KKKAH ve Aşı Çalışmaları Prof. Dr. AYKUT ÖZDARENDELİ ERCİYES ÜNİVERSİTESİ AŞI ARAŞTIRMA VE GELİŞTİRME MERKEZİ
12.yy Tacikistan da tanımlanmış KKKA ilk tarihçesi Kanama Burun kanaması Kara ölüm
Kırım 1944-45 Kırım Kanamalı Ateşi Kongo 1956 Kongo Hastalığı 1968 İki etkenin biyolojik olarak aynı olduğu bulunmuş 1979 İki coğrafik bölgenin adına uygun olarak Kırım-Kongo Kanamalı Ateş Hastalığı Virüsü (Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus; CCHFV)
Virüs Yapısı Helikal nükleokapsit, 100 (80-120) nm, Zarflı, Gc ve Gn yüzey glikoproteinleri Hemaglütinasyon Hücreye bağlanmada İmmünite
Virüsün doğal döngüsü Doğada yerleşik fokal odaklar şeklindedir Yabani hayvan-kene arasında geçer Hayvanların aksine, keneler rezervuar Ekolojik dengenin bozulduğu durumlarda odaklar genişler
T.C. Sağlık Bakanlığı Türkiye Halk Sağlığı Kurumu KKKA nın Belirtileri Nelerdir? Yüksek ateş, Baş ağrısı, Yoğun halsizlik, Kollarda ve bacaklarda şiddetli ağrı, Bazen kusma, karın ağrısı veya ishal Yüzde kızarıklık, İlerleyen safhada vücudun değişik yerlerinde kanamalar, Gövde, kol ve bacaklarda morluklar, Burun kanaması, dışkıda ve idrarda kan görülebilir. 8
Kırım-Kongo Kırım-Kongo kanamalı kanamalı ateşi ateşi İnsanlara Kenelerle bulaşan en yaygın viral hastalık 30 dan fazla ülkede bildirilmiştir Avrupa, Asya, Afrika En son salgınlar: Güney Rusya Federal Eyaletleri (1999-) Kosovo (2000-) İran (2000-) Türkiye (2002-) Rezervuar Keneler Tavşan, kirpi, karga, sığır Taşıyıcı (vektör) Keneler Hyalomma türleri 1
Türkiye de son durum Dünyanın Dünyanın en büyük KKKA epidemisi epidemisi 2002-2013 2002-2013 300 ilçeye bağlı 3000 köy 8064 olgu 389 ölüm (%4.8) (%4.8)
Koruyucu Aşı Çalışmaları Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi Virüsünün Epidemiyolojisi, Moleküler Karakterizasyonu, Antijen ELISA Geliştirilmesi ve Koruyucu Aşı Çalışmaları. TÜBİTAK 1007 KAMAG PROJESİ Proje Yöneticisi: Prof. Dr. Aykut ÖZDARENDELİ Başlama-bitiş tarihi: 01.06.2010-01.06.2015 Bütçe: 3.125.718,6
KKKAH ve aşı çalışmaları KKKAH BULGAR AŞISI
Source: http://www.bulbio.com/chf.html
Antigen Inactivated antigen CCHF virus strain V42/81 Suckling mouse brain preparation inactivated by chloroform and heating at 580 C, and adsorbed on Al(OH)3 Source: http://www.bulbio.com/chf.html
Dosage At day 0 and 30 days later, s.c. Reimmunization 1 year after the first application Every 5 years after the first reimmunization Source: http://www.bulbio.com/chf.html
AMAÇ 1.Aşı geliştirilmesi A- İnaktif aşı geliştirilmesi; KKKAHV Kelkit izolatı kullanılarak SW-13 ve VERO E-6 gibi hücrelerde virüse karşı inaktif aşı üretilmesi, Geliştirilen inaktif aşısının fare beyninden üretilen aşı ile karşılaştırılması
KKKAHV Kelkit06 Suşunun Farklı Metotlarla Gösterilmesi Vero E6 kontrol KKKAH Kelkit06 infekte 5. gün A- Pseudo-plaque B- PAP metot C- FFA
KKKAH Kelkit06 Virüs titrasyonu (Pseudo-plaque Forming Unit)
KKKAHV Kelkit06 suşunun; üretilmesi, konsantre edilmesi, pürifikasyonu, aşı antijen haline getirilmesi.
18 saat, 24.000 rpm
Fraksiyonların SDS ve Western blot ile test edilmesi
175 T flask; 4-5 mikrogram aşı antijeni 1 adet fare beyni; 3-4 mikrogram aşı antijeni
DOZ GRUPLAR -5 mikrogr (6 Balb/c) -10 mikrogr (6 Balb/c) -20 mikrogr (6 Balb/c) - Kontrol (6 Balb/c) -1 7 aşılama kan alma tartma 14 20 21 28 35 41
Aşı Gruplarına Ait Ortalama ELISA Değerleri 1. İmmünizasyon 2. İmmünizasyon Gruplar 20 µg 10 µg 5 µg 20 µg 10 µg Fare Beyni 1:733 1:450 1:540 1:3200 1:4400 1:1450 1:40133 1:38400 1:24000 Hücre Kültür Kontrol 5 µg 3.İmmünizasyon 20 µg 10 µg 5 µg 1:1333 1:1600 1:450 1:234666 1:7040 1:7467 1:81920 1:72533 1:51200 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fare Beyni 102400 51200 25600 12800 6400 3200 1600 800 400 200 100 1. İmm. 5 ugr 10 ugr 20 ugr Kontrol 2. İmm. 3. İmm. Gün E LIZ ATitre(Log2) E L IZ AT itre(l o g2) Hücre Kültür 102400 51200 25600 12800 6400 3200 1600 800 400 200 100 1. İmm. 5 ugr 10 ugr 20 ugr Kontrol 2. İmm. 3. İmm. Gün
Fare Beyni Aşısı PPRNT50 2.İmmünizasyon 3. İmmünizasyon 20 µg 10 µg 5 µg 20 µg 10 µg 5 µg 1 1:10 1:10 1:5 1:40 1:10 1:5 2 1:40 1:10 1:5 1:160 1:10 1:5 3 1:40 1:10 1:10 1:120 1:10 1:15 4 1:5 1:5 1:10 1:20 1:5 1:10 5 1:5 1:5 0 1:5 1:10 0 6 1:5 1:5 0 1:10 1:10 0 Fare No
Hücre Kültür Aşısı PPRNT50 2.İmmünizasyon 3.İmmünizasyon 20 µg 10 µg 5 µg 20 µg 10 µg 5 µg 1 1:160 1:5 1:10 1:500 1:40 1:120 2 1:120 1:40 1:10 1:120 1:160 1:40 3 1:20 1:10 1:5 1:40 1:160 1:5 4 1:5 1:10 1:5 1:20 1:40 1:5 5 1:20 1:5 0 1:40 1:10 0 6 1:5 1:5 0 1:5 1:5 0 Fare No
Fare Beyni Aşısı 256 2.İmm. 2.Hafta 3.İmm. 2.Hafta NötralizanTitre(PRNT50) 128 64 32 16 8 4 Doz Grupları
SONUÇLAR ELISA titreleri ve, nötralize edici antikor titreleri farklı 3 immünizasyon gerekli 5ugr doz yetersiz hücre kültüründen hazırlanan KKKAH aşı adayı daha immünojenik.
KNOCKOUT FARE MODELİ IFNAR(--) FARE MODELİ, 2010 (İSVEÇ), STAT-1 FARE MODELİ, 2010 (KANADA), IFN geni çıkarılmış knockout fareler, IbAr10200 virüsü her iki fare modeli için letal.
IFNAR(--) FARE MODELİ ve KKKAHV Kelkit06 suşu
KKKAHV Kelkit06 suşu ve letalite çalışmaları 4 farklı virüs doz, Her grup 3 IFNAR fare Grup 1; 10.000 ppfu (i.p.) Grup 2; 1.000 ppfu (i.p.) Grup 3; 100 ppfu (i.p.) Grup 4; 10 ppfu (i.p.)
KLİNİK SKOR İNDEKSİ 0 1 2 3 4 5 Normal görünüm Tüy karışıklığı 1 2 Letarji+dehidrasyon Kambur+ ağrılı duruş Abdominal solunum+felç Ölüm 3 4 5
Klinik Skor İndeksi 5 101 102 103 104 4 3 2 1 0 0 24 48 72 96 Saat 120 144 168
Doz Çalışması Ağırlık Artışı (%) 10 101 102 103 104 0-10 -20-30 0 1 2 3 4 5 6 7 Enfeksiyondan sonraki günler 8
Doz çalışması 38 101 102 103 104 Sıcaklık (oc) 37 36 35 34 32 26 20 0 1 2 3 4 5 6 7 Enfeksiyondan sonraki günler 8
100-10.000 ppfu virüs verilen IFNAR fareler; 58-76. saatler arasında 10 ppfu verilen fareler; 165-172. saatler arasında öldüler.
KKKAHV Kelkit06 suşu ve letalite çalışmaları sonucunda; verilen bütün virüs dozlarının IFNAR farelerinde letal olduğu, 10 ppfu doz aralığında %100 letalitenin gerçekleştiği, ölümlerin hepsinin virüs spesifik olduğu belirlendi.
IFNAR FARELERİNDE HÜCRE KÜLTÜR TABANLI KKKAH İNAKTİF AŞI ÇALIŞMALARI
DOZ GRUPLAR -5 mikrogr (5 IFNAR) -20 mikrogr (5 IFNAR) -40 mikrogr (5 IFNAR) - Kontrol (3 IFNAR) -1 7 14 aşılama kan alma tartma çelınc (1.000 ppfu) 20 21 28 35 41 56
Aşı ve Kontrol Grupları Vücut Isıları 38 5 ugr 20 ugr 40 ugr Kontrol Sıcaklık (oc) 36 34 32 30 28 26 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Günler
Aşı ve Kontrol Grupları Ağırlık Artışları Ağırlık Artışı (%) 10 5 ugr 20 ugr 40 ugr Kontrol 0-10 -20-30 -40 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Günler
Klinik Skor Klinik Skor İndeksi 5 5 ugr 20 ugr 40 ugr Kontrol 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Günler
Nötralizan Titre (PRNT50) IFNAR -/- Aşı Nötralizan Titreler 1024 2. İmm. 3.İmm. 512 256 128 64 32 16 8 4 Gruplar
Aşı Doz Fare Notralizan Grupları Sayısı Antikor Titre (ortalama) Ölüm Zamanı (gün) Yaşam Oranı Ölüm oranı Mortalite (%) Koruyuculuk (%) 5 ugr 5 44.8 7 3/5 2/5 40 60 20 ugr 5 204.8 8 4/5 1/5 20 80 40 ugr 5 512 9 4/5 1/5 20 80
Study Title INACTIVATED CCHFV VACCINE: 4-DOSE INTRAMUSCULAR TOXICITY STUDY IN NEW ZEALAND WHITE RABBITS FOLLOWED BY A 2-WEEK RECOVERY PERIOD Author H.H. van Vugt, Ph.D. Test Facility WIL Research Europe B.V. Hambakenwetering 7 5231 DD 's-hertogenbosch The Netherlands Laboratory Study Identification Project 500909 Substances 204281/A+B and 204319/A+B
GELİNEN NOKTA KKKAH Kelkit06 suşundan hazırlanan hücre kültürü tabanlı inaktif aşı adayının; Preklinik çalışmaları tamamlanmıştır, Gerekli izinler alınmış olup; E.Ü. İyi Klinik Uygulamalar Merkezi nde, Faz I çalışmaları için aşamasındadır.
teşekkürler