T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Prof. Dr. Saniye ŞEN DENEYSEL DİYABETİK NEFROPATİDE İRBESARTAN VE ANTİOKSİDAN TEDAVİLERİN KARŞILAŞTIRILMASI (Uzmanlık Tezi) Dr. Salim DÖNMEZ EDİRNE-2008
TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim süresince mesleki bilgi ve deneyimimi artırmamda ve tezimin hazırlanmasında büyük emeği olan değerli hocam Prof. Dr. Saniye ŞEN e ve İç Hastalıkları Anabilim Dalı ndaki tüm hocalarıma, yoğun işleri arasında bana zaman ayıran Prof. Dr. Mehmet KANTER e, tezimin her aşamasında tecrübe ve bilgisiyle desteğini gördüğüm sayın Yrd. Doç. Dr. Sedat ÜSTÜNDAĞ a, deney aşamasında bana çok yardımcı olan değerli arkadaşım Uzm. Dr. Cevat AKTAŞ a, laboratuar çalışmalarında destek veren Şentürk ÇİFTÇİ, Yrd. Doç. Dr. Hakan ERBAŞ ve Bora DEMİRKAN a, tüm asistan arkadaşlarıma ve hastane çalışanlarına saygılarımla ayrı ayrı teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER. 4 DİYABETES MELLİTUS TANIMI VE SINIFLANDIRILMASI... 4 DİYABETİK NEFROPATİ..... 5 RENİN ANJİOTENSİN SİSTEMİ.. 12 RENİN ANJİOTENSİN SİSTEMİ VE DİYABETİK NEFROPATİ. 15 ANJİOTENSİN RESEPTÖR BLOKERLERİ.. 17 L-KARNİTİN VE DİYABET... 18 ALFA LİPOİK ASİT VE DİYABET. 20 GEREÇ VE YÖNTEMLER... 21 BULGULAR... 26 TARTIŞMA... 50 SONUÇLAR... 59 ÖZET... 61 SUMMARY... 63 KAYNAKLAR... 65 EKLER
SİMGE VE KISALTMALAR ACEi : Angiotensin Converting Enzyme İnhibitors (Anjotensin Konverting Enzim İnhibitörü) ADA : American Diabetes Association (Amerikan Diyabet Cemiyeti) ADP : Adenosine Diphosphate AGE : Advanced Glycation End Products ALA : Alfa Lipoik Asit ANP : Atrial Natriüretik Peptid ARB : Anjiotensin Reseptör Blokeri ATP : Adenosine Triphosphate AT 1 : Angiotensin Tip 1 AT 2 : Angiotensin Tip 2 A II : Anjiotensin II A I : Angiotensinojen I DAG : Diacylglyserol DM : Diyabetes Mellitus DNP : Diyabetik Nefropati DSÖ : Dünya Sağlık Örgütü FENa : Fractional Excretion of Sodium (Fraksiyonel Sodyum Atılımı) GBM : Glomeruler Bazal Membran GFR : Glomerular Filtration Rate (Glomeruler Filtrasyon Hızı) GSH : Glutatyon GPx :Glutatyon Peroksidaz HbA1C : Hemoglobin A1 c
HDM : Hücre Dışı Matriks HT : Hipertansiyon HK : Hasta Kontrol inos : Inducible Nitric Oxide Synthase İR : İrbesartan KB : Kan Basıncı LC : L-Carnitine (L-Karnitin) NADPH : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat) NBT : Nitoblue Tetrazolium NO : Nitrik Oksit NOS : Nitrik Oksit Sentetaz OGTT : Oral Glukoz Tolerans Testi ONOO - : Peroksinitrit PAS : Periodic Acid Schiff PBS : Fosfat Tamponu PKC : Protein Kinaz C RAGE : Receptors for AGE RAS : Renin Anjiotensin Sistemi ROÜ : Radikal Oksijen Ürünleri SDBY : Son Dönem Böbrek Yetersizliği SOD : Superoksit Dismutaz STZ : Streptozosin TGF β-1 : Transforming Growth Factor Beta -1 ÜAA : Üriner Albümin Atılımı ÜGA : Üriner Glukoz Atılımı ÜPA : Üriner Protein Atılımı VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor
GİRİŞ VE AMAÇ Çağımızda hızla artan ve toplumda sık görülen Diyabetes Mellitus (DM), yüksek oranda hedef organ hasarlarına yol açmaktadır. Morbidite ve mortalitesi yüksek olan DM nin hedef organları arasında böbrekler önemli yer tutmaktadır. DM de kolay oluşan üriner traktüs ve renal infeksiyonlar ve makrovasküler bozulmalar nefropati gelişimini kolaylaştırır. Düzenli diyaliz tedavisi gören hastaların renal yetmezlik nedenleri arasında DM, %25-44 ile birinci sırada yer almaktadır (1). Amerika Birleşik Devletleri nde %40 olan bu oranın önümüzdeki 10 yılda % 50 ye çıkacağı öngörülmektedir. Ülkemizde de 2007 yılı renal yetmezlik nedenleri arasında DM, %25,3 oranındaki insidans ve prevelans ile birinci sıraya yükselmiştir. Endüstriyel yaşam ve beslenme şekli ile ilişkili olarak artan DM ve buna bağlı diyabetik nefropati (DNP) oranı da giderek artmaktadır (2). Vasküler yolla oluşan DNP gelişiminden çoklu etmenler sorumludur (3). Genetik yatkınlık, beslenme bozukluğu, inaktivasyon, obezite, hipertansiyon, dislipidemi ve benzeri risk faktörleri DM ve renal bozulmada rol alan faktörlerin başında gelmektedir. DM de hiperglisemi ve sodyum pompa bozukluğu ile kan volümü ve basıncı artmaktadır. Renal kanlanma ve intraglomerüler basınç artışı ile filtrasyon membranından ultrafiltrat, solüt, protein geçişi hızlanarak renal bozulmayı kolaylaştırmaktadır. Artmış glukoz ve enzimatik, nonenzimatik ürünlerinin yol açtığı oksidatif stres ile oluşan radikal oksijen ürünlerinin (ROÜ) artışı, protein kinaz C (PKC) aktivasyonu, protein ve aminoasitlerin glikasyonu ile oluşan glikozlanma son ürünleri advanced glycation end products (AGE) DNP gelişiminde önemli rol almaktadır (4-6). Bu ürünler, vazokonstriksiyon, inflamasyon ve tromboembolik olayları artırarak ateroskleroz gelişimini hızlandırarak organların bozulmasına katkıda bulunmaktadır. 1
Glukoz ve metabolitlerinin yol açtığı, renal parankimdeki lokal Renin Angiotensin Sistemi (RAS) aktivasyonu ile artan Angiotensin II (A II) nin Angiotensin Tip 1 (AT 1) reseptörleri DNP gelişiminde önemli rol oynamaktadır (7). AT 1 reseptör aktivasyonundaki artış, kan volümü, kan basıncı (KB) ve renal kanlanma ile efferent arterde vazokonstrüksiyonu artırarak intraglomerüler basıncı yükseltir. Filtrasyon bariyerinden geçişi artan antijenik yapıdaki proteinler ve solütler glomerüler ve tübüler duvarların bozulması, mezangial hücrelerin çoğalmasına yol açarlar. AT 1 reseptör aktivasyonu ayrıca nikotin amid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oksidaz oluşumunu ve süperoksit (O ²) yapımını uyarır. O ², özellikle tip 1 DM de yapımı artan nitrik oksit (NO) ile reaksiyona girerek peroksinitrit (ONOO ) radikalini oluşturur. Böylece NO fonksiyonunu bozarak ve ROÜ yü arttırarak endotelyal, mezengial ve interstisyel hücrelerin proliferasyonuna yol açar. Ayrıca, transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) yapımı uyarılarak kollajen ve fibronektin gibi mezengial matriks protein sentezini artırır. Hemodinamik olarak başlayan değişiklikler yapısal bozulma ile birleşerek DNP gelişimine yol açar (8). Anjiotensin dönüştürücü enzim inhibitörü (ACEi) ve AT 1 reseptör blokerleri (ARB) tedavisi ile yapılan klinik çalışmalarda proteinürinin azaldığı ve DNP gelişiminin yavaşladığı bilinmektedir (9-10). Bu ilaçların renal koruyucu etkilerinin öncelikle, KB ve glomerüler basıncı düşürerek, DM de oluşan renal hemodinamik değişiklikleri azaltıcı özelliklerinden kaynaklandığı bilinmektedir. Onozato ve ark. (11), deneysel DM geliştirdikleri ratların böbrek dokularında KB yi düşürmeyen dozdaki dört haftalık ACEi ve ARB tedavisi ile NADPH oksidaz, nöronal ve endotelyal NO sentetazda azalma gözlemeleri bu görüşü desteklemektedir. Ancak bu çalışmada, renal dokudaki lipid peroksidasyon ürünleri, ayrıntılı histopatolojik, periodic acid schiff (PAS) boyama ile kollajen birikimi ve renal dokuda TGF-β1 incelenmediğinden, ilaçların renal koryucu mekanizmaları yeterince aydınlanamamıştır. Organ hasarlarının gelişiminde DM lilerdeki adenozin trifosfat (ATP) azalmasının etkili olduğu bildirilmektedir (12). Karnitin, ATP üretiminde kullanılan uzun zincirli yağ asitlerinin iç mitokondriuma taşınmasında rol alır. Hücre içinde oluşan metabolitlerin atılmasında rol almaktadır. Demir (Fe +2 ) ile birleşerek, oksidatif stres yapıcı etkisini azaltmaktadır. Böylece hem ATP üretimini artırarak, hem de hücre içi toksisite ve hücre zarında lipit peroksidasyonu azaltarak hücrelerin bozulmasını yavaşlatmaktadır. DM lilerde sıklıkla karnitin ile birlikte organ hasarından sorumlu tutulan hücre içi ATP konsantrasyonu azalmaktadır. Hücre içi ATP konsantrasyon azalması ile hücre membranlarındaki lipidlerin 2
peroksidasyonu artarak hücre hasarı oluşmaktadır. Artan RAS aktivasyonu ile makrofajlarda kolesterol sentezi de lipid peroksidasyonunu güçlendirmektedir (13). Hemodinamik değişikliklerin olduğu tip 1 DM de ACEi, metabolik değişikliklerin ağırlıklı olduğu tip 2 DM de ARB kullanımının böbrek korunmasında daha yararlı olduğu bilinmektedir (14). Tip 1 DM de sistemik RAS azalmış olsa bile her iki tip DM de lokal RAS artmaktadır. RAS ın %10-20 si sistemik, %80-90 ı lokaldir. Bu nedenle lokal RAS giderek önem kazanmaktadır. ARB ile AT 1 reseptör aktivasyonuna bağlı RAS etkilerinin ACEi ye göre daha fazla baskılanacağı beklenmektedir. ARB ile birlikte antioksidan kullanımı ve renal doku, serum antioksidan kapasite ve lipid peroksidasyon ölçümünü yapan çalışmaya rastlayamadık. Son yıllarda, özellikle DM lilerde tamamlayıcı tıpta antioksidan kullanımının organ hasarını yavaşlattığı ileri sürülmektedir. Yapılan çalışmalarda deneysel DM de güçlü bir antioksidan olan alpha lipoic acid (ALA) ile diyabetik nöropati oluşumunun azaldığı ve DM li hastalarda nöropati semptomlarının gerilediği, siyatik sinir kan akımının arttığı gözlenmiştir. DM deki retinopati, lens bozukluğunun ALA ile azaldığı, karaciğer ve böbrekte antioksidan olan glutatyon (GSH) konsantrasyonunun arttığı gözlenmiştir. Benzer şekilde deneysel DM çalışmalarında L-Karnitin (LC) kullanımı ile kalp kasındaki ATP azalması, nöropati ve dislipidemi gelişimlerine olumlu etkileri gözlenmiştir (15-18). Ancak, klinik ve deneysel DNP çalışmalarında, renoprotektif etkisi kabul görmüş olan ARB ile antioksidanların kombinasyon tedavilerine rastlayamadık. Bu nedenle, çalışmamızda KB yi ve glomerüler filtrasyon hızını (GFR) düşürmeyen dozdaki ARB olan İrbesartanın (İR), farklı antioksidanlar olan ALA ve LC kombinasyonu ile tedavilerinin deneysel DNP üzerine etkilerini araştırmayı planladık. 3
GENEL BİLGİLER DİYABETES MELLİTUS TANIMI VE SINIFLANDIRMASI Amerikan Diyabet Cemiyeti (ADA) tarafından 2003 de yeniden belirlenen tanı kriterlerine göre; poliüri, polidipsi, glukozüri, ketonüri ve açıklanamayan ağırlık kaybı gibi semptomlar ile birlikte herhangi bir zamanda ölçülen plazma glukoz düzeyinin 200 mg/dl bulunması veya 10-12 saat açlık sonu sabah kan glukozunun 126 mg/dl bulunması DM olarak tanımlanmaktadır (19). Ayrıca 75 gr glukoz ile yapılan oral glukoz tolerans testinde 2. saatteki glukozun 200 mg/dl olması ile DM tanısı konmaktadır. DM için çeşitli sınıflandırmalar ileri sürülmektedir. Son sınıflamada tip 1 DM, tip 2 DM, gestasyonel diyabet ve diğer spesifik tipler olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır. Diyabetlilerin %10-15 ini tip 1 DM oluşturur. Genetik yatkınlık ve çevresel etkenlerle pankreas beta hücrelerinin ilerleyici harabiyetine bağlı olarak gelişir. Çoğunlukla çocukluk ve adolesan yaşta başlar. Otoimmün (tip 1A) ve idiyopatik (tip 1B) olmak üzere iki alt gruba ayrılmaktadır. Tip 1A da pankreas beta hücrelerinin çeşitli bileşenlerine karşı otoantikorlar bulunurken, tip 1B de otoimmünite bulguları yoktur ve kanda insülin düzeyleri düşüktür. Tip 1 DM, genellikle hızlı gelişir; bazı hastalarda yavaş seyir izler ve yıllar içinde insülin eksikliği artarak oral antidiyabetiklere yanıt vermez hale gelir. Bu hastalar yavaş seyirli bir otoimmünite gösterebilir (Latent Autoimmune Diyabetes of Adults, LADA) (20). Tüm diyabetli hastaların %90 ını oluşturan tip 2 DM de insülin direnci gelişimi ve/veya insülin salgılanmasında bozukluk vardır. Çoğunluğu orta yaşlı, şişman ve kadın hastalar olup, bazen genç yaşta başlayabilir. Genç yaşta başlayan hipergliseminin olması, ketozisin yokluğu 4
ve insülin kullanılmadan hipergliseminin düzeltilememesi durumunda erken başlangıçlı tip 2 diyabet (Maturity Onset Diyabetes of Young, MODY) düşünülmelidir (20). Ayrıca ilk kez gebelik sırasında ortaya çıkan gestasyonel diyabet ve pankreas hastalıkları, sürrenal ve hipofiz bezi hastalıkları, endokrin sistem ile ilişkili genetik sendromlar, kortikosteroid ve tiazid gibi bazı ilaçların kullanımına bağlı sekonder diyabet gelişebilmektedir (19). İnsidans ve prevalansı coğrafik ve etnik farklılıklar gösteren DM, özellikle kuzey ülkelerinde yüksek oranda görülmektedir. Danimarka da 22 yaş üzerinde diyabet prevalansı %38 lere çıkmaktadır (21). Ülkemizde 2004 yılında yapılan çalışmada %7,2 olduğu bildirilmiştir (22). Endüstriyel ülkelerde prevalansı artan DM nin komplikasyonları da yüksek oranda gelişmektedir. Akut ve kronik komplikasyonları olan diyabetin akut komplikasyonları arasında diyabetik ketoasidoz, hiperozmolar koma, laktik asidoz sayılabilir. Organ hasarına yol açan kronik komplikasyonları, genel olarak makro ve mikrovasküler olarak gruplandırılabilir. Makrovasküler grupta hipertansiyon (HT), kardiyovasküler, serebrovasküler hastalıklar sayılabilir. Nöropati, retinopati ve nefropati ise mikrovasküler komplikasyonlarıdır. Bunların dışında deri, bağ dokusu, eklemler, sinir sistemi gibi diğer sistemlerle ilgili sorunlar mikrovasküler bozulma ile gelişir (19). DNP oluşum mekanizmaları, aynı zamanda diğer mikrovasküler komplikasyonlara da ışık tutmaktadır. DİYABETİK NEFROPATİ Diyabetik nefropati dünyada ve ülkemizde son dönem böbrek yetersizliği (SDBY) nedenleri arasında birinci sırada yer almaktadır. ABD de düzenli diyaliz tedavisine giren hastaların %40 ını DM ye bağlı SDBY oluşturmaktadır. Ülkemizde de Türk Nefroloji Derneği 2005 verilerine göre diyaliz hastaları arasında DM, %25,3 ile SDBY nedenleri arasında birinci sırada yer almaktadır (23). Son on yılda diyalize giren diyabetik hasta sayısı %61 artmış ve 2010 yılında iki katına çıkacağı öngörülmektedir. Son on yılda DNP insidansı iki katına çıkmış olup; bu özellikle tip 2 DM artışından kaynaklanmaktadır. Gelişmiş ülkelerde, yeni tanı almış SDBY içindeki DNP oranı ise %30-40 arasındadır (24-26). Genel olarak yirmi yıllık DM de izlem sonu DNP görülme sıklığının, tip 1 DM de %30-40, tip 2 DM de %15-25 olduğu bildirilmektedir (19). Genetik yatkınlık, ırk, cinsiyet, diyabetin başlama yaşı, hastalığın süresi ve insülin rezistansı DNP gelişimini etkileyen risk faktörleridir (27). Glisemik kontrol bozukluğu, hipertansiyon, obezite, insülin rezistansı, 5
hiperlipidemi, diyetle yüksek protein alımı, albüminüri varlığı, sigara kullanımı prognozu kötüleştirmektedir (28). Genetik yatkınlığın DNP gelişiminde oldukça önemli rol aldığı düşünülmektedir (29). Genetik yatkınlıkla, hemodinamik ve metabolik faktörler arasındaki karmaşık etkileşim, DNP gelişimini kolaylaştırmaktadır (30). ACE genotipinin de DNP nin ilerlemesinde belirleyici olduğunu bildiren çalışmalar vardır (31). Oksidatif stres artışı ve glisemik kontrolün yeterli olmadığı durumlarda göz, sinir, böbrek gibi glukozun, insülinden bağımsız olarak hücre içine girebildiği dokularda, poliol yolu aktive olur ve AGE yapımı artar. RAS aktivasyonuyla oluşan hemodinamik değişiklikler ile sistemik ve intraglomerüler basınç artar (32). Hemodinamik ve metabolik değişikliklerle birlikte ve/veya bağımsız olarak hücre içi sinyal iletimini aktive eder ve sitokinlerin yapımını uyarır. Sitokinler nefronda yapısal ve fonksiyonel değişikliklerle DNP gelişimine neden olur (Şekil 1) (27). Şekil 1. Diyabetik nefropatinin patogenezi (27) TGF-beta 1: Transforming growth factor beta 1, VEGF: Vascular endothelial growth factor, AGE: Advanced glycation end products, HDM:Hücre dışı matriks 6
Hiperglisemi ile başlayan DNP gelişimi, bir süreçtir ve ilk aşamalarda belirgin bulgu vermeyebilir. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) DNP gelişme sürecini 5 döneme ayırmaktadır: Evre I (Hiperfiltrasyon): Aynı yaştaki kişilere göre GFR %20-40 oranında artmıştır. Be evrede renal plasma akımının %9-14 arttığı gösterilmiştir. Nefronlarda genişleme ve hafif hücre proliferasyonu vardır. Evre II (Sessiz Dönem): GFR de gerileme olmakla birlikte yüksek ve/veya normaldir. Normal glisemik kontrolle bu evre 5-15 yıl sürer. Glomerüler bazal membran (GBM) da kalınlaşma ve mezengiyal hücre ve matrikste artış vardır. Evre III (Mikroalbüminüri): 6-15 yıllık diyabet süresi sonunda gelişebilecek evredir. İdrarla atılan albümin 30-300 mg/gün ve/veya 20-200 mg/dk arasındadır. Bu evrede GFR yılda yaklaşık 1,1 ml/dk azalır. GBM kalınlığı ve interstisyel volüm artışı ne kadar fazla ise GFR deki düşüş o kadar fazladır. Tip 2 DM hastalarının çoğu, tanı konduğunda bu dönemdedir. Histolojik değişimler, glomerüler bazal membran kalınlaşmaları ve mezengial volüm artışı devam etmektedir. Evre IV (Açık Nefropati): >500 mg/gün proteinüri, >300 mg/gün albüminüri olan bu evrede, GFR yılda 10-12 ml/dk azalır. Hastaların çoğunda HT vardır ve bunun varlığı prognozu kötüleştirir. HT şiddeti ile GFR deki kayıp hızlanır. Evre V (SDBY): Hastaların tip 1 DM de %50 si, tip 2 DM de ise %20-30 u, 10 yıl içinde evre IV ten V e geçer. Artık renal replasman tedavisi gerektirir (27). Patogenez Genetik: Ailevi yatkınlık, genetik bir bozukluğun varlığını düşündürmekle birlikte, DNP gelişimiyle ilişkilendirilebilecek bir gen, açıkça gösterilememiştir. Bazı çalışmalar, ACE geni üzerindeki delesyon ile DNP arasındaki ilişkiye dikkat çekmektedir (33). ACE D allelin inserisyon/delesyon (ACEi/D) polimorfizminin ilerleyen böbrek fonksiyon kaybı ile ilgili olduğu düşünülmektedir (34). ACE inhibisyon tedavisi verilse dahi ACE gen polimorfizminin ilerlemede hızlandırıcı olduğu bildirilmektedir (35). Proteinürik 168 tip 2 DM li hastanın 10 yıllık izleminde, DD genotip gösteren hastaların tümünde 10 yıl içinde SDBY geliştiği bildirilmiştir (36). Bazı çalışmalarda ise bu ilişkiler bulunamamıştır. Son senelerde, apolipoprotein E ve ACEi/D ve lipoprotein lipaz Hind III polimorfizm ve overt DNP ilişkileri araştırılmakta ve ancak özel alt gruplarda genetik ilişki gösterilebilmiştir (37). Genetik yatkınlığın yanında, hiperglisemi ve HT nin rolü giderek daha iyi anlaşılmaktadır. Birçok 7
çalışmada, sistemik HT nin kontrol edilmesiyle proteinürinin azaldığı ve böbrek yetersizliği gelişiminin yavaşladığı gösterilmiştir (38). Hiperglisemi: Kronik hiperglisemik tablo olan DM nin, komplikasyonlarının gelişmesinde, glukozun aracılık ettiği birçok metabolik işlem rol oynamaktadır. DNP gelişiminde hiperglisemiye ilişkin ortaya atılmış hipotezler vardır. Birbirinden bağımsız olduğu düşünülen bu metabolik yolların, aslında sürekli karşılıklı etkileşim içinde bulunduğu ve birlikte aktive oldukları son zamanlarda anlaşılmıştır. Özellikle glukozun etkisiyle artan ROÜ nün, bu metabolik yolların aktivasyonu için gerekli olan hücre içi yaygın haber ileti sisteminde rol oynadığı düşünülmektedir (39). a-nonenzimatik glikozillenme ve ileri glikasyon ürünleri (AGE): Hiperglisemi, amino asit ve proteinlerin nonenzimatik glikozillenmesine ve birkaç kimyasal reaksiyon sonrasında Amadori adını alan ürünlerin gelişimine yol açar. İşlemin devamlılığı ve daha ileri işlemlerin devreye girmesi, hipergliseminin düzeyine bağlıdır. Bu nedenle, Amadori ürünlerinin kan düzeyi, son 2-3 aydaki glisemik kontrol hakkında fikir verir. HbA1c, bu amaçla kullanılan bir Amadori ürünüdür. Bu ürünlerin oluşumundan sonraki bir dizi yoğunlaştırma işlemi sonunda, AGE (pentosidine, pyralline, carboxymetil-lysin) oluşmaktadır (40). Normal yaşlanma sürecinde ve kronik renal hastalarda da AGE ler oluşur ve yaşa bağlı damarsal değişikliklerin gelişimini etkilemektedir. DM de oluşumu ileri derecede artan AGE mikrovasküler komplikasyonların oluşmasında önemli bir rol oynamaktadır (41). Bu etkilerini farklı mekanizmalarla gösterirler: Hücre dışı matriks (HDM) bağlantılarını etkileyerek sinyal iletilerini bozarlar, Kollajen gibi yapısal proteinlere, geri dönüşümsüz şekilde bağlanarak GBM ve matriks bileşenlerini bozarlar, Adezyon yapan matriks proteinlerini etkileyerek kapiller geçirgenliği artırır; makrofaj ve mezengiyal hücrelere de bağlanarak bölgeye monositlerin göçüne, matriks artışına ve NO yapımının engellenmesine neden olurlar, Kendine özgü reseptörlere (RAGE - receptors for AGE) bağlanır ve nükleer faktörkappa beta (NF-kB) yı aktive ederler. Böylelikle çok sayıda sitokin, kimokin ve vazoaktif hormon üretimini uyarırlar, Ayrıca glukoz, fruktoz ve ara ürünler, hedef dokudaki proteinlerin fonksiyonlarını doğrudan etkileyebilirler. Doğrudan proteinlere bağlanarak ya da RAGE ile etkilerini yapan AGE, temizlenmesinde RAGE dışındaki reseptörler daha çok AGE rol almaktadır. 8
Hayvan çalışmalarında, aminoguanidin verildiğinde, AGE oluşumunun ve albüminüri gelişiminin azaldığı, mezengiyal genişlemede iyileşme sağlandığı gözlenmiştir. Ancak, GBM kalınlaşmasındaki azalma hayvanların hepsinde gösterilememiştir (42). Aminoguanidin, AGE nin oluşumunu önlemekte ve onun diğer etkilerini de inhibe etmektedir. Örneğin AGE tarafından yapımı baskılanan NOS un oluşumunu arttırır (41). NOS ile vazodilatasyonda önemli rol alan NO yapımı uyarılır. Ayrıca AGE lerin, proteinlere bağlanmasını engelleyen phenacylthiazolium bromide ile DNP deki renal hasarın gerilediği, vasküler kompliyansın yeniden sağlandığı gösterilmiştir (43). b-sorbitol ve poliol yolu: Gözdeki lens ve retina ile böbreklerde, glukozun dokuya geçişi insülinden bağımsız gerçekleşir fazla olan glukoz sorbitole indirgenir (27). Bu işlem, NADPH bağımlı olarak, aldoz redüktaz enzimi tarafından katalize edilir. Hiperglisemide, NADPH tüketimi ve sorbitol yapımı artar, hücre içi miyoinositol azalır. Bunlardan dolayı Na + -K + -ATP az aktivitesi düşer. Hücre içi Na + atılamadığından, osmolalite artar ve hücre içine su çekilerek ödem gelişir. NADPH, hem serbest radikallerin uzaklaştırılmasında görev alan GSH oluşumunda, hem de NO sentezi için gereklidir. Böbrek mezengiyum hücrelerinde yapımı artan PKC ve TGF-β, DNP patogenezinde önemli rol almaktadır. Aldoz redüktaz enzimi inhibe edildiğinde, her ikisinin de yapımı azalmaktadır. Aldoz redüktaz inhibisyonununun, tip 1 DM de renal fonksiyonlar üzerinde olumlu etkileri gözlenmiştir (44,45). Ayrıca diyabetik katarakt oluşumunda ve nöropatide de oldukça ümit verici sonuçlar alınmıştır (42). c-protein kinaz c (PKC) aktivasyonu: Hücre kültür deneylerinde, glukozun hücresel hipertrofiyi, HDM sentezini ve TGF-β1 yapımını artırdığı gösterilmiştir (8). Bu etki glukozun PKC yi aktive etmesine bağlanmıştır. Serin treonin kinaz grubu olarak bilinen PKC, vücutta yaygın olarak bulunan bir enzimdir. Kinazlar vasküler permeabiliteyi, sellüler proliferasyonu ve vasküler kontraktiliteyi artırır. Diyabetik hayvanlarda gözde retina, aorta, kalp ve glomerülde arttığı gözlenmiştir (44). Radyoaktif glukoz ile yapılan incelemelerde, glikolitik yolun ara ürünlerinin, PKC nin en önemli endojen aktivatörü olan diacylglyserol (DAG) yapısına katıldığı gösterilmiştir (46). Hiperglisemiyle oluşan bu ara ürünlerdeki artış, DAG oluşumuna ve PKC aktivasyonuna neden olmaktadır. Ayrıca Anjiyotensin II (A II), vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) ve endotelin de DAG oluşumunu artırmaktadır (47). Protein kinaz C, kan akımının düzenlenmesi, hücresel farklılaşma, sitokin oluşumu gibi birçok vasküler fonksiyonlarda rol alır. Deneysel DNP çalışmalarında, PKC nin inhibe edilmesi ile GFR ve albüminüri, TGF-β1 ve HDM artışında azalma gösterilmiştir (48). Son 9
çalışmalarda, hem ACE inhibitörü olan ramiprilin hem de AGE inhibitörü olan aminoguanidinin, diyabete bağlı PKC aktivasyonunu önlediği gösterilmiştir (49). Bulgular PKC aktivasyonunun DNP patogenezinde önemli rol aldığını düşündürmektedir. d-oksidatif stres: Oksidatif stresin diyabetik komplikasyonların gelişmesinde anahtar rol oynadığına inanılmaktadır (39,50). Ancak, oksidatif stresin hiperglisemi ile komplikasyonlar arasında erken bir bağlantı mı oluşturduğu yoksa, diğer patojenik mekanizmalar sonucunda mı geliştiği netlik kazanmamıştır. Yakın tarihli çalışmalarda, ROÜ oluşumunun inhibe edilmesiyle PKC ve NF-kB aktivasyonu ve AGE oluşumunun engellendiği gösterilmiştir (51). Bu da ROÜ ile diğer metabolik yolların karşılıklı etkileşim içinde olduklarını düşündürmektedir. e-hemodinami: DNP gelişiminin en erken belirtisinin hiperfiltrasyon olduğu bildirilmektedir. Hiperfiltrasyon, yüksek kan glukoz değerinin aracılık ettiği ve vazoaktif hormonların neden olduğu afferent arteriol dilatasyonu ve kısmen de pre-postglomerüler kapiller koordinasyonun bozulmasından kaynaklanmaktadır. Afferent arteriol dilatasyonu ile glomerüle gelen kan artar ve glomerül içi hidrostatik basınç yükselir. Bu hemodinamik devingenlik tip 1 DM de daha belirgindir (32). Düşük proteinli diyet, HT kontrolü, efferent arteriol konstriksiyonunu azaltan ACEi ve ARB grubu ilaçlar ile glomerül içi basınç düşürüldüğünde, proteinüri azalmakta ve renal hasar gelişimi yavaşlamaktadır (52). f-renin anjiotensin aldosteron sistemi: Birçok çalışmada, özellikle RAS inhibisyonunun renal koruyuculuk açısından önemi belirtilmektedir (53). Deneysel diyabetik çalışmalarda, artmış glomerül içi basıncı da içeren bir dizi hemodinamik anormallik bulunmuş ve bundan özellikle A II etki mekanizmaları sorumlu tutulmaktadır. DM de hem glomerülde hemde insterstisyumda lokal RAS aktivasyonunda artış olduğu ve RAS ı kesintiye uğratan ilaçların DNP gelişimine olumlu etkilerinin olduğuna ilişkin kanıtlar giderek artmaktadır (47). RAS inhibitörleri, mikroalbüminüri evresindeki progresyonu, hem tip 1 hem tip 2 DM de yavaşlatmaktadır. RAS baskılayıcılarla, PKC aktivasyonu engellenmekte, renal TGF-β1 oluşumu azalmakta ve filtrasyon membranında azalmış olan nefrin proteini tekrar yerine konmaktadır (54). Vazoaktif faktörlerin DNP gelişimndeki etkisine ilişkin çalışmalar sürdürülmektedir. Güçlü bir vazokonstriktör olan endotelinin, diyabetlilerdeki nefropati gelişimindeki rolü tartışmalıdır. Endotelin inhibitörleri ile yapılan bazı çalışmalarda renal koruyucu etkileri gözlenirken, bazılarında etkili bulunamamıştır (55,56). Bu farklılık endotelinin DNP gelişiminde merkezi rolünün olmadığını düşündürmektedir. Ancak, genelde dikkatler 10
vazokonstriktör faktörlere çevrilmiştir. Glomerüler vazomotor tonus, vazokonstriktörlerin yanında, bradikinin ve atrial natriüretik peptid gibi vazodilatörlerin de etkisindedir. Son dönemlerde ACE ve nötral endopeptidaz gibi enzimler üzerine etkili yeni bileşikler bulunmuştur. Bunların bazıları hem ACE hem nötral endopeptidaz inhibisyonu yapmakta ve A II yapımını ve bradikininin yıkımını azaltmaktadır. DNP yi de içeren farklı nedenlere bağlı böbrek hastalıklarında bu bileşiklerin koruyuculuğu gözlenmiştir (57). g-sitokinler: Arteriosklerozun, vasküler duvar hücre ve moleküllerinin, yavaş ilerleyen inflamatuar olaylar zinciri olarak değerlendirilmesi nedeniyle araştırmalar, sitokin adı verilen ve suda çözülebilen büyüme faktörleri üzerine yoğunlaşmaktatır. Bu moleküllerin uygunsuz sentezlerinin, mikrovasküler hastalıkların gelişmesinde merkezi bir rol oynadıkları bildirilmektedir (8). En önemli sitokin, birçok değişik fibrotik olayın patogenezinden sorumlu olan TGF-β1 dir. Normal fonksiyonu, doku onarımı ile ilgili fizyolojik işlevlerin düzenlenmesidir. Hücrelerdeki matriks protein sentezini uyarır, hücre farklılaşması ve proliferasyonunu etkiler. Hipergliseminin, TGF-β1 sentezini uyararak kollajen yapımını artırdığı belirlenmiştir (8). Tip IV kollajen özellikle fibrozis oluşumunda önemlidir. Fazla TGF-β1 sentezleyecek şekilde genetik değişikliğe uğratılmış sıçanlarla yapılan çalışmalarda, bu madde ile mezengiyal matriks artışı ve glomerüloskleroz arasındaki ilişki gösterilmiştir. TGF-β1 i nötralize edecek antikorun uzun süreli uygulanması ile diyabetik sıçanlarda HDM artışı önlenmesi ve renal yetmezliğe götürecek GFR azalmasının geciktirilmesine karşın albüminüride gerileme olmamıştır (58). Connective tissue growth factor, VEGF, epidermal growth faktör gibi diğer bazı sitokinlerin de DNP gelişiminde rol aldığı düşünülmektedir. Mekanik etki ve TGF- β1 tarafından uyarılan ve özellikle tip I kollajen sentezine yol açan connective tissue growth faktörün diyabetik böbrekte 10 kat arttığı bildirilmiştir (59). Buna karşı, epidermal growth faktörün glomerüler hasarın onarımı ile ilişkisinin olduğu bildirilmektedir (46). Patoloji Diyabetik böbrek hastalığında, hem mikoanjiyopatik hem makroanjiyopatik değişiklikler vardır. Böbreğin glomerüler, tübüler, arteryel ve interstisyel dokularının hepsi etkilenebilmektedir. Glomerüllerin ultrastriktürü, hastalığın başında normaldir. Ortalama iki yıl sonra GBM kalınlaşır ve mezengial matriks genişler. DNP de en sık gözlenen diffüz glomerüler lezyonlardır. Tip 1 de %90, tip 2 de %25-50 oranında gelişmektedir ve diyabete özgü olmayan bu durum matriks genişlemesine bağlıdır. Diyabete özgü bulgu olan 11
interkapiller glomerüloskleroz (Kimmelstiel-Wilson) ise %20-40 oranında görülür. Diyabetin genelde geç dönemlerinde ortaya çıkan, PAS ile pozitif boyanan aselüler nodüler lezyonlardır (60). Diyabete özgü olmayan bir diğer lezyon ise bowman kapsülünde yer alan yuvarlak, homojen, eozinofilik yapıdaki fibrin cap tır. Diyabette arteriyel lezyonlar da sık gelişir ve hem afferent hem de efferent arteriyolde kalınlaşma görülür. Efferent arteriol tutulumu diyabete özgü olup bazen ilk bulgu olabilir (27). Diyabetik renal etkilenmenin başlangıcında, glomeüler ve tübüler dilatasyonla böbrekler hipertrofiktir. İlerleyen dönemde tübüler atrofi ve tübüler bazal membranlarda kalınlaşma olur. İnterstisyel fibrozis gelişir ve bu mezengiyal proliferasyon derecesinden bağımsızdır. Ayrıca, lokal iskemi de fibrozis gelişimini etkiler (61). Diyabetlilerde, sık gelişebilen assendan üriner infeksiyonlar da DNP sürecine katkıda bulunabilir. Papiller nekroz da diyabette görülebilir, ancak diyabete özgü değildir. RENİN ANJİOTENSİN ALDOSTERON SİSTEMİ Bir endokrin sistem olan RAS, vücutta değişik birçok homeostatik olaya karışır. Özellikle kan basıncı düzenlenmesinde, su ve elektrolit dengesinin sağlanmasında önemli rol oynar (62). Böbrekte, jukstaglomerüler apparatustan salınan renin, karaciğerde yapılan anjiotensinojeni, anjiotensinojen I (A I) e dönüştürür. A I ise ACE tarafından ağırlıklı olarak akciğerde A II ye dönüştürülür. A I ve A II den değişik proteolitik enzim sistemleriyle, A III ve birçok aminopeptit açığa çıkarır (63). Renin İlk kez 1898 de Tigrstedt tarafından keşfedilen renin, 36 kda ağırlığında bir aspartil proteazdır ve anjiotensinojenden, A I oluşmasında rol alır. Renin, afferent arterioldeki özelleşmiş vasküler düz kas hücreleri tarafından yapılır. Renal kan akımında azalma, renal sempatik uyarı, makula densaya ulaşan sıvı-na azalması ve hormonal değişiklikler reninin salınımını uyarır (63). Anjiotensinojen Anjiotensinojen 60 kda ağırlığında olup büyük oranda karaciğer tarafından yapılır. Beyin, böbrek, kalp, akciğer, yağ dokusu ve fibroblastlar tarafından da sentezlenir. Anjiotensinojen, renin aracılığı ile A I e dönüşür. A I in biyolojik aktivitesi sınırlıdır. %90 ı 12
dolaşımla ulaştığı akciğerdeki ACE aracılığı ile yüksek biyoaktiviteli A II ye dönüşür (63). (Şekil 2) Anjiotensin Konverting Enzim Bir metalloproteinaz olan ACE, A I den A II oluşumunu sağlar. Bradikinin gibi diğer peptitlerin inaktivasyonunda rol oynar. Bu yüzden ACE inhibisyonu yalnızca A II oluşumunu azaltmaz, bradikinin ve neurokinin gibi diğer vazodilatör peptitlerin yıkımını da önler (63). Bu nedenle, ACE inhibisyonu ile öksürüğün oluşmasından, kinin artışı sorumlu tutulmaktadır. Bradikinin artışı ile NO salınımı oluşmaktadır (64). Şekil 2. Sistemik renin anjiotensin aldosteron aktivasyonu (46) t- PA: Tissue plasminojen aktivatör, ACE: Anjiotensin konverting enzim, AT 1, 2, x: Anjiotensin tip 1, 2, x reseptör 13
Doku Renin Anjiotensin Sistemi Vücudun hemen bütün dokularında RAS ın tüm unsurlarının bulunduğu, depo edildiği ve salgılandığı saptanmıştır. Doku RAS ı etkilerini otokrin, parakrin veya intrakrin olarak gösterir. Lokal doku RAS ı sistemik RAS tan etkilenir ve onu destekler, fakat bağımsız olarak görev yapar. RAS ın %10 unu klasik olarak bilinen dolaşım sistemindeki %80-90 ını dokulardaki lokal RAS oluşturmaktadır (65). Böbrekler, damar endoteli, sürrenal bez, beyin, kalp ve yağ dokularında renin, anjiotensinojen gibi RAS ın temel elemanları bulunmuştur. Sistemik RAS ın inhibisyonu ile lokal A II oluşumunun yeterince engellenememesinden dolayı doku RAS inhibisyonu önem kazanmıştır. Bu nedenle doku hasarlanması ve DNP patogenezinde A II nin temel rol oynuyor olması, lokal RAS inhibisyonunun önemini artırmaktadır. Anjiotensin II ve Reseptörleri İnsanda 4 tip A II reseptörü bilinmektedir (66). A II nin iyi tanımlanmış A II-tip 1 (AT 1) ve A II-tip 2 (AT2) olarak adlandırılan iki reseptörü vardır. Bu reseptörleri kodlayan genler farklı kromozomlarda yer alır. G protein ailesinden olan bu iki reseptörün uyarılması, birbirinden farklı etkilerin ortaya çıkmasına yol açar (67,68). A II hemodinamik, endokrin ve mitojenik etkilerini AT 1 üzerinden gösterir (67). AT 2 reseptör aktivasyonu, AT 1 üzerinden gerçekleşen olayları antagonize ediyor görünmekle birlikte; AT 2 reseptörünün insanlardaki tüm fonksiyonları ve önemi henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. AT 1 reseptörünün fonksiyonları: Vazokonstriksiyon, Aldosteron salgılanması, Böbrek tübüler Na + tutulumu, Kalp ve damar düz kas hücrelerinde hipertrofi, Miyokard ve vasküler duvarda fibrozis, Fibroblastlarda hiperplazi, Miyokarda sitotoksik etki, Endotelin sekresyonunun artması, Vasopressin ve antidiüretik hormonun (ADH) salınımının artması, Sempatik adrenerjik aktivasyonun kolaylaşması, Süperoksit oluşumlarının artması, Plazminojen Aktivatör İnhibitör-I (PAI-I) artışı, 14
Makrofajlarda kolesterol sentezi, Tuz ve yiyeceğe karşı iştah artışı olarak özetlenebilir (63). Fetal mezenkimal dokular ile sürrenal, uterus, beyin, kalp, glomerul, afferent arteriol ve endotel hücrelerinde AT 1 reseptör sıklığının %20 si oranında bulunan, AT 2 reseptörlerinin etkileri daha az bilinmektedir. Uyarılması ile vazodilatasyon oluştuğu, AT 1 in tersine endotel, damar düz kas hücreleri ve birçok dokuda büyümenin inhibe olduğu gösterilmiştir. Bu reseptörlerin apoptozis ile ilişkisi bildirilmiştir. Sıçan ve farelerde AT 3 denilen reseptörler bulunmuştur. AT 3 ve AT 4 reseptörleri ile ilgili araştırmalar devam etmektedir (63). RENİN ANJİOTENSİN SİSTEMİ VE DİYABETİK NEFROPATİ Deneysel hayvan modellerindeki renal dokuda RAS komponentlerinin artmış olduğu gösterilmiştir (69). A II nin renal doku üzerindeki etkisi, KB ve glomerüler geçirgenlikte artışla hem hemodinamik hem de hormonal ve metabolik yolla gerçekleşmektedir. Bu etkiler arasında oksidatif stres, büyüme faktörleri, TGF-β1, fibroblast ve fibroziste artış, monosit aktivasyonu önemli yer alır (70). Anjiotensin II nin Sistemik ve Glomerüler Hemodinamik Etkileri Sistemik KB artışının DNP gelişimindeki rolü oldukça önemlidir (71). A II, sistemik dolaşımın yanısıra, glomerül içi mikrodolaşımda ve glomerül içi basıncın ayarlanmasında anahtar rol oynar. DM de, mikrovasküler kan dolaşımının otoregülasyonu bozulur ve glomerüler basınç artar (72). Sıklıkla gelişen sistemik HT ye karşın afferent arteriol duvar tonusunun bozulması ile basınç doğrudan glomerül içine yansır. Bu nedenle diyabetin başlangıcında renal plazma akımının ve GFR nin artışına yol açar. Artmış renal RAS aktivitesi efferent arteriol vazokonstriksiyonu ile glomerül içi basıncını daha da yükseltir (73). Yükselen basınç, glomerül kapiller duvardan ultrafiltrat, solüt ve albümin geçişini hızlandırarak tubul iş yükünü de artırır. DNP nin en bilinen belirtisi olan mikroalbüminüri ve proteinürinin gelişmesine neden olur (74). Ultrafiltrata geçişi artan albümin antijenik yapısı nedeniyle zamanla glomerüler ve tübüler bozulmayı hızlandırmaktadır. Bu nedenle kardiyovasküler hastalık gelişiminde risk faktörü oluşturmaktadır. Anjiotensin II nin Hemodinamik Yol Dışındaki Etkileri Son zamanlarda A II aktivite artışının hemodinami dışında etkileri gözlenmiştir: Birçok hücre tipinde doku hasarı ve onarımı ile ilgili mekanizmalara etki eder, 15
İnflamasyon, fibrozis gibi olayları tetikler, Glomerüllerin makromoleküllere olan geçirgenliğini doğrudan etkileyebilir, Güçlü prooksidan ve protrombotik etki ile doku hasarı ve fibrozisi daha da artırır (64). Proteinüri ve Angiotensin II Mikroalbüminüri, DNP nin önemli bir bulgusudur. Erken dönemdeki üriner albümin atılımı (ÜAA) ve glomerül içi basınç değişikliklerinden etkilenmekte ve geriye döndürülebilmektedir (46). GBM geçirgenliği, molekül boyutları ve elektrik yükü ile ilişkilidir. Bu seçici geçirgenlik özelliğindeki bozulmalar, makromoleküllerin glomerüllerden tubulusa geçişine neden olur (32). Çalışmalarda proteinürinin başlangıcında A II nin rol aldığı iki önemli mekanizma olan, glomerül içi basınç artışı ve makromoleküllere karşı geçirgenlik artışının, ileri dönemde yapısal değişiklik ve hasarlanmanın da etkisiyle daha ağır protein kaybına neden olduğu gösterilmiştir (47). Deneysel hayvan modellerinde, bir ARB olan losartan ın AT 1 reseptörünü bloke ederek, glomerüler geçirgenlikteki bozulmayı düzelttiği gösterilmiştir (75). Büyüme Faktörü Olarak Angiotensin II Birçok hücre tipi için A II bir büyüme faktörü olarak görev almaktadır. Glomerüler mezengiyal hücreler, kalp hücreleri ve damar düz kas hücreleri bunlar arasındadır (47). Damar ve mezengiyum hücreleri için mitojen etki gösteren büyüme faktörlerinin de sentez ve salınımını uyarır. Bu da mezengiyal hücre proliferasyonuna ve mezengiyal matriks yapım artışı ve ekspansiyonuna neden olur. Böylece glomerül filtrasyon yüzeyi daralır. Ayrıca AT 1 reseptör aracılığı ile VEGF yapımını tetikleyerek yeni damar oluşumunu ve kapiller kaçışı artırır (76). Renal İnflamasyon, Oksidatif Stres ve Angiotensin II Angiotensinojen II nin renal ve kardiyovasküler sistemlerde oksidatif stresi uyardığı gösterilmiştir (77). AT 1 reseptörü aracılığı ile damar düz kas hücresi ve glomerüler mezengiyal hücrelerde NADPH yapımını artırır. Bu da, yüksek aktiviteye sahip bir oksijen molekülü olan süperoksitin oluşmasına neden olur (77). Proinflamatuvar olan süperoksit, lokal doku zedelenmesine yol açar. NO ile reaksiyona girerek bir başka toksik radikal olan 16
ONOO - ye dönüştürür ve NO nun fonksiyonu bozulur. Güçlü bir vazodilatör olan ve glomerüler hemodinami regülasyonunda önemli rol alan NO nun antiproliferatif ve antitrombotik etkileri de azalır (78). Oksidatif stres, hücre duvarındaki lipidlerde yapısal bozukluklara yol açar ve lipid peroksidasyon ürünlerinin oluşmasına neden olur. Bunlardan biri olan malondialdehidin özellikle diyabete bağlı glomerüler hasarlanmada arttığı gösterilmiş ve bu nedenle diyabetik bozulma göstergesi olarak kullanılmaktadır (79,80). Sağlıklı bireylerde, meydana gelen ROÜ, antioksidan sistemle dokudan uzaklaştırılır. Diyabetli hastalarda, oksidatif stresin artması nedeniyle kullanımı artan antioksidanlar kapasite yetersiz kalmaktadır (81). Renal Matriks Sentezi, Fibrozis ve Angiotensin II Renal fibrozis gelişiminde anahtar role sahip bir sitokin olan TGF- β1 in yapımı A II ile uyarılır (82). TGF-β1, matriks proteinlerindeki artışı dengeleyen metalloproteinazları inhibe ederek, matriks protein sentezinin artışına neden olur. Ayrıca podositlerde azalma, tübüler atrofi ve kapiller endotel hücre kaybına neden olur (83). Glukoz artışı ve hemodinamik stresle artan TGF-β1, mezengiyal matriks artışını tetikler. TGF-β1, tip IV kollajen yapımını artırarak fibrozis gelişmesine neden olur. Diyabetlilerin, renal dokularında ve serumlarında TGF-β1 in arttığı gösterilmiştir (82). Bu durum DM nin proinflamatuvar bir süreç olduğunu düşündürmektedir. A II, oluşumunun inhibe edilmesi ile hem ÜAA nın hem de TGF-β1 azalması, A II nin proinflamasyonda önemli rol oynadığını göstermektedir (84). Bu bulgular, A II nin hemodinamik ve hemodinamik olmayan yolla DNP gelişiminde asıl rolü oynadığını, inflamatuar bir sürecin aktivasyonu ile süregen renal hasarlanmaya ve sonuçta fibrozise yol açtığını göstermektedir. Bu süreçle gelişen ateroskleroz, diyabete bağlı organ komplikasyonlarının temelini oluşturmaktadır. Özetle, diyabetik hastalarda oluşan uygunsuz RAS aktivasyonu DNP gelişiminde başlıca rol oynamaktadır. Bu nedenle, RAS inhibisyonunun DNP gelişimini yavaşlatacağı görüşü geniş kabul görmektedir (9,11,85). ANJİOTENSİN II TİP 1 RESEPTÖR BLOKERLERİ (ARB) Aşağıdaki nedenlerden ötürü Angiotensin II nin etkilerini baskılamak amacıyla ACE inhibisyonu dışında alternatif ilaç arayışlarına yönelinmiştir (86). ACE dışında enzimlerin de rol alması nedeniyle, A II oluşumunun tam olarak inhibe edilememesi ve aldosteron kaçağının gerçekleşmesi, 17
ACE inhibitörlerinin doku afinitelerindeki farklılıktan dolayı, lokal RAS baskılanmasının yeterli olamaması, ACE inhibisyonu ile oluşan aşırı bradikininin, beta 2 reseptörleri aracılığıyla noradrenalin salınımında artışa neden olması, Yıkımı engellenen bradikinin nedeniyle inatçı kuru öksürük gelişmesi. Anjiotensin, renal ve kardivasküler etkilerinin büyük çoğunluğunu AT 1 reseptörleri aracılığı ile gerçekleştirmektedir. ARB ler, AT 1 reseptörlerini bloke ederek hem sistemik hemde lokal A II nin etkilerini azaltırlar (87). ARB lerin, RAS aktivitesini düşürücü etkilerinin yanısıra sempatolitik ve aldosteronu dolaylı inhibe edici özellikleri ile natriüretik etkileri de vardır. Bu nedenle diyabetlilerdeki sempatik aktivasyon ve sodyum tutulum artışını azaltmada yararlı etki yapmaktadır (88). AT 1 reseptör blokajı, A II nin dolaşımda artmasına ve AT 2 ile diğer reseptörlere bağlanmasına neden olur. Bu nedenle AT 1 in zıt etkilerine sahip olan AT 2 reseptörlerinin aşırı uyarımının uzun vadede apoptozis aracılığı ile yol açabileceği etkilerinin tartışılmasına neden olmaktadır. Anjiotensin reseptör blokerlerin ilk bulunan üyesi losartan olup; şu anda 10 a yakın molekül vardır. Irbesartan, candesartan, valsartan, telmisartan diğer AT 1 blokerlerinden bazılarıdır. Irbesartan, kompetitif, özgün AT 1 reseptör blokeridir. Ağız yoluyla alındıktan 1,5-2 saat sonra serumda en yüksek konsantrasyona erişir. Biyoyararlanımı %60-80 kadardır. %80 karaciğerde, %20 böbrekte metabolize olur. Günlük doz 150-300 mg dır. Irbesartan ve diğer AT 1 blokerleri ile yapılan çalışmalarda, insanlardaki renal koruyucu özelliklerinin, KB düşürücü etkilerinden bağımsız olarak da gerçekleştiği anlaşılmıştır (89,90). Yine losartan ile yapılan çalışmada da renal koruyucu sonuçlar elde edilmiştir (53). ARB lerin deneysel diyabetik hayvan modellerinde oksidatif stresi ve albüminüriyi anlamlı derecede azalttıkları da gösterilmiştir (11,91). L-KARNİTİN VE DİYABET Karnitin ATP üretiminde kullanılan uzun zincirli yağ asitlerinin dış mitokondriumdan iç mitokondriye geçişinde taşıyıcıdır. İnsan vücudunda bulunan karnitin, ya diyetle alınır ya da organizma tarafından sentez edilir. Organizmadaki karnitinin %95 i iskelet kaslarında ve kalpte, %1 i ekstrasellüler sıvıda ve %4 ü ise başlıca karaciğer ve böbrek olmak üzere diğer dokularda bulunmaktadır (92). Endojen karnitin, organizmada başlıca karaciğer, az miktarda böbrek ve beyinde iki esansiyel aminoasit olan lizin ve metiyoninden sentezlenmektedir (93). Böbrekte metabolize olan karnitin insanlarda, esas olarak idrar yoluyla atılmaktadır. Serbest 18
karnitin böbreklerde reabsorbe olurken, açil karnitin tübüllerle sekrete edilir (94). Yağ asitlerinin metabolize olabilmesi için karnitinin taşıyıcılığı gereklidir. Uzun zincirli yağ asitlerinin beta oksidasyonu için, iç mitokondri membranına penetrasyonda önemli bir kofaktördür. Beta oksidasyon sonucunda açığa çıkan asetil koenzim A lar, sitrik asit siklusuna girerek enerji oluşumunda görev alır (95). Yapılan araştırmalarda, karnitin in perfüze kalbi oksidatif strese karşı koruduğunu gözlenmiştir (96). Ayrıca, LC nin kardiyovasküler sistemde serbest oksijen radikallerini azalttığı ve lipid peroksidasyonunu önlediği, kardiyak endotel hücre membranlarını Fe +2 aracılı peroksidasyona karşı koruduğu gösterilmiştir (97,98). Bu çalışmalar sonucunda LC nin, ATP üretimini artırarak hücre membran stabilizasyonunu artırdığı ve oksidatif stresi engellediği bildirilmektedir (99). Ratlara verilen karnitinin, hem makroskobik hem de mikroskobik vasküler lezyonların gelişimini önlediği bildirilmiştir (96). Ayrıca, karbonhidrat metabolizması sonucunda oluşan pirüvik astin, laktik asite dönüşünü engelleyerek, son derece toksik olan laktik asidozun önlenmesine yardımcı olmaktadır. Karnitin, açil guplarını bağlayarak, mitokondrinin zarında ATP/ADP değişimini de dolaylı yoldan kontrol etmektedir. Endotel hücrelerinde glutatyon (GSH) sentezinde kofaktör olan NADPH miktarının da karnitin kullanımıyla arttığı gösterilmiştir (100). Hiperglisemiyle, hücre içinde Ca +2 nin arttığı ve ATP konsantrasyonunun azaldığı, gliseminin düzeltilmesi ve/veya kalsiyum kanal blokerleri ile Ca +2 artışının gerilediği, ATP nin düzeldiği ve doku bozulmalarının azaldığı gözlenmiştir. Bu durum, ATP pompa aktivitesinin azalması ile artan hücre içi Ca +2 ve hücre membranındaki lipit peroksidasyonunun doku bozulmasını hızlandırdığını düşündürmektedir. Ayrıca diyabetteki doku bozulmalarının, ATP düşüşüne bağlı yetersiz oksidasyonla ilişkili olabileceği bildirilmektedir (101). Deneysel DM çalışmalarında, Na/K ATPaz ve Ca/Na ATPaz pompalarında bozukluk, doku ve hücrelerde yağ asitleri ve acil Ko A artışı, ATP nin azaldığı gözlenmiştir (102). Yüksek doz karnitin ile DM oluşturulan ratlarda kalp kas hücresinin düşük ATP konsantrasyonunun arttığı, fonksiyonlarının düzeldiği bildirilmiştir (103). ATP üretiminde önemli rol alan karnitin, üremideki ATP ase inhibisyonunu da düzeltebilmekte ve eritrosit hücre duvarındaki peroksidasyon ve ROÜ oluşumu azaltarak hücrelerin yıkımını ve anemi gelişimini azaltmaktadır (104,105). Bunların yanısıra, iyonik Fe +2 yi bağlayarak Haber- Weiss reaksiyonuyla oluşan lipid peroksidasyonu azaltıcı etkisi de mevcuttur (106). LC nin bu özellikleri ve oksidatif stresin DNP gelişimine katkısı nedeniyle deneysel DNP de LC tedavisinin etkili olabileceğini düşünmekteyiz. 19
ALFA LİPOİK ASİT VE DİYABET Kimyasal adı 1,2 ditiolan-3-pentanoik asit olan alfa lipoik asit, sekiz karbonlu bir yağ asididir. Tüm prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde bulunur. İnsanda, oksidatif glikoz metabolizmasında ve hücresel enerji üretiminde rol alan bazı mitokondriyal enzimlerin doğal kofaktörüdür (107,108). Enzimlerin açil grubunu bağlayarak, enzimin bir tarafından diğer tarafına transfer edilmesini sağlar. Bu süreç içinde dihidrolipoik aside indirgenir. Dihidrolipoik asid, daha sonra lipomid dehidrogenaz ile tekrar okside olur. İnsanda, lipoik asid genelde proteine bağlı olarak bulunur (109). Ancak, terapötik etki gösteren serbest lipoik asittir. Plazma yarılanma ömrü 30 dakikadır. Esas olarak karaciğerde metabolize olur (110). ALA, hem yağda hem de suda çözünen, oksijen radikallerini etkileyen güçlü bir antioksidandır. ALA nın, hem okside şekli hem de indirgenmiş şekli antioksidan aktivite göstermektedir. Dihidrolipoik asid ise, dihidroaskorbik asidi yeniden askorbik aside çevirebilir ve direkt olarak C vitamininin, indirekt olarak E vitamininin yeniden oluşumunu sağlayabilir. ALA bakır, manganez ve çinko gibi bazı metalleri bağlar ve onlarla stabil kompleksler oluşturur. Bu etkisi ile ağır metal zehirlenmelerinde metal şelatörü olarak kullanılabilmektedir. ALA nın diyabetik sıçanlarda nöropati başlangıcını geciktirdiği ve nöropati gelişiminde önemli rol oynadığı düşünülen lipid peroksidasyonunu azalttığı gözlenmiştir. (111,112). ALA nın, oksidatif stres varlığında aktive olarak insülin direncine neden olan, NF-kB yi inhibe ettiği, AMP ile aktive olan protein kinazı aktive ederek iskelet kasında lipid birikimini azalttığı, insülin direnci gelişmiş iskelet kasında insulin reseptör substrat-1 ve glukoz transporter-4 (GLUT 4) seviyesini ve buna bağlı olarak da glukoz transportunu arttırdığı gösrerilmiştir. Bu özelliklerinden ötürü ALA, insüline bağımlı olan ve olmayan diyabete bağlı bağlı nöropati tedavisinde klinikte kullanılmaya başlanmıştır. Deneysel DM li ratlarda ALA ile oksidatif ürünlerin azalması ve glomerüloskleroz gelişiminin yavaşladığı gözlenmiştir. Güçlü bir antioksidan olan ALA nın bu özellikleri nedeniyle DNP gelişimini önlemede kullanılabileceğini düşünmekteyiz. Ancak diğer antioksidanlarda olduğu gibi prooksidan dozda kullanılmamasına özen gösterilmelidir (113-115). 20
GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışma 2007-2008 yıllarında Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Nefroloji Bilim Dalı, Histoloji Ana Bilim Dalı, Biyokimya Anabilim Dalı ve Deney Hayvanları Laboratuvarı nda gerçekleştirildi. Etik kurul onayı 08.06.2006 tarihinde alındı (Ek 1). ÇALIŞMA GRUPLARI Çalışmada ortalama ağırlıkları 233,5 ± 30,5 gr olan, 3,5-4 aylık, Sprague-Dawley cinsi 98 adet erkek rat kullanıldı. Ratlar Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvarı ndan sağlandı. Sağlıklı grup olarak 6 tanesi ayrıldıktan sonra, kalan 92 rata tip 1 DM oluşturulmak üzere sitrat tampon içerisinde çözülmüş olan streptozosin (STZ) 45 mg/kg intraperitoneal verildi. 48 saat sonra kuyruktan alınan kan glukoz değeri 250 mg/dl olanlar DM kabul edildi. Kan glukozu 250 mg/dl nin altında bulunan 9 rat çalışma dışı bırakıldı ve 3 ü injeksiyon sonrası 24 saat içinde öldü. Kalan 80 rat ağırlıklarına ve glukoz değerlerine göre 7 gruba dengeli olarak dağıtıldı. Deney boyunca kafeslerde 2 şer rat olarak, nem oranı %50-60, 22 ± 1 ºC sıcaklıkta, 12 saat gece 12 saat gündüz ışık periyodu olan ortamda tutuldular. Günlük temizlikleri yapılarak %21 protein içeren rat yemi ve su verildi. Çalışma süresinde, hasta kontrol (HK) grubunda 11, İR grubunda 7, ALA grubunda 6, İR+ALA grubunda 12, İR+LC grubunda 9 rat, 7. grupta (İR+LC+ALA) alınan ratların tümü olmak üzere hiperglisemi komplikasyonuyla öldüler. Grup-I (n = 6): Sağlıklı kontrol grubu = Günlük su ve yem verildi. 21
Grup-II (n = 5): Hasta kontrol grubu = DM oluşturularak hasta kontrol grubu olarak alındı. İçme suyu ve yem dışında herhangi bir şey verilmedi. Grup-III (n = 8): İR grubu = DM oluşturulan ratlara 12 hafta boyunca KB yi düşürmeyen 5 mg/kg irbesartan, 2 şer ml sıvıda çözülerek oral yoldan verildi. Grup-IV (n = 6): ALA grubu = DM oluşturulan bu gruptaki ratlara da 12 hafta boyunca 100 mg/kg dozda ALA, 2 şer ml sıvıda çözülerek oral yoldan verildi. Grup-V (n = 7): İR+ALA grubu = DM oluşturulan bu gruptaki ratlara 12 hafta boyunca 5 mg/kg irbesartan ve 100 mg/kg dozda ALA, 2 şer ml sıvıda çözülerek oral yoldan ayrı olarak verildi. Grup-VI (n = 7): İR+LC = DM oluşturulan bu gruptaki ratlara 12 hafta boyunca 5 mg/kg dozda irbesartan, 2 şer ml sıvıda çözülerek ve LC 150 mg/kg dozda oral solüsyon olarak verildi. İlaç grubundaki ratlara günlük ilaçları hesaplanan dozlarda, insülin enjektörü ile oral olarak tek tek içirildikten sonra su ve yiyecek konusunda serbest bırakıldılar. Her biri ortalama 12 haftalık çalışmanın son günü Harvard metabolik kafese alındılar ve 24 saatlik idrarları toplandı. Santrifüj edildikten sonra idrarlar derin dondurucuda saklandı. İdrar miktarları ve kiloları kaydedildi. Aynı günde, ketamin (60-80mg/kg IM) ve xylazin (5-10mg/kg IM) anestezisi altında intrakardiyak yolla kanları alınan ratlar sakrifiye edildiler. Karın açılarak sağ ve sol böbrekleri çıkarıldı ve %0,9 luk NaCl ile yıkanıp sagital olarak ikiye ayrıldı. Sol yarısı histopatolojik inceleme için formole kondu. Sağ yarısı daha sonra superoksit dismutaz (SOD), GSH ve glutatyon peroksidaz (GPx) çalışılmak üzere önceden hazırlanmış ve kodlanmış alüminyum folyolarla sarılarak 70ºC de saklandı. İntrakardiyak yolla heparinli enjektörlere alınan kanın, 2 ml si aynı gün çalışılmak üzere hemogram ve HbA1c için ayrıldı. Kalan kan örnekleri soğuk santrifüjde çevrilerek plazmaları ayrıldı ve derin dondurucuya konuldu. SOD ÖLÇÜMÜ Ölçümün yapılacağı gün, derin dondurucudan çıkarılan böbrek kortekslerinden eşit ağırlıkta örnekler alındı. Çalışmanın objektif olması için gruplara neler uygulandığı belirtilmeksizin, daha önce kodlanmış olan böbrek dokuları, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Ana Bilim Dalı Laboratuvarı na ulaştırıldı ve inceleme burada gerçekleştirildi. Ksantin+ksantin oksidaz sisteminin ürettiği süperoksit anyonunun yol açtığı nitroblue tetrazolium (NBT) indirgenmesinin inhibisyonu ile SOD aktivitesi tespit edilmektedir (116). 22