Sperma Sulandırıcıları ve Spermanın Sulandırılması Spermanın Kısa ve Uzun Süreli Saklanması ve Kryobiyoloji Prof.Dr.Serhat PABUCCUOĞLU 22 Nisan 2013, İSTANBUL, AVCILAR
Sperma Sulandırıcısı Nedir? Spermanın ihtiyaçlarını karşılayan, dış etkenlere karşı spermatozoanın bütünlüğünü ve fertilite yeteneğini koruyan, dişi genital sistemine zarar vermeyen, spermanın hacmini istenilen düzeye çıkarabilen spermatozoa için geliştirilmiş sıvı besi ortamlarıdır. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 2
Spermayı hacim olarak artırmak Spermatozoanın canlılığını daha uzun süre devam ettirebilmek Spermatozoayı ani ısı değişikliklerinden koruyabilmek Mikroorganizmaların spermatozoaya zarar vermesini önlemek SULANDIRICILARIN KULLANIM AMAÇLARI 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 3
Spemanın hacmini artırmak Bir ejakulasyon sonunda elde edilen, örneğin bir boğa sperması ortalama 5 ml dir. Bu sperma ile sun'i tohumlama yöntemi kullanılarak 100-500 adet inek tohumlanabilir. Ancak 5 ml spermayı hiçbir şey yapmadan 100-500 eşit hacime bölmek mümkün değildir. Bunu bölebilmek için spermatozoaya zarar vermeden hacmini uygun bir şekilde artırmak gerekir. Bunun için de «SPERMA SULANDIRICISI» kullanılır 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 4
Spermatozoanın canlılığını daha uzun süre devam ettirebilmek Testislerde üretilip ejakulasyon ile dışarıya bırakılan sperma seminal plazmada bulunan maddeler sayesinde canlılıklarına devam ederler. Ancak bu stoklar sadece dişi genital kanalın bir kısmındaki yaşama payını karşılayabilir. Dış ortamda daha uzun süre canlı ve fertil kalabilmeleri için mutlaka daha fazlasına ihtiyaç vardır. Sulandırıcılarda bulunan basit şekerler gibi enerji veren maddeler, spermatozoanın canlılığını sürdürmesinde yardımcı olurlar. Ayrıca makromoleküler yapıdaki maddeler (özellikle lipoproteinler) membran bütünlükleri ve oksidadif strese karşı koruyucu etkiye sahiptirler. Metabolizma artıkları ekarte edilerek oksidatif strese bağlı hem membran hem de DNA üzerinde şekillenecek önemli bozulmaların önüne geçilir. Tampon ortamlar sayesinde ortamın ph değişimlerinin önüne geçilir. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 5
Spermatozoayı ani ısı değişikliklerinden koruyabilmek. Spermanın daha uzun süre saklanabilmesi için 5 o C'a soğutulması veya dondurulması zorunludur. Böylece sperma çok daha uzun süre potansiyel fertilitesini koruyabilir. Spermatozoanın membran yapısı lipoprotein yapısındadır ve içinde kolesterol molekülleri bulunur. Kolesterolün temel görevi hücre membranının düşük ısılardaki dayanıklılığını artırmaktır. Kolesterol miktarları düştükçe ısı değişimlerine karşı spermatozoanın dayanıklılığı da azalır. Sulandırıcıların içinde bulunan makromoleküller özellikle lipoprotein, phospholipid, Lesitin, β-lipovitellin ve glikoproteinler bu değişimlere karşı spermatozoayı korurlar. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 6
Mikroorganizmaların spermatozoonlara zarar vermesini önlemek. Spermatozoa, herhangi bir hastalık etkeni söz konusu olmadığı sürece üretildiği testis bölgesinden üretraya gelinceye kadar steril ortamdadır. Ejakülasyon sırasında üretra içinde saprofit mikroorganizmalarla karşılaşır ve karışır Dış ortama atıldığında ise çevrede bulunan tüm mikroorganizmalar spermayı kontamine eder. Bu kontaminasyonun önlenmesi veya mikroorganizmaların etkisiz hale getirilmesi için gereken önlemler: Kullanılan tüm malzemenin temizliğine, asepsisine ve sterilizasyonuna dikkat edilir Sulandırıcılar içine mutlaka antibiyotik ilave edilir streptomycin B sulfat (1000 µg/ ml) + Penicillen G (1000 IU/mL) Gentamycin (500 µg/ml), Tylosin (100 µg/ml) Linco-spectin (300-600 µg/ml) 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 7
Sulandırıcılarda Aranan Temel Özellikler Ozmotik basıncı seminal plazmanın ozmotik basıncına eşit olmalı ve bu denge saklama süresince bozulmamalıdır. Spermatozoanın metabolizmasında gerekli olan mineral maddeleri taşımalıdır. Spermatozoanın enerji gereksinimini karşılayabilecek maddeleri içermelidir. Isı değişimlerine karşı spermatozoayı koruyan maddeler bulunmalıdır. Spermatozoanın metabolik artıklarını elimine edebilmelidir. İçinde patojen mikroorganizma bulunmamalı bakteriyel 22.04.2013 kontaminasyonun kontrolü Prof. Dr. Serhat için Pabuccuoğlu, antibiyotikler İstanbul içermelidir. 8
Sulandırıcılarda Aranan Temel Özellikler: OZMOTİK BASINÇ Seminal plazma ozmotik basıncı 300-340 mosmol/kg civarındadır. Sulandırıcı içine koyulacak olan mineral tuzlar, şekerler, tampon sistemler, yumurta sarısı gibi maddeler bu basıncın sağlanmasında büyük rol oynar. Gliserol ozmotik basınç üzerinde en etkin olan maddedir. O nedenle gliserol katma işleminden sonra sulandırılmış olan spermanın ozmotik basıncının 1200 mosmol/kg üzerine çıkması istenmez. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 9
Sulandırıcılarda Aranan Temel Özellikler: ENERJİ MADDELERİ Eklenti üreme bezleri tarafından yapılan salgı tarafından oluşturulan seminal plazma farklı türlerde farklı miktarlarda FRUKTOZ içerir. Bu basit şeker spermatozoa hareketi için olmazsa olmaz bir maddedir. Sulandırıcılara bu maddenin ilave edilmesi şarttır. FRUKTOZ yerine GLİKOZ da kullanılabilir. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 10
Sulandırıcılarda Aranan Temel Özellikler: ph TAMPON SİSTEMLERİ ph değişimlerine karşı koruyucu tampon sistemlerini içermelidir(spermanın ph değeri 6,8 dir). Na-citrat TRIS Sperma ejakule edilirken eklenti üreme bezlerinden yapılan salgılar öncelikle üretra ve daha sonra spermanın gideceği dişi genital kanalı spermatozoa için uygun bir yer haline getiren ph tampon sistemlerini içerir. Dış ortamda da spermatozoanın metabolizması sonucunda ortam ph sı değişeceği için bu sistemlerin ortamda bulunması gerekir. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 11
Sulandırıcılarda Aranan Temel Özellikler: MEMBRAN BÜTÜNLÜĞÜ KORUMASI Bazal çukurluk Plazma membranı akrozom Dış akrozom membranı Spermanın gerek +5 o C'a soğutulması ve burada saklanması veya daha uzun süre kullanılabilmesi için dondurulması zorunludur. Bu aşamada hem plazma mebranının hem de akrozom membranı ve yapısının korunması fertilite için olmazsa olmazdır. Spermatozoanın membran yapıları lipoprotein yapısındadır ve içinde kolesterol molekülleri bulunur. Kolesterolün temel görevi hücre membranının düşük ısılardaki esnekliğini dolayısı ile dayanıklılığını artırmaktır. Kolesterol miktarları düştükçe ısı değişimlerine karşı spermatozoanın dayanıklılığı da azalır. Sulandırıcıların içinde bulunan makromoleküller özellikle lipoprotein, phospholipid, Lesitin, B-Lipovitellin ve glikoproteinler bu değişimlere karşı spermatozoayı korurlar. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 12
Sperma sulandırmada kullanılan sulandırıcılar Na-sitrat Yumurta Sarısı Sulandırıcısı TRIS Bazlı Sulandırıcılar Yağsız Süt veya Süt Tozu İle Hazırlanmış Sulandırıcılar Ticari Sulandırıcılar BTS (domuz) BIOXEL (boğa) CANİN-EXT (köpek) 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 13
Yumurta Sarısı ve Sulandırıcılardaki Önemi Yumurta sarısı ticari ürünler dışında hazırlanan tüm sulandırıcıların içinde %20 oranında mutlaka vardır. Yumurta sarısı içinde bulunan lipoproteinler ve diğer glikoproteinler membran koruyucu özelliklerinin yanı sıra içerdiği antioksidan maddeler ile oksidatif stresin de önlenmesinde katkı sağlar. Bu sayede hem membranların hem de DNA ların hasarlanmasının önüne geçilmiş olur. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 14
Yağsız Süt veya Süt Tozu Yağsız süt tozu veya yağı alınmış süt ile hazırlanacak olan sulandırıcıların mutlaka 92 95 o C ısıda 8 10 dakika ısıtılması gerekir. Süt proteinleri arasında bulunan «LACTENİN» bu süreçte inaktive edilmiş olur. Bu proteinin spermatozoa üzerinde toksik etkisinin olduğu belirlenmiştir. UHT sütler çok yüksek ısılara maruz bırakıldığı için bu ısıtma sürecine ihtiyaç yoktur doğrudan kullanılabilir 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 15
Anabioz ve kryobiyoloji nedir ANABİOZ: Canlı metabolizmasının 5 o C gibi düşük ısılarda yavaşlatılarak yaşam süresinin ve buna bağlı olarak yaşamsal ve işlevsel yeteneğinin bozulmadan uzatılmasına anabiose adı verilir. KRİYOBİYOLOJİ (DONMA BİLİMİ): Canlı materyallerinin 196 C gibi çok düşük ısılarda, canlılıklarını ve fonksiyonel özelliklerini kaybetmeksizin saklanabilmesi ile ilgilenen bilim dalıdır. Kriyobiyoloji kavramının içerisinde; sulandırıcılar, sulandırma, KRYOPROTEKTAN, soğutma, dondurma ve depolama tekniklerinin yanı sıra eritme teknikleri de yer alır. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 16
Spermanın kısa ve uzun süreli saklanması Spermanın kısa süreli saklanması (ANABİOZ): Oda ısısında ancak bir kaç saat süre ile fertilizasyon yeteneğini koruyabilen spermatozoa, sulandırılırsa ve 5 o C de saklanırsa bu yeteneğini bir kaç gün sürdürebilir (yaklaşık 72 saat). Spermatozoa metabolizmasının 5 o C gibi düşük ısılarda yavaşlatılarak yaşam süresinin ve buna bağlı olarak fertilizasyon yeteneğinin uzatılmasında ANABİOSE dan yararlanılır. Spermanın uzun süreli saklanması (DONDURULMASI): Spermanın dondurularak metabolizmasının durma noktasına yaklaştırılmasına ve böylece canlılığını yıllarca koruyabilmesine de anabiose denilebilir. Spermatozoa, özel olarak hazırlanmış ve KRYOPROTEKTAN içeren sulandırıcılar içerisinde, bir dizi soğutma aşamalarından sonra dondurularak 196 C gibi çok düşük ısılarda depolanır. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 17
Biyolojik materyallerin dondurulmasında koruyucu olarak kullanılan malzemeler: KRİYOPROTEKTANLAR Biyolojik materyallerin dondurulmasında donma işleminin oluşturacağı olumsuz etkilere karşı suyun fizikokimyasal yapısını değiştirerek korumak ve oluşacak hasarı en aza indirebilmek amacıyla hücrelerin bulunduğu ortama bir takım koruyucu maddeler ilave edilir. Bu maddelere genel olarak KRİYOPROTEKTAN adı verilir. Sperma, embriyo, oosit ve vücut hücrelerinin dondurulmasında en yaygın olarak kullanılan kimyasal kriyoprotektanlar aşağıda sıralanmıştır. Gliserin(gliserol) DMSO( dimetilsulfoksit) Etilen glikol Propilen glikol Koruyucu özelliğe sahip sukroz, trehaloz gibi polisakkaritler, glikoproteinler, lipoproteinler ve makromoleküler yapıdaki maddeler, dondurulacak olan biyolojik materyallerin özellikle membran yapılarının korunmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 18
Kryoporotektanların etki mekanizması Kimyasal kryoprotektanlar su moleküllerini kendi yapılarına çekme özellikleri vardır Osmotik basıncı oldukça yükseltirler Hücre içinde dehidrasyon oluşumunu sağlar Suyun donma sırasındaki davranışını bozarak kristal oluşumu bozulur amorf lameller şeklinde buz oluşumu şekillenir Hücre içinde mikro kiristallerin şekillenmesi sağlanır mekanik DNA hasarı önlenir 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 19
Sperma Sulandırılmasındaki Temel Kurallar Sperma ile temas edecek olan tüm malzeme ve ekipmanın temiz (kimyasal ve diğer kirleticiler açısından) ve mümkünse steril olması sağlanmalıdır Sulandırıcılar içinde bulunan ve kısa sürede bozulabilen enzim ve proteinleri içermesi nedeniyle taze olarak hazırlanmalıdır Sulandırıcı ve sperma her zaman karıştırılmadan önce aynı ısıya getirilmelidir Her zaman sulandırıcı spermanın üzerine katılmalıdır Sulandırıcı sperma üzerine bir seferde değil, kısım kısım ayrılmış hacimlerde (tercihen sırasıyla katılacak toplam sulandırıcı miktarının %10, %20, %30, %40 ı veya %20, %30 ve %50 si şeklinde) kademeli olarak ve 8-10 dakika aralıklarla sperma üzerine eklenmelidir 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 20
Spermanın taze kullanım amaçlı sulandırılması Sulandırıcı taze olarak hazırlanır Kullanım günü hazırlanan sulandırıcı, içinde 26-32 o C su bulunan ben-marey içine alınır Suni vajen veya elektroejakülatör ile sperma alınır Sperma alındıktan hemen sonra sulandırıcının içinde bulunduğu ben marey içine yerleştirilir. Buradaki amaç sulandırıcı ve sperma ısılarının bir birine eşitlenmesidir Makroskobik ve Mikroskobik Muayeneleri gerçekleştirilir Sulandırıcı miktarı hesaplanır Sulandırma işlemi gerçekleştirilir Sulandırma sonrasında mikroskobik muayeneler tekrarlanır +4 - +5 o C ye Soğutma işlemi gerçekleştirilir ve soğukta saklanır Kullanım öncesinde muayeneler tekrarlanır 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 21
Sulandırıcı Miktarının Hesaplanması 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 22
Sulandırıcı Miktarının Hesaplanması Yapılan hesaplamada 100 adet inek tohumlanabileceği belirlenmiştir. Tohumlama dozunun hacmi 1 ml olacak ise çıkan bu rakam hacimle çarpılmalıdır 100 x 1 ml = 100 ml (Sperma + Sulandırıcı) Bu hacimden sperma miktarını çıkarttığımızda gerekli olan sulandırıcı miktarını hesaplamış oluruz 100 4 = 96 ml sulandırıcı hazırlanması ve spermanın üzerine eklenmesi gerekir 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 23
Spermanın Soğutulması Türler bazında farklılıklar göstermekle birlikte in vitro koşullarda dondurulmaksızın saklanabilmesi için veya donma öncesinde kryoprotektanların eklenmesi ve için spermanın 5 o C'a soğutulması gerekmektedir. Spermatozoon membranlarındaki yapısal özellik soğutma işlemine karşı hassasiyeti de beraberinde getirmiştir. Bu nedenle yapısal ve fonksiyonel bütünlüğün korunabilmesi için mutlaka soğutma işleminin de hassas ve yavaş bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. Yapılan çalışmalarda ön sulandırılması işlemi gerçekleştirilmiş olan spermanın dakikada 0,2-0,3 o C/dak hızla soğutulmasının en iyi sonucu verdiği anlaşılmıştır. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 24
Avantajları: Spermalar çok uzun yıllar saklanabilir ve kullanılabilir Çok küçük hacimdeki stoklarda çok yüksek miktarlarda damızlığın sperması saklanabilir Dondurulan spermalar uzun mesafelerde nakledilir Boğaların spermaları çok geniş coğrafik alanlarda kullanılabilir Kıymetli damızlıklardan daha fazla yararlanabilme imkanı sağlanır SPERMANIN UZUN SÜRELİ SAKLANMASI İÇİN DONDURULMASI 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 25
Dondurularak Depolanmış Spermalar 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 26
Suni Tohumlama sektöründeki Dondurulmuş spermanın yerine bir örnek 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 27
Spermanın dondurma amaçlı sulandırılması Sulandırıcı taze olarak hazırlanır Kullanılacak olan sulandırıcı miktarı ikiye ayrılır A (gliserolsüz sulandırıcı) ve B (gliserollü sulandırıcı) sulandırıcısı olarak işaretlenir Kullanım günü hazırlanan A sulandırıcı, içinde 26-32 o C su bulunan ben-marey içine alınır Kullanım günü hazırlanan B sulandırıcısı içine gliserol eklenir, 4 o C soğuk vitrin içine alınır Suni vajen veya elektroejakülatör ile sperma alınır Sperma alındıktan hemen sonra sulandırıcının içinde bulunduğu ben marey içine yerleştirilir. Buradaki amaç sulandırıcı ve sperma ısılarının bir birine eşitlenmesidir Makroskobik ve Mikroskobik Muayeneleri gerçekleştirilir Sulandırıcı miktarı hesaplanır Sulandırıcı A ile sulandırma işlemi gerçekleştirilir Sulandırılmış sperma +4 o C a soğutulur Soğutma sonrası mikroskobik muayeneler tekrarlanır Soğutma işlemi tamamlandıktan sonra gliserollü sulandırıcı sulandırılmış spermanın üzerine eklenir «GLİSEROLİZASYON» Gliserolizasyon işlemi tamamlandıktan sonra spermatozoonların «EKİLİBRASYONU» yapılır Dondurma yöntemine göre porsiyonlanır Dondurma işlemi gerçekleştirilir Dondurulmuş olan spermalar uygun koşullarda saklanır Donma sonrasında 37 o C daki su banyosunda çözündürülerek mikroskobik muayeneler gerçekleştirilir Bir hafta sonra yeniden örnek alınıp çözündürülerek mikroskobik muayeneler tekrarlanır ve uygun olan spermalar kullanılmak üzere depolanır. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 28
Sperma dondurmada kullanılan kryoprotektanlar, Süt lipidleri ve proteinleri de kryoprotektan olarak kabul edilirler. Süt proteinlerinin yanı sıra kazein iyonlarının fiziksel etkiden ziyade kimyasal yolla kryoprotektif özellik gösterdikleri bilinmektedir. Yumurta sarısının sitratlı sulandırıcılarda yararlı etkisi 1939 yılında rapor edilmiştir. Yumurta sarısındaki fosfolipit, Lesitin, B-Lipovitellin, Lipoprotein ve glikoprotein'in kryoprotektif özellikte olduğu çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir. Süt, yumurta sarısı gibi maddelerdeki makromoleküllerin varlığı da spermatozoanın yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünün korunması için neredeyse zorunludur. Spermanın dondurulmasında en yaygın kullanılan kimyasal ajan GLİSEROL dür. Gliserol türe bağlı olmakla birlikte genellikle hacmen %3-7 aralığında sulandırıcılara katılır (boğa sperması için %5-7 en yaygın kullanılan orandır) 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 29
Dondurma amaçlı sulandırıcı hazırlanması Alınan sperma muayene edildikten sonra kullanılacak olan toplam sulandırıcı miktarı hesaplanır Hesaplanmış olan sulandırma sonrası ulaşılacak toplam hacim ikiye bölünür Birinci hacim sperma + sulandırıcı A olarak belirlenir İkinci hacim ise Sulandırıcı B + total gliserol olarak belirlenir. B sulandırıcısı içine finalde belirlenen gliserol miktarı eklenir. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 30
Örnek Sulandırılmış spermanın toplam hacmi 50 ml olacaksa ve bunun içinde %5 oranında gliserol ilave edilecek ise finalde hacmi oluşturan unsurlar şu şekilde sıralanabilir 5 ml sperma 2,5 ml gliserol 42,5 ml sulandırıcı Ön sulandırma işleminde 5 ml sperma üzerine sulandırıcı A dan 20 ml kuralına uygun olarak eklenmesi gerekir 5 ml sperma 20 ml sulandırıcı A (2 ml, 4 ml, 6 ml ve 8 ml lik porsiyonlar halinde 10 dakika ara ile) 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 31
Spermanın Soğutulması Spermanın gliserolizasyon ve dondurma işleminden önce +4 o C a soğutulması çok önemlidir. Bu aşamada yapılacak olan bir hata donma sonrası yapısal ve fonksiyonel bütünlüğün (membran ve akrozom bütünlüğü, motilite ve fertilite kabiliyeti) korunmasında da negatif etkileyecektir. Temel kural burada da aynıdır ve yapılan çalışmalarda ön sulandırılma işlemi gerçekleştirilmiş olan spermanın dakikada 0,2-0,3 o C/dak hızla soğutulmasının en iyi sonucu verdiği gösterilmiştir. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 32
Gliserolizasyon Dondurulacak olan spermaya gliserolün kademeli ve aralıklı olarak alıştıra alıştıra katılması olayıdır 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 33
Gliserolizasyon Soğutma işlemi tamamlandıktan sonra Gliserol içeren B sulandırıcısı eklenmesi gerekir. B Sulandırıcısı toplam hacimde bulunması gereken toplam gliserol miktarını içerir yani: 22,5 ml Sulandırıcı 2,5 ml gliserol eklenir ve iyice karıştırılır Hazırlanan sulandırıcı B gliserolizasyon işleminde kullanılır 25 ml Sulandırıcı A ile sulandırılmış sperma 25 ml Sulandırıcı B (2 ml, 4 ml, 6 ml ve 8 ml lik porsiyonlar halinde 10 dakika ara ile) 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 34
Örnek 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 35
Gliserolizasyon Örnek: 5 ml boğa spermasının(1,25 x 10 9 spermatozoon/ml %80 motil) %7 gliserollü sulandırıcı ile payet başına 12,5 milyon motil spermatozoon olacak şekilde dozlandığında 400 doz sperma hesaplanır. Her bir tohumlama dozu 0,25 ml olursa toplamda ulaşılacak olan hacim 100 ml dir. Bu da 95 ml sulandırıcı + 5 ml sperma demektir Sulandırıcı A ile 26-32 o C lik su banyosunda ön sulandırma Toplam Hacim 50 ml (Gliserolsüz) 45 ml sulandırıcı + 5 ml sperma = 50 ml (2-4 saat soğutma) 22.04.2013 +5 o C Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 36
Gliserolizasyon Sulandırıcı B nin yapısı ve sulandırma işlemi (+ 5 o C) Toplam hacim 50 ml (Gliserollü) Sulandırıcı 43 ml + Gliserol 7 ml = 50 ml Sulandırılmış sperma (50 ml) + 10ml Sulandırıcı B 10 dakika Sulandırılmış sperma (60 ml) + 15 ml Sulandırıcı B 10 dakika Sulandırılmış sperma (75 ml) + 25 ml Sulandırıcı B Toplam = 100 ml içinde 7 ml gliserol = %7 (10 dakika ara ile gliserollü sulandırıcının önce %20'si sonra %30'u ve %50'sini ilave etme tekniğini gösteren örnektir.) 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 37
Ekillibrasyon Spermanın gliserollü sulandırıcı ile işlem gördükten sonra 5 o C de geçirmek zorunda olduğu adaptasyon süresidir. Gliserolizasyon sonrası sperma hücresi ile sulandırıcı (gliserol) arasındaki madde alış verişinin tamamlanması ve ortamın dengeye ulaşması için beklenilir. Ekilibrasyon sonrası sperma donma işlemine hazır hale gelmiş olur. Bu süre türe ve bireye bağlı olarak yaklaşık 2-3 saat kadardır. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 38
Ekilibrasyon Aşamasında Gerçekleşen Olaylar SU HİPEROSMOTİK BASINÇLI ORTAM 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 39
Spermanın dondurulmasında kullanılan yöntemler Ampul yöntemi ile spermanın dondurulması Kuru buz Etil Alkol banyosu kullanılarak gerçekleştirilen yöntemdir. Etil alkol banyosu içine 79 o C deki kuru buz parçaları atmak suretiyle 2 aşamada gerçekleştirilir. Birinci aşamada alkol banyosunun ısısı 5 o C den -20 o C'a kadar 1-2 o C/dak hızında soğutulur İkinci aşamada mümkün olan en yüksek donma hızı sağlanarak ısı - 20 o C den -79 o C'a soğutulur. Depolama aynı banyo kabında yapılır. Ancak kuru buz eksildikçe takviyesinin yapılması ve ortamın -79 o C de tutulması zorunludur. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 40
Spermanın dondurulmasında kullanılan yöntemler Pellet yöntemi ile spermanın dondurulması 79 o C deki kuru buz bloklarının üzerinde gerçekleştirilen şok dondurma yöntemidir. Kuru buz (katı CO2) blokları üzerine ufak oyuklar açılır. Sonra bu çukurlara 5 o C ısıda ekilibrasyonu tamamlanmış 0,1 0,2 ml kadar sıvı sperma damlatılır. Birkaç dakika (2-3 dakika) içerisinde donan sperma pellet tarzında elde edilir. Pelletlerin üzerine önceden hazırlanmış hayvan, laboratuvar adı vb. bilgileri taşıyan küçük kağıt parçaları yapıştırılır. Bu kağıt parçaları kuru buz üzerine sperma damlatıldıktan sonra donma öncesi yerleştirilmelidir. Pelletler özel yuvaları olan pellet taşıyıcılarına yerleştirildikten sonra, -196 o C ısıdaki sıvı azot içinde depo edilirler. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 41
Spermanın dondurulmasında kullanılan yöntemler Payet yöntemi ile spermanın dondurulması Günümüzde kullanılan en yaygın ve en pratik donma yöntemidir Sperma 0,25 ml veya 0,5 ml hacimli payet denilen plastik çubuklarda dondurulur Ülkemiz laboratuvarlarında 0,25 ml payetler kullanılmaktadır. Payetlerin bir ucu açık, bir ucu kapalıdır. Otomatik makine veya elle bu payetlerin içine sulandırılmış sperma doldurulur ve açık ağızları ısı veya polivinil alkol yardımı ile kapatılır 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 42
Payet Doldurma-kapatma Makinası 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 43
Spermanın Payet Yöntemi İle Dondurulması Sperma ile dolu payetler yine 5 o C'lık ortamda taraklara dizilirler. Buradaki amaç payetlerin üst üste yığılmasını önlemek ve donma esnasında bütün payetlerin sıvı azot buharı ile temas etmesini sağlamaktır. Taraklara dizilen payetler zaman geçirilmeksizin donma kazanına aktarılırlar ve özel ızgara bölümüne yerleştirilirler. Dondurma kazanı daha önceden hazırlanmalıdır. Dondurma kazanı içindeki sıvı azot seviyesi, ızgaranın bulunduğu yüksekliğe kadar getirilmelidir. Payetler içindeki sperma sıvı azot seviyesinin yaklaşık 4 cm yukarısında 7 10 dakika sürede dondurulurlar. -110 ile -120 o C arasında sıvı azot buharındaki bu şok dondurma sırasında azot buharının yoğunlaşması amacıyla dondurma kazanının üst kısmı kapatılır. Donma işlemi tamamlandıktan sonra payetler sıvı azot içine daldırılarak aynı ortamda plastik gobletlere yerleştirilir ve sıvı azot içinde -196 o C de depolanırlar. 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 44
Sıvı Azot Buharında Payetler Kullanılarak Spermanın Dondurulması 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 45
Payet Yöntemi ile Dondurulmuş ve Depolanmış Spermalar 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 46
Spermanın dondurulması sırasında spermayı etkileyen çevresel faktörler Ani ısı değişimleri Ani ph değişimleri Ani ozmotik basınç değişimleri Güneş ışığının zararlı etkileri Kimyasal kirlik Mikrobiyel kirlilik Taze olmayan biyolojik materyal (yumurta, süt vs.) Sıvı azot seviyesi ve sıvı azot buharı yoğunluğu Sıvı azot içine aktarırken yapılan hatalar Saklama konteynerleri içindeki sıvı azot miktarı 22.04.2013 Prof. Dr. Serhat Pabuccuoğlu, İstanbul 47