SF verilen gruptan istatistiksel olarak anlamlı derecede kötü skora sahiptiler (p<0.001). KAR+CDDP ile SF+CDDP grupları ise nefrotoksisite skorları açısından birbirinden istatistiksel olarak farklı değildi (Tablo 16). Tablo 15. Nefrotoksisite total skorları açısından grupların dağılımı Nefrotoksisite GRUPLAR Total Skoru AMF(200)+CDDP KAR+CDDP SF+CDDP AMF(200) KAR SF Yok/Hafif (0-2) 0 6 5 5 8 8 Orta (3-6) 8 5 6 3 0 0 Yüksek (7-10) 3 0 0 0 0 0 AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. Tablo 16. Nefrotoksisite total skorları açısından grupların karşılaştırılması AMF(200)+CDDP KAR+CDDP SF+CDDP AMF(200) KAR SF AMF(200)+CDDP + + + + + KAR+CDDP + - - - + SF+CDDP + - - - + AMF(200) + - - - - KAR + - - - - SF + + + - - AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin; KAR: Karnitin; SF: Serum Fizyolojik. (+): p <0.001, (-): p>0.05. 26
Şekil 3 te, AMF(200)+CDDP grubunda saptanan histopatolojik bulgular gösterilmiştir. Bu grupta; interstisyumda lenfositer infiltrasyon, tubulus lümenlerinde pembe eosinofilik materyal birikimi, distorsiyon ve rejeneratif değişiklikler dikkati çekmektedir. Şekil 3. AMF+CDDP grubu histopatolojik bulgular: a- Uzak büyütmede AMF+CDDP grubunda interstisyumda izlenen lenfositer infiltrasyon, tubulus lümenlerinde biriken pembe eosinofilik materyal (tubuler tiroidizasyon bulgusu), tubuler distorsiyon, b-yakın büyütmede tubuluslarda görülen rejeneratif değişiklikler, hidropik dejenerasyon ve tiroidizasyon bulguları dikkati çekmektedir (H&E x 50,100) Şekil 4 te ise KAR+CDDP grubunda tubuler distorsiyon ve hidropik dejenerasyon görülmektedir. Şekil 4. KAR+CDDP grubu histopatolojik bulgular: a- Tubuler distorsiyon, b- Hidropik dejenerasyonun devam etmekte olduğu görülmektedir (H&E x 50, 100) 27
EK İKİ GRUBUN DEĞERLENDİRME SONUÇLARI Amifostin(200)+Sisplatin grubunun üre sonuçlarının istatistiksel olmasa da en azından değersel olarak SF+CDDP grubundan daha yüksek saptanması (sırasıyla medyan 88, 57mg/dl), glomerüler hasar, tubuler hasar, tubuler interstisyel infiltrat ve nefrotoksisite total skoru yönünden AMF(200)+CDDP grubunun SF+CDDP grubundan istatistiksel olarak anlamlı daha kötü sonuç vermesi üzerine, bu durumunun seçilen amifostin dozuyla ilişkisi olup olmadığını anlamak için etik kurul onayı da alınarak iki yeni çalışma kolu daha oluşturuldu. Amifostin in 200 mg dozunda ratlarda hipotansiyona yol açarak renal perfüzyonu bozmak suretiyle tubuler hasara neden olabileceği düşünülerek bu yeni iki çalışma kolunda, literatürde ratlarda nefrotoksisiteyi engellediği gösterilmiş en düşük doz olan 25 mg\kg amifostin dozu kullanıldı. Tablo 17 de ek iki grubun medyan üre, kreatinin değerleri ve histopatolojik değişiklik dereceleri sunulmuştur. Bu ek iki grup ile yaptığımız çalışmada bulduğumuz üre, kreatinin ve histopatolojik değişiklik sonuçları, daha önceki AMF(200)+CDDP grubu sonuçları ile karşılaştırıldığında, amifostin dozunun 200mg/kg yerine 25mg/kg olarak verilmesinin sonucu istatistiksel olarak anlamlı düzeyde değiştirmediğini belirledik. Tablo 17. Ek iki grubun üre, kreatinin ve histopatolojik bulguları AMF(25)+CDDP) AMF(25) Üre (%25-%75 persantil) mg/dl 98(83-218) 42(35,25-42,75) Kreatinin (%25-%75 persantil) mg/dl 1,2(1,1-1,9) 0,6(0,6-0,6) Glomerüler hasar derecesi 1(1-1) 1(0,25-1) Tubuler hasar derecesi 3(2-3) 2(1-2) Tubulointersitisyel inflitrat derecesi 1(1-1) 1(1-1) Total nefrotoksisite skoru 5(4-6) 3,5(3-4,75) AMF: Amifostin; CDDP: Sisplatin. 28