RIDASCREEN Leishmania Ab Makale no: K7121 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Almanya Telefon: +49 (0) 6151 8102-0 / Fax: +49 (0) 6151 8102-20
1. Kullanım amacı İn vitro diagnostik kullanım içindir. RIDASCREEN Leishmania Ab Testi insan serumundaki Leishmania infantum karşı spesifik IgG antikorlarının kalitatif tespiti için enzim immunoassaydir. Bu test Leishmaniasis şüphesi olduğunda onay amaçlı veya bağışıklık durumunu netleştirmek için kullanılmalıdır. 2.. Özet ve testin açıklaması Leishmania ile enfeksiyon sonrası spesifik antikorlar bağışıklık sisteminden yanıtın sonucu olarak patojene karşı oluşturulur. İmmunolojik metodlar kullanılarak serumda antikorları tespit etmek mümkündür. Kullanılan test yöntemi ve patojen-spesifik antijenin seçimi testin anlamlılığı üzerinde öneme sahiptir. 3. Test prensibi Saflaştırılmış antijenler mikrokuyu plağa kaplanır. Hasta örneklerindeki antikorlar antijenlere bağlanır ve enzim-etiketli anti-human antikorlar (konjugat) kullanılarak ikinci inkübasyon aşaması esnasında tespit edilir. Enzim mavi son ürün için renksiz substrata (üre peroksit/tmb) dönüşür. Bu enzim reaksiyonu sülfürik asit eklenmesiyle durdurulur ve aynı zamanda karışımın rengi maviden sarıya değişir. Son ölçüm referans dalgaboyu 620 nm kullanılarak bir fotometrede 450 nm de yapılır. RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 2
4. Sağlanan reaktifler Kit içinde 96 tespit için yeterli reaktif vardır. Plak 96 tespit Mikrokuyu plak; strip tutucuda 12 mikrokuyu strip (bölünebilen); Leishmania infantum antijenleriyle kaplı Seyreltici 100 ml Örnek buffer, fosfat-buffered NaCl solüsyonu, kullanıma hazır SeroWP 100 ml Yıkama buffer, 10-kat konsantre; tris-buffered NaCl solüsyonu Kontrol + Kırmızı kapak Kontrol - Renksiz kapak Konjugat Turuncu kapak 1.2 ml IgG pozitif kontrol, insan serumu, kullanıma hazır; 2.5 ml IgG negatif kontrol, insan serumu, kullanıma hazır; 12 ml anti-insan IgG konjugat, kullanıma hazır; Stabilize protein solüsyonunda peroksidaz konjugatlı anti-insan IgG konjugat SeroSC 12 ml Substrat H2O2/tetrametilbenzidin; kullanıma hazır SeroStop 12 ml Durdurma reaktifi 0.5 M sülfürik asit; kullanıma hazır Etiketleme yükümlülüklerine göre tehlikeli maddelerin detayları. Daha fazla detay için www.r-biopharm.com. da Malzeme Güvenlik Bilgi Formlarına bakın (MSDS). 5. Saklama talimatları Bu test kiti 2-8 o C de saklanmalıdır ve etiketteki son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Seyreltilmiş yıkama buffer 2-8 o C de saklandığında maksimum 4 hafta veya oda sıcaklığında saklandığında (20-25 C) 5 gün kullanılabilir. Son kullanma tarihinden sonra kalite garantisi artık geçerli değildir. Mikrokuyu plak içeren alüminyum çanta klip contası parçalanmayacak şekilde açılmalıdır. Herhangi mikrokuyu stribinin alüminyum çanta içinde saklanması gerekli değildir. Reaktiflerin kontamine olmasına izin verilmemelidir ve renksiz substrat doğrudan ışığa maruz kalmaktan korunmalıdır. RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 3
6. Gerekli ama sağlanmayan materyaller 6.1. Reaktifler distile veya deiyonize su 6.2. Aksesuarlar Test tüpleri Vorteks karıştırıcı 10-100 µl ve 100-1000 µl kapasite için mikropipetler Ölçüm silindiri (1000 ml) Durdurma saati Mikroplak yıkayıcı veya çok kanallı pipet Mikroplak okuyucu (450 nm, referans dalgaboyu 620 nm) Filtre kağıdı (laboratuvar havlusu) 0.5 % hipoklorit solüsyonu içeren atık konteyneri 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Bu test sadece eğitimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır. Medikal laboratuvarlardaki çalışma kuralları takip edilmelidir. Test prosedürü için kullanım kılavuzu izlenmelidir. Örnekler veya reaktifleri ağızla pipetleme yapmayın. Yaralanmış cilt veya mukozal membranlarla temas önlenmelidir. Örnekleri veya reaktifleri kullanırken, uygun güvenlik giysileri (uygun eldivenler, lab giysisi, emniyet gözlükleri) kullanın ve test prosedüründen sonra ellerinizi yıkayın. Örnekler veya reaktiflerin kullanıldığı alanlarda sigara içmeyin veya birşey yiyip içmeyin. Daha fazla detay için www.r-biopharm.com. da Malzeme Güvenlik Bilgi Formlarına bakın (MSDS). Kit içindeki kontrol serumları (pozitif kontrol ve negatif kontrol) HbsAg yanısıra HIV- ve HCV-Ab için negatif sonuçlarla test edilmiştir. Yine de onlar ve temas ettikleri diğer tüm materyaller hasta örnekleri gibi aynı şekilde olası bulaşıcı gibi işlenmelidirler ve ilgili ulusal güvenlik düzenlemeleri ile uyumlu olarak kullanılmalıdırlar. Kullanılan tüm reaktifler ve materyaller kullanımdan sonra uygun şekilde atılmalıdır. Lütfen atım için ilgili ulusal düzenlemelere bakın. RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 4
8. Numune toplama ve saklama Bu test insan serum örneklerini test etmek için geliştirildi. Kan toplama sonrası kan hemolizi önlemek için mümkün olduğunca en kısa sürede kan pıhtılarından ayrılmalıdır. Örnekler test edilene kadar soğuk veya dondurulmuş saklanmalıdır. Örneklerin tekrar tekrar dondurulup çözdürülmesi ve mikrobiyel kontaminasyonu her ne pahasına olursa olsun önlenmelidir. Isı ile inaktive edilmiş, lipemik, hemolitik, ikterik veya bulanık örneklerin kullanılması yanlış sonuçlara yol açabilir. Tablo 1: Örnek saklama Seyreltilmemiş serum Seyreltilmiş serum 2 8 C -20 C 2 8 C 1 hafta >1 hafta 7 saat 9. Test prosedürü 9.1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve mikrokuyu plak kullanımdan önce oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmelidir. Mikrokuyu stripler oda sıcaklığına erişene kadar alüminyum çantadan çıkartılmamalıdır. Bu reaktifler kullanımdan hemen önce iyice karıştırılmalıdır. Kullanımdan sonra kit hemen 2 ve 8 C arasında geri saklamaya konulmalıdır. Sadece test prosedürü için gereken miktarda reaktif hacmi alın. Reaktif kontaminasyonu oluşabileceğinden reaktifleri şişelere geri dökmeyin. Mikrokuyu stripler birden fazla kullanılamaz. Bu reaktifler ve mikrokuyu stripler paketleme hasarlıysa veya şişelerde sızıntı varsa kullanılmamalıdır. Yıkama buffer, örnek buffer, durdurma reaktifi ve substrat teste özgü değildir; parazitlere karşı antikorları tespit etmek için başka RIDASCREEN ELISA içinde kullanılabilirler. 9.2. Yıkama buffer hazırlama 1 kısım yıkama buffer konsantre SeroWP 9 kısım distile suyla karıştırılır. Bunu yapmak için 1000 ml ölçüm silindirinde 100 ml konsantre koyun ve distile suyla 1000 ml için solüsyon yapın. Konsantre içindeki herhangi kristal 37 o C de su banyosunda ısıtılarak önceden çözülmelidir. Seyreltilmiş buffer 2 8 C de saklandığında maksimum 4 hafta veya oda sıcaklığında saklandığında (20 25 C) 5 gün kullanılabilir. 9.3. Örnekleri hazırlama Teste başlamadan önce örnek buffer Seyreltici ile test edilecek serum örneklerini seyreltin 1:50. ör. 10 µl Serum +490 µl Seyreltici RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 5
Not: Negatif kontrol ve pozitif kontrol kullanıma hazırdır ve SEYRELTİLMEMELİDİR. 9.4. İlk inkübasyon Çerçeve içine yeterli sayıda kuyu yerleştirdikten sonra, 100 µl seyreltilmiş serumları ve kullanıma hazır kontrolleri Kontrol - ve Kontrol + ilgili kuyuların her birine pipetleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında (20 25 C) de inkübe edin. Negatif kontrolün Kontrol - iki kez yapılmasını öneririz. 9.5. Yıkama Kuyular dezenfeksiyon için hipoklorit solüsyonu içeren atık konteynerine boşaltılmalıdır. Bundan sonra kalan nemi uzaklaştırmak için emici kağıt üstünde plağa vurun. Sonra her defasında 300 µl yıkama buffer kullanarak 5 kez plağı yıkayın. Her yıkamadan sonra emici kağıdın kullanılmamış kısmında onlara vurarak kuyuların tamamen boşaltıldığından emin olun. Mikroplak yıkayıcı kullanıldığında, makinenin kullanılan plağın tipine doğru şekilde uyduğundan emin olun. Yıkama sonrası herhangi kalan nemi uzaklaştırmak için temiz emici kağıt üstünde plağa vurun. 9.6. İkinci inkübasyon Her kuyuya 100 µl anti-insan IgG konjugat Konjugat ekleyin. Sonra 15 dakika oda sıcaklığında (20 25 C) plağı inkübe edin. 9.7. Yıkama Kısım 9.5 uygun olarak 5 kez yıkayın. 9.8. Üçüncü inkübasyon Her kuyuya 100 µl substrat SeroSC koyun. Sonra 15 dakika oda sıcaklığında (20 25 C) plağı inkübe edin. Bundan sonra, her kuyuya 50 µl durdurma reaktifi SeroStop ekleyerek reaksiyonu durdurun. 10. Kalite kontrol - instabilite veya bozulma belirtileri Kalite kontrol amaçları için, pozitif kontrol ve negatif kontrol (iki kez) her test yapıldığında kullanılmalıdır. 450 nm de negatif kontrolün ortalama sönmesi 0.3 den küçükse test doğru yapılmıştır. İki ayrı ölçüm %25 den fazla ortalamadan saparsa test tekrarlanmalıdır. 450 nm de pozitif kontrol için sönme 0.8 den büyük olmalıdır. Değerler olması gerekenden farklıysa, substrat bulanıksa veya kuyulara eklenmeden önce maviye dönüşmüşse, bu reaktiflerin son kullanma tarihinin geçtiğini gösterebilir. RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 6
Öngörülen değerler karşılanmazsa aşağıdaki noktalar testi tekrarlamadan önce kontrol edilmelidir: Kullanılan reaktiflerin son kullanma tarihi Kullanılmakta olan ekipmanın işlevselliği (ör. kalibrasyon) Doğru test prosedürü Kontaminasyon veya sızıntılar açısından kit bileşenlerinin görsel kontrolü - maviye dönen substrat solüsyonu kullanılmamalıdır. Testi tekrarlamadan sonra şartlar hala yerine getirilmediyse lütfen yerel R-Biopharm distribütörünüzle temasa geçin. 11. Değerlendirme ve yorumlama 11.1. Örnek index hesaplama 1. Negatif kontrol için ortalama absorbans hesaplanır. 2. Ortalama absorbansa 0.150 eklenir. Bu test için cut-off verir. 3. Örnek index cut-off tarafından örnek için absorbansın bölünmesiyle elde edilir. Örneğin: Negatif kontrol 1 O.D. = 0.115 Negatif kontrol 2 O.D. = 0.125 Örnek O.D. = 0.508 cut-off = 0.115 + 0.125 2 + 0.150 = 0.270 Örnek index = 0.508 0.270 = 1.88 11.2. Test sonucu Tablo 2: Örnek index değerlendirme negatif şüpheli pozitif Örnek index < 0.9 0.9 1.1 > 1.1 12. Metod sınırlamaları RIDASCREEN Leishmania Ab enzim immunoassay Leishmania infantum karşı spesifik IgG antikorlarını tespit eder ve Leishmaniasis enfeksiyonu şüphesi olduğu durumlarda yapılmalıdır. Elde edilen sonuçlar her zaman klinik tablo ve diğer tanısal bulgular ile birlikte yorumlanmalıdır. RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 7
Antikor sinyalleri parazitoz lokalizasyonuna bağlıdır ve hastadan hastaya değişebilir. Şüpheli ve zayıf pozitif sonuçlar aşağıdaki durumlarda oluşabilir: - hastalığın endemik olduğu ve enfeksiyon belirtisi olmaksızın düşük antikor titreleri oluşturan bölgelerde enfekte phlebotomae (kum sinekleri) tarafından sokulan kişiler - asemptomatik enfeksiyondan kurtulmuş veya henüz kurtulmuş ve dolayısıyla hala düşük antikor titreleri üreten kişiler - geçmişte hastalığa maruz kalmış ve hala kalan titreleri üreten kişiler - hastalığın erken aşamalarındaki kişiler - tanımlanabilir ve spesifik olmayan faktörler Bu durumlar klinik belirtiler dikkate alınarak ve başka diagnostik metodlarla başka örnek test edilerek yeniden incelenmelidir. Herhangi başka kesin tanı yokluğunda test yeni bir örnekle 2-4 hafta sonra tekrarlanmalıdır. Orta ve yüksek pozitif sonuçlar akut hastalığa uğramış veya son zamanlarda hastalığa uğramış kişilerle üretilebilir. Hatta daha yüksek antikor titreleri geçmişte oluşmuş daha uzun enfeksiyonlar sonrası üretilebilir. Net olmadığı durumlarda sonuç, vaka geçmişi, klinik belirtiler ve diğer diagnostik metodların ışığında yorumlanmalıdır. Negatif bir sonuç ille de Leishmaniasis ekarte etmez. Enfeksiyonun erken aşamaları esnasında, antikorların sayısı test negatif sonuç verecek kadar çok küçük olabilir. Leishmaniasis için vaka geçmişine dayanarak şüpheleniliyorsa, başka serum örneği 4 hafta sonra test edilmelidir. T. cruzi (Chagas hastalığı) karşı antikorlar içeren serumlarla çapraz reaksiyon Güney Amerika da bazı durumlarda gözlenmiştir. Chagas hastalığının endemik olduğu Güney Amerika alanlarında test yapılırken bu dikkate alınmalıdır. Pozitif bir sonuç başka bulaşıcı patojen varlığını ekarte etmez. 13. Performans özellikleri Tablo 3: Inter- test varyasyonu (n = 5) Inter- test varyasyonu IgG OD CV Serum 1 0.225 15.0% Serum 2 0.451 10.6% Serum 3 0.927 14.2% RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 8
Tablo 4: Intra- test varyasyonu (n = 24) Intra- test varyasyonu IgG OD CV Serum 1 0.133 18.5% Serum 2 0.438 10.4% Serum 3 0.963 12.1% Tablo 5: İki başka ticari ELISA ile kıyaslamada duyarlılık ve özgüllük IgG Duyarlılık Özgüllük 87.5% 88.7% Tablo 6: Almanya da bir kan donör merkezinden alınan 200 kan-donör serumunun test edilmesiyle sonuçlar negatif şüpheli pozitif 200 kan donor serumu 89% 5.5% 5.5% RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 9
Referanslar 1. Bray, R.S. and Lainson, R., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 60, 605-609 (1966). 2. Bray, R.S. and Lainson, R., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 61, 490-505 (1967). 3. Bray, R.S., Ecol. Dis., 4, 257-267 (1982). 4. Hommel, M., Peters, W., Ranque, J., Quilici, M. and Lanotte, G., Ann. Trop. Med. Parasitol., 72, 213-218 (1978). 5. Kager, P.A., Rees, P.H., Wellde, B.T., Hockmeyer, W.T. and Lyerly, W.H., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 75, 556-559 (1981). 6. Lainson, R., Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 77, 569-596 (1983). 7. Low-A-Chee, R.M., Rose, P. and Ridley, D.S., Ann. Trop. Med. Parasitol., 77, 255-260 (1986). 8. Ranque, J. and Quilici, M., Journal of Parasitology, 56, 277-278 (1970). RIDASCREEN Leishmania Ab 2014-02-14 10