Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMİNİN İNSAN ERİTROSİTLERİNDEN SAFLAŞTIRILMASI * Purification Of Superoxide Dismutase From Human Erythrocytes Hasan KARADAĞ Kimya Anabilim Dalı Ramazan BİLGİN Kimya Anabilim Dalı ÖZET Süperoksit Dismutaz (SOD), (E.C:1.15.1.1) süperoksitin hidrojen perokside dismutasyonunu katalizler. Bu çalışmada, SOD, DEAE-Selüloz kromatoğrafisi ve bakır-iminodiasetik asit-agaroz kromatoğrafisi kullanılarak izole edilmiştir. Enzim % 33,8 verimle 196,3 kat saflaştırılmıştır. SOD nin moleküler ağırlığı 2 g/mol olarak saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: Süperoksit Dismutaz, Saflaştırma, Eritrosit. ABSTRACT Superoxide Dismutase (SOD), (E.C:1.15.1.1) catalyzes the dismutation of the superoxide to hydrogen peroxide. In this study, SOD isolated by using DEAEcellulose chromatography and copper-iminodiacetic acid agarose chromatography. Enzyme was purified 196,3 fold and 33,8 % efficiency. Molecular weight of SOD was determined as 2 g/mol. Key Words: Superoxide Dismutase, Purification, Erythrocyte. Giriş 1938 de Mann ve Keilin, sığır kanından izole ettikleri bakır içeren mavi yeşil proteini, haemocuprein i tanımladılar.1953 de benzer bir protein at karaciğerinden izole edilmiş ve hepatocuprein olarak adlandırılmıştır. Beyinden cerebrocuprein gibi bu tip diğer protein sonradan izole edilmiştir. 197 de eritrosit proteinin bakır gibi çinko da içerdiği bulunmuştur. Bu proteinlerde hiçbir enzimatik reaksiyon görülmemiş olup bazen metal depolayıcıları olarak önerildiler. Buna karşın, 1969 da Mc Cord ve Fridovich, eritrosit proteinin süperoksit radikalini katalitikçe uzaklaştırabildiğini belirttiler. Bu eritrosit proteini bir süperoksit dismuataz enzimi (SOD) olarak fonksiyon göstermektedir.yoğun araştırmalara rağmen, SOD nin katalizlediği başka substrat bulunamamıştır. Demek ki SOD katalitikçe süperoksitlerin uzaklaştırılmasına spesifik görünmektedir. Bakır çinko içeren süperoksit dismutazlar olağan dışı bir şekilde kararlıdır. Eritrositlerden Cu-Zn SOD nin saflaştırılmasında, hücreler parçalanır. Hemoglobin kloroform ve etanol muamelesi ile ardından santrifüjleme ile ayrılır. Enzim organik faza girer, burada soğuk aseton eklenmesi ile çöktürülür. Ardından iyon değişim kromatografisi ile ileri derecede saflaştırılır. Birçok enzim böyle işleme dayanamaz. * Doktora Tezi-PhD. Thesis 5
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 Cu-Zn SOD, ısıya, proteazların saldırısına, guadinyum klorür, sodyum dodesil sülfat ve üre nin denetürasyonuna karşı oldukça dayanıklıdır (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Materyal ve Metod Materyal Kullanılan bütün kimyasallar analitik saflıkta olup, Sigma Firmasından, Almanya dan karşılanmıştır. Metod Enzimin saflaştırılması Hemoliz, diyaliz ve santrifüjleme 4 C de 1-15 gün sitrat-fosfat-dekstroz çözeltisinde bekletilmiş insan kanı kullanılmıştır. Eritrositler, düşük hızlarda 1 dakika, 3 r.p.m de santrifüjlenip, serum fizyolojik ile yıkanmıştır. Ardından 4 ml eritrosit alınıp, üzerine 4 C deki saf su eklenerek 1 ml ye getirilip, hemoliz edilmiştir. Hemolizat diyaliz keselerine konulup saf suya karşı diyaliz edilmiştir. Keselerden çıkan Cl -,,1 M AgNO 3 ile test edilmiştir. Cl - keseden çıkana kadar diyaliz edilmiştir. Diyaliz edilmiş hemolizat örneği 1 r.p.m de 2 dakika santrifüj edilmiştir. Supernatanlar toplanmıştır. DEAE-selüloz kromatoğrafisi 25 g DEAE-selüloz tartılıp, 4 ml 1,5 mm ph=6.8 fosfat tamponunda dengeye getirilmiştir. Trompta süzülüp, yine aynı tampon ile yıkanmıştır. DEAEselüloz, 4 ml 1,5 mm ph=6,8 fosfat tamponu unda tekrar dengeye getirilip, toplanan süpernatanlar (98 ml hemolizat) ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 1 saat magnetik karıştırıcıda karıştırılıp, 4 C de bir gece bekletilmiştir. Bu süre içerisinde süperoksit dismutaz, DEAE-selüloz üzerine adsorbe olmuştur. DEAE-selüloz-enzim çökeleği kolona doldurulmuş ve 2,6x1,5 cm lik yer kaplamıştır. Yani 56,2 ml lik çökelek elde edilmiştir. Kolon başlangıç tamponu ile yıkanarak, hemoglobinin çoğu uzaklaştırılmıştır. Süperoksit dismutaz, DEAE-selüloz dan 2 mm ph=6.8 fosfat tamponu kullanılarak elüe edilmiştir. 3,1 ml/dakika lık akış hızı ile 1 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. Aktivitesi yüksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmıştır. Bakır-iminodiasetik asit-agaroz kromatoğrafisi İminodiasetik asit-agaroz süspansiyonu kolona doldurulmuş ve 2,3x4,4 cm lik yer kaplamıştır. Yani 18,2 ml lik jel elde edilmiştir. Kolon 3 yatak hacmi saf su ile ardından 3 yatak hacmi 1 mg/ml CuSO 4.5 H 2 O ile yüklenmiştir. Kolon 5 yatak hacmi kromatoğrafi tamponu (5 mm NaCl içeren 5 mm ph=7, fosfat tamponu) ile yıkanmıştır (Bollag ve ark, 1996). Cu 2+ nin jelden ayrılıp ayrılmadığı 3 M KI ile test edilmiştir. Enzim çözeltisi, kromatoğrafi tamponu ile 1:1 oranında seyreltilmiştir. 1 ml enzim çözeltisi Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonuna yüklenmiştir. Kolona kromatoğrafi tamponundan 2 ml eklenip, kolonun altından 2 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. Bu işlemden sonra süperoksit dismutaz 5 mm NaCl içeren 5 mm Tris HCl ph=8, ile elüe edilmiştir (Asano ve ark, 1986). 1 ml/dakika lık akış hızı ile 51
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 2 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. Aktivitesi yüksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmıştır. Süperoksit dismutaz tayini SOD, oksidatif enerji üretimi sırasında oluşan toksik süperoksit radikallerinin (O2 -) hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dismutasyonunu hızlandırır. Bu yöntem, ksantin ve ksantin oksidaz (XOD) kullanılarak oluşturulan süperoksit radikallerinin (1), nitro blue tetrazolium (N.B.T) ile meydana getirdiği mavi renkli formazan boyasının 56 nm dalga boyunda verdiği optik dansititenin (OD) okunması esasına dayanmaktadır. Örnekte bulunan SOD, süperoksit radikallerini ortamdan uzaklaştırarak 2 numaralı formazan reaksiyonunu inhibe eder. SOD nin bir ünitesi deneme koşulları altında N.B.T indirgenme hızının % 5 inhibisiyonudur (Sun ve ark, 1988). Ksantin XOD Ürik asid + O 2 - (1) N.B.T.+ O2 - formazan boyası (2) O 2 - + O 2 - + 2H+ SOD O 2 + H 2 O 2 (3) Protein Tayini Protein tayini metodu Lowry ve ark (1951), tarafından önerilen yönteme göre yapılmıştır. Moleküler ağırlık tayini Laemmli (197), tarafından bildirilen yöntem kullanılmıştır. Araştırma Bulguları Materyal ve metod bölümünde belirtilen şekilde eritrositler hemoliz ve diyaliz edilmiştir. Ardından santrifüjlenip, elde edilen süpernatanlar (98 ml), DEAE- Selüloz kolonuna yüklenmiş, 1,5 mm ph=6,8 fosfat tamponu ile yıkanmıştır. Süperoksit dismutaz, DEAE-selüloz kolonundan 2 mm ph=6,8 fosfat tamponu kullanılarak elüe edilmiştir. 5 tüpe 1 ml lik fraksiyonlar toplanmıştır. DEAE- Selüloz kolonundan alınan her bir fraksiyonda 28 nm de protein miktarı için, 45 nm de hem grubu için absorbans değerleri okunmuş ve bu değerler şekil 1 de gösterilmiştir. DEAE-Selüloz kolonundan alınan 1 ml lik fraksiyonlarda aktivite ve protein tayin işlemleri materyal ve metod bölümünde anlatıldığı şekilde yapılmıştır. ü/ml olarak bulunan aktivite değerleri ile birlikte proteinin neden olduğu absorbans değerleri şekil 2 de, ü/mg protein olarak ifade edilen spesifik aktivite değerleri ise şekil 3 de gösterilmiştir. Aktivitesi yüksek olan fraksiyonlar biraraya toplanmıştır. 52
Aktivite (ü/ml) Absorbans Absorbans (A) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 1 2 3 4 5 6 28 nm 45 nm Şekil 1. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonların 28 nm ve 45 nm deki absorbans değerleri. Kolon Boyu: 2,6x1,5 cm Kolondan Akış Hızı: 3,1 ml/dakika Dengeleme Tamponu: 1,5 mm ph=6,8 fosfat tamponu Elüsyon Tamponu: 2 mm ph=6,8 fosfat tamponu 25 2 15 1 5 Aktivite(ü/ml) 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 Absorbans,28 nm 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 Şekil 2. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonlarda aktivite ve 28 nm deki absorbans değerleri. 53
Spesifik Aktivite (ü/mg) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 5 45 4 35 3 25 2 15 1 5 1 2 3 4 5 Şekil 3. DEAE-Selüloz kolonundan alınan fraksiyonlarda spesifik aktivite değerleri. DEAE-Selüloz kolonundan alınan yüksek aktivite gösteren enzim çözeltisi, kromatoğrafi tamponu (5 mm NaCl içeren 5 mm ph=7, fosfat tamponu) ile 1:1 oranında seyreltilip, 1 ml si Cu 2+ ile yüklenmiş iminodiasetik asit-agaroz kolonuna yüklenmiştir. Kolonun ağzı açılıp, kromatoğrafi tamponundan 2 ml eklenip, alttan 2 ml lik fraksiyonlar alınmıştır. Bu işlemlerden sonra süperoksit dismutaz 5 mm NaCl içeren 5 mm Tris HCl ph=8, ile elüe edilmiştir. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonların 28 nm ve 45 nm deki absorbans değerleri şekil 4 de gösterilmiştir. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan 2 ml lik fraksiyonların aktiviteleri ölçülüp, 28 nm de verdikleri absorbanslarla grafiğe geçirilmiştir (şekil 5). Ayrıca her fraksiyonun protein içeriği belirlendikten sonra spesifik aktiviteler hesaplanıp grafiğe geçirilmiştir (şekil 6). 54
Aktivite (ü/ml) Absorbans Absorbans (A) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6,35,3,25 28 nm 45 nm,2,15,1,5 1 2 3 4 5 6 Şekil 4. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonların 28 nm ve 45 nm deki absorbans değerleri. 1 ml lik fraksiyona kadar kolon 5 mm NaCl içeren 5 mm ph=7, fosfat tamponu ile ardından 5 mm NaCl içeren 5 mm Tris HCl ph=8, ile yıkanmıştır. Kolon Boyu: 2,3x4,4 cm Kolondan Akış Hızı: 1 ml/dakika Dengeleme Tamponu: 5 mm NaCl içeren 5 mm ph=7, fosfat tamponu Elüsyon Tamponu: 5 mm NaCl içeren 5 mm Tris HCl ph=8, tamponu 6 Aktivite (ü/ml) Absorbans,28 nm,35 5,3 4,25,2 3,15 2,1 1,5 1 2 3 4 Şekil 5. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonlarda aktivite ve 28 nm deki absorbans değerleri. 1 ml lik fraksiyona kadar kolon 5 mm NaCl içeren 5 mm ph=7, fosfat tamponu ile ardından 5 mm NaCl içeren 5 mm Tris HCl ph=8, ile yıkanmıştır. 55
Spesifik Aktivite (ü/mg) Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 5 1 15 2 25 3 35 4 Şekil 6. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan fraksiyonlarda spesifik aktivite değerleri. 1 ml lik fraksiyona kadar kolon 5 mm NaCl içeren 5 mm ph=7, fosfat tamponu ile ardından 5 mm NaCl içeren 5 mm Tris HCl ph=8, ile yıkanmıştır. Cu-iminodiasetik asit-agaroz kolonundan alınan yüksek aktivite gösteren proteinler biraraya toplanmış, hacim ölçümü, protein tayini, aktivite ölçümü yapılmıştır. Saflaştırma basamakları çizelge 1 de gösterilmiştir. Çizelge 1. Saflaştırma tablosu. Saflaştırma V T C Toplam Aktivite Toplam Spesifik Verim Saflaştırma Basamağı (ml) protein protein (ü/ml) Aktivite Aktivite (%) Oranı (mg/ml) (mg) (U) (U/mg) Hemolizat 1 95,852 9585,2 735,95 73595 7,68 1 1 Ultrasantrifüj 98 89,593 878,1 747,39 73244 8,34 99,5 1,1 DEAE- 38,687 261,1 16,77 4573 155,41 55,1 2,2 Selüloz Kolonu Bakır Şelat Kolonu 532,31 16,5 46,74 24866 157,74 33,8 196,3 56
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 DEAE-Selüloz kolonundan ve bakır-iminodiasetik asit agaroz kolunundan geçirilerek saflaştırılmış olan süperoksit dismutaz enziminin Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) yapılmıştır. Aynı şartlarda sığır albumini (68 g/mol), ovalbumin (45 g/mol), α-chymotrypsin (25 g/mol), sitokrom C (12 5 g/mol) nin elektroforezi yapılmıştır. Enzimin elektroforez sonuçları şekil 7 de verilmiştir. 1 2 3 4 5 6 Şekil 7. Süperoksit dismutaz enzimine ait SDS-PAGE elektroforez sonuçları. 1. Sığır albumini (68 g/mol), 2. Ovalbumin (45 g/mol), 3. α-chymotrypsin (25 g/mol), 4. Sitokrom C (12 5 g/mol), 5. β-merkaptoeteanol lü ortamda SOD, 6. β-merkaptoeteanol süz ortamda SOD. β-merkaptoeteanol lü ve β-merkaptoeteanol süz ortamda Süperoksit Dismutaz ın molekül ağırlığı 2. g/mol olarak hesaplanmıştır. Tartışma ve Sonuçlar Inouye ve ark. (1985), yaptıkları çalışmada sığır eritrositlerinden Cu,Zn- SOD yi (E.C.1.15.1.1) saflaştırmışlardır. Aseton ile çöktürüp, yüksek performanslı iyon değiştirici, TSK-GEL DEAE-5PW kolonuna yüklemişlerdir. Enzimi, NaCl ün dan,3 M a değişen konsantrasyonuyla elüe etmişlerdir. 38 ünite/mg prot. spesifik aktivitesine sahip saf protein elde etmişlerdir. Weselake ve ark. (1986), Cu,Zn-SOD yi insan kırmızı hücrelerinden DEAE- Sefaroz ve bakır şelat afinite kromatoğrafisi kullanarak izole etmişlerdir. Enzimin 38 ünite/mg protein spesifik aktivitesine ulaşmışlardır. Öztürk ve ark. (21), tavuk karaciğerinden SOD yi saflaştırmış ve kısmen karakterize etmişlerdir. SOD yi DEAE-iyon kromatoğrafisi ve Sefhadeks G-75 jel 57
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 filtrasyon kromatoğrafisi ile % 7,3 lük verimle 286 kez saflaştırmışlardır. 4818,2 U/mg spesifik aktivitesine ulaşmışlardır. Aydemir ve ark. (21), SOD yi tavuk eritrositlerinden saflaştırmış ve kısmen karakterize etmişlerdir. Eritrosit membranlarını Triton X-1 ün varlığında dondurup-çözme metodu ile parçalamışlardır. Etanol çöktürmesinden sonra, SOD içeren çözeltiyi DEAE-Selüloz ve ardından Sephadex G-1 jel kolonlarına uygulamışlardır. Tavuk eritrosit SOD sini % 26 verimle 58 kez saflaştırmışlardır. 8 48 U/mg spesifik aktivitesine ulaşmışlardır. Mavi ve ark. (26), Cu-Zn SOD enzimini insan eritrositlerinden, hemoglobini uzaklaştırmak için etanol-kloroform ile etkileştirmişler, ardından iyon değişim kromatoğrafisi (DEAE-Sefaroz) ve bakır şelat ilgi kromatoğrafisi tekniklerini kullanarak % 12 verimle 837 kez saflaştırmışlardır. Bu çalışmada, SOD, DEAE-Selüloz ve bakır-iminodiasetik asit-agaroz kromatoğrafisi kullanılarak saflaştırılmıştır. % 33,8 verimle 196,3 kez saflaştırılmıştır. SOD nin moleküler ağırlığı 2 g/mol olarak hesaplanmıştır. Kaynaklar HALLIWELL B., GUTTERIDGE J. M. C., 1999. Free Radicals In Biology And Medicine. Third Edition, Oxford University Press Inc., New York, 936s. BOLLAG D.M., ROZYCKI, M.D., EDELSTEIN,S.J., 1996. Protein Methods.Willey-Liss, Inc., New York, 415s. ASANO, M.M., ITO K., IKEDA H., SEKIGUCHI, S., 1986. Purification Of Copper-Zinc-Superoxide Dismutase And Catalase From Human Erythrocytes By Copper-Chelate Affinity Chromatography. Journal Of Chromatography A, 37: 51-57. SUN Y., OBERLEY L.W., LI Y., 1988. A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin. Chem., 34: 497-5. LOWRY O.H, ROSEBROUGH N.J, FARR A.L., RONDALL, R.J., 1951. Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem., 193: 261-275. LAEMMLI U.K., 197. Cleavage Of Structural Proteins During The Assembly Of The Head Of Bacteriophage T4. Nature, 227: 68-685. INOUYE,K., NAKAMURA, K., MITOMA, Y., MATSUMOTO, M., IGARASHI, T., 1985. Application Of A New Ion Exchanger TSK-GEL DEAE-5PW, To The Purification Of Cu,Zn-Superoxide Dismutase Of Bovine Erythrocytes. Journal Of Chromatography A, 327: 31-311. WESELAKE R.J., CHESNEY S.L., PETKAU A. AND FRIESEN A.D., 1986. Purification Of Human Copper, Zinc Superoxide Dismutase By Copper Chelate Affinity Chromatography. Analytical Biochemistry, 155(1):193-197. ÖZTÜRK ÜREK, R., TARHAN L., 21. Purification And Characterization Of Superoxide Dismutase From Chicken Liver. Comparative Biochemistry And Physiology Part B 128: 25-212. 58
Ç.Ü Fen Bilimleri Enstitüsü Yıl:28 Cilt:17-6 AYDEMİR T., TARHAN L., 21. Purification And Partial Characterisation Of Superoxide Dismutase From Chicken Erythrocytes. Turkish Journal Of Chemistry, 25: 451-459. MAVI, A., KÜFREVIOĞLU, Ö.İ., YILDIRIM A., 26. Effects Of Some Drugs On Purified Human Erythrocyte Cu,Zn SOD And İn Vitro İnhibitiory Effect Of 5- Fluorouracil On Leukocyte Total SOD Activity. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 21(2): 235 239. Teşekkür F.E.F 23 D 17 Proje numaralı doktora çalışmasını destekleyen Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ne teşekkür ederiz. 59