İNDÜKTE BALGAM (İB) Prof. Dr. Füsun Yıldız Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, Kocaeli Aşağı solunum yollarından elde edilen balgamın incelenmesi birçok havayolu hastalığının tanısında ve inflamasyonun gösterilmesinde 1900 lü yılların başından itibaren önem kazanmış ve invaziv yöntemler olan bronkoskopik biyopsi ve bronkoalveoler lavajın (BAL) yerine kullanılabileceği bildirilmiştir. Uzun yıllar çeşitli hastalıkların tanısı için kullanılsa da esas 1989 yılında Gibson ve arkadaşları İB incelemesinin güvenilir ve geçerli bir yöntem olduğunu göstermiş, 1992 yılında Pin ve arkadaşları bu yöntemi özellikle astımda inflamasyonun gösterilmesi ve araştırılmasında kullanmaya başlamışlardır (1,2). Yöntemin standardize edilmesi için 2002 yılında Avrupa Solunum Derneği (ERS) ve Amerikan Toraks Derneği (ATS) ortak bir uzlaşı belgesi hazırlamışlardır (ERJ 2002, Suppl. 37). Balgam indüksiyonu güvenilir ve basit bir yöntem gibi görünse de bu yöntemi uygulayacak kişinin işlemin her basamağı için iyi eğitilmiş, bilgilendirilmiş olması ve işlemin standart protokollere göre yapılması gereklidir. Balgam indüksiyonu: Spontan balgam çıkaramayan kişilerde hipertonik solüsyonları nebulizatör yoluyla inhale ettirerek alt solunum yollarından yeterli balgam elde etmek için yapılan işleme balgam indüksiyonu elde edilen materyale de indükte balgam (İB) adı verilir. Hipertonik salin kullanılarak yapılan balgam indüksiyonun mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Sorumlu tutulan mekanizmalardan birinin bronş mukozasında artmış olan vasküler geçirgenliğe bağlı osmolaritenin arttığı ve bunun da submukozal bezlerin mukus üretimini arttırması olarak bildirilmektedir (3). Bununla beraber invivo olarak hava yollarına hipertonik solüsyon verilen hayvan ve insan çalışmalarında çeşitli maddelerin düzeyi artarken, vasküler permeabilite artışının göstergeleri olan albumin ve diğer bazı göstergelerin düzeyinin artmadığı ve bu yüzden de bu hipotezin doğrulanamadığı belirtilmektedir (3). Hipertonik salinin hava yolu epitelinden dışarıya sıvı çıkışını sağlayarak, öksürük reseptörlerini uyararak ve mukosiliyer klirensi hızlandırarak etkili olduğu kabul gören diğer görüşlerdir. İndüksiyon için gerekli koşullar: Balgam indüksiyonu sırasında hasta yapılacak işleme kesin koopere olmalıdır. Bu yüzden işlemden önce ayrıntılı olarak yapılacaklar hakkında bilgilendirilmesi gereklidir. İndüksiyon işlemi, bu konuda deneyimli bir hekimin gözetiminde, deneyimli bir teknisyen tarafından sakin bir ortamda yapılmalıdır. İstirahat sırasında hipoksemi varsa, işlem sırasında oksijen desteği sağlanabilmeli ve tam donanımlı resüsitasyon araç gereci ortamda bulundurulmalıdır (3). İndüksiyon için gerekli malzemeler: -Nebulizatör (Diğer nebulizatörler yeterli aerosol üretemediklerinden ultrasonik olanlar tercih edilir) -Spirometre -Steril %3-5 lik hipertonik salin solüsyonu -Steril su (Dilüsyon için gereklidir, her kullanımda taze hazırlanmalıdır) -Dithiothreitol (DTT) -Hank s dengeli tuz solüsyonu (HBSS) veya Dulbecco s Phospate Buffered Saline (PBS) -Soğuk santrifüj -Sitospin -Işık mikroskopu
İşlem öncesi bronkodilatör uygulanması: Hipertonik salin solüsyonu balgam indüksiyonu sırasında mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte muhtemelen hava yolu mast hücreleri veya duyu sinir aktivasyonuna bağlı olduğu düşünülen bronkokonstriksiyon oluşturmaktadır (3,4). Bazı araştırmacıların işlem öncesinde bronkodilatör verilmesine karşı çıkmasına karşın, işlem sırasında gelişebilecek aşırı bir bronkokonstriksiyonu önleyebilmek için kısa etkli beta-2 agonistlerin kullanımı standart olarak uygulanmaktadır (2,3,5). Bronkodilatör olarak sıklıkla salbutamol (200-400 µg) veya eşdeğerinin kullanımı önerilmektedir. Daha yüksek dozlarda bronkodilatör uygulanmasının ek bir yararı saptanmamıştır (3,5). Beta-2 agonist kullanımının indükte balgam hücre diferansiyasyonunu etkilemediği gösterilmiştir (6). Solunum Fonksiyonlarının monitorizasyonu: Balgam indüksiyonunun güvenle uygulanabilmesi ve işlem sırasında oluşabilecek bronkokonstriksiyonunun anında farkedilerek tedavi edilebilmesi için solunum fonksiyonlarının monitorizasyonu gereklidir. Bunun için oluşturulmuş standart bir protokol bulunmamakla birlikte bazı araştırmacılar işlem süresince her 5-10 dakikada ölçülmesi gerektiğini ve semptom olduğunda ölçümün tekrarlanmasını önermektedirler (3). Tepe akım hızını (PEF) pefmetre ile takip edenler olmakla birlikte duyarlılığı az olduğu için spirometre tercih edilmektedir (7). Salin solüsyonunun konsantrasyonu ve nebulizatör çıkışı: İndüksiyon işlemi için kullanılması önerilen salin solüsyonu konsantrasyonu %0.9-7 arasında değişiklik göstermektedir (3). Bazı araştırmalarda %3 salin ile işleme başlanıp, %4 ve %5 e çıkılmıştır. İyi tolere edildiği ve ticari olarak kolay bulunabildiği için genellikle %4.5 lik salin solüsyonu önerilmektedir. Çalışmalar hipertonik salinin izotonikten daha etkili olduğunu göstermiş, ancak bronkospazm riski bulunanlarda izotonik salin kullanımının daha güvenli olacağı bildirilmiştir (8). Balgamın hücre içeriği izotonik veya hipertonik salin kullanımı ile değişiklik göstermemekle birlikte, sıvı fazdaki mediyatörler üzerine etkisi bilinmemektedir (3). İşlem için özellikle çıkışı 1ml/dk olan ultrasonik nebülizatörlerin kullanılması önerilmektedir (3). İnhalasyon süresi ve indüksiyonun sıklığı: Yapılan değişik çalışmalar indüksiyon işlemi sırasında nötrofil ve eozinofillerin erken dönemde, lenfosit ve makrofajların ise daha sonra toplanan balgamda arttığını göstermiştir. Ayrıca musin konsantrasyonları ilk 0-4 dakikada artış gösterirken, sürfaktan konsantrasyonu daha sonra alınan balgamda yüksek bulunmuştur. Bu sonuçlar solunum yollarının değişik bölümlerinden farklı zamanlarda örnek elde edildiğini yani; ilk dönemde alınan balgamın daha çok santral hava yollarını, geç dönemde alınan balgamın ise periferik hava yollarını temsil ettiğini düşündürmektedir (3). Balgam indüksiyonunun sık tekrarlanmaması ve iki işlem arasında 48 saatlik bir süre bulunması önerilmekle birlikte, bu konuda daha fazla çalışmaya gerek olduğu bildirilmektedir (3). Balgam ekspektorasyon tekniği: Bazı protokoller işlem sırasında bulantı kusma olmaması için aç kalınmasını, bazıları ise orofarengeal kontaminasyonun önlenmesi için diş fırçalanmasını önermektedir. Ama bunların hiçbirisinin balgam üzerine etkisinin olmadığı, uygun bir balgamın teknik özelliklerden çok kişisel özelliklere bağlı olduğu bildirilmektedir (3). Balgam indüksiyon uygulamasının güvenliliği: Balgam indüksiyonunun birçok hastalığın tanı, izlem ve tedavisinde kullanılabilen basit, güvenli ve noninvazif bir yöntem olduğu bilinmekle birlikte, işlemin mutlaka bu konuda deneyimli bir hekim eşliğinde, yine deneyimli bir teknisyen tarafından uygulanması gerekmektedir. İşlem süresince bu ekip işlem yapılan kişinin yanında bulunmalıdır. Tüm olgularda işlem öncesi solunum testleri ve reversibilite testi uygulanmalı, işlem sırasında FEV 1 %20 den fazla düşerse 200-400 µg salbutamol, FEV 1 1 litrenin altına düşerse 2.5-5 mg nebulize salbutamol uygulanmalıdır. Tüm hastalar
bronkodilatör uygulandıktan sonra bazal değerlerine dönene kadar hekim gözetiminde işlemin yapıldığı ünitede tutulmalıdır. Hava yolu obstrüksiyonunun ve duyarlılığının derecesi, önceden çok fazla kısa etkili beta-2 agonist kullanımı gibi faktörler işleme bağlı bronkokonstriksiyon gelişimini kolaylaştırmaktadır. Balgam indüksiyonunda standart işlem (3) (Şekil I): 1-Hastaya işlem öncesinde ayrıntılı bilgi verilmeli ve yazılı aydınlatılmış onam alınmalı, 2-Ultrasonik nebulizatör çıkışının 1ml/dk ya ayarlanmalı, 3-Bazal FEV 1 ölçümünden sonra 200-400 µg salbutamol inhale ettirilmeli, 4-Yirmi dakika sonra postbronkodilatör FEV 1 ölçülmeli ve beklenenin >%60 veya >1 lt ise işleme devam edilmeli, 5-Ultrasonik nebulizatör ile ya sabit bir salin konsantrasyonu ( %3 veya %4) veya giderek arttırılan dozlarda salin (%3, %4, %5) inhale ettirilmeli, 6-Beş dakikada bir 20 dakika süreyle indüksiyon uygulanmalı veya indüksiyon 1,4,5 dakika süre uygulandıktan sonra, 5 dakika süreyle 3 indüksiyon uygulaması daha yapılmalı, 7- FEV 1 değeri her indüksiyon işleminden sonra tekrar ölçülmeli ve bronkodilatör sonrası ölçülen değerden %20 veya üzerinde düşme gözlenirse veya bronkospazm oluşursa işlem sonlandırılarak hastaya tekrar salbutamol verilmeli, 8-Hastadan ağız ve boğazını çalkalaması ve burnunu temizlemesi istenmeli ve öksürerek (5.,10.,15. ve 20.dakikalarda) balgam çıkartması sağlanmalı 9-Yeterli miktarda balgam elde edilene kadar ya da indüksiyon süresi 20-30 dakika olana kadar işleme devam edimeli. İşlem şu durumlarda sonlandırılır: 1-Yeterli balgam elde edilmişse, 2-- FEV 1 değerinde %20 den fazla veya 1 lt nin altına düşüş olmuşsa, Diğer dikkat edilmesi gereken durumlar ise; planlanan bir çalışmada özellikle aynı kişide uygulanan tedavi öncesi ve sonrası inhalasyon sürelerinin tüm çalışma süresince aynı olması ve indüksiyonun aynı kişide 48 saatten önce tekrarlanmamasıdır (3). İndükte balgamın analizi, işlenmesi ve hücre sayımı: Balgam alındıktan sonra hemen incelenmelidir. Bu mümkün değilse buzdolabında en fazla 2 saat saklanabilir. İncelemeye alınacak balgamın seçiminde iki yaklaşım mevcuttur; bunlardan birincisi ekspektore edilen tüm materyalin, ikincisi ise seçilmiş balgam şeklinde tanımlanan ve ekspektore edilen materyalin daha yoğun ve visköz kısımlarının değerlendirmeye alınmasıdır. Bir çalışmaya hangi yöntemle başlandıysa o yöntemle devam edilmesi özellikle önerilmektedir (9). Seçilmiş balgam yöntemi, skuamöz hücre kontaminasyonu daha az ve toplam hücre sayısı daha fazla olduğundan ve elde edilen sekresyonların gramına düşen hücre sayısı olarak ifade edilebildiğinden daha avantajlıdır. Eğer balgamdaki hücre canlılığı %50 den az ve skuamöz hücre %20 den fazla ise materyel kaliteli değildir (6,10). İyi bir hücre dağılımı sağlamak için alınan materyale taze hazırlanmış %0.1 dithiothreitol (DTT), Hank s dengeli tuz solüsyonu (HBSS) eklenir. DTT glikoprotein liflerini bağlayarak balgamın jel formunu sağlayan disülfid bağlarının kopararak mukoliz yapar. Elde edilen materyal bir su banyosunda veya bir tüp karıştırıcı ile oda sıcaklığında çalkalanarak homojenize edilir ve 48µm gözenekli naylon filtrelerden geçirilir (9). HBSS ile 10 ml ye tamamlanarak seyreltilen karışıma, hücrelerin balgamın sıvı kısmından ayrılabilmesi için 300-1500xg (gravite) hızında 5-10 dakika santrifüjleme işlemi uygulanır. Total hücre sayımı için hemositometre kullanılır. Bütün alanlar sayıldıktan sonra canlı hücreler toplam hücre sayısının yüzdesi olarak ifade edilir ve %40 ın altında olan hücre canlılığı güvenli bulunmamaktadır (9). Santrifüj işleminin total hücre sayısını azaltabileceği bu yüzden total hücre sayımının santrifüj işleminden önce yapılmasının uygun olacağı belirtilmektedir (9). Santrifüj işlemi ile hücrelerin balgamın sıvı kısmından ayrılması tamamlandıktan sonra üstteki sıvı (süpernatan) örnek -20 ile 70 o C de saklanmalı kalan kısım ise hücre sayımı için kullanılmalıdır. Sitospinin optimum hücre sayısı (40-60x10 3 hücre) ile yapılmasının sonuçların güvenilirliğini
arttıracağı bildirilmektedir (9). Sitospinler total hücre sayımı için Giemsa veya Wright boyası ile boyanabilir. Ayırıcı hücre sayısı için en az 400 nonskuamöz hücre sayılmalı, eozinofil, nötrofil, makrofaj, lenfosit ve bronş epitel hücrelerinin sayıları toplam nonskuamöz hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilmelidir. Balgamın sıvı kısmında ise değişik sitokinler, kemokinler, proteazlar gibi birçok gösterge çalışılabilmektedir. Astımda indükte balgamın yeri: Hava yollarının inflamatuvar bir hastalığı olarak bilinen astımda indükte balgam; 1-Hava yolu inflamasyonunun varlığının, tipinin ve derecesinin saptanmasına yardımcı olur: Astımda sıklıkla balgamda eozinofili gözlenmekte ve bu oran steroid kullanmayan hastalarda %80 nin, steroid kullananlarda ise %50 nin üzerinde gözlenmektedir (10-13). Astımın saptanmasında balgamda yüksek eozinofil sayısının PEF değişkenliğinden ve akut bronkodilatör yanıtından daha geçerli olduğu hatta bronş hiperreaktivitesine yakın spesifisite ve sensitivite taşıdığı bildirilmektedir (11,13). Sağlıklı bireylerle karşılaştırıldığında eozinofil sayıları astımlı bireylerde daha yüksek bulunmuş hatta bunun astımın ağırlığı ile de değiştiği ve hafif astımlılarda İB da eozinofil oranı %5 iken, ağır astımlılarda bu oran %29 olarak bildirilmiştir (15,16). Yine aynı çalışmada hastalığın şiddeti arttıkça balgamda nötrofil yüzdesinin de arttığı belirtilmiştir (15). İB da astım patogenezinde rol oynayan pek çok inflamasyon göstergeleri de araştırılabilmektedir. Bunlar eozinofil katyonik protein (ECP), interlökin-5 (IL-5), eotaksin, albumin, fibrinojen, major bazik protein, eozinofil peroksidaz, tümör nekroz factor-alfa (TNF-α) ve nitrik oksit metabolitleridir (10,17,18,19,20). 2- Astım ataklarının nedenini araştırmamızı sağlar: İB astım atak nedenini saptamada yani atak bir infeksiyona mı yoksa infeksiyon dışı bir nedene mi bağlı, bu konuda yol gösterme de ve tedaviyi yönlendirme de faydalı olabilmektedir. 3- Verilen tedavinin etkinliğinin değerlendirilmesine yardımcı olur: Steroid tedavisine ihtiyacı belirlemede, İB ile altta yatan hava yolu inflamasyonunun araştırılmasının solunum fonksiyon bozukluğunu göstermekten daha çok yardımcı olacağı bildirilmektedir (11). Bunun için yapılmış bir çalışmada inhale steroid tedavisine kısa süreli yanıt ile balgam eozinofil sayısı arasındaki ilişki araştırılmış, balgam eozinofil sayısı %3 ten az olan hastaların semptom ve bronş aşırı duyarlılığında yeterli düzelme gözlenememiştir (11). Hastaları balgamlarında eozinofil varlığına göre sınıflandırmanın özellikle inhaler steroid tedavisine rağmen semptomatik olanlarda faydalı olabileceği belirtilmekte ve bu olgularda diğer antiinflamatuvar ilaçların (lökotrien antagonisti, teofilin vb) eklenmesinin yararlı olup olmayacağının daha iyi anlaşılmasında İB yönteminin kullanılması gerekli görülmektedir (11). 4- Mesleksel astımda hava yolu inflamasyonunun değerlendirilmesine yardımcı olur: Genellikle mesleksel astımdaki balgamın özellikleri, mesleksel olmayan astımdaki ile benzerlik göstermektedir. Mesleksel astımda olguların işyerindeki maruziyetleri sonrasında balgamda eozinofil sayısı artmaktadır (21). Bu yüzden meslek astımının değerlendirilmesinde PEF ölçümleri ve hava yolu duyarlılığının yanında indükte balgamın da önemli tanısal bilgiler sağlayabileceği ve bu yönde araştırmalar yapılması gerekliliği bildirilmektedir (11). Balgam eozinofil düzeyindeki artışın düşük molekül ağırlıklı maddelere maruziyet sonrası daha belirgin olduğu bildirilmektedir (21). Bu durum düşük molekül ağırlıklı ajanların genellikle geç astmatik reaksiyona neden olmasıyla açıklanmakta ve bu reaksiyonun erken yanıtla karşılaştırıldığında hava yolu inflamasyonunda daha belirgin artışa neden olduğu bildirilmektedir.
FEV 1 ölçümü 200-400 µg salbutamol inhalasyonu 20 dak sonra postbronkodilatör FEV 1 ölçümü >%60 (beklenenin) veya >1L ise işleme devam Ultrasonik nebulizatörle %3-%5 lik salin inhalasyonu FEV 1 de>%20 düşüş Yeniden FEV 1 ölçümü veya belirgin semptom İşlemi sonlandır Ağız ve boğaz çalkalanır, burun temizlenir Öksürtülerek balgam çıkartılır Yeterli balgam elde edilene kadar 15-20 dk süre ile tekrarlanır Şekil I: Balgam indüksiyon yöntemi (3): KAYNAKLAR: 1-Gibson PG, Girgis Gabardo A, Morris MM et al. Cellular characterization of sputum from patients with asthma and chronic bronchitis. Thorax 1989;44:693-9. 2-Pin I, Gibson PG, Kolendowicz R et al. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax 1992;47:25-9. 3-Paggiaro PL, Chanez P, Holz O et al. Sputum induction. Eur Respir J 2002;20 (Suppl.37):3s-8s. 4-Makker HK, Holgate ST. The contrubution of neurogenic reflexes to hypertonic saline-induced bronchoconstriction in asthma. J Allergy Clin Immunol 1993;92:82-8. 5-Wong HH, Fahy JV. Safety of one method of sputum induction in asthmatic subjects. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:299-303. 6-Kipps JC, Fahy JV, Hargreave FE. Methods of sputum induction and analysis of induced sputum: a method for assessing airway inflammation in asthma. Eur Respir J 1998;11:S9-12. 7-Giannini D, Paggiaro PL, Moscato G et al. Comparisın between peak expiratory flow and forced expiratory volume in one second (FEV1) during bronchoconstriction induced by different stimuli. J Asthma 1997;34:105-11. 8-Pizzichini E, Pizzichini MMM, Leigh R et al. Safety of sputum induction. Eur Respir J 2002;20 (Suppl 37):9s-18s.
9-Efthimiadis A, Spanavello A, Hamid Q et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridization. Eur Respir J 2002;20 (suppl 37):19s-23s. 10- Pizzichini E, Pizzichini MMM, Efthimiadis A et al. Indices of airway inflammation in induced sputum. Reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. Am J Respir Crit Care Med 1996;154:308-17. 11-Pavord ID, Sterk PJ, Hargreave FE et al. Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum. Eur Respir J 2002;20(Suppl 37):40s-43s. 12-Karakurt Z, Ceyhan B, Karakurt S, Türker H. Induced sputum cell profile in mild to severe stable asthmatics and healthy adults. Turkish Respiratory Journal. 2001;2:22-7. 13-Louis R, Lau LC, Bron AO et al. The relationship between airways inflammation and asthma severity. Am J Respir Crit Care Med 2000;161:9-16. 14-Hunter CJ, Brightling CE, Woltmanw G et al. A comparison of the validity of different diagnostic tests in adults with asthma. Chest 2002;121:1051-7. 15-Fahy JV, Liu J, Wong H et al. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatics and from healthy subjects.am Rev Respir Dis 1993;147:1126-31. 16-Balzano G, Stefanelli F, Iorio C et al. Eosinophilic inflammation in stable chronic obstructive pulmonary disease: relationship with neutrophils and airway function. Am J Reapir Crit Care Med 1999;160:1486-92. 17-Kips JC, Peleman RA, Pauwels RA. Methods of examining induced sputum:do differences matter? Eur Respir J 1998;11:529-33. 18- Fahy JV, Liu J, Wong H et al. Analysis of cellular and biochemical constituents of induced sputum after allergen challenge: a method for studying allergic airway inflammation. J Allergy Immunol 1994;93:1031-9. 19-Frederick E, Hargreave MD. Induced sputum and response to glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol 1998;102:S102-S105. 20-Basyigit İ, Yildiz F, Ozkara SK et al. Inhaled corticosteroid effects both eosinophilic and noneosinophilic inflammation in asthmatic patients. Mediators of Inflammation. 2004;13(4):285-91. 21-Lemiere C. Non-invasive assessment of airway inflammation in occupational lung diseases. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2002;2:109-11.