DOĞAL ORTAMLARDA B. AMYLOLIQUEFACIENS İLE α-amilaz ÜRETİMİNİN İNCELENMESİ M. Ş. TANYILDIZI, M. ELİBOL, D. ÖZER Fırat Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 23119, ELAZIĞ ÖZET Son yıllarda endüstriyel enzimlerin üretiminde substrat olarak endüstriyel ve tarımsal yan ürünlerin kullanılması yaygın bir şekilde araştırılmaktadır. Hem üretilen ürün maliyetlerini azalmak hem de çevre problemine neden olan bu atıkların çok daha verimli olarak kullanılması amaçlanan bu çalışmalarda buğday kepeği, şeker kamışı posası, muz atıkları gibi bir çok atık kullanılmıştır. Mısır işlenmesi esnasında yan ürün olarak çıkan mısır proteini (gluten) hem yüksek protein içeriğinden dolayı hemde α-amilazın substratı olan ve bir çok çalışmada indükleme etkisi olduğu belirtilen nişasta içerdiğinden dolayı α-amilaz üretiminde substrat olarak kullanımı araştırılmıştır. Çok daha az kimyasal madde kullanılan doğal ortamda yapılan deneyler sonucunda sentetik ortama göre yaklaşık 5 kat daha yüksek enzim aktivitesi belirlenmiştir. Anahtar kelimeler : α-amilaz, mısır proteini, katı hal fermantasyonu. 1. GİRİŞ Nişasta sıvılaştırma, kağıt endüstrisi, tekstil başta olmak üzere bir çok endüstride yaygın olarak kullanılan α-amilazın ekonomik olarak üretilmesi, düşük maliyetli fermantasyon ortamı gerektirmektedir. Sentetik ortam bileşenleri yerine çok daha ekonomik olan endüstriyel ve tarımsal yan ürünler kullanılabilir (1). Son yıllarda kassava bagası, şeker kamışı bagası, şeker kamışı küspesi, kahve kabuğu ve atıkları, elma posası, arpa, soya fasulyesi atıkları, meyve suyu endüstrisi atıkları, patates atıkları gibi tarımsal endüstriyel atıkların daha etkin bir kullanım alanlarının araştırılması gittikçe artmaktadır (2). Bu hammaddeler kullanılarak etanol, tek hücre proteini, mantar, enzimler, organik asitler, amino asitler ve biyolojik olarak aktif sekonder metabolitler gibi değerli ürünlerin üretimi için prosesler geliştirilmiştir (3). Endüstriyel ve tarımsal uygulamalar sonucunda her yıl çok büyük miktarlarda tarımsal ve endüstriyel yan ürünler oluşmaktadır. Zengin sabit karbon kaynağı olan bu yan ürünler dünyada en yaygın enerji kaynaklarındandır. Pahalı olmayan bu ürünlerin substrat olarak kullanımı fermantasyon endüstrisinde giderek daha fazla ilgi çekmektedir (4). Tarımsal ve endüstriyel yan ürünlerin biyoproseslerde alternatif substrat olarak kullanımının yanında çevre kirliliği problemlerinin çözümüne yardımcı olmaktadır. Enzim ve fermantasyon teknolojisinde biyoteknolojik yeniliklerin gelişmesiyle endüstriyel ve tarımsal yan ürünlerin kullanımı için bir çok yeni imkanlar sağlanacaktır (3). Bu substratlar kullanılarak yapılan katı hal fermantasyonunun konvensiyonel daldırmalı fermantasyona göre bir çok avantajı bulunmaktadır. Daha az su kullanıldığından substratlar daha konsantredir, daha az sabit ve işletme masrafı gerektirir, çoğu durumlarda verim daldırmalı fermantasyonla aynı veya daha yüksektir ve atıklar hayvan yemi gibi daha faydalı bir şekilde değerlendirilebilir(2). Yapılan bu çalışmada endüstriyel işletmelerde oluşan yan ürünlerden mısır proteini alfa amilaz üretiminde substrat olarak kullanılması araştırılmıştır.
2. DENEYSEL Bacillus amyloiqyefaciens. (NRRL B-645) ARS kültür koleksiyonundan temin edildi. Standart aşı ortamının başlangıç ph 7. ye ayarlandı. 25 ml lik erlenlerde 5 ml ortama mikroorganizma ekiminden sonra 37 C de 15 rpm çalkalamalı inkübatörde 18 saat fermente edildi. Enzim üretim ortamı ise karbon kaynağı olarak mısır proteini, azot kaynakları (pepton, yeast ekstract) ve iz elementler değiştirildi. Belirlenen optimum fermantasyon ortamında çalkalama hızı, ortam sıcaklığı ve başlangıç ph sının etkisi incelendi. Deneylerde musluk suyu kullanıldı. Hücreler santrifüjle uzaklaştırıldıktan sonra kültür sıvısında aktivite tayini yapıldı. Alfa amilaz aktivitesi iyodun nişasta ile verdiği renk esasına dayanılarak spektrofotometre (62 nm) yardımıyla belirlendi..284 OD azalması 1 birim internasyonel ünite (IU/ml) olarak tanımlandı ( 5). 3. SONUÇLAR Ortama sadece musluk suyu ve substrat olarak kullanılması düşünülen doğal ortamlar (mısır proteini, mısır kepeği, buğday kepeği, ayçekirdeği küspesi, melas ve keçi boynuzu) konularak yapılan deneylerde, enzim aktivitesi mısır proteininin kullanıldığı ortamda diğerlerine göre çok daha yüksek olduğu görülmüştür (Şekil 1). Çalışılan diğer kaynaklardan buğday kepeği ve mısır kepeği sırasıyla 1 UI ve 97 UI aktivite gösterirken mısır proteiniyle 6 UI aktivite gözlenmiştir. 7 6 5 4 3 2 1 2 4 6 8 Şekil 1. Farklı doğal substratlar kullanılarak enzim üretiminin değişimi. ( 1 g/l şeker pancarı küspesi, 1 g/l keçi boynuzu, 1 g/l mısır kepeği, 1 g/l melas, x 1 g/l ayçekirdeği 1 g/l mısır proteini, 1 g/l buğday kepeği) Fermantasyon ortamında doğal substratlar ve musluk suyu kullanıldığından mısır proteini içeren ortamda yeterli miktarda azot kaynağı bulunurken diğer ortamlarda mikroorganizmaların gelişmesi ve enzim üretebilmesi için yeterli azot kaynağının olmadığı görülmüştür.azot kaynaklarının enzim üretimine etkisini incelemek amacıyla fermantasyon ortamına pepton ve yeast ekstract eklendiğinde enzim üretiminin yaklaşık 1.5 kat arttığı gözlenmiştir. Maksimum enzim aktivitesi 1 g/l yeast ekstract içeren ortamda görülmüştür (Şekil 2-3).
14 12 1 8 6 4 2 2 4 6 8 inkübasyon süresi (saat) Şekil 2. 1 g/l mısır proteini içeren ortama farklı konsantrasyonlarda YE kullanılan deneylerde enzim üretiminin değişimi. (o 1 g/l YE, 2.5 g/l YE, 5 g/l YE, x 1 g/l YE, 3 g/l YE) 12 1 Aktivite (IU) 8 6 4 2 2 4 6 8 Şekil 3. 1 g/l mısır proteini içeren ortama farklı konsantrasyonlarda pepton kullanılan deneylerde enzim üretiminin değişimi. (o 1 g/l pepton, 2.5 g/l pepton, 5 g/l pepton, x 1 g/l pepton, 15 g/l pepton, 3 g/l pepton) Mısır proteinin konsantrasyonunun etkisinin incelendiği deney sonuçları şekil 4 te verilmiştir. Düşük konsantrasyonlarda enzim üretiminin de düşük olduğu görülmüştür. maksimum enzim üretiminin 3 g/l mısır proteini içeren ortamda gözlenmiştir. Daha yüksek konsantrasyonda yapılan deneyde enzim üretiminin azaldığı tespit edilmiştir. 4 g/l mısır proteini gibi yüksek konsantrasyonda serbest su miktarının azaldığından bakteri gelişimi ve enzim üretiminin azaldığı düşünülmektedir.
3 25 Aktivite (IU) 2 15 1 5 2 4 6 8 Şekil 4. 1 g/l YE içeren ortama farklı konsantrasyonlarda mısır proteini kullanılan deneylerde enzim üretiminin değişimi. ( 5 g/l Mısır proteini, + 1 g/l Mısır proteini, 15 g/l Mısır proteini, 2 g/l Mısır proteini, x 25 g/l Mısır proteini, 3 g/l Mısır proteini, o 4 g/l Mısır proteini) KH 2 PO 4, MgSO 4, CaCl 2 ün enzim üretimi üzerine önemli derecede etkisinin olmadığı görülmüştür. Bunun nedeni olarak mısır proteini içerisinde bulunan ve ayrıca musluk suyundan gelen minerallerin enzim üretimi için yeterli olduğu düşünülmektedir. Enzim üretimine ortam sıcaklığının etkisini incelemek için yapılan deneylerde 33ºC de enzim aktivitesinin (89 UI) maksimum olduğu ve fermantasyon sıcaklığının enzim üretimini önemli derecede etkilediği görülmüştür (Şekil 5). 1 8 6 4 2 2 4 6 8 1 Şekil 5. Farklı fermantasyon sıcaklıklarında yapılan deneylerde enzim üretiminin değişimi. (x 27 ºC, 3ºC 33ºC, + 37ºC, 4ºC, 45ºC)
Başlangıç ph sı ve innokulum miktarının enzim üretimini önemli miktarda etkilemediği görülmüştür. Farklı başlangıç ph sında yapılan deney sonuçları şekil6 da verilmiştir. Nötr yakın ph larda başlatılan deneylerde enzim üretiminin başlangıç phsının daha yüksek ve daha düşük fermantasyon ortamlarından daha yüksek olduğu görülmüştür (şekil6). 1 8 6 4 2 5 1 15 Şekil 6. Farklı başlangıç ph larında yapılan deneylerde enzim üretiminin değişimi. (o 5, 6, 6.5, 7, x 8 ) Mısır proteinin substrat olarak kullanıldığı deneyler sonucunda elde edilen enzim üretiminin, optimize edilmiş sentetik ortamda elde edilen enzim üretimine göre yaklaşık 5 kat arttığı gözlenmiştir. Mısır proteininde vitaminler yanında amino asitler ve birçok mineral bulunmaktadır. Bundan dolayı doğal ortamda enzim üretiminin, sentetik ortama göre çok daha yüksek olduğu görülmüştür. Ayrıca katı besi ortamlarının substrat olarak kullanılmasının yanında mikroorganizmalar için destek maddesi olarak ta davranmasının enzim üretimi üzerinde etkili olduğu düşünülmektedir.
4. KAYNAKLAR 1- Haq, İ., Ashraf, H., Iqbak J., Qadeer M.,A, 23, Production of alfa amylase by Bacillus licheniformis using economical medium, Biosource Tech., 87, 57-61. 2- Berovic M., Ostroversnik H., 1996, production of Aspergillus niger pectolytic enzymes by solid state bioprocessing of apple pomace, J. Biotechnology, 53,47-53. 3- Pandey A., Soccol C. R., Nigam P., Soccol V.T., Vandenberghe L.P.S., 2, Biotechnological potential of agro-industrial residues. II: cassava bagasse, a, Radjiskumar Mohan ağabeyoresource Technology 74, 81-87. 4- Francis F., Sabu A., Nampoothiri K.,M, Ramachandran S., Ghosh S., Szakacs G., Pandey A., 23, Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production of α-amylase by Aspergillus oryzae, Bioch. Eng. J., 15, 17 115. 5 -Pfueller S.L., Eliot W.H., 1969, The extraceluler α-amylase of Bacillus stearotermophillus, J. Biological Chemistry, 244, 48-54.