Toplum Kökenli Pnömoni Tan s nda Mikrobiyolojik İncelemelerin Yeri ve Önemi

Toplum Kökenli Pnömoni Tan s nda Mikrobiyolojik İncelemelerin Yeri ve Önemi Dr. Zeynep GÜLAY Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal, İZMİR Alt solunum yolu infeksiyonlar (ASYİ), dünyada en s k görülen ve en s k öldüren infeksiyon hastal klar aras nda yer almaktad r. ASYİ genel olarak, akut bronşit, kronik bronşitin akut alevlenmeleri ve pnömonileri kapsamaktad r. Pnömoniler ise, toplum kökenli (TKP), hastane kökenli (HKP) ve bağ ş kl ğ bask lanm ş hastalardaki pnömoniler (BBHP) olarak s n fland r l r. Bu klinik tablolar n her birinde birçok farkl mikroorganizma etken olarak karş m za ç kabilmektedir. Solunum yolu infeksiyonlar, ayn zamanda antibiyotik kullan m na yol açan klinik tablolar n baş nda gelmektedir. Özellikle akut bronşit gibi çoğu viral kökenli olan tablolarda gereksiz antibiyotik kullan m solunum yolu patojenlerinin (örneğin; Streptococcus pneumoniae) direnç kazanmas na yol açm şt r. Yukar da s ralanan bu etken çeşitliliği ve baz solunum yolu patojenlerinin antibiyotiklere dirençli olmas gibi faktörler, mikrobiyoloji laboratuvarlar na önemli bir yük getirmektedir. Ancak etkenlerin tümünü saptayabilen ideal bir test bulunmay ş nedeniyle, özellikle akut bronşit ve TKP tan ve tedavisinde mikrobiyolojik testlerin yararl l ğ tart şmal - d r. Buna karş n, HKP ve BBHP de etkenin ortaya konulmas daha fazla önem taş maktad r. Bu yaz da, TKP lerin saptanmas nda kullan lan laboratuvar testleri ele al nacakt r. The Significance of Microbiological Examination in Diagnosis of Community-Acquired Pneumonia Anahtar Kelimeler: Mikrobiyoloji, pnömoni, toplumdan kazan lm fl infeksiyon, tan Key Words: Microbiology, pneumonia, communityacquired infection, diagnosis GENEL TANI PRENSİPLERİ Mikrobiyoloji laboratuvar na gelen çeşitli klinik örneklerde etken mikroorganizma varl ğ n n gösterilmesi için baz genel tan yöntemleri kullan lmaktad r. Bunlar; 1. Etken mikroorganizman n kültürde üretilmesi, 2. Etkenin vücut s v lar veya solunum yollar örneklerinde gösterilmesi, 3. İnvazyonun histopatolojik yöntemlerle kan tlanmas, 4. Etkene ait antijenlerin veya gelişen özgül antikorlar n serolojik yöntemlerle gösterilmesi, olarak s ralanabilir. Pnömoni etkenlerinin ortaya konmas nda da ayn prensipler izlenmektedir. Mikrobiyolojik tan için laboratuvara en s k, balgam, endotrakeal aspirat, nonbronkoskopik bronkoalveoler lavaj (BAL), bronşiyal lavaj ve BAL s v lar ile korumal f rçalama (PSB) örneği gönderilmektedir. Ayr ca, transbronşiyal biyopsi, transtorasik iğne aspirasyonu ve akciğer biyopsi örnekleri de mikrobiyolojik inceleme için kullan labilir. Tan da solunum yolu örnekleri d ş nda, kan kültürü ve serolojik testler için kan örnekleri ile antijen aranmas için idrar örnekleri de incelenmektedir. Bunlar n yan s ra, parapnömonik efüzyon varl ğ nda plevra s v s ndan mikroskobik inceleme ve kültür de yap labilmektedir. Laboratuvar sonuçlar n n doğru olmas için; klinikte infeksiyon bölgesinden uygun miktarda nitelikli örnek al nmas ve örneğin k sa zamanda (en fazla iki saat içinde) uygun şartlarda laboratuvara ulaşt r lmas ; laboratuvarda da bu örneklerden h zla, doğru in- 195

Gülay Z celemelerin yap lmas gereklidir. Solunum yolu örneklerinin s kl kla potansiyel patojenleri de içeren flora bakterileriyle kontamine olmas nedeniyle, genellikle kantitatif (mikroorganizma say lar n n belirlendiği) kültür yöntemleri kullan lmaktad r. TKP ler, öykü ve fizik muayene bulgular na göre tipik ve atipik olarak ikiye ayr lmaktad r. Bu tablolardan farkl etkenler sorumlu olmakla birlikte, en s k görülen etken S. pneumoniae d r (Tablo 1). TKP de, öykü ve fizik muayene bulgular tablonun şiddetinin belirlenmesi için kullan lacak mikrobiyoloji d ş incelemelerin seçimi için önemlidir. Mikrobiyoloji d ş tan sal testlerin baş nda akciğer grafisi gelmektedir. Akciğer grafisi hem akut bronşit-pnömoni ayr mlar n n yap lmas n hem de tüberküloz veya Pneumocystis carinii pnömonisi gibi şüphelenilmeyen tablolar n tan nmas n sağlar. TKP de mikrobiyoloji laboratuvar n n rolü infeksiyona yol açan etyolojik ajan n belirlenmesidir. TKP Tablo 1. Alt solunum yolu sendromlar nda en s k görülen patojenler. Hastal k ve etken Rölatif görülme s kl (%) Akut bronflit Solunum yolu virüsleri 90 Bordatella pertussis- B. parapertussis 5-10 (tüm atipik bakteriyel Mycoplasma pneumoniae patojenlerin ortak Chlamydia pneumoniae görülme yüzdesidir) Toplum kökenli pnömoni Streptococcus pneumoniae 66 Haemophilus influenzae 1-12 Legionella spp. 2-15 Mycoplasma pneumoniae 2-14 Klebsiella spp. 3-14 Enterik gram-negatif basiller 6-9 Staphylococcus aureus 3-14 Chlamydia spp. 5-15 nfluenza virüs 5-12 Hantavirüsler < 1-2 Di er virüsler < 1-12 Mycobacterium tuberculosis < 1-10 Moraxella catarrhalis < 1-2 Bilinmeyen 23-49 Hastane kökenli pnömoniler Gram-negatif basiller Pseudomonas aeruginosa 16 Enterobacter spp. 11 Klebsiella pneumoniae 7 Di er enterik gram-negatif basiller 9 Acinetobacter 3 Legionella spp. 0-2 Haemophilus influenzae 0-2 Di er 0-10 Gram-pozitif koklar Staphylococcus aureus 17 Streptococcus pneumoniae 2-20 Di er 2-5 Anaeroplar 10-20 Funguslar 0-10 Kar fl k 13-54 196

etkenlerinin saptanmas için kullan lan mikrobiyolojik yöntemler Tablo 2 de gösterilmiştir. Yöntemler aras nda, balgam örneğinin mikroskobik incelemesi ve kültürü, kan kültürü, serolojik çal şmalar, antijen tan mlama testleri ve nükleik asit çoğaltma yöntemleri say labilir. Tüm tan sal testlere rağmen, TKP lerin ancak %50 sinde etken mikroorganizman n üretilebildiği unutulmamal d r. I. MİKROSKOBİK BAKI ve KÜLTÜR 1. Örnek Kalitesinin ve İçerdiği Mikroorganizmalar n Değerlendirilmesi Bu k s mda özellikle balgam örneklerinin incelenmesi için uygulanan yöntemler ele al nacakt r. Ancak bunlar n büyük k sm (örnek kalitesinin değerlendirilmesi, boyal mikroskobik bak, kantitatif kültürler) diğer alt solunum yolu örnekleri için de uygulanmaktad r. a. Direkt preparat: Balgam ve diğer solunum yolu örneklerinden direkt (boyas z) preparat haz rlan p yass epitel ve polimorfonükleer lökosit (PNL) say - lar değerlendirilir. Ayr ca, S. pneumoniae için kapsül polisakkaridlerine özgül antiserumlarla kapsül şişme (Quellung) tepkimesine bak labilir. b. Boyal preparatlar: Gram boyama yöntemi: Dr. Hans Christian Gram taraf ndan geliştirilmiş bir boyama tekniğidir. Mikroorganizmalar hücre duvar yap özelliklerine göre Gram boyas yla farkl renklerde boyan r. Öyle ki Gram boyanma özelliği mikrobiyolojideki en temel s n fland rma yöntemlerinden biridir ve bakterilerin büyük bir çoğunluğu bu boyayla boyanma özelliklerine göre gram-negatif veya grampozitif olarak adland r l r. Gram-pozitif bakteriler bu boyama yöntemiyle mor, gram-negatif bakteriler ise pembe boyan r. Esas olarak bakteriler için geçerli bir teknik olmakla birlikte örneğin; mayalar da Gram boyas yla gram-pozitif olacak şekilde boyan r. Ayr - ca, somatik hücreler (eritrositler, PNL, epitel hücreleri vb.) de Gram boyas yla boyanm ş preparatlarda incelenebilir. Mikobakteriler, Chlamydia spp., Mycoplasma spp., Legionella gibi baz bakteriler ise Gram boyas yla boyanmaz veya zay f olarak boyan r. Bu nedenle Gram boyal bir preparatta çok miktarda PNL görülmesine karş n bakteri görülememesi, bu türleri akla getirmelidir. Bu mikroorganizmalar için farkl boyama yöntemleri kullan lmal d r (Tablo 3). c. Örnek kalitesinin değerlendirilmesi: Solunum yolu örneklerinin kültür için uygunluğu ve kaliteli (ekime uygun) bir örnekte predominant mikroorganizma morfolojisinin saptanabilmesi amac yla, Gram boyal preparatlar kullan lmaktad r. Bu amaçla preparatlar önce küçük büyütmeyle (x10) içerdikleri hücreler aç s ndan incelenir. Kaliteli örneklerden haz rlanm ş preparatlarda ayr ca immersiyon objektifi ile (x100) predominant mikroorganizma morfolojisi (örneğin; gram-negatif kokobasil, gram-pozitif lanset biçimli diplokok vb.) değerlendirilir. Örnek kalitesinin değerlendirilmesi için çeşitli kriterler bulunmaktad r (Tablo 4-7). Kültür yap lmas için en az ndan her sahadaki yass epitel hücre say s n n < 25 olmas kriteri aranmal d r. TKP de kullan lan mikrobiyolojik incelemeler aras nda en tart şmal olanlar, balgam örneğinin Gram boyal bak s ve kültürüdür. Türk Toraks Derneği ve Amerika İnfeksiyon Hastal klar Derneği (IDSA) Tan ve Tedavi Rehberleri nde Gram boyal preparat haz rlanmas ve değerlendirilmesi için balgam örneği gönderilmesi önerilirken; tan ve tedavinin klinik bulgular ve kliniğin ağ rl ğ na göre yönlendirildiği American Thoracic Society (ATS) k lavuzunda bu incelemeler önerilmemektedir. Gram boyal preparat haz rlama ve değerlendirmeye basit bir test gözüyle bak lmas na rağmen sonucunun yararl olabilmesi için, balgam örneğinin uygun koşullarda al nmas, en k sa zamanda laboratuvara ulaşt r lmas, laboratuvarda örneğin pürülan k s mlar ndan preparat haz rlanmas, boyanmas ve yorumlanmas basamaklar n n tümünün doğru olarak yap lmas gereklidir (Tablo 8). Bunlar n yan s ra, hastan n önceden antibiyotik kullan p kullanmad ğ ve klinik tan n n doğruluğu balgam preparat ve kültür sonuçlar n n yararl l ğ n etkilemektedir. Bu faktörlere ayr - ca laboratuvar içerisindeki bireysel örnek işlemleme ve yorum farklar da eklenince balgam direkt bak s - n n değeri konusundaki tart şmalara şaş rmamak gereklidir. 2. Besiyerleri ve Ekim Yöntemleri Solunum yolu örneklerinin ekiminde rutin olarak üç besiyeri kullan lmaktad r. Bunlar kanl agar, çukulata agar ve Eosine-Methylene Blue (EMB) agar besiyerleridir. Bunun d ş nda güç üreyen mikroorganizmalar için farkl besiyerleri önerilmektedir (Tablo 9). Solunum yolu örneklerinin ekiminde kullan lan temel teknik, tek koloni ekim yöntemidir. Ad ndan da anlaş ld ğ gibi, bu yöntemde kolonilerin tek tek düşürülmesi, böylelikle hem koloni morfolojilerinin incelenebilmesi hem de bundan sonraki işlemlerin kar ş kl k olmaks z n yap labilmesi amaçlanmaktad r. 197

Gülay Z Tablo 2. Alt solunum yolu infeksiyonlar n n tan s nda kullan lan yöntemler. Etken Kullan lan yöntemler Yorumlar Bakteriyel tipik pnömoni etkenleri Streptococcus pneumoniae, Balgam, BAL ve di er solunum yolu NOW S. pneumoniae idrar antijen testi kullan labilir. örneklerinden Gram boyal bak ve kültür Özgüllü ü > %95; duyarl l %52-80. Haemophilus influenzae, Plevral s v dan Gram boyama ve kültür Moraxella catarrhalis, Kan kültürü Staphylococcus aureus, gram-negatif basiller vb. Atipik pnömoni etkenleri Legionella spp. Solunum yolu sekresyonlar ve dokulardan Alt n standart olarak kabul edilir. BCYE ve selektif BCYE kullan larak kültür drar antijeni saptanmas Birçok kit var, sadece L. pneumophilia SG1 sapt yor. Seroloji Akut ve konvalesan faz serumlar aras nda dört kat titre art fl aran r; serokonversiyon için bir-üç ay gerekebilir. PCR (solunum yolu sekresyonlar nda) En fazla gelecek vadeden. Mycoplasma pneumoniae Seroloji En s k uygulanan yöntem. Nadiren uygulan r. Özel besiyeri, uzun inkübasyon gerekir. PCR Baz laboratuvarlarda Chlamydia pneumoniae Seroloji MIF en iyi yöntem Çok uygulan yor. Duyarl l k %50-70 PCR Standart yöntem yok; baz laboratuvarlarda uygulan yor. Chlamydia psittaci Seroloji Klinik laboratuvarlarda kültür yap lmas önerilmiyor. Bordatella spp. Nazofarengeal sürüntü, aspirat, y kama örneklerinden yap l r. Transport ve ekim için özel besiyeri gerekir. DFA Monoklonal antikorlar kullan ld nda duyarl l k %65; özgüllük %99.6 Seroloji PT ve PFA karfl IgG ve IgA saptanmas PCR H zl, duyarl, kalsiyum alginatl eküvyonlar inhibitör etkili Coxiella burnetii Seroloji Faz II karfl IgG titresinin 200 olmas Nocardia spp. Gram boyama Modifiye aside dirençli boyama Mycobacterium spp. Aside dirençli boyama; hem kat hem de s v besiyerleri kullan larak kültür Do rudan amplifikasyon teknikleri FDA onayl iki yöntem bulunmaktad r. GenProbe bulunmaktad r AMTDT ve Roche Amplicor ve COBAS Amplicor Virüsler nfluenza virüs, respiratuar sinsityal virüs (RSV) ve parainfluenza 1-4 Nazofarengeal aspirat, y kama s v s ve sürüntü tercih edilen örneklerdir. RSV haricindekiler için kültür kullan l r. RSV için DFA tercih edilen yöntemdir. 198

Tablo 2. Alt solunum yolu infeksiyonlar n n tan s nda kullan lan yöntemler (devam ). Etken Kullan lan yöntemler Yorumlar Adenovirüs De iflik özgüllük ve duyarl l kta antijen saptama yöntemleri var. PCR Herpes simpleks virüs Virüs izolasyonu PCR Sitomegalovirüs Antijenemi saptanmas (kandan) Risk alt ndaki hastalarda antijenin periferik kan Solunum yolu örneklerinden (DFA) lökositlerinde saptanmas ve plazma ve serumda da Shell-vial kültür amplifikasyon teknikleri kullan lmas gerekir. Varisella-zoster virüs Virüs izolasyonu DFA Hantavirüsler Seroloji; IgM ve IgG EIA Nadir uygulan yor Funguslar Kesin patojen olanlar: Dimorfikler (Blastomyces, Histoplasma, Fungal boyalar-gomori metenamin Co rafi bölge olarak ülkemizde nadir Coccidioides immitis, gümüflleme (GMG), kalkoflar, PAS (hatta varl flüpheli) Sporothrix schenkii) Seroloji BBH güvenilir de il Cryptococcus neoformans Yukar daki boyalar Lateks aglutinasyon veya EIA ile serumda antijen aranmas F rsatç lar Candida spp. Gram veya fungal boyalar Sadece kültürde üremesi tan için yeterli de il; histoloji gereklidir. Aspergillus GMG, kalkoflar beyaz Kültür yap lmal d r. Zygomycetes GMG, kalkoflar beyaz Septas z genifl hifler zigomiçetleri düflündürür. Histopatoloji Pneumocystis carinii Giemsa, GMG, Toluidine mavisi; DFA ndüklenmifl balgam ve bronkoskopide daha fazla saptan r. Solunum yolu örnekleri bu teknikle ekildikten sonra, kültür plaklar 35-37 C de inkübe edilir. Çukulata agarlar ve antibiyogram için kullan lan kanl agarlar %5-10 CO 2 li ortama kald r l r. Besiyerlerindeki üremeler 18-24 saat sonra (eğer üreme olmad ysa veya zay f üreme varsa 48 saat sonunda) değerlendirilir. Koloni say lar na bak larak semikantitatif bir değerlendirme yap labilir. Bunun için aşağ daki sistem kullan l r: Sadece ilk ekim çizgisinde üreme varsa = 1+ (az say da) Birincinin yan s ra ikinci ekim çizgisinde de üreme varsa = 2+ (orta) Üçüncü ekim çizgisinde de üreme varsa = 3+ (çok say da) olarak değerlendirilir. İkinci bir yönteme göre; ikinci ekim çizgisinde > 5 koloni; üçüncü ekim çizgisinde 3-5 koloni oluşturan mikroorganizma predominant olarak tan mlan r. İdentifikasyon için işlemler ve antibiyogram uygulan r. Besiyerlerinde Gram boyal preparatlarda görülen predominant veya hücre içi olan bakteriye ait koloniler mutlaka aranmal d r. Gram boyal preparatlarda, > 25 PNL ve bakteri görülmesine rağmen 48 saat sonra üreme olmuyorsa, anaeroplar ya da geç ve güç üreyen (örneğin; Nocar- 199

Gülay Z Tablo 3. Preparat boyama teknikleri ve tan mlanan mikroorganizmalar. Yöntem Aside dirençli boyama EZN, Kinyoun* Modifiye teknik (%1 H 2 SO 4 ile dekolorizasyon) Mikroorganizma Mikobakteriler Nocardia, Rhodococcus, askosporlar, sporlar Basit boyama teknikleri Toluidine mavisi Metilen mavisi Florokrom boyalar Akridin oranj Auramine-Rhodamine Kalkoflor beyaz Pneumocystis carinii Direkt örnekten haz rlanm fl preparatlarda Gram boyama ile görülmesi zor olan Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis gibi bakteriler için Hücre içi bakterilerin görülmesi için, PNL ler yeflil, DNA içeren materyal (bakteriler dahil) turuncu boyan r. Mikobakteriler Mantarlardaki selüloz ve kitine ba lan r, maya, hif, yalanc hif görülür. Doku boyalar Wright-Giemsa PAS (periyodik asit schiff) Gomori metenamin gümüflleme * EZN s cak; Kinyoun so uk boyama tekni idir. Periferik kan yaymalar nda s k kullan l r, ASY örneklerinde maya, Histoplasma görülebilir. Fungal elemanlar Pneumocystis carinii, mantar elemanlar Tablo 4. Solunum yolu örneklerinin kalitesinin değerlendirilmesi (Q skoru). Yass epitel hücreleri Alandaki hücreler 0 (yok)** 1-9 (az) 10-24 (orta) > 25 (çok) Nötrofiller* 0 (yok)** 3 0 0 0 1-9 (az) 3 0 0 0 10-24 (orta) 3 1 0 0 > 25 (çok) 3 2 1 0 talik k s mlar Q skorunu göstermektedir. Örne in ifllemlenmesi için skorun 1 olmas gerekir. * Sili epitel hücreleri de nötrofil say s na eklenir. ** Say lara karfl l k gelen yorumlar. Tablo 5. Bartlett değerlendirmesi*. Nötrofil say s (x10) Derece Epitel hücre say s (x10) Derece < 10 0 10-25 -1 10-25 +1 > 25-2 > 25 +2 Mukus varl +1 * Yirmi-otuz farkl alandaki epitel ve nötrofil say s n n ortalamas al n r. Sonuç 0 (s f r) veya daha az ise tükürük kontaminasyonu olarak düflünülür ve yeni bir örnek istenir. 200

Tablo 6. Murray ve Washington değerlendirmesi. Nötrofil say s (x10) Epitel hücre say s (x10) Grup 1* 10 25 Grup 2 10-25 25 Grup 3 25 25 Grup 4 25 10-25 Grup 5 25 <10 * Grup 1-4 orofarengeal kontaminasyon nedeniyle uygunsuz örneklerdir. Grup 5 uygun balgam örne idir. Tablo 7. Gram değerlendirmesi. Hücre say s /Alan (x100) Grup Nötrofil Yass epitel 6 (TTA)* < 25 < 25 5 > 25 < 10 4 > 25 10-25 3 > 25 > 25 2 10-25 > 25 1 < 10 > 25 * Transtrakeal aspirat: E er mikroorganizma yok ve epitel say s > 10 ise reddedilmelidir. Grup 4-6 kültür için uygundur. Grup 1-3 kültür için uygun de ildir, yeni örnek istenmelidir. dia) bakterilerle infeksiyon veya hastan n antibiyotik kullan m na bağl olarak bakterilerin ürememesi düşünülmelidir. Etken olarak düşünülen bakterilerden antibiyogram yap l r. Antibiyogram yap m nda Clinical and Laboratory Standards Institue (CLSI) taraf ndan önerilen disk difüzyon ve dilüsyon testleri uygulanmaktad r. Özellikle pnömokoklar için beta-laktam ajanlar n minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) değerlerinin belirlenmesinde E-test (AB Biodisk; Solna, İsveç) yöntemi de kullan lmaktad r. Kültürleri değerlendirirken özellikle flora içeren bölgelerde etken ayr m n n yap lmas önemlidir. Solunum yolu floras pnömoni etkeni olabilecek baz türleri de kapsad ğ ndan, solunum yolu örneklerinden etken-flora ayr m n yapmak oldukça güç olmaktad r. Bu nedenle kültür yap lmadan önce Gram boyal preparatlarda yass epitel say lar değerlendirilerek orofarengeal kontaminasyonun derecesi belirlenmelidir. Yine Gram boyal preparatlarda predominant ve/veya hücre içi olarak görülen bakterilere yönelik işlem yap lmal d r. Tüm kültür yöntemlerine rağmen solunum yolu örneklerinin ancak %50 sinde üreme olmaktad r. Bu durumun nedenleri aras nda; İşlem öncesi antibiyotik kullan m, İnfeksiyon etkeninin Mycoplasma, Chlamydia, virüsler, mikobakteriler gibi rutin kültürlerde üretilemeyen mikroorganizmalar olmas, Bronşiyal/bronkoalveoler y kama için kullan lan fizyolojik tuzlu suyun üremeyi bask lay c etkisi, Lokal anestetiklerin üremeyi inhibe etmesi, Özellikle korumal f rçalama ile örnek al m nda yetersizlik, Bronkoskopik olmayan invaziv yöntemlerde infeksiyon alan n kaç rma, Örneğin laboratuvara getirilmesinde gecikme, Laboratuvarda örneğin bekletilmesi, Etkene uygun işlem yap lmamas (örneğin; Nocardia kültürlerini 48 saatte ç karma), Belirtilerden pnömoniyi taklit eden infeksiyon d ş nedenlerin sorumlu olmas, say labilir. 3. Kantitatif Kültürler HKP de ventilatörle ilişkili pnömoni tan s nda, ayr - ca kistik fibrozisli ve bronşektazili hastalar n balgam kültürlerinde kantitatif ekim uygulanmas önerilmektedir (Tablo 10). Ağ r TKP nedeniyle hastaneye yat- 201

Gülay Z Tablo 8. Balgam örneğinin al nmas ve işlemlenmesi. Pnömonilerde (özellikle TKP) balgam örne inin Gram boyal bak s yayg n uygulanan ve basit bir teknik olarak görülmesine ra men asl nda görüldü ü kadar kolay de ildir: Birçok hasta balgam ç karamamaktad r. Balgam örneklerinin ço u vas fs zd r. Preparatlar n yorumu e itim ve deneyim gerektirmektedir. Pozitif bir preparat konusunda de erlendirme kriterleri de ifliktir. Atipik pnömoni etkenleri tan mlanamamaktad r. Önceden (48 saat içinde) antibiyotik kullan m preparattaki bakteri say lar n etkilemektedir. Balgam örne i al nmas bazen tedaviyi geciktirebilmektedir. Balgam örne inin al nmas, laboratuvara gönderilmesi ve ifllemlenmesinde baz kurallara uyulmas klinik aç dan yararl sonuçlar n elde edilmesine yard mc d r: 1. Balgam örne i (mümkünse) antibiyotik tedavisi bafllanmadan önce e itimli bir personel gözetiminde al nmal d r. Bu kifli hastaya örnek vermeden önce neler yapmas gerekti ini anlatmal d r. 2. Hasta, örnek vermeden önce bir-üç saat birfley yememeli, örnek vermeden önce a z n su veya tuzlu suyla çalkalamal d r. 3. A z temizlendikten sonra balgam derin bir öksürükle ç kar lmal ve makroskobik olarak pürülan gözükmelidir. 4. Örnek h zla laboratuvara ulaflt r lmal d r. Oda s s nda iki-befl saatlik gecikmeler S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus gibi patojenlerin izolasyon oranlar n düflürmekte, buna karfl n, normal flora elemanlar n n ço almas na neden olmaktad r. 5. Laboratuvarda Gram boyama ve kültür için pürülan bir k s m seçilmelidir. E er mümkünse S. pneumoniae için Quellung tepkimesine bak lmal d r. 6. Küçük büyütme (x10) ile örne in içerdi i hücreler de erlendirilmelidir. Kalite de erlendirilmesi için çeflitli kriterler bulunmaktad r. Kültür uygulamas için klasik olarak, her sahada < 10 yass epitel hücresi, > 25 PNL bulunmas kriteri aranmaktad r. Ancak en az ndan < 25 yass epitel olmas flart aranmal d r. Bu kriterler, Mycobacterium ve Legionella kültürleri için uygulanmamaktad r. 7. Kültürler standart olarak kanl, çukulata ve EMB besiyerlerine tek koloni yöntemiyle ekilir. Rapor semikantitatif olarak verilebilir. Patojenlerin ço u ikinci ekim çizgisinde befl koloniden fazla üreme gösterir. Gram boyal preparatlarda görülen predominant bakteri morfolojisine uyan koloniler özellikle aranmal d r. Kaynak: Bartelt lg, Breiman RF, Mandell LA, File TM. Community acquired pneumonia adults: Guidelines for management. Clin Infect Dis 1998; 26: 811-38. mas ve yoğun bak m desteği gereken hastalarda, bronkoskopik yöntemlerle al nan solunum yolu örnekleri de yukar da belirtilen besiyerlerine ekim yap larak kantitatif yöntemle incelenir. 4. Diğer Kültürler Kan kültürlerinde etken üreme oranlar düşük (%5-16) olmas na rağmen, pnömonili hastalardan kan kültürü yap lmas da önerilmektedir. Kan kültürü için farkl zamanlarda en az iki kültür al nmas gereklidir. Yine TKP li hastalar n yaklaş k %40 nda pnömoniye plevral efüzyon eşlik etmektedir. Bu hastalarda torasentez yap lmaya karar verilirse örnekten Gram boyal preparatlar haz rlanmal ve yukar da belirtilen besiyerlerine ekim yap lmal d r. II. İMMÜNOLOJİK ve MOLEKÜLER YÖNTEMLER 1. İmmünolojik Yöntemler Tan sal mikrobiyolojide kullan lan antikor (Ab) ve antijen (Ag) testlerini kapsamaktad r. Ag ve Ab birleşmeleri son derece özgül reaksiyonlar olduklar için, bu testler ya bilinen Ab kullan larak hasta örneklerinde Ag ya da bilinen Ag kullan larak hasta serumunda Ab aranmas için kullan labilir. Aglutinasyon testleri: Aglutinasyon testlerinde Ab- Ag birleşerek gözle görülür kümeler oluşturur. Bunun için farkl yöntemler kullan lmaktad r. i. Direkt (doğrudan) aglutinasyon reaksiyonlar : Antijenin partiküler olduğu durumlarda (örneğin; antijen olarak bütün bakteri kullan ld ğ nda) görülen 202

Tablo 9. Alt solunum yolu infeksiyonu oluşturabilen mikroorganizmalar ve önerilen kültür ortamlar. Mikroorganizma Kültür ortam S. pneumoniae, S. aureus, A grubu beta-hemolitik streptokok %5 koyun kanl agar Enterobacteriaceae üyeleri, Pseudomonas aeruginosa ve di er nonfermentatifler Haemophilus influenzae Corynebacterium diphtheriae Moraxella catarrhalis Legionella* Mycobacterium tuberculosis** Bordatella pertussis Anaeroplar*** Burkholderia cepacia Chlamydia spp. Virüsler EMB ve kanl agar Çukulata agar, at kanl agar (X ve V faktör katk l ) Loeffler koagüle s r serumlu besiyeri veya tellüritli besiyeri Çukulata agar ve kanl agar Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE) Özel kat ve s v besiyerleri, Löwenstein-Jensen Middlebrook 7H11 (kat ) ve 7H9 (s v ); s v kültür sistemleri BACTEC 460 TB; MGIT 960 vb. Bordet-Gengou by.; Regan-Lowe (aktif kömürlü) Anaerop kanl agar (Columbia blood agar, hemin ve K vitamini katk l ); antibiyotikli (gentamisin) anaerop kanl agar Polimiksin B, kolitsin, aminoglikozid katk l besiyerleri (kistik fibroziste kullan l r) Hücre kültürü Hücre kültürü * Solunum yolu örneklerinin önceden asit ile muamelesi verimi artt r r. ** Solunum yolu örneklerinin önce dekontaminasyonu gereklidir. *** Anaerop ekim sadece transtrakeal aspirat, biyopsi örnekleri ve torasentez s v s nda yap l r. Tablo 10. Kantitatif kültür sonuçlar n n yorumu. Örnek Toplam miktar Suland r m faktörü Tan sal eflik de eri (cfu/ml) Balgam, endotrakeal aspirat 1-2 ml-20ml 1 10 5-10 8 PSB 0.001 ml/ 1 ml suland r c da 1/1000 10 3 BAL 1 ml / 100 ml s v içinde 1/100 10 4 PSB: Korumal f rçalama, BAL: Bronkoalveoler lavaj. kümeleşme reaksiyonudur. Örneğin; Haemophilus influenzae üreyen bir kültürde aglutinasyon yap larak kapsül serotipinin b olup olmad ğ anlaş labilir. ii. Partikül aglutinasyonu (dolayl veya pasif aglutinasyon): Bu yöntemde kümeleşme görülebilmesi için taş y c partiküller kullan l r. Bu partiküller aras nda lateks boncuklar (lateks aglutinasyon), eritrositler (pasif hemaglutinasyon) veya özel bir Staphylococcus aureus (Cowan 1) suşu (koaglutinasyon) say labilir. S. aureus (Cowan 1) suşu d ş ndaki partiküller bilinen antikorla kaplanarak hasta örneğinde antijen aramak, bazen de protein yap s ndaki antijenle kaplan p antikor aramak için kullan labilir. Koaglutinasyonda S. aureus yüzeyindeki protein A nedeniyle antikorla kaplan r ve antijen aramak için kullan l r. İmmünfloresan (IF) mikroskopi yöntemleri: İmmünfloresan mikroskopide florokromlarla işaretli antikorlar (konjuge antikor veya konjugat olarak adland r l r) kullan l r. Florokromlar, ultraviyole ş nlar n absorbe eden ve ald ğ ş k enerjisinin daha uzun dalga boylar ndaki ş n mlar şeklinde b rakan (emisyon), böylelikle floresans veren maddelerdir. Birçok florokrom madde olmas na rağmen tan sal testlerde en s k florescein isothiocyanate (FITC) maddesi kullan lmaktad r. İmmünfloresan yöntemlerin uygu- 203

Gülay Z lanabilmesi için laboratuvarda uygun bir ş k kaynağ ve filtreleri olan bir floresan mikroskobu bulunmal d r. i. Direkt (doğrudan) floresan antikor (DFA) testi: Bu tek basamakl testte, hastalar n solunum yolu örneklerinde antijenlerin saptanmas veya kültürde üreyen mikroorganizmalar n tan mlanmas için FITC işaretli antikorlar kullan l r. DFA testi Bordatella pertussis ve P. carinii için uygulanmaktad r. ii. Dolayl (indirekt) floresan antikor testi (IFAT): İki basamakl bir test olan IFAT ta da Ag veya Ab aranabilmektedir. Antikor aranacaksa, bilinen Ag ile (örneğin; M. pneumoniae) preparat haz rlan r. Bazen haz r antijenle kapl lamlar kullan labilir. Tesbit edilir. Üzerine hasta serumu eklenir, nemli bir atmosferde Ag-Ab birleşmesinin oluşmas beklenir. Preparat y kan r. Böylelikle hastan n serumunda bulunan bağlanmam ş antikorlar uzaklaşt r l r. Daha sonra preparat üzerine FITC ile işaretli antiinsan immünglobulini eklenir. Y kama basamağ ndan sonra floresan mikroskobunda incelenir. Hastan n serumunda Ab varsa floresans görülür. Antijen aranacaksa hasta örneği ile preparat haz rlan r, tesbit edilir. Üzerine bilinen antikor (birinci antikor) konur. Nemli atmosferde inkübasyondan sonra y kan r ve üzerine FITC ile işaretli antiimmünglobulin (birinci antikor hangi türde haz rland ysa ona özgül, örneğin; antitavşan immünglobulini) eklenir. İnkübasyon ve y kamadan sonra floresans görülmesi antijen varl ğ n gösterir. DFA, IFAT tan daha çabuktur. Antijen tan mlamas nda IFA testleri daha duyarl, DFA ise daha özgüldür. Enzim işaretli immünolojik saptama yöntemleri (enzim immünassay; EIA): Enzimle işaretli antikorlar n (konjugat) kullan ld ğ yöntemlerdir. Bu yöntemde Ag ve Ab birleşmesi bir enzimin kolorojenik substrat na etki etmesi ve renk değişimi olmas yla gösterilmektedir. Birçok farkl EIA tipleri vard r. ELISA lar, antikor veya antijenin kat yüzey (örneğin; boncuklara veya plastik mikrodilüsyon plaklar - n n kuyucuklar na bağl olduğu) EIA varyantlar d r. EIA testleriyle hasta örneklerinde antijen veya bir solunum yolu patojenine karş antikor saptanabilmektedir. Antijen tan mlama testleri, özellikle influenza virüs ve respiratuar sinsityal virüs (RSV) gibi viral etkenlerin saptanmas nda kullan lmaktad r. Antijen tan mlama testlerinin baş nda DFA testleri gelmektedir. DFA için nazal aspirat/nazal y kama s v s veya nazofarengeal sürüntü örnekleri kullan lmal d r. Boğaz sürüntü örneklerinin verimi düşüktür. Bunlar d ş nda Legionella pneumophilia ve S. pneumoniae için idrarda çözünür antijen saptama testleri bulunmaktad r. Bu testler, radyoimmünassaydan-enzim immünassaya kadar farkl yöntemlerle çal şmaktad r. Legionella üriner antijen kitleri sadece L. pneumophilia serogrup 1 i saptamaktad r. Bu nedenle diğer 62 serogrup saptanmamaktad r. Değişik çal şmalarda, testin duyarl l ğ %70-90, özgüllüğü ise > %99 olarak bildirilmiştir. Ülkemizde yap lan çal şmalarda da lejyonelloz olgular n n çoğundan L. pneumophilia serogrup 1 in sorumlu olduğu görülmektedir. Son y llarda hem L. pneumophilia hem de S. pneumoniae için idrarda antijen saptamaya yönelik bir immünkromatografik yöntem geliştirilmiştir (NOW test, Binax lnc.). Bakteremik hastalarda, kan kültür sonuçlar yla k yasland ğ nda bu testin Legionella için duyarl l k ve özgüllüğü s ras yla, %70 ve %100; S. pneumoniae için %80 ve > %95 olduğu bildirilmektedir. Serumda antikor saptanmas na yönelik serolojik testler ise genellikle M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophilia gibi atipik patojenlerin tan s nda kullan lmaktad r. Ancak bunlar için en güvenilir serolojik kan t akut ve konvalesan dönem serum örneklerindeki IgG antikor titrelerinin dört kat artmas d r. Dolay - s yla, sonuçlar rutinde yararl olmayacak kadar geç ç kmaktad r. Ancak yine de uygulanmalar epidemiyolojik aç dan yararl d r. 2. Moleküler Yöntemler Hibridizasyon yöntemleri: Nükleik asit problar n n kullan ld ğ yöntemlerdir. Bunlar tek iplikli DNA veya RNA ya bağlanabilen (hibridize olabilen) böylelikle çift iplik oluşturabilen nükleotid dizgileridir. Bir mikroorganizma türüne veya cinsine özel bir nükleik asit dizisi çoğalt l p kemiluminisan bir maddeyle işaretlendikten sonra prob ad n al r. Hibridizasyon yöntemi, kültürde üreyen mikroorganizmalar n tan mlanmas veya hasta örneklerinde mikroorganizma saptanmas için kullan lmaktad r. Legionella spp. ve mikobakteriler gibi baz solunum yolu patojenleri için ticari kitler bulunmaktad r. Ancak baz s - n rl l klar mevcuttur. Örneğin; hasta örneklerinde az miktarda hedef molekül bulunduğu için genellikle bu testlerle klinik örneklerde doğrudan mikroorganizma varl ğ n n gösterilmesi mümkün olmamaktad r. Bu nedenle, hedef moleküller polimeraz zincir reaksiyonuyla çoğalt ld ktan sonra hibridizasyon uygulanmaktad r. 204

Nükleik asit amplifikasyon yöntemleri i. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR): Bu teknikte DNA daki özel bir dizgi (hedef), sürekli kopyalanarak çoğalt lmaktad r. PCR ile teorik olarak ortamdaki tek bir hedef DNA bile çoğalt labilir. Ancak testin bu duyarl l ğ ayn zamanda zay f yönüdür. Ortam n çok az miktarda hedef DNA ile kontaminasyonu bile yalanc pozitifliklere yol açmaktad r. Bu nedenle PCR uygulanan laboratuvarlar özel olarak düzenlenmiş olmal d r. Günümüzde M. tuberculosis saptanmas nda kullan lan ve Food and Drug Administration onayl PCR testleri bulunmaktad r. Bunun d ş nda, S. pneumoniae, B. pertussis, L. pneumophilia, C. pneumoniae ve solunum yolu virüsleri için geliştirilmiş PCR yöntemleri bildirilmektedir. PCR birçok özelliği ile ASYİ tan s nda aranan ideal test olma potansiyeline sahiptir. KAYNAKLAR 1. Bartlett JG, Dowell SF, Mandell LA, File TM, Musher DM, Fine MJ. Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis 2000; 31: 347-82. 2. Bartelt MA. Immunologic and Molecular Procedures in Diagnostic Microbiology: A Study Guide. 1 st ed. FA Davis Comp 2000: 33-44. 3. Carroll KC. Laboratory diagnosis of lower respiratory tract infections; controversy and conundrums. J Clin Microbiol 2002; 40: 3115-20. 4. Drummond P, Clark J, Wheeler J, et al. Community acquired pneumonia- aprospective UK study. Arch Dis Child 2000; 83: 408-12. 5. Ewig S, Sclochtermeier M, Göke N, Niedermann MS. Applying sputum as a diagnostic tool in pneumonia. Chest 2002; 121: 1486-92. 6. Fagon JY, Chastre J, Wolff M, et al. Invasive and noninvasive strategies for management of suspected ventilator associated pneumonia. Ann Intern Med 2000; 132: 621-30. 7. Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol 1. Washington DC: ASM, 1992: 1.1-1.6.l 8. Metlay JP, Fine MJ. Testing strategies in the initial management of patients with community acquired pneumonia. Ann Intern Med 2003; 138: 108-18. 9. Reimer LG, Carroll KC. Role of microbiology laboratory in the diagnosis of lower respiratory tract infections. Clin Infect Dis 1998; 26: 742-8. 10. Rozon B, Caratala J, Verdauger R, Dorca J, Manresa F, Gudiol F. Prospective study of usefulness of sputum Gram stain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiring hospitalization. Clin Infect Dis 2000; 31: 869-74. 11. Saubolle M, McKellar PP. Laboratory diagnosis of community acquired lower respiratory tract infection. Infect Dis Clin North Am 2001; 15: 1025-45. 12. Smith PR. What diagnostic tests are needed for community acquired pneumonia? Med Clin North Am 2001; 85: 1381-86. 13. Toraks Derneği tan ve tedavi rehberleri 2002. 14. Yüce A. Pnömonilerde mikrobiyolojik tan. Ekim N, Uçan ES (editörler). Solunum Sistemi İnfeksiyonlar. Ankara: Toraks Kitaplar, 2001: 110-124. YAZIŞMA ADRESİ Prof. Dr. Zeynep GÜLAY Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal İZMİR 205