55 TULAREMİ Doç.Dr. Aynur KARADENİZLİ Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Tularemi hastalığı bakteriyel bir zoonoz olup, küçük, gram negatif bir kokobasil olan Francisella tularensis bakterisi tarafından oluşur. F.tularensis insanlar ve bazı kemirgenler, tavşanlar için oldukça virulan bir bakteridir. Tularemide insandan insana geçiş saptanmamıştır. Başlıca insanlara geçiş yolları: 1. Artropod ısırıkları 2. İnfekte hayvan, infeksiyöz hayvana ait doku yada sıvılar 3. Kontamine su veya yiyecek yenilmesi 4. İnfektif aerosollerin inhalasyonu Tarihçe Tularemi eski Sovyetler Birliği (2.Dünya Savaşı sırasında 67 000 olgu) ve ABD de (1990-2000 yıları arasında 1400 olgu) toplum sağlığı problemidir. Savaş gibi felaketlere bağlı olarak hijyen şartlarının bozulması, kırsal alanlarda kemirgen, kene, tavşanlarla temas olasılığının artması ile tulareminin görülme sıklığı daha da artar. 1999-2000 yıllarında savaşın yıktığı Kosova 327 olguyu içeren bir salgın buna örnektir. Türkiyenin birçok bölgesi Tularemi yönünden endemik olarak kabul edilmektedir. Günümüze kadar Türkiyede sporadik olgular dışında dokuz salgın hakkında literatür bilgisi bulunmaktadır. Bunlar Trakya (1936, 1945), Antalya (1953), Bursa (1988), Ankara (1998), Zonguldak ve çevresi (2003), Suluova (2004),, Düzce (2004) ve Gölcük (2005) de ortaya çıkan salgınlardır. Soğuk Savaş sırasında Doğu ve Batı da F.tularensis bir biyolojik savaş silahı olarak geliştirilmiştir. Yüksek infektivite özelliği, aerosollerde nispeten stabil olması yayılımını kolaylaştırır. Taksonomi Proteobakterilerin gama-altsınıfında bulunur. Francisella familyasındadır. Francisella cinsinde iki farklı F.tularensis türü vardır: F.tularensis ve F.philomiragia. F.tularensis in 4 alttürü vardır. Bunların virulansları, coğrafik dağılımları farklılık gösterir. 1. F.tularensis alttür tularensis, 2. F.tularensis alttür holarctica,
56 3. F.tularensis alttür novicida, 4. F.tularensis alttür mediasiatica Alttürlerin genel Özellikleri F.tularensis alttür tularensis (Tip A):Yüksek düzeyde virulandır. Kuzey Amerikada yaygındır. F.tularensis alttür holarctica (Tip B):Tüm kuzey hemisferde bulunur. Türkiye de salgınlara neden olan alttürdür. Daha az virulandır. F.tularensis alttür mediasiatica: Kazakistan ve Özbekistan dan izole edilmiştir. Orta düzeyde virulansa sahiptir. F.tularensis alttür novicida: ABD ve Avusturalya dan izole edilmiştir. İmmun yetmezlikli kişilerde hastalık oluşturur. Düşük virulansa sahiptir. Epidemiyoloji F.tularensis alttür tularensis bulaşında tavşan, koyun ve kene, F.tularensis alttür holarctica bulaşında ise misk sıçanı, kunduz gibi suyla yaşamsal ilişkisi olan çok sayıda vektör hayvan tanımlanmıştır. Klinik İnfeksiyon kaynağı ve klinik bulgular etken olan F.tularensis alttürlerine göre değişir. Ortalama inkubasyon süresi 3-5 gündür. F.tularensis alttür tularensis insanlar için bilinen en infeksiyöz patojenlerden biridir. Hayvanlar arasında yada hayvandan insana geçişte kene bazen sinek yada aerosoller rol oynar. Antibiyotik öncesi dönemde mortalite %5 60 arasındaydı. Günümüzde %2 olarak kabul edilmektedir. Solunum semptomları, boğaz ağrısı ve substernal ağrı başlıca şikayetlerdir. Rhabdomyolizis ve şokla hasta kaybedilir. F.tularensis alttür holarctica nadiren fatal seyreder. Hastalığın uzamasına ve supuratif komplikasyonlara yol açar. Klinik Form Ülseroglandüler yada Glandüler Okuloglandüler Orofarengeal Solunum Tifoid Vücuda Giriş Yolu Vektörler (kene, sinek vb.), İnfekte hayvan yada doku ile temas Kontamine parmakla göze temas, aerosolle Kontamine yiyecek yada su alımı Kontamine tozun inhalasyonu yada laboratuar infeksiyonu Tam bilinmiyor
57 Avrupa ülkelerindeki salgınların >%95 i ülseroglandüler yada glandüler formdadır. Türkiye de 1936-2004 yılları arasında raporlanan 507 olgunun 387 si (%77.4) orofarengeal form olarak saptanmıştır. Orofarengeal form genellikle baş ve boyunda lokalizedir. Ağızda ve farengeal müköz membranlarda kızarıklık ve püstüler değişiklikler oluşur. Genellikle tek taraflı olan bölgesel boyun lenf adeniti gelişebilir. Bu bulgular streptokokal tonsillit, enfeksiyoz mononukleoz ve tüberküloz lenfadenit ile kolayca karıştırılabilir. Bu olgularda epidemiyolojik çalışmalarla tularemi kaynağı olarak yiyecek ve su kaynağı saptanırsa tanı koymak kolaylaşır. Klinik ve laboratuar bulgularına göre tularemi olgularının tanımlanması Tularemi Olgu Tanımı Şüpheli Tularemi Olası Tularemi Özelliği Tularemi ile uyumlu klinik semptomlar ve riskli temas hikayesi Tularemi ile uyumlu klinik semptomlar var ve klinik örneklerden Antijen yada DNA pozitifliğinin gösterilmesi Tek bir serumda serolojik olarak pozitifliğin saptanması Kesin (İspatlanmış) Tularemi Kültürde üreyen F.tularensis in identifikasyonu (Ag yada DNA bakılarak) Farklı zamanda alınan serum örneklerinde 4 kat artış (Tüp yada mikroagglütinasyon testi) ELISA ile en az bir serumda yüksek düzeyde pozitiflik saptanması Laboratuvar tanı Örnek alımı 1. Hastaya ait (Tam kan, serum, solunum sistemine ait sekresyonlar, lezyondan sürüntü, lezyondan yapılan aspiratlar, doku biyopsisi, otopsi materyali), 2. Memeli hayvanlara ait (Serum, lezyondan yapılan aspirat, otopsi materyali), 3. Artropodlar (kene, sivrisinek), 4. Çevresel örnekler (Su, toprak, çamur, hayvan dışkıları yada çıkartıları) kullanılabilir.
58 Kültür Tanıda altın standart olarak kabul edilmektedir. Fakat bakterinin nazlı üreme ve yüksek bulaşabilme özelliği nedeniyle pratik uygulanımı zordur. İşlemler sırasında Düzey III Emniyet kabini kullanımı gereklidir. Ayrıca çevresel örneklerdeki kontaminan bakteriler nedeniyle kültürde başarı oranı düşüktür. Kültür hastalığın kesin tanısının konulmasını sağlar. Ayrıca moleküler epidemiyoloji, tiplendirme çalışmaları ile yeni alttürlerin saptanması mümkün olur. Besiyeri olarak Sistein yada sistin içeren agarlar, BCYE agar, GC agar (%1 Hemoglobin ve %1 IsoitaleX) ve kontamine örnek ekimlerinde antibiyotikli besiyerleri tercih edilir. Antimikrobiyal duyarlılık testleri Tularemi tedavisinde kullanılan antibiyotiklere karşı henüz direnç rapor edilmediği için rutin olarak duyarlılık testleri yapılmaz. Eğer yapılacaksa CLSI broth mikrodilüsyon yapılmasını önermektedir. Ayrıca E-test de kullanılabilir. Serolojik Tanı (ELISA ve aglütinasyon testleri) Tanıda en yaygın kullanılan yöntemdir. Mikroagglütinasyon yada tüp aglütinasyonu şeklindedir. Antijen olarak FopA, LPS, dış membran karbohidrat fraksiyonu (OMP) ve ölü bakteri hücresi kullanılır. Dezavantajı antikorların genellikle hastalığın 2. haftasına kadar saptanamaması ve bazen brusella, proteus yada yersinia cinsi bakterilerle çapraz reaksiyonlar göstermesidir. Antijen saptamasına yönelik testler Direkt floresan antikor testi, immunohistokimyasal boyama, Ag-Capture ELISA başlıca testlerdir. Referans merkezlerde yapılan Floresan Antikor testi, antijen saptama testleri ve immunohistokimyasal boyalarla yapılan çalışmaların sınırlı kullanım alanları vardır. Direkt Floresan Antikor testi hızlı ve özgün bir testtir (duyarlılık sınırı ~10 6 hücre/ml). Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Hastaya ait lezyonlardan, aspiratlardan ve çevresel örneklerden yapılabilen PCR ile F. tularensis genomik segmentlerinin amplifikasyonu sağlanır. Bu duyarlı ve özgün bir yöntemdir. Bu yöntemin laboratuar personeli için güvenli olması bir diğer avantajıdır. Son yıllarda jel-bazlı PCR sistemleri yerine DNA miktarındaki artışın eş zamanlı olarak izlenebildiği Real-Time PCR teknikleri tercih edilmektedir. Başlıca Real-Time PCR teknikleri, 5' nükleaz assay (TaqMan PCR), Hairpin probları, Hibridizasyon temelli rezonans enerji transfer probları, çift ipliğe spesifik DNA boyalarının kullanılmasına dayanır. PCR temelli metodlarda F. tularensis'e ait hedeflenen başlıca genler: tul4 (Dış membran proteinlerini kodlar), fopa (Dış membran proteinlerini kodlar),
59 ISFtu2 (Multiple sayıda bulunan insersiyon element benzeri bir sekans) ve 23kDa gen (Makrofaj infeksiyonunda eksprese edilen bir proteini kodlar)'dir. Üç farklı genomik lokusu (ISFtu2, 23kDa, tul4) hedefleyen multitarget TaqMan assay sayesinde bir adet F.tularensis'i dahi saptamanın mümkün olduğu belirtilmektedir. Bu yöntem aynı zamanda türe özgün sonuçlar verebilir. Üçünün pozitif olduğu durumda F. tularensis, ISFtu2 pozitif ve tul4 negatif ise F. philomiragia tanısı konulabilir. Türkiyede Tularemi Ülkemizde Tularemi hastalığı 2005 ten itibaren bildirimi zorunlu (C grubu) hastalıklardan kabul edilmektedir. Olası ve kesin olgu olarak değerlendirilen hastaların 014 nolu Formla İl Sağlık Müdürlüklerine bildirilmesi zorunludur. Kesin olgular ise 017/C Formu ile Sağlık Bakanlığına bildirilmelidir. 2005 yılında 14 farklı ilden toplam 319 olgu tanımlanmıştır. Türkiyede ilk epidemilerin tanımlanmasında kültür, seroloji ve hayvan inokülasyonu (fare, kobay) yöntemleri, sonraları uzun yıllar boyunca aglütinasyon testi kullanılmıştır. 2004 yılından sonra tularemi tanısının konulmasında hem hastaya ait örneklerden hem de su, çamur, kemirgen ölülerinden Real Time PCR yöntemi kulanılmaya başlanmıştır. Ülkemizde olguların erken tanısının konulabilmesi için ilgili meslek dallarında çalışanların (Tıp hekimleri, veteriner hekimler, çevre sağlığı alanında çalışanlar) eğitimi, organizasyonu, ortak çalışma planlarının hazırlanması gerekmektedir. Birçok merkezde düzey III emniyet kabinlerinin olduğu kültür yapılabilecek şartların sağlanması, moleküler yöntemlerin yerleştirilmesi, serolojik testlerde kullanılması için antijen üretilmesi, tulareminin epidemiyolojik özelliklerinin anlaşılabilmesi için üretilen suşların tiplendirilmesi, antimikrobiyal duyarlılık testlerinin yapılabilmesi gelecekte tularemi ile ilgili ülkemizde yapılması gerekli başlıca hedeflerdir. Kaynaklar 1. Ellis J, Oyston PC, Green M, Titball RW. Tularemia. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 631-46. 2. Parola P, Raoult D. Ticks and tickborne bacterial diseases in humans: an emerging infectious threat. Clin Infect Dis 2001; 32: 897-928. 3. Dennis DT, Inglesby TV, Henderson DA, Bartlett JG, Ascher MS, Eitzen E, et al. Tularemia as a biological weapon: medical and public health management. JAMA 2001; 285: 2763-73. 4. Choi E. Tularemia and Q fever. Med Clin North Am 2002; 86: 393-16. 5. Blanco JR, Gutierrez C, Zabalza M, Salcedo J, Erdozain I, Oteo JA. Clinical microbiological case: sore throat and painful bilateral cervical lymph nodes. Clin Microbiol Infect 2001; 7: 637-8, 54-6. 6. Sjostedt A, Eriksson U, Berglund L, Tarnvik A. Detection of Francisella tularensis in ulcers of patients with tularemia by PCR. J Clin Microbiol 1997; 35: 1045-8. 7. Versage JL, Severin DD, Chu MC, Petersen JM. Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. J Clin Microbiol 2003; 41: 5492-9. 8. Karadenizli A, Gurcan S, Kolayli F, Vahaboglu H. Outbreak of tularaemia in Golcuk, Turkey in 2005: Report of 5 cases and an overview of the literature from Turkey. Scand J Infect Dis 2005;37(10):712-6