Protein C Antijen Test Kit REF 5285

Transkript

1 Protein C Antijen Test Kit REF 5285

2 In Vitro Diagnostik kullanım için KULLANIM AMACI Sitratlı insan plazmasında Protein C Antijen kantitatif tespiti için bir enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) testidir. TESTİN ÖZETİ VE AÇIKLAMASI Protein C karaciğerde hepatositler tarafından öncelikle sentezlenen vitamin K-bağımlı bir protein dir ve Protein C Antikoagülan Sisteminde önemli bir fizyolojik rol oynar 1,2. Protein C, koagülasyon kaskadının diğer faktörleri ile kompleks etkileşimi aracılığı ile kan pıhtısından gelen trombin ve endotel hücrelerde pıhtı oluşumu üretimini azaltan ve fibrinoliz tarafından normal hemostatik mekanizmasını sürdürülmesine katkı sağlar. Protein C Antikoagülan Sistem, endotel hücreleri protein reseptöründe trombomodulin e trombin bağlanması ile aktive edilir. 3 Endotel hücre zarı üzerinde bağlayıcı trombin-trombomodulin, Protein C dolaşımda aktive edilir. Aktive Protein C endotel hücre veya trombositlerin membranlarında Protein S e bağlanır. Bu protein C-protein S kompleksin de, aktive protein C pıhtı oluşumu üretimini azaltan pıhtılaşma faktörleri Va ve VIIIa inaktive etme yeteneğine sahiptir. Ayrıca, aktive Protein C plazminojen aktivatör inhibitör-1 (PAI-1), inhibitöründen gelen bu molekülü ayırarak doku plazminojen aktivatörün (TPA) fonksiyonunu artırır 1-3. Protein C eksikliği, ya konjenital ya da sonradan kazanılan, tromboflebit, derin ven trombozu, pulmoner emboli gibi ciddi trombotik olaylara yol açabilir. 4 Nadir homozigot eksikliği olan hastalarda yenidoğan döneminde masif tromboz (purpura fulminans) ile bulunuyorken konjenital heterozigot eksikliği olan hastalarda genç erişkinlerde venöz tromboz ile bulunabilir 5. Genel popülasyonda Protein C eksikliği prevalansı 300 de 1 olarak tahmin edilmiştir. Tekrarlayan venöz trombozlu genç hastalarda (<40-45 yaş), Protein C eksikliği sıklığı 10 ila 15% kadar yüksek olabilir. 6-7 Sonradan kazanılan protein C eksikliği, karaciğer hastalığı, geniş trombotik episod, cerrahi, oral antikoagülan, antifosfolipid sendromunda görülebilir. Plazmada azaltılmış Protein C aktivitesi düşük konsantrasyonların ve fonksiyon (Tip I) ya da sadece düşük fonksiyonunun (Tip II) sonucu olabilir 6. Protein C eksikliğinin laboratuvar tanısı hem kantitatif hem de kalitatif (fonksiyonel) tayin gerektirebilir. Kantitatif tespit, jelde radyal immunodiffüzyon, Laurell roket immunoelektroforez ve ELISA gibi immünolojik tekniklere dayanır 6,8. ELISA prosedürleri çalışma daha azdır ve daha fazla objektif, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar. Buna ek olarak, ELISA yaygın kullanılan laboratuvar cihazları ile otomasyon sağlar. TESTİN PRENSİBİ Protein C Antijen bir sandviç ELISA dır. İnsan Protein C için spesifik bir antikor yakalama 96- mikrowell polistiren plaka ile kaplanmıştır. Dilüe hasta plazması mikrokuyu yüzeyinde antiinsan Protein C antikor bağlamak için herhangi bir mevcut Protein C sağlayan kuyularda inkübe edilir. Plakalar bağlanmayan proteinler veya diğer plazma moleküllerini uzaklaştırmak için yıkanır. Bağlı Protein C, anti-insan Protein C tespit antikoruna konjuge horseradish peroksidaz (HRP) kullanarak kantitatif olarak tespit edilir. İnkübasyonun ardından, bağlanmayan konjugat yıkanarak uzaklaştırılır. Tetrametilbenzidin (TMB) ve hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) in bir kromojenik substratı renkli reaksiyonu geliştirmek için eklenir. Rengin yoğunluğu 450nm de bir spektrofotometre ile optik yoğunluk (OD) birimleri ile ölçülür. Relatif yüzde konsantrasyonda hasta Protein C Antijen kit ile sağlanan referans plazmadan yapılan bir eğriye karşı tespit edilir. REAKTİFLER C de saklanır. Dondurmayın. Her bir Protein C Antijen 96-microwell Test Kit aşağıdaki reaktifleri içerir: 1

3 12 x 8 anti-insan Protein C antikor kaplınmış mikrokuyular. 60mL Numune Diluent (mavi-yeşil solüsyon); sodyum azit içerir. 3 x 0.5mL liyofilize Referans Plazma, test kağıdı ile. 12mL anti-human Protein C HRP Konjugate (kırmızı solüsyon). 13mL Substrat (TMB ve H2O2). 15mL Durdurma solüsyonu (0.36 N sülfürik asit). 30mL Wash Konsantre (0.01% Tween 20 ile 33X fosfat buffer saline). NOT: bulanıklık kompenant performansını etkilemeyen yıkama solüsyonunda görünebilir ve çalışma dilüsyonu hazırlandığında görülmez. UYARILAR VE ÖNLEMLER In vitro Diagnostik kullanım için 1. Bu kitte bulunan referans plazma hazırlamak için kullanılan insan kaynaklı materyaller test edilmiştir ve FDA tarafından HBsAg, HCV ve HIV-I & II için antikorlar negatif bulunmuştur. Bu nedenle, hasta örnekleri dahil bütün insan kan türevleri potansiyel bulaşıcı materyalmiş gibi çalışılmalıdır. 2. Ağız ile pipetleme yapmayın. 3. Kit veya örnek reaktifleri çalışılırken yemek yemeyin sigara veya içecek içmeyin. 4.Kit reaktifleri kullanırken tek kullanımlık eldiven giyin ve sonra iyice ellerinizi yıkayın. 5. Tek bileşenli substrate gözleri ve cildi tahriş edebilir. Deri yoluyla emilimi mümkündür. Substrate kullanırken eldiven giyin ve kullanım sonrası iyice yıkayın. Ateşleme kaynaklarından reaktifi uzakta tutun. Oksitleyici maddeler ile temastan kaçının. 6. Numune Diluent koruyucu olarak sodyum azit içerir. Sodyum azit metallerle reaksiyon vererek kurşun ve bakır azit formlarını oluşturur. Bu metal azitler patlayıcıdır. Azit içeren herhangi bir solüsyon tesisat sisteminde patlayıcı metal azitlerin birikmesini önlemek için iyice bol su ile yıkanmalıdır. 7. Bazı bileşenleri aşağıdaki ile etiketlenir: Yutulursa sağlığa zararlıdır(r 22). Gözleri ve cilt için tahriş eder (R 36/38). Göz ve cilt temasından kaçının (S 24/25). Göz ile teması halinde etkilenen bölgeleri bol su ile yıkayın ve tıbbi yardım alın(s 26). Uygun koruyucu önlük giyin (S 36). ÖRNEK ALMA VE HAZIRLAMA Bir antikoagulant gibi ya 3.2% ya da 3.8% sodyum sitrat ile toplanan plazma bir örnek matriks olarak kullanılmalıdır. Kan damardan alınmalıdır ve hemen santrifüj edilmelidir. Plazmayı alın ve test yapılana kadar C de saklayın. Eğer toplanan numune 8 saat içinde çalışılmazsa, numune -70 C de saklanmalıdır ve 1 ay içinde test edilmelidir. KULLANIM TALİMATLARI SAĞLANAN MATERYALLER Protein C Antijen Test Kiti; tam listesi için, "Reaktifler" bölümüne bakın. GEREKLİ OLAN FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER Protein C Kontrol Plazma. Üreticinin talimatlarını kullanarak seçilen Kontrol Plazmasını çözün ve önerildiği gibi saklayın. PBS/Tween 20 yıkama solüsyonu hazırlamak için, Referans Plazma yı çözmek için ve son test adımını sırasında plakayı okuyucuya okutmak için distile su (1L). Mezür. Uygun pipet uçları ile 5 ve 1000 mikrolitre arası çekebilen hassas pipettörler. Küçük hacimli kullanım için uygun çeşitli cam. Şişe veya flakon, 1 litre. Otomatik veya yarı-otomatik yıkama sistem, ya da geniş bir akım sağlamak için tercihen uçlu yıkama şişeleri. 2

4 Pudrasız tek kullanımlık eldiven önerilir. 450nm de absorbans okuyabilen plaka okuma spektrofotometre (varsa bir 650nm referans ile). Aynı anda 8 kuyu yu pipetleyebilen multikanallı pipetler. Hasta numunesi hazırlama için mikrodilüsyonlu tüpler. PROSEDÜR İLE İLGİLİ NOTLAR 1. Kullanmadan önce plazma örnekleri ve kit reaktifleri önce oda sıcaklığına ( C) getirin ve köpük oluşumunu önleyerek iyice karıştırın. En kısa sürede kullanılmayan örnek ve reaktifleri buzdolabına(2...8 C) koyun. 2. Referans plazmasının, kontrol için seçilen kontrol plazmasının ve hasta örneklerinin tüm dilüsyonları bu test çalışılmadan önce yapılır. 3. Tek bir su blank kuyusu her çalışmada her bir plaka üzerine kurulmalıdır. Hiçbir örnek veya kit reaktifleri bu kuyuya eklenmeyecektir. Yerine, spektrofotometrede plaka okumadan önce hemen kuyuya 200μL reaktif saf su ekleyin. Plaka okuyucu bu suya karşı sıfır veya blank olarak programlanmış olmalıdır. 4. İyi yıkama tekniği testin performansı için önemlidir. Yeterli yıkama, mikro kuyuların altında geniş uçlu bir plastik sıkılmış şişeden gelen yıkama solüsyonunun güçlü bir şekilde direk olarak akıtılması ile gerçekleşir. Su blank kuyusunda yıkama solüsyonu prosedürü engellemez. Yıkama sistemi otomatik bir mikrotiter plaka da kullanılabilir. 5.ÖNEMLİ: Kalıntı PBS / Tween 20 in uzaklaştırılmaması substrat solüsyonun tutarsız renk gelişimine neden olabilir. 6. Eğer mümkünse, eş zamanlı olarak 8 kuyuyu çekebilen multikanallı pipettör kullanın. Bu işlem hızlıdır ve tüm kuyular için daha eşit inkübasyon ve reaksiyon süresi sağlar. 7. Tüm adımların dikkatle kontrol zamanlaması kritik öneme sahiptir. Tüm referans plazma dilüsyonları, kontrolleri ve örnekleri 5 dakika içinde mikrokuyulara eklenmelidir. Örneklerin lot boyutu bu zaman periyodunda eklenebilen miktardan daha fazla olmamalıdır. 8. Tüm inkübasyonlar için, inkübasyon döneminin başlangıcı reaktif veya numune eklenmesi tamamlandığında başlar. 9. Tüm örneklerin ve reaktiflerin eklenmesi aynı hızda ve aynı sırada yapılmalıdır. 10. İnkübasyon sıcaklığının normal oda sıcaklığından ( C) düşük veya yüksek olması yanlış sonuçlara neden olabilir. 11. Birincil flakonlardan reaktifi bölerken ve açarken kontaminasyondan kaçının. 12. Son kullanım tarihi geçen kit bileşenlerini kullanmayın. 13. Farklı kit lotları ile kullanılmayan spesifik lot bileşenleri kaplanmış mikrokuyu, konjugat ve substrate dir. Reaktif Hazırlama 1. Yıkama Solüsyonu - fosfat buffer saline (PBS)/Tween 20: 30mL Wash Concentrate ölçün (33X PBS/Tween 20) ve1 litre saf su ile dilüe edin. Son solüsyonun ph olmalıdır C de kullanılmayan PBS/Tween 20 solüsyonu saklayın. Eğer solüsyonda kontaminasyon belirtisi varsa atın mL distile su eklenerek Referans Plazmayı çözün. Karıştırmak için yavaşça karıştırın. Çözünmenin tamamlanması için kullanım öncesi 10 dakika bekletin C de saklandığında 8 saat stabilidir. Üreticinin talimatlarını kullanarak uygun Kontrol Plazmasını çözün ve önerildiği gibi saklayın. Test Prosedürü 1. Çerçeveden kullanılmayacak mikro kuyu stripleri alın ve sağlanan paket içinde saklayın. 2. Çift çalışma ile her bir referans plazma dilüsyonunu test edin. Tekrar tespiti örnek ve kontrol örnekleri için de önerilir. Bir kuyu reaktif blank olarak çalışılmalıdır; plazmasız örnek dilüenti bu bölümde 7. bölümde açıklanan kuyulara eklenir. Bu kuyu sonraki test adımında hasta örneği gibi çalışılır. Bir su blank kuyu her bir plakayı içerir; 200μL reaktif saf su plaka 3

5 okunmadan önce hemen test tamamlandığında eklenene kadar boş kalır. Su blank kuyu plaka okuyucuyu sıfırlamak için kullanılacaktır. 3. Aşağıda açıklandığı gibi tüm plazma ön dilüsyonları (Örnek Dilüent de 1:2 oranında dilüsyon) hazırlayın: Referans plazma: 100μL Sample Diluent e 100μL referans plazma ekleyin. Kontrol ve hasta örneği: 20μL Sample Diluent e 20μL plazma ekleyin. İyice karıştırın. Bu ön dilüsyonlar adım 4 ve 5 de çalışma dilüsyonlarını hazırlamada kullanılır. 4. Adım 3 deki 1:2 referans plazma dilüsyonu kullanarak, aşağıda belirtildiği gibi altı çalışma referans dilüsyonları hazırlayın. * Referans seviye değeri sadece referans eğrisi oluşturmak için kullanılacak μL Örnek Diluent e 20μL ön dilüent plazma ekleyerek kontrol ve hasta örneğinin çalışma dilüsyonlarını hazırlayın. (Not: bu dilüsyonlar 100% referans plazma dilüsyona karşılık gelir). 6. Uygun mikrokuyulara 100μL dilüsyon (referans plazma x 6 hasta örneği ve kontroller) ekleyin ve iyice karıştırın. 7. Reaktif blank kuyu ya 100mL Örnek Dilüent ekleyin. Su blank kuyuyu boş bırakın. 8. Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, mikrokuyuları dikkatlice ters düz edin ve sıvıyı dökün. Örnekler in kontaminasyonuna izin vermeyin. 9. Kullanılan yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkayın (PBS/Tween 20). Her bir kuyu yıkama başına yıkama solüsyonu ile doldurulmalıdır. Bir su blankı olarak kullanılmak için amaçlanmış boş kuyuda yıkama solüsyonu prosedüre engel olmaz. Boş sıvı için her yıkama arası mikrokuyuları ters düz edin. Kuyulardaki sıvıyı sallamak için hafifçe çerçeveye vurun. Çerçeve yıkama sırasında mikro kuyu modülleri korumak için sıkılmış olmalıdır. Kalan yıkama sıvısını uzaklaştırmak için emici kağıt ile kurutun. Adımlar arasındaki sürede kuyuların kurumasına izin vermeyin. 10. Her bir kuyuya 100μL Konjugat (kırmızı) ekleyin (su blank kuyusu hariç). 11. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, mikrokuyuları dikkatlice ters düz edin ve konjugat solüsyonu dökün. 12. Adım 9 da olduğu gibi kullanılan yıkama solüsyonu (PBS/Tween 20) ile 4 kez yıkayın. Su blank kuyusu içindeki yıkama solüsyonu prosedüre engel olmaz. Kuyulardaki sıvıyı sallamak için hafifçe çerçeveye vurun ve final yıkama sonrası emici kağıt ile kurutun. Kuyuların kurumasına izin vermeyin. 13. Her bir kuyuya 100μL Substrat ekleyin (su blank kuyusu hariç) ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Sabit bir hızda kuyulara substrat ekleyin. Mavi renk pozitif örnekler ile kuyuda gelişecektir. 4

6 14. Enzim reaksiyonunu durdurmak için her bir kuyuya (su blank kuyusu hariç) 100μL Durdurma Solüsyonu (0.36 N sülfürik asit) ekleyin. Substrate Solüsyonu eklendiğinde aynı oranda ve aynı sırada kuyulara Durdurma Solüsyonu ekleyin. Mavi substrat sarıya dönecek ve renksiz substrat renksiz kalacaktır. Su blank kuyusuna Durdurma Solüsyonu eklemeyin. Bunun yerine, su blank kuyusuna 200μL distile su ekleyin. Su blank kuyusuna karşı plaka okuyucuyu blank yada sıfır okutun. Bir 650nm referans filtreye (varsa) karşı, 450nm de her bir kuyunun OD sini okuyun. En iyi sonuçlar için, O.D. değerleri Durdurma Solüsyonu eklendikten sonra 30 dakika ölçün. Sonuçlar 1. Kullanmak için seçilen kontrol ve hasta numuneleri, referans plazma dilüsyonlarının tekrarı için OD değerlerini hesaplayın. 2. Referans seviyesine (y eksen) karşılık gelen değere karşı referans plazmasının (x ekseni) her bir dilüsyonu için elde edilen ortalama OD çizin. Eğri doğrusal, yarı-log veya log-log grafikte çizilebilir. Noktaları birleştirmek için bir line çizin. 3. Ortalama O.D kullanarak, grafikten hasta relatif değerini ve kontrolü belirleyin veya alternatif olarak, referans eğrisinden hesaplamak için lineer regresyon kullanın. 4. Normal yüzde de (%) Protein C Antijen düzeyini hesaplamak için, Referans Plazma (şişe etiketine bakın) için belirlenmiş değer ile kontrol ve hasta relatif değerleri (referans eğriden elde edilen) çarpılır. Örnek: Hasta relatif değeri (referans eğrisinden ): 40 Belirlenmiş Referans Plazma değeri: 105% normal Gerçek hasta Protein C Antijen değeri (% normal olarak): 40 x 1.05 = 42% 5. Test sonuçlarını rapor etmeden önce bütün kalite kontrol parametrelerinin yerine getirilmiş olduğundan emin olun (Kalite Kontrol bakın). KALİTE KONTROL 1. Reaktif blank ın ortalama OD, spektrofotometre de su kuyusuna karşı boş okutulduğunda 0.1 den daha az olmalıdır. 0.1 den daha büyük okumalar olası reaktif kontaminasyonunu veya yetersiz plaka okumayı gösterebilir. 2. Kontrol veya hasta örneklerinin tekrar çalışmaları için O.D. değerleri, den daha büyük absorbans okumalı örnekler için 20% ortalama O.D. değerinin içinde olmalıdır. 3. Kontroller için elde edilen Protein C Antijen değerleri üreticinin belirlediği ELISA aralıkları içinde olması gerekir. Bu aralıklar dışında nadiren küçük sapmalar kabul edilebilir. 4. Her bir laboratuar düzenli olarak bu test için kendi referans aralığı belirlemelidir. BEKLENEN DEĞERLER 10 Normal Aralık: Protein C Antijen değerleri havuzlu normal plazma ile karşılaştırıldığında genellikle relatif yüzde (%) olarak ifade edilmiştir. Normal plazma örnekleri Helena BioSciences Protein C Antijen yöntemle test edildiğinde normal aralık % (ortalama 110%, SD 24%) idi. Bu aralık literatürde ile uyumludur ve diğer ticari testler tarafından rapor edilmiştir 6,8. Referans eğrisi aralığından yukarıdaki numuneler dilüe edilmeli ve doğru sonuçlar için yeniden test edilmelidir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ 9 Tespit aralığı: Helena BioSciences Protein C Antijen test için tespit aralığı 5-200% olmalıdır. Bu nedenle, her bir çalışmanın efektif aralığı referans plazmanın test edilen değerine bağlıdır. En iyi doğru için, referans eğrisinin O.D. aralık dışında absorbans veren örnekler uygun dilüsyonda tekrar test edilmelidir. 5

7 Presizyon: Test arası presizyon: Bir plaka içindeki değişkenliği belirlemek için, bilinen Protein C seviye (bir yüksek, bir orta ve bir düşük) ile üç plazma örneği üç lotun her birinden altı plaka üzerinde, 2 çalışma ile 16 kuyuda test edildi. Aşağıdaki tabloda sunulan veriler, üç lotta % 7.0 ortalama CV gösterir. Buna ek olarak, testin tam tespit aralığını kapsayan Protein C seviyeleri ile doksan dokuz (99) hasta örneği, pakette kullanım talimatına göre son kullanıcılara presizyonu göstermek için 3 lot boyunca çift çalışılarak test edildi. Tabloda görüldüğü gibi, tekrar için genel ortalama CV % 6.0 idi. Test içi presizyon: Altı (6) ticari hazırlanan, % aralığında Protein C değerleri ile test edilen plazma örnekleri, lotlar arasında test prezisyonunu belirlemek için üç lotta çift çalışma yapılarak test edilmiştir. Ortalama test içi CV tabloda görüldüğü gibi % 7.5 idi: Doğrusallık: Protein C Antijen testinde üç lotunda test edilen Protein C eferans plazma örneklerinin seri iki kat dilüsyonu, ortalama tespit katsayısı ile eğri göstermektedir; tek tek nokta kurtarma % ile +21.3% arasında değişmektedir. Doğruluk: Doğruluk, Protein C testinde önceden belirlenmiş değerler ile referans plazma karışımları test edilerek ve teorik değerleri kurtarma hesaplanarak belirlendi. 3 lot arasında genel toplam ortalama yüzde kurtarma % 6.1 ortalama varyasyon(cv) ile 99.4% idi. TESTİN SINIRLAMALARI Bu testten elde edilen Protein C Antijen konsantrasyon değerleri sadece teşhis içidir. Her bir hekimin hastanın öyküsü, fiziki muayene bulguları ve diğer tanı yöntemleri ışığında bu sonuçları yorumlaması gerekir. Protein C in konjenital homozigot eksikliğine sahip hastalar, heterozigot eksikliği genellikle % 30 ile% 60 normal seviyeleri arasında iken Protein C in belirlenemeyen seviyelerine sahip olabilir. Sonradan kazanılan Protein C eksikliği sayısız klinik durum ile görülebilir: yeni doğan (düzeyleri 20-50% yetişkinlerden daha düşük), ağır karaciğer hastalığı, oral antikoagülan, post-operatif dönemde, yaygın damar içi pıhtılaşma (DIC), antifosfolipid sendromu gibi 6-8. Protein C artmış seviyesi böbrek hastalığı olan hastalarda görülebilir. Uygun olmayan toplama veya laboratuvar işleminin yanlış yapılması sonucu plazma örneklerinde Protein C bozulmuş veya yanlışlıkla tükenmiş olabilir. Hedef molekül yakalamak için bir hayvan kaynağından (örneğin fare, tavşan, keçi gibi) alınan antikorların kullanıldığı herhangi bir testte tanı veya tedavi için hayvan antikorları içeren preparatlara maruz kalan hastaların plazma veya serumunda etkileşim olasılığı vardır. Yanlışla yükselmiş veya depresif değerler bu hastalarda görülebilir. 6