MOLEKÜLER BİYOLOJİ Dr. ismail Bezirganoglu
DNA YAPISI Kimyasal anlamda DNA, nükleotid denilen yapıtaşlarından oluşan bir zincirdir. Her nükleotid bir şeker, bir baz ve bir fosfat dan oluşur. Bu bölümün amacı, DNA nın yapısını, canlı hücre içindeki göreviyle birlikte tanımlamaktır.
Primer yapı: Nükleik asitlerin bileşenleri DNA ve RNA olmak üzere iki grupta toplanır. Nükleotid denilen alt birimlerden meydana gelmiştir. NÜKLEOTİD= BAZ+ŞEKER+FOSFORİK ASİT
NÜKLEOTİDLER-NÜKLEİK ASİTLERİN YAPI TAŞLARI Nükleotid= azotlu baz + pentoz şekeri ( 5 karbonlu) + fosfat grubu içerirler
AZOTLU BAZLAR: İKİ ÇEŞİTTİR 9 atomlu, iki halkalı pürinler (Adenin, Guanin) 6 atomlu tek halka içeren pirimidinler (Sitozin, Timin, Urasil) A,C,G,T ve U şeklinde simgelenirler. A,G,C DNA ve RNA da ortak bulunur T->DNA da, U->RNA da bulunur.
ŞEKER= PENTOZ Nükleik aside adını taşıdığı şeker verir. Ribonükleik asitlerde-riboz Deoksiribonükleik asitlerde-deoksiriboz bulunur. Deoksiribozun ribozdan farkı C-2 pozisyonunda OH grubu olmamasıdır.
Nükleozit- baz + şeker NMP = nükleozit + 1 PO 4 NDP = nükleozit +2 PO 4 NTP = nükleozit + 3 PO 4 Nükleik asitlerin yapı taşıdır özel NTPs: ATP & GTP Nükleik Asit Kimyası
NÜKLEOTİTLERDE BAĞLANMA Nükleotid yapısındaki bağlar son derece özgüldür. Şekerin C-1 atomu azotlu bazla kimyasal bağ yapar. Pürinlerde N-9, pirimidin ise N-1 atomu şekerin C-1 atomu ile bağ yapar. Nükleotidlerde fosfat grubu, şekerin C-2, C-3 yada C-5 atomu ile bağ kurar. Bu yapı, biyolojik sistemlerde en yaygın olan ve DNA ve RNA da bulunandır.
POLİNÜKLEOTİTLER İki mononükleotit arasında bağ yapısında, iki şekere bağlı fosfat grubu yer alır oluşan bağ fosfodiester bağıdır, çünkü fosforik asit her iki taraftaki alkol grubu ( iki şekerdeki OH grubu ) ile ester bağı yapar. Aynı bağ, RNA da da bulunur. dinükleotitler & trinükleotitler oligonükleotitler (<20) polinükleotitler (>20) Uzun polinükleotid zincirleri varyasyon sağlamaktadır. 1000 nt oluşan bir zincir 4 1000 kombinasyon ile oluşturulabilir. Levene nin tetranükleotid hipotezi bu varyasyonu sağlamamaktadır.
FOSFODİESTER BAĞLARI DNA VE RNA NIN KOVALENT İSKELETİDİR
DNA Ve RNA Zincirinin UzunluĞu Hücresel RNA lar 100 nükleotitden daha kısa olandan birkaç bin nükleotit uzunluğa kadar geniş bir aralıkta olabilir. Nükleotitlerin nt veya bazların sayısı bir uzunluk ölçüsü olarak kullanılır. Hücresel DNA molekülleri birkaç yüz milyon nükleotit uzunluğunda olabilir. Baz çifti (bp) sayısı, çift zincirli DNA nın uzunluk ölçüsü olarak kullanılır. DNA için kullanılan uzunluk birimi 1000 baz çiftine karşılık gelen kilobaz çifti (kb) veya 1,000,000 baz çiftine karşılık gelen megabaz çifti (Mb)
5 Ve 3 Nün Önemi Bir nükleik asit zincirinin 5 ve 3 polaritesi, molekülün oldukça önemli bir niteliğidir. Bu polaritenin anlaşılması replikasyonun ve transkripsiyonun yönünün anlaşılması DNA zincirinin okunması ve laboratuvardaki çalışmalarının gerçekleşmesi için önemlidir. Genel olarak bir DNA veya RNA zinciri 5 ucu solda, 3 ucu sağda olacak şekilde yazılır.
DNA Nın Sekonder Yapısı 1940-1953 Erwin Chargaff, Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Linus Pauling, Francis Crick, James Watson arasında yarış 1953 yılında Nature- The Double Helix yayını ile sona ermiştir. Watson- Crick için yapıyı aydınlatmadaki en önemli kaynaklar Ø Hidrolize edilmiş DNA nın baz kompozisyon analizleri Ø DNA nın X ışını kırınımı çalışmalarıdır.
Watson ve Crick in ortaya çıkardığı gibi DNA genelde hücrede birbirine sarılan çift zincir olarak yer alır. çift zincirli DNA (ds DNA) veya dubleks DNA olarak da ifade edilen DNA çift sarmalı, bazı virüslerde bulunan tek zincirli DNA (ssdna) dan farklıdır. DNA nın yapısı, organizmaların üreme ve gelişmesi için gerekli olan genetik bilgiyi çoğaltmalarına ve muhafaza etmelerine izin verir. Çeşitli kimyasal kuvvetler, DNA, çift sarmalının oluşumunu sağlar. Bunlar bazlar arasındaki hidrojen bağları ile bazların kümeleşmesine yol açan hidrofobik etkileşimleri içerir.
BAZLAR ARASıNDA HIDROJEN BAĞLARı OLUŞUR Termodinamik olarak kararlı hidrojen bağları, birbirine sarılan DNA zincirlerinin karşılıklı zincirlerdeki azotlu bazlar arasında oluşur. Bazlar arasındaki hidrojen bağları komp lementer baz eşleşmesi olarak ifade edilir.
BAZ ISTIFLENMESI, DNA ÇIFT SARMALıNA KIMYASAL KARARLıLıK SAĞLAR Bazlar nükleotid oluşturmak üzere bir şekere bir fosfata bağlandığında, suda çözünebilir hale gelirler fakat yine de çözünmezlikleri hala çözeltideki DNA nın tam konformasyonu üzerinde büyük sınırlamalara sebep olur. Eşleşmiş nispeten yassı bazlar sarmal dönüş sebebiyle birbirlerinin üzerine istiflenme, raflaşma yığılma eğilimindedirler. Çift zincirli DNA nın bu özelliği baz istiflenmesi olarak bilinir.
CHargaff Kurali Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine parçalandığında serbest kalan nukleotidlerde adenin miktarının timine, guanin miktarının da sitozine daima eşit olduğunun saptanmasıdır. Yani Chargaff kuralı na göre doğal DNA moleküllerinde adeninin timine veya guaninin sitozine oranı daima 1 e eşittir. (A/T=1 ve G/C=1) Pürinler= pirimidinler (A+G=T+C) İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek böyle özelliklere sahip DNA makro molekülünün sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler.
X-IŞINI KIRINIMI DNA zincirleri X-ış ını bombardımanına tutulur ve molekülün atomik yapısına göre saçtığı ışınlar belirlenir. Buna göre; 1947- William Astbury DNA da 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu ileri sürmüştür. 1950-1953- Rosalind Franklin 3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA nın bir çeşit sarmal yapıda olduğunu daha saf örnekler kullanara gösterebilmiştir.
Sağ el sarmalının uzaydaki konformasyonu, Watson Crick in verilerine en uygun olanıdır. DNA daki baz eşleşmesi modelin genetik açıdan en önemli özelliğidir. Bu yerleşim nedeniyle eksen boyunca büyük ve küçük oluklar ortaya çıkar.
DNA ÇİFTE SARMALINDA ZİNCİRLER BİRBİRLERİNİN TAMAMLAYICISIDIR.
DNA molekülü kendini oluşturan nukleotidlerin sayısına bağlı olarak, büyüklüğü türden türe değişen, uzun zincir şeklinde bir yapı gösterir. İnsanda bu zincirin uzunluğu açıldığında 2 metreye kadar varabilir. Bütün halinde eldesi zincirin hassas ve kırılgan yapısından ötürü çok güçtür. Nukleotidlerin yapısı bazik olmasına karşın oımurgadaki PO4(fosforik asit) grubunun varlığı polinükleotid zincirlerin asit özellikte olmalarına yol açar ve nükleik asit terimi de bu özellikten kaynaklanır. DNA çift sarmalının dikkate değer ve önemli bir özelliği, molekülü oluşturan zincirlerin birbirlerinden kolaylıkla ayrılabilmesi ve yeniden birleşebilmesidir. Protein sentezi ve DNA replikasyonu (kendi kopyasını oluşturması) bu özellik sayesinde meydana gelebilir. DNA nın iki zinciri, birbirine sadece H bağları ve hidrofobik etkileşimlerle bağlı olmaları nedeni ile, nükleotidleri arasındaki kovalent bağlardaki herhangi bir kopma olmaksızın çözülebilir (denatürasyon). Aynı şekilde çözülmüş molekülün zincirleri tamamlayıcı bazları arasında H bağlarının oluşumu ile birleşip sarmal yapıyı yeniden oluşturabilir (renatürasyon).
DNA NIN FORMLARI Tek-krista-X-ışını analizi çalışmaları ile 5 A luk çözünürlük 1 A a kadar düşürülmüştür. A-DNA right handed (11 baz/ 1 tam dönüş/çap 23 Å) yüksek tuz kons. Yada dehidrasyon koşullarında baskındır. B-DNA right handed (normal, 10 baz/tdönüş, çap 20 Å) Z-DNA left handed (all GC, 12 bases/turn, 18 Å) Fizyolojik koşullarda rasgele bir DNA dizesinde en stabil form B formudur. A formu su dışında birçok çözeltide oluşan bir formdur. Z formu: sola doğru dönen heliks yapısındadır. Z formu bazı genlerin ekspresyonlarının regulasyonunda rol alabilir.
FARKLI DNA FORMLARININ ÖZELLİKLERİ
FArkli DNA Formlari
DNA-RNA Double stranded - single stranded RNA da T yerine U bulunur.tipleri mrna, rrna, trna snrna (RNA processing) Telomerase RNA (replikasyon) antisense RNA (regulasyon)
DNA VE RNA ARAŞTIRMALARINDA KULLANILAN ANALİTİK YÖNTEMLER U.V ışığının soğurulması (254-260 nm arasında en fazla) Çökelme Davranışı- Nükleik asitler çeşitli gradiyent santrifügasyon işlemleri ile ayrılabilirler. Çökelme özelliğ i m o l e k ü l ü n yoğ unluğ u, k ü t l e s i v e biçimine bağ l ı d ı r v e Svedberg katsayısı (S) olarak ölçülür.
NÜKLEİK ASİTLERİN DENATÜRASYONU VE RENATÜRASYONU DNA nın denatürasyonu sonucu H- bağları kopa, çift zincir çözülür ancak kovalent bağlar kırılmaz. Isı yada kimyasal yolla olabilir. Denatürasyon sırasında DNA akışkanlığı azalır, U.V absorbsiyonu ve denge yoğunluğu artar. Isı sonucu oluşan denatürasyona erime-melting denir Isıtılan DNA nın U.V absorbsiyonundaki artışa hiperkromik kayma denir. Erime sırasında, DNA nın 260 nmdeki absorbsiyonu sıcaklığa karşı grafiklenirse br erime profili elde edilir. Bu eğrinin orta noktasına erime sıcaklığı (Tm) denir. DNA zincirinin %50 sinin açıldığı sıcaklıktır.
DNA NIN ISI İLE DENATÜRASYONU
DNA NIN DENATÜRASYONU
KISMEN DENATÜRE DNA
DNA HİBRİDİZASYONU DNA çifte sarmalı ve RNA denatüre olabilir. A n n e a l : D e n a t ü r e segmentin tekrar çifte sarmal oluşturması Farklı türlerin nükleik asidleri hibrid formlar oluşturabilirler. Türler ne kadar yakınsa hibridizasyon o kadar kolay gerçekleşir. Nükleotidler ve nükleik asidler non enzimatik transformasyona uğrarlar.
KROMOZOM YAPISI VE DNA ORGANİZASYONU
İnsan genomu 3 x 10 9 bp İnsan diploidtir, her çekirdek 6 x 10 9 bp yada 2 m DNA içerir 5-10 µm çapındaki çekirdeğe nasıl sığmaktadır?
DNA MOLEKÜLÜNÜN BÜYÜKLÜĞÜNÜN HÜCRENİN BOYUTLARI İLE KIYASLANMASI
DNA NIN KROMOZOMLARDA PAKETLENMESİ Kromozomlar içerdikleri DNA moleküllerinden çok daha kısadırlar. Bu nedenle DNA nın kromozomlara paketlenmesi için hayli organize bir paketleme sistemi gereklidir. Ökaryotlarda DNA kromatin şeklnde düzenlenmiştir. DNA paketlenmesi ile ilgili ilk veriler 1970 lerde biyokimyasal analizler ve EM çalışmalarından elde edilmiştir. İlk bilgiler DNA nın DNA-binding proteinler olarak da bilinen histonlar ile ilişkili olduğu idi. Ancak ayrıntılı yapı billinmiyordu. 1973-74 yıllarnda birkaç araştırma grubu kromatinler (DNAhiston kompleksi) üzerinde nüklease protection assay i yapmışlardır. DNA-histon kompleksi enzimlerle muamale edildiğinde DNA sadece histon proteinlerinin yer almadığı bölgelerden kesilmiştir. Yaklaşık 200 bç uzunluğunda pekçok fragment oluşmuştur. Bu gözlem enzimatik parçalanmanın gelişigüzel olmadığını göstermiştir.
DNA NIN KROMOZOMLARDA PAKETLENMESİ Kromozomlar içerdikleri DNA moleküllerinden çok daha kısadırlar. Bu nedenle DNA nın kromozomlara paketlenmesi için hayli organize bir paketleme sistemi gereklidir. İnterfaz sırasında, genetik madde ve ilgili proteinler açılırlar ve nükleusun içinde kromatin olarak dağılırlar. Mitoz başladığında kromatin yoğunlaşır ve pofaz sırasında bilinen tipik kromozomlar şeklini alır. Bu yoğunlaşma, her birkromozom ipliğinin boyunun 10.000 kez kısalmasını sağlar. DNA paketlenmesi ile ilgili ilk veriler 1970 lerde biyokimyasal analizler ve EM çalışmalarından elde edilmiştir. İlk bilgiler DNA nın DNA-binding proteinler olarak da bilinen histonlar ile ilişkili olduğu idi. Ancak ayrıntılı yapı billinmiyordu. 1973-74 yıllarnda birkaç araştırma grubu kromatinler (DNA-histon kompleksi) üzerinde nüklease protection assay i yapmışlardır. DNA-histon kompleksi enzimlerle muamale edildiğinde DNA sadece histon proteinlerinin yer almadığı bölgelerden kesilmiştir. Yaklaşık 200 bç uzunluğunda pekçok fragment oluşmuştur. Bu gözlem enzimatik parçalanmanın gelişigüzel olmadığını göstermiştir.
Ada ve Donald Olins, taneciklerin kromatin zinciri ekseni boyunca düzenli olarak yerleştiğini ve bir zincir üzerindeki boncukları andırdığını söylemişlerdir. (v-body, nu, nükleozomlar) Nükleozom-DNA etkileşimi çalışmaları; H2A, H2B, H3 ve H4 histonlarının (H2A)2, (H2B)2, (H3)2 ve (H4)2 şeklinde iki tip tetramer oluşturduğunu göstermiştir. Nükleozom yapısındaki 4 protein: H2A, H2B, H3, ve H4 H3 ve H4 are arjinice zengin, yüksek oranda korunmuş H2A ve H2B lizince daha zengin Arjinin ve lizin histidin, histon proteinlerinin bazik ve pozitif yüklü olmasına neden olur. Kornberg- tekrarlayan herbir nükleozomda bu iki tetramerden birer tane olduğunu yaklaşık 200 bç lik DNA ile birleştiğini iler sürmüştür. Nükleaz ile parçalama işlemi biraz kısa tutulursa, 200 bç lik DNA dan bir kısmı nükleozomdan ayrılır ve 196 bç içeren Nükleozom kor Partikülü elde edilir. Bu sayı çalışılan tüm organizmlarda aynıdır. 1984- Finch ve Klug X ışını analizleri ile detaylı nükleozom yapısı-196 bç lik çekirdek DNA, nükleozom başına 1.7 dönüş yapacak şekilde histon oktamerinin etrafını sola doğru süper sarmal yaparak sarar.
HİSTONLAR KÜÇÜK BAZİK PROTEİNLERDİR
NÜKLEOZOM YAPISINDAKİ BEŞİNCİ PROTEİN, H1 H1, nükleozomun bir parçasıdır anck oktomerin dışında gibi görülür H1 organizmalar ve dokular arasında farklılıklar gösterir.
NÜKLEOZOM PROTEİN ÇEKİRDEĞİ
2nm çapındaki DNAà 11 nm çapında nükleozomà 30 nm kromatin iplikleri (solenoid) oluşturur. Mitotik kromozom yapısında; sayısız 30 nm solenoidlerà 300 nm çapında kromatin ipliklerià m e t a f a z kromzomundaki kromozom kolları olan kromatidleri oluş t u r m a k ü z e r e kıvrılırà 700 nm çapında kromatità kardeş kromatitlerà 1900 nm uzunluğunda kromozom
Packaging DNA Histone octomer Histone proteins B DNA Helix 2 nm
Packaging DNA Histone octomer Histone proteins B DNA Helix 2 nm
Packaging DNA 11 nm Histone octomer Histone proteins B DNA Helix 2 nm Nucleosome
Packaging DNA Histone H1
DNA Paketlenmesi Histone H1
DNA Paketlenmesi Beads on a string 11 nm Tight helical fiber 30 nm Looped 200 nm Domains Protein scaffold
DNA Paketlenmesi Nucleosomes 11 nm 30 nm Tight helical fiber Metaphase Chromosome 200 nm 700 nm Looped Domains B DNA Helix 2 nm Protein scaffold
BİR ÖKARYOTİK KROMOZOMDA DNA NIN KATLANMA MODELİ
Kromatin: Bölünmeyen ökaryotik hücredeki kromozomal materyale denir. Amorftur ve nükleus ta rasgele dağılmıştır. Histon: Bir kromatinde DNA nın sıkıca bağlantılı olduğu proteinler Nükleozom: Histonlar ve DNA nükleozom adı verilen yapılar üniteler içinde katlanırlar.
HETEROKROMATİN YAPISI Kromatin Tipleri 1928- interfazda kromozomun bazı kısımlarının açılmadan kaldığı ve koyu boyandığı bulunmuştur. Heterokromatin DNA nın en fazla kondanse olduğu yerdir, ve genellikle transkripsiyonel aktivesi yoktur. Ya gen içermezler yada yada baskılanmış genleri içerirler. Hücre döngüsünün S fazında ökromatinden daha sonra replike olurlar. Ökaryotik DNAların bazı bölgelerinin protein kodlamadığına dair ilk ipuçlarını vermiştir. Sentromer ve telomer bölgeleri heterokromatinden oluşur. Y kromozomunun büyük kısmı ve Barr cisimciği olarak bilinen inaktif X kromozları hetrokromatiktir. Position effect (Durum etkisi): belirli heterokromatik bölgeler aynı kromozom üzerinde yer değiştirdiğinde ya da homolog olmayan başka bir kromozoma geçtiğinde, bu bölgede genetik olarak aktif olan kısımlar, eğer yanlarına transloke olmuş heterokromatin gelirse bazen inaktif hale geçerler. Yani bir genin yada bir gen grubunun diğer genetik maddeye göre göreceli durumları onların ifadelerini etkileyebilir. Ökromatin Aktif genlerin yer aldığı bölgelerdir genellikle daha az kondansedir.
KROMOZOM BANTLAMA TEKNİĞİ Sitolojik öntemler kullanarak kromozomların uzun eksenleri boyunca farklı boyanmalarını sağlayan bantlama teknikleri geliştirilmiştir. Pardue ve Gallà C-bantlama; Kromozom preparatları ısı ile denatüre edilip sonra Giemsa ile boyanırsa özgül boyama profilleri ortaya çıkar.kromozomların heterokromatin özelliğindeki sentromer bölgeleri boyayı kolaylıkla alır. Caspersson ve arkà Q bantlama; metafaz kromozomlarını florokrom kuinakrin mustard ile muamele edip floresan mikroskobunda inceleyerek 23 çift insan kromozomunu ayırt etmişlerdir. R-bantlama; G-bantlarının tersi bir profil gösterir. 1971à Paris te, G bant profilleri temel alınarak insan kromozomlarının bant paternlerinin ortak sınıflandırmasını sağlayan bir toplantı yapılmıştır.
JUNK DNA 1960 ların sonlarına doğru makalelerde ökaryotik DNA nın büyük miktarda tekrar eden ve protein olarak kodlanmayan diziler içerdiği rapor edilmiştir. (Britten and Kohne, 1968). 1970, Junk DNA terimi non-coding DNA için kullanılmıştır. (Ohno, 1972).
JUNK DNA TİPLERİ Nowak (1994) 9 tip junk DNA Bunlar 3 büyük grupta toplanır. 1 Repetitive DNA sequences 2 Untranslated parts of RNA transcripts (pre-mrna) 3 Other non-coding sequences
REPETİTİVE DNA Repetitive DNA tipleri: 1. Satellites 2. Minisatellites 3. Microsatellites 4. Short (300 bp) ve Long (up to 7,000 bp) Interspersed Elements (SINEs and LINEs)
REPETİTİVE DNA Genom büyüklüğü ve organizma komleksliği ile arasında bağlantı olmaması ilk yıllarda moleküler biyoloji için bir puzzle olmuştur (C-value paradox). Örn. İnsan genomu, maya S. Cerevisiae genomundan 200 kat daha büyükk iken Amoeba dubia genomundan ise 200 kat daha küçüktür. Bu paradoks genomların büyük miktarda repetitive sekanslar içerebileceklerinin ispatlanması ile çözülmüştür. DNA kategorileri 1. Tek kopya DNA lar 2. Repetitive DNA lar (=junk/ignorant/selfish DNA)
TAnimlar Yüksek sayıda tekrarlayan dizeler ( highly repetitive, simple-sequence DNA): Bir hücrede milyonlarca kez tekrarlayan 10 baz çiftinden daha kısa DNA segmentleri (%10). Kısmen tekrarlayan DNA (moderately repetitive): En az 1000 kez tekrarlanan birkaç yüz baz çifti uzunluğunda DNA segmentleri (%20). Satellit DNA: Çoğu ökaryotik kromozomdaki en önemli iki yapı olan sentromer ve telomer ile ilişkili sezyum klorid dansite gradient santrifüjü ile uydu bantlar şeklinde diğer DNA dizelerinden ayrılan temel-dna dizeleri. Sentromer: Hücre bölünmesi esnasında proteinler için kromozomlara bağlantı sağlayan DNA dizisi içeren bölge. Telomer: Ökaryotik kromozomun uçlarında kromozomu stabilize eden bölgeler.
ÖKARYOTİK KROMOZOMLAR OLDUKÇA KOMPLEKSTİR
HİGHLY REPETİTİVE DNA İnsan α satellit DNA (centromeric) tipik olarak 171 bç uzunluğundadır ve dimer (342 bç) yada 16 tekar (2736 bç) ünitesi halinde bulunurlar. Genellikle minisatellit ve mikrosatellitlerden daha az uzunluk varyasyonlarına sahiptirler. İnsan β satellitler 68 bç lik bir monomerin 30.000-60.000 (2.040.000-4.080.000 bç) kopyası ile oluşmaktadır. Metacentrik kro 9 ve akrosentrik kromozomlar 13, 14, 15, 21, 22 de yer alırlar.
MİDDLE REPETİTİVE DNA İnterspersed repeats Memeli interspersed repeatler genellikle 3 sınıfa ayrılırlar: 1. LINE and SINE repeats (non-ltr yada poly-a retro(trans)posons) 2. LTR retroposonlar (retrovirus-like elements) 3. DNA transposonlar Tandemly repeated DNA 1. Microsatellit DNA (dinükleotidler) 2. Minisatellite DNA (VNTR s) 3. Çok kopya genler (rrna)