1. Enzimler GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ UYGULAMA DERSİ NO:5 Enzim Analizleri Enzimler, hücreler ve organizmalardaki reaksiyonları katalizleyen ve kontrol eden protein yapısındaki bileşiklerdir. Reaksiyon hızını klasik kimyasal katalizörler ile kıyaslanamayacak kadar artırırlar. Enzimlerin katalitik gücünü anlayabilmek için hidrojen peroksitindekompozisyon reaksiyonu iyi bir örnek oluşturmaktadır. H2O2 in su ve oksijene parçalanması termodinamik açıdan istemli bir reaksiyondur. Fakat H2O2 çözeltisi şişe içerisinde pratikçe bozunmadan aylarca saklanabilir. Çözeltiye az miktarda FeCI3 ilave edilirse bozunma reaksiyonunun 1000 kat arttığı gözlenir. İnorganik demir (3) tuzu yerine demir (3) iyonu içeren protein (Hemoglobin) kullanılırsa bozunma 1000 kat daha hızlanacaktır. Çoğu hücrelerde bulunankatalaz enzimi ise H2O2 in bozunma hızını 10 9 kat artırmaktadır. Bazı hücresel reaksiyonlar sonucu oluşan H2O2 çok tehlikeli bir oksidandır ve bu tehlike hücrede bulunan katalaz sayesinde ortadan kaldırılır. Enzimler katalizör tanımına uyarlar, az miktarı yeterlidir, reaksiyon sırasında değişime uğramaz, reaksiyon hızını çok artırır ve dengenin çabuk yerleşmesini sağlar ama asla reaksiyon dengesini değiştirmezler. Bugün bilinen yaklaşık 4000 enzim mezofilik organizmalardan elde edilmiştir. Mezofilik organizmalardan elde edilen enzimler nötralph bölgesinde ve dar bir aralıkta, 25-45 0 C sıcaklıkta, atmosfer basıncı dolayında aktive göstermektedir. Doğal enzimlerden katalitik potansiyellerinden daha verimli yararlanmanın bir yolu immobilizasyondur. İmmobilizasyon, çeşitli fiziksel veya kimyasal yollardan destek materyali vasıtasıyla hareketin sınırlandırılmasıdır. Bu sayede hem enzimin kararlılığı artmakta hem de enzim preparatı birçok kez kullanılmaktadır (Bu konu ileriki uygulamalarda ayrıntılı olarak anlatılacaktır). Enzimler temel yapı olarak monomerik veya oligomerik protein molekülleridir. Çoğu enzimler amino asitlerden oluşan polipeptid zincir veya zincirleri yanında kofaktörleri (Cu, Fe, K, Mg, Mn, Mo, Ni, Se, Zn), prostetik grupları (NAD, FAD, B vitaminleri), karbonhidrat veya lipid gruplarını da içerebilirler. Enzimleri diğer katalizörlerden ayıran üç temel özellik vardır: Yüksek katalitik güç Spesifiklik Katalitik aktivitelerinin ayarlanabilir olması. 2. Enzim Aktivitesi ve Ölçümü Enzim aktivitesi, enzimin belli koşullarda sahip olduğu aktif enzim miktarının bir ölçüsüdür ve birim zamanda (saniyede) değişime veya dönüşüme uğratılan Substratınmol sayısı ile ifade edilir. Bu tanımlama SI-Birimler sistemine uygun olup bu sistemde enzim aktivite birimi katal dir. 1 katal = 1 mol/saniye dir. Daha pratik ve yaygın olarak kullanılan aktivite birimi Uluslararası Birim dir ve IU veya EU şeklinde kısaltılır. Uluslararası Birim, 1
dakikada bir mikromolsubstratı dönüşüme uğratan enzimin aktivitesidir (1 Enzim ünitesi (EU) = 1 µmol/dak). Görüldüğü gibi uluslararası enzim aktivite birimi tanımında enzim miktarı yer almamaktadır. Bu tanıma enzim miktarı eklendiğinde spesifik aktivite birimi ortaya çıkar. 1 mg enzim tarafından 1 dakikada dönüşüme uğratılan enzimin aktivitesi o enzimin spesifik aktivitesidir. Spesifik aktivite enzim preparatının saflık düzeyinin bir ölçüsüdür. Enzim aktivitesi, enzimatik reaksiyonda substratkonsantrasyonundaki azalma veya ürün konsantrasyonundaki artış yardımı ile izlenir. 2.1. Aktivite tayin yöntemleri Enzim aktivite tayininde kullanılan yöntemler şunlardır: Spektrofotmetrik yöntemler: Reaksiyon ortamında absorplanan ışık miktarındaki değişim izlenir. Örneğin; spektrofotometrik yöntemde mannanaz enzimi aktivitesi, 540 nm dalga boyunda ölçülmektedir. Fluorimetrik yöntemler Lüminesans yöntemler İmmunokimyasal yöntemler İyon selektif ve oksijen selektif elektronlar Radyometrik yöntemler Kalorimetrik ve manometrik teknikler 3. Mannanaz Enzimi Aktivitesinin Tayini ve Miktarının Belirlenmesi 3.1. DNS Hazırlanması 10 g Dinitrosalisilik asit 0.5 g Sodyum sülfit 10 g Sodyum hidroksit Üzerine 1 L DI su 3.2. Substratın Hazırlanması 1. Aşama 1,5 L 50 mm lik Sodyum sitrat hazırlanır. Bunun için; y =50 mm X MA X 1,5 L 400 ml, 50 mm lik sitrik asit hazırlanır. Bunun için; y =50 mm X MA X 0,4 L 1,5 L Sodyum sitrat üzerine yavaş yavaş sitrik asit solüsyonu ilave ederek ph 6 ya ayarlanır. 2
2. Aşama 2 L likerlenmayereph 6 lık 1,5 L solüsyonundan ilave edilir ve üst çizgisi işaretlenir. 2L lik erlenmayerde bulunan 1.5L lik solüsyondan 400 ml si alınır. Kalan 1,1 L lik solüsyon içine manyetik balık atılarak 200 C da karıştırılır. Isıtma ve karıştırma devam ederken 7,5 g LocustBeanGum (LBG) ilave edilerek çözündürülür. LBG nin topaklaşmaması için yavaş yavaş ilave edilir. Son olarak oda sıcaklığında soğumaya bırakılan solüsyon +4 de manyetik karıştırıcı ile 18-24 saat arası sürekli karıştırılır. Geriye kalan ph ı 6 olan solüsyondan (400 ml), hazırlanan LBG nin işaretlenen hacim çizgisine kadar ilave edilir. 3.3. Mannanaz Enzimi Aktivitesinin Belirlenmesi Fermentasyon ortamından alınan örneklerde mannanaz aktivitesi belirlenecektir. Bu amaçla endo-beta-1,4 mannanaz, DNS (dinitro salisilik asit) metodu ile belirlenecektir. Öncelikle Na-sitrat tamponunda (ph 6) keçiboynuzu gamı solüsyonu (%0.05 w/v) hazırlanacak ve belirtilen solüsyonun 1.8 ml si ile 0.2 ml 20 kat seyreltilmiş fermentasyon örneklerinin berrak kısmı bir test tüpünde karıştırılacaktır. Su banyosunda 50ºC de 5 dakikainkübasyona bırakıldıktan sonra 3 ml DNS çözeltisi eklenecek ve tüpler daha sonra 90ºC lik su banyosunda 15 dakika kaynatıldıktan sonra soğutulmak üzere buz banyosuna aktarılacaktır. Elde edilen örnekler 540 nm despektrofotometrede ölçülecek ve değerler mannoz standart kurvesinden faydalanılarak aktivite belirlenmesinde kullanılacaktır. Mannanaz aktivitesinin tanımlanmasına uygun olarak elde edilen aktivite değerleri U/ml olarak belirlenecektir. Enzim aktivitesinin bir birimi (1U=16.7nkat), bir dakikada 1 µmol D- mannoz a eşit gelen indirgen şekerleri serbest hale geçiren enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Mannoz standart kurvesi, farklı konsantrasyonlarda D-mannozun (0-10 µmol/ml) hazırlanması ve DNS metodu uygulandıktan sonra 540 nm deabsorbanslarının ölçülmesi ile çizilecektir. Standart kurve çizildikten sonra aşağıdaki denklem oluşturulacaktır. Denklemde, a: Standart kurvenin eğimi b: Standart kurvenin kesim noktası Cmannoz= Mannozkonsantrasyonu (µmol/ml) (1) 3
Mannoz Ort. Abs Konsantrasyonu (mmol/l) 0 0 0,280 1 0,767 2,5 1,516 5 2,884 10 Örneklerin indirgen şeker içeriği Eşitlik 1 e göre hesaplanacaktır. Mannanaz aktivitesinin belirlenmesinde her bir örnek için mannozkonsantrasyonuna eşit olan indirgen şeker miktarı kullanılacaktır. Bu amaçla; (2) Denklemde, DF:Dilüsyon faktörü RV: Test tüpündeki toplam hacim/enzim solüsyonunun hacmi t: Reaksiyonda kalma zamanı (dak) Yukarıdaki eşitlik kullanılarak enzim aktivitesi hesaplanır. Enzim Analizleri konusuna ait rapor soruları: 1. Yapılan enzim analizi sonucunda elde edilen ortalama mannozabsorbas değeri 0.350 nm dir. Bunun sonucunda mannanaz enzimi aktivitesinikatal, microkatal ve nanokatalolarak hesaplayınız? (1 U = 1/60 microkatal = 16.7nanokatal) Veriler Dilüsyon faktörü 20 Test tüpündeki toplam hacim 5 ml Enzim solüsyonunu hacmi 0,2 ml Zaman 300 saniye 2. Enzimlerin genel özellikleri nelerdir? Enzim aktivitesi ve ölçümünün temel prensibi hakkında bilgi veriniz? Bonus:Enzim aktivitesine etki eden faktörler nelerdir? (10 puan) DİKKAT! 4
Rapor yazımında Enzim Analizleri konusuna ait yukarıda yer alan rapor sorularını cevaplayınız (40 puan). 5