Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999; 3: 189-195 Hastane İnfeksiyonları Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin Hastane nfeksiyonlar nda Kullan m Dr. Fatih KÖKSAL* * Çukurova Üniversitesi T p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal, Adana. Hastane infeksiyonlar n n kontrolü ve önlenmesi hiç flüphesiz ki multidisipliner kat l ml bir ekip iflidir ve klinik mikrobiyologlar bu ekibin vazgeçilmez üyeleridir. Ekip, hastane infeksiyonlar n n kontrolünde her hastadan izole edilen kuflkulu izolmanlar identifiye eder, bu mikroorganizmalar n epidemi ile ilgilerini, kaynaklar n, hastalar veya hastaneler aras ndaki olas geçifl yollar n belirleyerek gerekli tedbirleri almaya çal fl r. Bu ba lamda kararlar s kl kla kültür sonuçlar n n baz olarak al nd mikrobiyolojik testler dikkate al narak verilir. Ancak kültür sonuçlar n n nas l yorumlanaca ve baz spesifik problemler karfl s nda ne tür çözümler üretilece- i konusunda mikrobiyologlar yard mc d r. Özellikle stafilokoklar, enterokoklar, enterobakteriler, Pseudomonas ve Candida lar gibi hastane infeksiyonlar nda önem arz eden, ancak mikro-çevrede ve florada da s k görülen mikroorganizmalara ait izolmanlar n bir infeksiyonu mu yoksa normal floray m yans tt, hastadan elde edilen tekrarlayan izolmanlar n basit kontaminasyonu mu, kolonizasyonu mu yoksa reinfeksiyon veya reaktivasyonu mu gösterdi i cevaplanmal d r. Çünkü her cevab n çözümü bir di erinden farkl olacakt r. flte bu sorular n cevaplanabilmesi için mutlaka mümkün oldu u kadar h zl, do ru, kullan - labilir klonal seviyede sonuçlar veren ileri tetkikler yap lmas gereklidir. Bununla beraber yap lacak ileri tetkikler, maliyet parametreleri de gözönüne al narak infeksiyonlar n kontrolünde veya hasta baz nda tedavideki yarar dikkate al - narak seçilmelidir. Bunun için de yine mikrobiyolo un özel problemlerden haberinin olmas gereklidir. Klinik mikrobiyoloji laboratuvarlar yukar da bahsedilen ve hastane infeksiyonlar ndaki insidanslar ve önemleri gittikçe artan klasik bakterileri izole edip tür baz nda identifiye edecek donan ma sahiptir. Ancak yine klinik ve epidemiyolojik olarak önemli salg nlara sebep olan Acinetobacter ler, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, çoklu ilaç direnci gösteren mikobakteriler, C. albicans d fl ndaki kandida türleri, Aspergillus ve Fusarium türü mantarlar, P. carinii, Cryptosporidia lar, Cyclosporidia lar ve Microsporidia gibi parazitler ve HCV, HBV, RSV, CMV ve HIV gibi virüslerin tan s nda yeni seçici ve zengin besiyerleri ve ileri teknoloji ürünü olan moleküler tan yöntemlerine ihtiyaç duyulur. Yine hastane salg nlar ndan izole edilen mikroorganizmalar n antibiyotik duyarl l k kal plar n n süratle belirlenmesi de korunma ve kontrol aç s ndan son derece önemli epidemiyolojik bulgulard r. Çünkü metisilin dirençli S. aureus (MRSA), penisilin dirençli S. pneumoniae, vankomisin dirençli enterokoklar ve enterokok d fl ndaki gram pozitif koklar gibi hastane kökenli sufllar türünün di er 189
Köksal F. Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin örneklerine göre duyarl olmalar beklenen antibiyotiklere karfl çoklu ilaç direnci gösterirler. flte klasik kültür yöntemleri ile gerekti i gibi çözümlenemeyen bu problemlerin çözümünde otomatize sistemler ve moleküler biyolojik tan yöntemleri, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlar - na yard mc olmamaktad r. Otomatik sistemlerle klasik kültür yöntemlerine göre çok daha k sa sürede çok daha az örnekle %90-95 oran nda güvenilebilirlik derecesine sahip sonuçlar al nabilmifl ve birçok büyük hastane laboratuvar nda bu sistemler klasik sistemlerin yerini alm flt r. Ancak bu sistemlerin hastane epidemiyolojisi çal flmalar için önemli olan iki eksi i giderilememifltir. Bunlardan ilki direnç tespiti ile ilgilidir. Otomatize sistemlerde genetik olarak kontrol edilen direncin 3-5 saat içerisinde belirlenmesi yalanc duyarl l k kal plar n yarat r. Yani MRSA, penisilin dirençli Streptococcus, Van-B ba ml vankomisin dirençli enterokoklar amfoterisin-b, triazol ve echinocandin dirençli Candida lar ve Aspergillus lar gibi önemli patojenlerde güvenilir sonuçlar n eldesi her zaman mümkün de ildir. kinci önemli eksiklik de epidemiyolojik tiplendirmedeki yani klonal tiplendirmedeki yetersizliktir. Gerek klasik kültür izolasyonu ve identifikasyonu bazl sistemler gerekse otomatize sistemler genellikle mikroorganizman n, uzun sürede sonuç verip yo- un laboratuvar çal flmalar na ihtiyaç duyan, yetersiz say da ve yorumlanmas güç ancak gen ekspresyonuna ba l olarak de iflebilecek stabil olmayan fenotipik özelliklerini baz olarak al rlar. flte bu anlamda moleküler biyolojik yöntemler sadece izolasyonunda zorluk çekilen patojenlerin tan s amac ile de il ayn zamanda hastane infeksiyonlar ile epidemiyolojik anlamda iliflkisi düflünülen hastane içi klinik ve çevresel örneklerle hastaneler aras salg nlardan izole edilen sufllar n tür ve tip baz nda identifikasyonuna olanak sa lar. Bir örnekten izole edilen suflun k - sa bir süre içerisinde gerçek anlamda bir hastane epidemisi ile iliflkisini göstermek ve o klonun kayna na ulaflmak, kontrol politikalar oluflturmak aç s ndan son derece önemlidir. EP DEM YOLOJ K T PLEND RME Hastane infeksiyonlar n n kontrolünde salg nlardan elde edilen tür ve tür içerisindeki sufllar n klonal iliflkileri ve iliflkili sufllarda kayna n belirlenmesi son derece önemlidir. Bu iliflkileri ortaya ç karabilmek için sufllar n tan mlanmas, birbirleri ile benzerlikleri ve daha da önemlisi farkl l klar n n ortaya konulmas gereklidir. Yani epidemiyolojik olarak tiplendirilmeleri gerekmektedir. Tiplendirmede kullan lacak yöntemler test edilen sufllardan kesin sonuçlar ç kartabilmeli, yer ve zaman ba ml l olmaks z n her çal flmada ayn sonuçlar üretmeli ve epidemiyolojik olarak ilgisiz sufllar belirleyebilmelidir. Epidemiyolojik tiplendirme klasik olarak fenotipik özellikler veya gen karakterleri belirlenerek yap labilir. Fenotipik Tiplendirme Yöntemleri Fenotipik tiplendirme yöntemleri aras nda s k kullan lanlar bakterinin antibiyotik duyarl l k kal plar, biyokimyasal ve antijenik profili, faj duyarl l k kal plar, multilukus enzim elektroforez profilidir. PAGE de protein profili ve immünblotlama ile sitoplazmik veya hücre duvar antijen profilinin belirlenmesi gibi yöntemlerdir. Her ne kadar hastane infeksiyonlar epidemiyolojisi ile çal flan gruplar n ço u taraf ndan first line yöntemler olarak bu testler yeterli bulunmuflsa da gerçek anlamda daha çok benzerlikleri ortaya koyan bu yöntemler yeteri kadar ayr m yetene ine ve kullan labilirlik özelliklerine sahip de ildir. Bu testlerin yumuflak karn : 1. Genotipik ekspresyon veya varyasyonlarla de iflebilecek stabil olmayan karakterleri kullanmalar, 2. S n rl say da özelli i ortaya koyabilmeleri, 3. Farkl özelliklerin ortaya ç kar lmas için metodlar n önemli ölçüde modifikasyonlar gerektirmeleri, 4. Yavafl, emek yo un, pahal ve yorumlamas problemli sonuçlar üretmeleridir. Oysa mikroorganizmalarda kromozomal plazmid veya mitokondria DNA s n ve DNA daki farkl l klar ortaya koyarak tiplendirmenin yap ld genotipik epidemiyolojik metodlar fenotipik tiplendirme metodlar n n eksikliklerini önemli ölçüde ortadan kald rm flt r. Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemleri (Genotipleme) Bu metodlarda temel prensip, DNA n n uygun restriksiyon endonükleaz enzimleri (REE) ile hazmettirilmesi sonucu ortaya ç kan polimorfik DNA parçac klar n n elektrikli bir ortamda agaroz jel veya akrilamid jelde migrasyonel separasyona tabii tutularak parça büyüklü üne göre ayr flt r lmas (RFLP) ve ayr flan parçalar n jel- 190 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999; 3: 4
Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin Köksal F. de oluflturduklar bandlar n ethidium bromide ile boyanarak veya iflaretli problar kullan larak görüntülenmesi esas na dayan r (DNA parmakizi). Genotiplemede hedef DNA, kromozomal DNA, kromozom üzerindeki belirli gen bölgeleri, varsa plazmid e veya mitokondria ya ait DNA olabilir. Yine hedef DNA direkt restriksiyon endonüklezlarla (RE) hazmettirilece i gibi PCR ile amplifiye edildikten sonra jel üzerinde direkt veya RE hazmettirilerek analiz edilebilir (Tablo 1). Epidemiyolojik olarak tek atadan (klonal) ço- alan sufllar jel üzerinde di er sufllardan yani epidemi ile iliflkisi olmayan sufllardan farkl, üniform band kal plar oluflturacaklard r. Bu farkl band oluflumlar genetik farkl l dolay s ile atasal farkl l yans tmaktad r. Fenotipik metodlara göre daha güvenilir sonuçlar n üretildi i genotipik metodlar n en önemli avantajlar flunlard r: 1. Standardize edildikleri zaman stabil karakterlerdir. 2. Tüm farkl polimorfik özelliklerini ortaya koyabilirler. Yani güçlü ayr m yetene ine sahiptirler. 3. Benzer reagenler, aletler ve prosedürler kullan larak bakteriler, virüsler, mantarlar ve parazitler gibi oldukça farkl mikroorganizma türleri için kullan labilir. 4. Ucuz, h zl, basit ve duyarl yöntemlerdir. flte bu özellikleri ile moleküler biyolojik teknikler yani genotipleme teknikleri, mevcut problemlerine ra men hastane infeksiyonlar n n izlenmesi ve kontrolünde klinik mikrobiyologlara devrim olarak tan mlanabilecek önemli avantajlar sa lam flt r. Bu yöntemler altyap yetersizlikleri, buna ba l olarak yap lan çal flmalar n halihaz rda genel sonuçlar ç kartabilmek için yetersiz oluflu ve standardizasyonun olmay fl sebebi ile yayg n olarak kullan m alan bulamam fllard r. Ancak gelecek vadeden bu yöntemleri kronolojik olarak k saca tan mlamak, avantaj ve dezavantajlar n irdeledikten sonra bir sonuç ç kartmak daha do ru olacakt r. Moleküler biyolojik yöntemleri; nonamplifiye DNA n n kullan ld direkt genotipleme yöntemleri ve amplifiye DNA n n kullan ld yöntemler olarak iki bafll kta de erlendirebiliriz. 1. Direkt DNA n n Hedef Al nd Yöntemler A. Plazmid DNA kal plar Bakteri genotiplemesinde kullan lan ilk moleküler biyolojik yöntemdir. Bakteri içerisindeki Tablo 1. Moleküler Biyolojik Bazl Genotiplendirme Yöntemleri. Direkt genotipleme Plazmid parmakizi (fingerprinting) Genomik DNA restriksiyon fragment length polimorfizmi Kromozomal DNA-RFLP rdna-rflp Southern hibridizasyon Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) Mitokondrial DNA-RFLP Amplifikasyon bazl genotipleme PCR-RFLP Amplifiye fragment length polimorfizmi (AFLP) PCR-rDNA Repeatitive element polimorfizm-pcr (REP-PCR) Multiple arbitrary amplicon profiling ( MAAP) Arbidrary primed PCR (AP-PCR) Random amplification of polimorphic DNA (RAPD) DNA amplifikasyon fingerprinting (DAF) Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999; 3: 4 191
Köksal F. Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin DNA n n say ve büyüklü üne göre jel üzerinde elektrikli ortamda separasyonu sonucu oluflan bandlar n polimorfizmine göre oluflan farkl l klar baz al r. Plazmid DNA s n n ekstraksiyonunun basit ve h zl oluflu bu yöntemin yayg n olarak kullan m alan bulmas n sa lam flt r. Bu yöntemle elde edilen sonuçlar n birçok araflt rmac taraf ndan yeterli bulunmas ve yöntemin gerçek anlamda baz bakteri türleri için yüksek ayr m yetene i göstermesine ra men yönteme ilgi giderek azalm flt r. Çünkü mikroorganizmalar n ço unda plazmid bulunmamaktad r. Ayn atadan gelen klonal sufllar plazmidi kazanabildikleri gibi sonradan da kaybedebilmektedirler. Nihayet insersiyon ve delezyonlar n yayg n olarak görüldü ü ve kolay oldu u plazmid DNA profili ile tipleme ve subtiplemenin kabul edilebilirli i tart fl lmal d r. B. Kromozomal DNA restriksiyon endonükleaz analizi Bu anlamda kromozomal DNA n n tamam veya rezistans kodlayan veya rrna y kodlayan (rdna) gibi özel gen bölgelerinin bir veya birden fazla özel REE kullan larak hazm sonunda oluflan polimorfik DNA parçac klar n n uzunluklar (Restriktion Fragment Length Polimorfizm- RFLP) incelenir. Kromozomal DNA-RFLP yönteminde öncelikle mikroorganizman n kromozomu ekstraksiyon ve plazmid DNA s ndan kurtar lmak için pürifikasyon ifllemine tabi tutulur. Daha sonra çift sarmall kromozomal DNA y 4-6 bp uzunlu undaki spesifik bölgelerinden kesebilen SstI, BglII, XhoI, SalI, HpaII ve HinfI gibi enzimlerle haz m ifllemi yap l r. Bu enzimler son derece spesifik olarak DNA y 1.000-20.000 bp aras nda de iflen büyüklükte parçalara ay r rlar. Üretilen bu parçalar agaroz jelde büyüklüklerine göre hareket ederek ayr fl rlar ve sufl için spesifik RFLP olarak tan mlanan band kal plar olufltururlar. Bu kal plara parmakizi de (DNA fingerprinting) denir. Bu yöntem basit, h zl sonuç veren tek tek günlük örneklerle uygulanabilen bir yöntem olma avantaj na sahiptir. Ancak haz m sonucu üretilen genomik fragmanlar n say s n n çok fazla oluflu okuma ve de erlendirmeyi güçlefltirir. Mesela 6 bp uzunlu unda spesifik bölgeleri kesen SstI restriksiyon enzimi ile E. faecalis sufllar nda 95 den fazla band oluflmaktad r. Bu son yorumlanmas ve standardizasyonu son derece zor bir profildir. Benzerlikler ve farkl l klar fark etmek imkans z derecede zordur. Sistemin otomasyona ihtiyac vard r veya modifikasyonlarla kullan m mümkün olabilir. Bu modifikasyonlar ya direnç genleri, IS genleri ve rdna (ribotipleme) gibi spesifik gen bölgelerinin RFLP analizini yapan ya iflaretli problarla belirli genleri araflt rarak farkl l klar ortaya ç karan (southern hibridizasyon) veya daha büyük parçalar kesebilen restrüksiyon endonükleazlar yard m ile daha az say da fakat daha uzun fragmentleri üreten Pulsed Field Gel Elektroforezi (PFGE) gibi yöntemleridir. 1. Southern hibridizasyon yöntemi: Bu yöntemde ekstraksiyon ve pürifikasyon iflleminden sonra uygun RE taraf ndan hazmettirilen ve agaroz jelde separe edilen farkl uzunluktaki DNA fragmentleri bir naylon membrana transfer edilir. Daha sonra kromozom üzerindeki bilinen bir gen, rdna veya IS gibi hedef herhangi bir bölgeyi tan yan iflaretli DNA veya RNA problar kullan larak komplementer DNA ile hibridizasyon gerçeklefltirilir. 2. Ribotipleme (rdna-rflp): rrna y kodlayan kromozomal gen bölgeleri RE ile hazmettirilerek ortaya ç kan ürünlerin fragment uzunlu u analiz edilir. Bu gen bölgesinin bütün bakterilerde bulunmas ve birden çok kopyas n n bulunmas testin kullan labilirli ini art r r. Bu yöntemle bütün bakteri türleri ve tür içindeki subgruplar n tespiti mümkündür. Ancak birden çok enzimin kullan lmas, ifllemlerin uzun ve emek yo un oluflu bu yöntemin en önemli dezavantajlar d r. 3. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE): Bu yöntemle kromozomal DNA y daha büyük ancak daha az say da fragmentlere ay ran Lamda/HindIII ve NheI gibi uzun enzimler kullan l r. Bu enzimlerle haz m sonucunda 10 Mb yani yaklafl k olarak 10.000 kb uzunlu unda DNA fragmentleri üretilir. Klasik sürekli elektroforezde agaroz jelde ancak 30-50 kb uzunlu undaki DNA fragmentlerinin ayr m mümkündür. Çünkü agaroz jelde 50 kb dan daha uzun olan parçalar düzenli tek yönlü ak m ile jel üzerinde yo un tek bir band fleklinde hareket ederler. Ancak ak m n yönü veya aç s periyodik olarak de ifltirilirse büyük ve küçük fragmentler birbirlerinden ayr - lacakt r. Elektrikli alanda elektrik yönü veya aç - s ndaki herbir de iflik uygulama esnas nda küçük parçalar yeni direktifler do rultusunda daha h zl hareket ederek büyük parçalardan kopacakt r. Böylece büyük fragmentler daha geride 192 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999; 3: 4
Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin Köksal F. küçükler ise önde olmak üzere yeniden dizilim ortaya ç kacakt r. Bu yöntem özel cihazlar n kullan m n gerektiren bir tekniktir. Kullan lan cihazlar iki bafll k içerisinde de erlendirilebilir. Bunlardan ilki basit manüplasyonlarla yani bir anahtarla ak m n yönünü de ifltiren cihazlard r (field Inversion gel electrophoresis -FIGE). Di eri de belirli aç larla ak m n yönünü sürekli olarak de ifltirebilen cihazlard r. Bu yöntemde DNA fragmentleri jel üzerinde sürekli olarak zigzag çizerek hareket ederler. Bu cihazlarla daha k sa sürede daha fazla say da band oluflturmak mümkündür. Ticari olarak sa lanan bu sistemlerin önemlileri; Contour-clamped Homogenous Electric Field (CHEF), Transvers alternating Field electrophores (TAFE) ve Rotating Gel Electrophoresis (RGE) dir. Yüksek ayr m gücü ve yorumlanabilir say da fragment üretimine ra men bu tekni in geç sonuçlanmas, pahal enzim ve ekipmana ihtiyaç duymas ve 20 den fazla say - daki bandlar n yorumunda problem olmas yöntemin kullan labilirli ini azaltmaktad r. 2. Amplifikasyon Bazl Yöntemler Genotiplendirmenin bu prosedürlerinde hedef DNA önce amplifiye edilir daha sonra amplifiye ürünler ya direkt olarak veya özel RE ile hazmettirildikten sonra ortaya ç kan son ürünlerin fragment uzunluklar n n analizi için agaroz jelde separe edilir. Böylece bir türün farkl sufllar aras ndaki fragment kal plar ndaki farkl l klar de erlendirilir. Bu yöntemler aras nda en fazla kullan - lanlar PCR-RFLP, PCR-ribotipleme, AP- PCR/RAPD/DAF, REP-PCR ve AFLP dir. 1. RFLP-PCR Bu yöntemle önce kromozom üzerindeki spesifik bir gen bölgesinin amplifikasyonu yap l r, daha sonra amplikon özel REE leri kullan larak hazmettirilir. Haz m sonunda üretilen farkl uzunluktaki parçalar n da l m agaroz jel elektroforez yöntemi ile belirlenir. 2. PCR-ribotipleme Bu yöntemle önce kromozom üzerinde rrna y kodlayan gen bölgesi amplifiye edilir. Daha sonra REE kullan larak RFLP analizi yap labilir. Bu yöntem tip ve sub tip tespitinde kullan labilir. 3. Tekrarlayan ekstragenik elementlerin PCR ile amplifikasyonu (REP-PCR) Bu yöntemle bakteri ve birçok mantar türünde kromozomun farkl bölgelerinde bulunabilen k sa, tekrarlayan ve konservatif yap lar hedef alan k sa primerler kullan l r. Bölgelerin birbirlerine yeteri kadar yak n olmalar na ba l olarak iki ekstragenik bölge aras nda kalan bölgeler amplifiye edilir. Amplikonlar n say ve uzunluklar agaroz jelde elektroforez ile belirlenir. 4. Amplifiye fragment length polimorfizmi (AFLP) Bu yöntemde kromozomal DNA önce aç k uçla kesen 6-7 bp uzunlu undaki bir RE ile kesilir. Daha sonra RE nin aç k ucunu komplementer olarak tan yan primerler kullan larak hedef ba lanma veya bir baflka ifade ile kesilme bölgelerinin amplifikasyonu müteakibinde fragment uzunluklar n n analizi yap l r. Bu yöntemin özellikle C. pneumoniae n n oküler ve solunum yollar izolatlar n n ayr flt r lmas nda baflar ile kullan labilece i bildirilmifltir. 5. Multiple arbitrary amplicon profiling (MAAP - AP-PCR, RAPD ve DAF) Bu isim AP-PCR, RAPD ve DAF gibi çok küçük farklara sahip ancak ayn prensiple çal flan metodlar n tamam n içine alacak bir terim olarak önerilmifl ancak fazla kabul görmemifltir. Bu yöntemlerin hepsinde hedef DNA hakk nda ön bilgiye ihtiyaç yoktur ve kullan lan primerlerde random olarak haz rlan r. Yine düflük annealling s n n kullan ld bu yöntemlerde primerlerin uzunlu u yöntemlerin ad n n farkl an lmas na neden olmufltur. Mesela AP-PCR da kullan lan primerler klasik PCR dakine benzer olarak 18-24 bp olarak düzenlenmiflken, RAPD da kullan lan primerler 8-10 bp, DNA amplifkasyon Fingerprinting (DAF) te 4-5 bp uzunlu unda dizayn edilirler. Bu yöntemlerde ilk olarak kromozomal DNA ekstrakte ve pürifiye edilir. Daha sonra denatüre edilen DNA random primer/primerler kullan larak amplifiye edilir. lk siklusta kal p primer kromozom üzerindeki komplementeri ile birleflir. Primerlerin random olmas sebebi ile birleflmenin spesifitesini azaltmak için düflük annealling s s kullan l r. Bu sebeble teorik olarak daha etkili veya çok say da birleflmenin olabilmesi için daha uzun primerlerin kullan lmas yararl olacakt r. Bilindi i gibi uzaman n oluflumu primerin 3 ucu ile kal ba ba lanmas ile bafllar ve bu uçla tutunabilen primer düflük s da uzamay sa layabilir. Uzun primerlerle 5 ucu veya ortada herhangi bir bölgenin kal p ile birleflmesine bak lmak- Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999; 3: 4 193
Köksal F. Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin s z n daha fazla say da ba lanma ve farkl uzunlukta fragman oluflumu sa lanabilir. Çal flmada kullan lacak primerlerin uzunlu u, dizayn ve say s da tamamen deneme yan lma yöntemi ile belirlenir. Mesela S. aureus ve E. faecium için 18-20 bp uzunlu undaki primerler kullan fll bulunmuflken Candida türleri için 10 bp uzunlu undaki primer veya primerler daha uygun bulunmufltur. flte böyle random primerlerle yap lan amplifikasyon sonras üretilen amplikonlar n say ve uzunluklar n n agaroz jelde elektroforeze tabi tutularak fragment uzunluklar na göre separe edilmeleri sonucu oluflan kal plar tiplemede kriter olarak kullan lmaktad r. Bu yöntemler klasik PCR teknikleri kadar kolay, h zl ve kullan labilir sonuçlar üretirler. Ekstra alet ve reagene ihtiyaç duymadan küçük modifikasyonlarla bütün mikroorganizma gruplar için uygulanabilmesi kullan m alan n geniflletmektedir. Ancak bu yöntemlerin de önemli dezavantajlar bulunmaktad r. Bu dezavantajlardan en önemli ve kapsaml s standardizasyonsuzluktur. DNA n n haz rlan fl nda ve konsantrasyonunda, kullan lan primer veya primerlerin seçiminde, polimeraz n tür ve konsantrasyonunda, kullan lan termal döngü cihaz ve jelin kalitesinde, say s nda ve nihayet boya giderme ifllemlerinin yap l p yap lmamas ndaki de iflkenlikler yani standardizasyonsuzluklar sonuçlar n de iflkenli ini yaratmaktad r. Yine personelin bilgi ve tecrübesi ile üretilen bandlar n yorumlanmas sonuçlar etkilemektedir. DNA fragmentlerinin uzunluklar na göre agaroz jeldeki oluflturduklar band paternlerini kriter olarak alan bütün yöntemler için önemli bir genel problem de kaç banttaki farkl l n gerçek anlamda klonal farkl l yans tt n n belirlenmesidir. flte bu sorunun cevab henüz tam olarak verilememifltir. fiüphesiz ki üretilen toplam band say s na göre her band n önemi de ifliklik arz etmektedir. Fakat kabaca 1 farkl band nokta mutasyonlar 2, 3, band ayn tür içerisindeki delezyon veya insersiyonlar fleklinde yorumlanabilir. Ancak 4 ve üzerindeki farkl band n oluflumu gerçek anlamda klonal fark yans tmaktad r. Yani güvenilir bir standardizasyonun yoklu u yorumlar da kiflisellefltirmektedir. Bu mahsurlar ortadan kald r labilmek veya en aza indirebilmek için örneklerin topluca bir kerede ayn flartlar alt nda de erlendirilmesi önerilebilir. Yukar da say lan baz olumsuzluklara ra men moleküler biyolojik genotipleme yöntemleri h zla fenotipik tiplendirme yöntemlerinin yerini almaktad r. KL N K UYGULAMALAR Moleküler biyolojik tiplendirme yöntemleri özellikle kandidalar, aspergilluslar, lejionellalar, ve enterokoklar gibi fenotipik yöntemlerle tiplendirilmeleri zor olan mikroorganizmalar n tiplendirilebilmesinde büyük avantajlar yaratm flt r. Kandidalar s kl kla tabiatta toprak ve g dalardan, hastane ortam nda hava ve çevresel örneklerden ve hastaya ait klinik örneklerden izole edilen mikroorganizmalard r. Deri ve gastrointestinal sistemde floran n üyesi olarak da görülürler. Hastane infeksiyonlar nda gittikçe artan bir öneme sahip olan kandidalar immün sistemi bask lanm fl kiflilerde, yo un bak m ünitelerinde ve postoperatif bak m ünitelerinde izlenen hastalarda s kl kla ciddi infeksiyonlara yol açabilmektedir. Klinik örneklerdeki kandida izolatlar - n n infeksiyonlar m yoksa kolonizasyonu mu gösterdi ini anlamak zordur. Çünkü klasik fenotipik özelliklere dayal tiplendirme yöntemleri ile klonal farkl l klar göstermek imkans zd r. Ancak RFLP parmakizi yöntemi ve ribotipleme yöntemlerinin kullan lmas ile kandidalar n klonal tan mlamalar yap labilmifltir. RFLP ile kandidalar n 4 genotipi oldu u, ribotipleme ile de sufllar aras ndaki klonal iliflkinin ortaya konabilece i gösterilmifltir. Yine mitokondrial DNA-RFLP analizi tür baz nda tiplemede yararl bulunmufltur. Bir di er önemli kullan m alan bulan mikroorganizma grubu da enterokoklard r. Bu bakteriler de fenotipik özelliklerine göre epidemiyolojik anlamda tiplendirilemezler. Oysa enterokoklar yaln z hastanelerde baktereminin önemli bir etkeni olma özellikleri ile de il ayn zamanda transfer edilebilir çoklu ilaç direncini kodlayan gen veya plazmidleri tafl malar ile de hastane infeksiyonlar nda izlenmesi gereken önemli mikroorganizmalard r. Enterokoklar yetiflkinlerin ço unda d flk da bulunur. Penisillin ve sefalosporinlere nispeten dirençli aminoglikozidler ve linkozamidlere karfl da düflük derecede intrinsik direnç gösterirler. Bu direnç profili mikroorganizmalar aras nda süratle yay lma e ilimindedir. Vankomisin dirençli enterokok sufllar ilk olarak 1986 y l nda izole edilmifl ve k sa sürede tüm Avrupa ve Amerika ya yay lm flt r. Moleküler tiplendirme teknikleri kullan larak dirençli enterokoklarla oluflan infeksiyonlar n insidans nda art fl oldu u gösterilmifltir. Bu infeksiyonlar, bir atadan gelen klonal yay l ma ba l olabilece i gibi, sufllar aras nda plazmidle aktar lan direnci 194 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999; 3: 4
Moleküler Biyolojik Tiplendirme Yöntemlerinin Köksal F. veya antibiyotik bask s alt ndaki hastalarda seleksiyonla endojen dirençli sufllar n yarat lm fl olabilece ini de düflündürür. Bu üç halde de infeksiyonun kontrolü için gelifltirilecek stratejiler birbirinden oldukça farkl d r. Bu sebeble moleküler tiplendirme dirençli enterokoklar n araflt - r lmas nda, da l m n n önlenmesinde veya kontrolünde son derece önemlidir. Buna karfl l k fenotipik metodlar n da tamamen yarars z oldu unu söylemek mümkün de ildir. Mesela MRSA lar n tan mlanmas nda disk difüzyon yöntemi ile antibiyotik duyarl l k kal plar n n tespiti RFLP ve ribotipleme gibi bu amaç için kullan lmas önerilen yöntemlerin hepsinden daha etkili ayr m yetene i göstermifltir. Her ne kadar moleküler biyolojik tiplendirme yöntemleri geliflmifl laboratuvarlarda süratle fenotipik metodlar n yerini al yorsa da unutulmamal d r ki hiçbir bir tek bafl na mükemmel de ildir. Gerekli olan yöntemler, gerekli olduklar yerlerde kullan lmal ve ihtiyaç oldu unda yan testlerle desteklenmelidir. KAYNAKLAR 1. Debast SB, Meis J FMG, Melchers WJG, Voss A. Use of interrepeat PCR fingerprinting to investigate an A. baumannii outbreak in an intensive care unit. Scand J Infect Dis 1996;28:577-81. 2. Engleberg NC. Molecular methods: Applications for clinical infectious diseases. Ann Emerg Med 1994;24:490-502. 3. Hall LMC. Are point mutations or DNA rearrangements responsible for the restriction fragment length polymorphisms tahat are used to type bacteria. Microbiolgy 1994;140:197-204. 4. Louie M, Simor AE, Rachlis A, Louie L. Nosocomial Neisseria meningitidis: Molecular analysis of a clinical problem. Infect Control Hosp Epidemiol 1997;18:203-4. 5. Low DE, Mc Geer A. The use of molecular biology techniques for diagnostic microbiology and hospital epidemiology. New Horizons 3:2, 161-69. 6. Obayashi Y, Fujita J, Ichiyama S, et al. Investigation of nosocomial infection caused by arbekacin - resistant methicillin resistant S. aureus. Diagn Microbiol Infect Dis 1997;28:53-9. 7. Pfaller MA, Herwaldt LA. The clinical microbiology laboratory and infection control: Emerging pathogens, antimicrobial resistance and new technology. Clin Infect Dis 1997;25:258-70. 8. Power EGM. RAPD typing in microbiology-a technical review. Hosp Infect 1996;34:247-65. 9. Prosser JI. Molecular marker systems for detection of genetically engineered micro-organisms in the environment. Microbiology 1994;140:5-17. 10. Struelens Marc J, Gheldre YD, Deplano A. Comparative and library epidemiological typing systems outbreak investigations versus surveillance systems. Infect Control Hosp Epidemiol 1998;19: 565-9. YAZIfiMA ADRES : Prof. Dr. Fatih KÖKSAL Çukurova Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikobiyoloji Anabilim Dal Balcal - ADANA FEMS Symposium Laboratory Monitoring of Viral Infections and Antiviral Resistance Detection The Marmara Hotel June 10-13, 2000, İstanbul Congress Secreteriat Prof. Dr. Gülden YILMAZ, M.D. Department of Microbiology and Clinical Microbiology Istanbul Faculty of Medicine Çapa 34390 Istanbul, TURKEY Phone: + 90212 631 18 78, Fax: + 90212 635 11 86, + 90212 635 25 82 E-mail: ercuyilmaz@superonline.com Hastane nfeksiyonlar Dergisi 1999; 3: 4 195