SÜT VE SÜT ÜRÜNLERİNDE OKRATOKSİNLER ÖZET

SÜT VE SÜT ÜRÜNLERİNDE OKRATOKSİNLER ÖZET Okratoksinler çeşitli Aspergillus ve Penlcillium türleri tarafından sentezlenen toksik metabolitlerdir. Bunlar içerisinde okratoksin - A (OT-A) en fazla toksik olan okratoksindir. Yapılan araştırmalarda OT-A'nın çeşitli gıdalar ve süt ürünlerinde bulunan en önemli mikotoksinlerden bir, olduğu saptanmıştır. OT- A hayvanlarda böbrek yıkımına, karaciğer nekrozlsi ve enteritise neden olmaktadır. Nefrotoksik özelliği nedeniyle insanlarda görülen Balkan Endemik Nefropatlsinin etmeni olduğu düşünülmektedir. 1. GİRİŞ Mikotoksinler, küflerin salgıladığı ikincil metabolitler olup, insan ve hayvanlarda patolojik veya istenmeyen fizyolojik değişikliklere neden olurlar. Mikotoksikozis ise, mikotoksinlerle kontamine olmuş gıda ve yemlerin tüketilmesiyle ortaya çıkan hastalıklardır. Süt ve süt ürünleri, et, yumurta gibi hayvansal ürünlerin mikotoksinlerle kontaminasyonu ise çoğunlukla mikotoksinlerle kontamine olmuş hayvan yemlerinin tüketilmesinden kaynaklanmaktadır. Tarihte mikotoksinlerle ilgili insan hastalıkları Ortaçağ'a kadar dayanmaktadır. Bazı Avrupa ülkelerinde görülen çavdar zehirlenmesi (Ergotism; St. Anthony ateşi); Rusya'da görülen Gıda Kaynaklı Toksik Lökopenl (Alimentarla Toxic Aleukia, ATA), Japonya da görülen sarı pirinç hastalığı; ayrıca Rye sendromu, Balkan nefropatisi, hepatokarsinoma en fazla karşılaşılan mikotoksikozislerdir. Günümüzde 300 civarında mikotoksin bilinmektedir ve bu mikotoksinlerin çoğu Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium ve Rhizopus gibi küf cinslerince sentezlenmektedirler. Bu konuda yapılan araştırmaların çoğunluğu aflatoksin ve trikotesenler üzerinde yoğunlaşmış; okratoksin (OT), patulin, sitrinin, sterigmatosistin, zearalenon ve sikloplazonik asit gibi ikinci grup mikotoksinlerle ilgili çalışmalar son yıllarda artmıştır. Okratoksin A (OT-A) ve daha az toksik dekloro analoğu olan Okratoksin U (Ol-B) ilk kez 1965 yılında Güney Afrikalı kimyacılar tarafından tanımlanmış ve D.B. Scott tarafından sorgum tanelerinden izole edilen Aspergillus ochraceus K-804 susundan izole edilmiştir. insanlarda Balkan Endemik Nefropatisi (BEN), domuzlarda Danimarka Böbrek Nefropatisi ve ayrıca kümes hayvanlarındaki önemli bir problemin muhtemel kaynağının OT-A olduğu belirlenmiştir. özellikle hububatlar, kuru baklagiller, tahıllar, çeşitli hayvan yemleri ve hayvan

dokuları başta olmak üzere dünyada pek çok gıdada yaygın olarak saptanan OT-A ite ilgili olarak yapılan çalışmalar son yıllarda artmıştır. Türkiye'de ise OT-A ile ilgili tarama çalışmaları sayıca az olmakla beraber, bu çalışmalarda Türkiye'deki gıda ve yemlerdeki OT-A miktarının göz ardı edilmeyecek kadar yüksek olduğu belirlenmiştir. 2. OKRATOKSİN SENTEZLEYEN KÜFLER OT kontaminasyonundan sorumlu olduğu bilinen en önemli küf türleri A.ochraceus ve P.viridicatum'dur. Bu türlerin yanında A.alliaceus, Aalutaceus, A.melleus, A.ostianus, A.petrakii, A.sclerotiorum, A.sulphureus, P.chrysogenum, P.commune, P.cyclopium, P.palitans, P.purpurescens, P.variable ve P.verruculosurrtun daokratoksin sentezlediği belirtilmektedir. Sentezlenen okratoksinin çeşidi ve miktarı, küf türüne ve suşuna bağlı olduğu gibi substratın nem ve besin içeriği, inkübasyon sıcaklığı gibi çevresel faktörlere de bağlıdır 3. OKRATOKSİN'NİN KİMYASAL YAPISI OT-A ve daha az toksik olan OT-B ilk kez 1965 yılında Güney Afrika'lı kimyacılar tarafından tanımlanmıştır. OT'ler, aflatoksinlerin keşfinden sonra tanımlanan mikotoksinler içerisinde en önemli gurubu oluşturmaktadır. OT A'nın kimyasal yapısı Şekil 1'de verilmiştir. Kristal halde renksiz bir bileşik olan OT polar organik çözgenlerde yüksek oranda, suda ise çok az çözünmekte olup, sulu sodyum bikarbonatla erimektedir. OT-A; L-5-fenifalanine karboksil grubuyla bağlanmış, 7-karboksi-5-kloro-8-hidroksi- 3,4-dihidro-3R-metilizokumarin içermektedir. OT-A kristalleri renksiz olmakla birlikte, asit koşullarda yeşil, alkali koşullarda mavi floresans vermektedir. Soğukta etanol içinde stabil olan bu bileşik hububat, gıda, hayvan yemleri ve çeşitli hayvan dokularında sıkça rastlanan ve en fazla toksik olan OT'dir. OT-A'nın dihidroizokumarin kısmına yapısal olarak benzeyen meltein ve 4-hidroksimellein ise A. ochraceus ve diğer suşlardan izole edilmiştir. OT-B, ise daha az toksik bir metabolit olup, C-5 bağında klor içermez. OT-A ve OT- Bnin metil ve etil esterleri A. ochraceus kültürünün minör metabolitleri olarak sentezlenir. OT-A'nın esterlerinin toksisitesi OT-A'nın toksisitesine yakınken, OT-B'nin esterleri toksik değildir.

Şekil 1. Okratoksin A nın kimyasal yapısı. 4. OKRATOKSİN'NIN PATOJENİTE VE TOKSİSITESİ Bir nefrotoksin olan OT-A'nın çeşitli hayvanlarda nefrotoksik etkiler gösterdiği saptanmıştır, özellikle Bulgaristan, Romanya ve Yugoslavya'da insanlarda ölüm oranı yüksek bir böbrek hastalığı olarak bilinen "BEN" ile; İskandinav ülkelerinde OT'nln neden olduğu mikotoksik domuz nefropatlsi arasındaki benzerlikler nedeniyle OT-A'nın insanlarda da endemik hastalıklara neden olduğu düşünülmektedir. OT-A bir nefrotoksin olmakla birlikte hepatotoksik, embriyonik, İmmunotoksik, teratojenik ve karsinojenik etkilere de sahiptir. Nefrotoksik özelliğinden dolayı en çok etkilenen organların başında böbrekler gelmektedir. Ayrıca karaciğer, miyokardiya sistem, gastrointesinal sistem, lenf sistemi, iskelet sistemi, hemaploiteik dokular ve üreme sistemi gibi sistemler de etkilenen dokular arasında yer almaktadır. OT-A'nın karaciğerde hafif dejenerasyona ve ince bağırsakta enteritise neden olduğu, aynı zamanda karbonhidrat metabolizması, protein sentezi ve spesifik olarak tosfoenolipiruvat karboksikinaz ve fenitalanin-trna senteziyle ilgili bazı enzimlerin aktiviteterini de etkilediği bildirilmiştir. BEN ilk kez 1950'lerde Bulgaristan, Romanya ve Yugoslavya'nın bazı bölgelerinde öldürücü kronik bir hastalık olarak ortaya çıkmıştır. Hastalık; böbrek zarında değişiklik, tubular dejenerasyon, intestinal fibrosis ve glameruli hiyalinizasyonu belirtilerini göstermektedir. Domuzlarda görülen endemik nefropati ile BEN arasındaki benzerlikler nedeniyle OT-A'nın BEN etmeni olabileceği düşünülmüş ve toksin endemik nefropati görülen insan topluluklarının bulunduğu yerlerde insan kanı ve hububat örneklerinden izde edilmiştir. Yugoslavya'nın BEN görülen bölgelerinden alınan toplam 1553 gıda örneğinin % 10.3'ünde yüksek miktarda OT-A saptanırken, bu bölgelerdeki insanların %9.8-13.5'inin kanlarında OT- A saptanmıştır.

OT insan sağlığını iki yolla etki altına almaktadır. Birincisi OT üreten küflerle kontamine olmuş gıdanın direk tüketimi (primer mlkotoksikozis), diğeri ise OT ile kontamine olmuş yemlerle beslenen hayvan et ve sütlerinin tüketimidir (sekonder mikotoksikozis). OT ile kontamine olmuş yemlerin tüketilmesi sonucu toksin, hayvanlarda kan, böbrek, karaciğer, kas gibi farklı dokulara dağılmaktadır. OT-A, yağda çözündüğü ve dışarıya salgılanmadığı için özelikle yağlı dokularda birikmekte ve bu şekilde toksin içeren dokunun tüketilmesi ile insana geçmektedir. Bu iki yoldan biriyle toksin alan kişilerde BEN görülebilmektedir. Bazı hayvanlar OT-A'yı hidrolizleyerek OT- ve L-teniIalanine, bazıları ise daha az olasılıkla olmak kaydıyla 4 ve 10 OH-OT türevlerine dönüştürmektedir. Oluşan bu metabolitler toksik değillerdir. Ancak organizmada OT-A'nın metabolizmasının yavaş olduğu, domuzlarda oral dozun %66'sının absorbe edildiği ve bu absorbe olan toksinin yarılanma ömrünün 89 saat gibi uzun bir süre olduğu bildirilmiştir. Düşük düzeyde toksin içeren yemlerin tüketilmesi sonucu OT-A'ya ilişkin toksik etki genelde kronik etki şeklinde olmaktadır, ineklerde OT-A'ya ait LD50 değerleri Çizelge 1'de verilmiştir, ineklerde, 25 mg/kg kadar yüksek düzeyde toksin alınmadıkça, OT-A'nın vücutta kullanımlığı (bioavailability) düşük olduğundan, toksin işkembe yoluyla daha az toksik olan - forma hidroliz olmakta, süte ve idrara geçmemektedir. 317-1125 g/kg düzeyde doğal kontamine yemlerle beslenen iki süt ineğinin idrar ve sütünde OT saptanırken; OT- kalıntısı kas, karaciğer, böbrek, süt serumu ve idrarda bulunmuştur; ancak ineklerden birinin böbreklerinde 5 ug/kg düzeyinde OT-A belirlenmiştir.. OT'lerin akut toksisitesinin bir göstergesi olan LD50 değerleri hayvan cinslerine bağlı olmakla birlikte, bir cins içindede yaş, cinsiyet, diyet, vücuda veriliş yolu, genetik farklılıklar ve okratoksinin formu gibi faktörlerden de etkilenmektedir. 5. SÜT VE ÜRÜNLERİNDE OKRATOKSİNLER Mikotoksinlerle kontamine olmuş hayvan yemlerinin süt inekleri tarafından tüketimi, küflü peynir üretiminin kontrolsüz koşullarda doğal olarak yapılması ve üretim sırasında mikotoksijenik küflerle kontaminasyon sonucu süt ve ürünlerinde çeşitli mikotoksinler saptanmaktadır. Bu toksinler içerisinde aflatoksinler yüksek tosisiteye sahiptir. Günümüzde 22'den fazla ülkede süt ve ürünlerinde atlatoksin M, düzeyi üzerine yönetmelikler yürürlükte olup, bu yönetmeliklere göre maksimum tolere edilebilir aflatoksin M, miktarı 0-0.1 f/g/l arasındadır. Allatoksin yanında okratoksin, sterigmatosiztin, penisillik asit, patulin, mikofenolik asit, rokfortin ve sikloplazonik asit gibi toksinlerde süt ve süt ürünlerinde rastlanmaktadır.

Çizelge 1. Bazı hayvanlarda OT-A için LDM değerleri (2). Hayvan cinsi Ördek Erkek sıçan Dişi sıçan Yeni doğmuş sıçan inek Keçi Dişi kobay Erkek kobay Bir günlük civciv Alabalık LD50 değeri 150 g 28mg/kg 20 mg/kg 3.90 mg/kg 13 mg/kg 3 mq/kg 8.1 mg/kg, 9.1 mq/kg Ş.3-3.9 mg/kg 4.67-5.53 mg/kg Valenta ve Goll (1996) Almanya'nın batı bölgesinden topladıkları 121 inek sütü örneğinde OT-A'ya hiç rastlamazken. Breltholtz - Emanuelsson ve ark (1993) İsveç'te 5 farklı ciltlikten farklı hatlardan aldıkları 36 adet inek sütü örneğinin 31'inde OT-A düzeyini < 10 ng/lt, 5'inde ise 10-40 ng/l olarak saptamışlardır. Çizelge 2. İnek Sütlerindeki OT-A miktarları. Örnek Alınan Yer Ot-A İçeren Örnek, Sayısı Toplam Örnek <10ng/l 10-40ng/l Sayısı Lycksele Haziran -Temmuz 4 2 6 6 0 6 Ostersund 5 1 6 Uppsala 5 1 6 Visby 6 0 6 Maimö 5 1 6 Toplam 31 5 36 Diğer yandan çeşitli ürünlerde OT-A düzeyleri üzerine yapılan bir araştırmada İtalya'da 50 adet anne sütü örneğinin % 18'de 1.7 ile 6.6 g/kg düzeyinde OT-A belirlenmiştir. İsveç'te laktasyon dönemindeki kadınlardan alınan 39 kan ve 40 süt örneğinin OT-A içeriği açısından araştırıldığı bir çalışmada anne sütü örneklerinin % 58'inde 10-40

ng/t aralığında, insan kanı örneklerinin ise hepsinde 90-940 ng/l aralığında OT-A saptanmıştır. Sierra Lone'de 113 annenin sütünde OT-A ve çeşitli allatoksin varlığı araştırılmış ve örneklerin % 35'i nin ÖT-A içerdiği, bunların bir kısmının diğer mikotoksinleri de içerdiği bildirilmiştir. Cheddar peynirlerinde mikotoksin üreten küflerin izolasyonu üzerine yapılan çalışmada 4 adet izolatin OT-A ürettiği bildirilmiştir. 11 İsveç peynirinde ise mikotoksin üretimi incelenmiş hiç birinde OT-A bulunmamıştır. Mikotoksinlerin peynirlerdeki riskini ortaya koymak amacıyla komposit peynirlerle yapılan bir araştırmada analiz edilen 25 örneğin 12'slnde <50 g/kg, 3'ünde >50 g/kg düzeyinde OT-A; 2'sinde ise 100 g/kg şiirinin saptanmış, hiçbir örnekte sterigmatosiztin ve sterigmatoslztin sentezleyen A.versicolor saptanmamıştır. OT-A saptanan 15 örneğin 13'ünde okratoksin sentezlediği bilinen P.viridicatum ve P.cyclopium, şiirinin saptanan ancak OT saptanmayan 2 örnekte ise P.cycloplum saptanmıştır. Çalışmada sonuç olarak örneklerdeki OT-A ve okratoksijenik küfler arasında iyi bir korelasyon olduğu ortaya konmuştur. Bir başka çalışmada ise; 1980 yılında analiz edilen 25 peynir örneğinin 15'inde OT-A, 2'sinde şiirinin; 1981-1982 yıllarında analiz edilen 19 örneğin 3'ünde OT-A ve 15'inde şiirinin saptanmıştır. 1980 yılındaki araştırmada maksimum OT-A düzeyi 260 g/kg; 1981-1982 yıllarındaki araştırmada ise OT-A düzeyi 7 g/kg olarak belirlenmiştir Portekiz de 1990-1993 yıllan arasında yapılan bir çalışmada flamengo, casteloes, camembert, az yağlı peynir ve emmental peynirlerinden oluşan 182 peynir örneğinde allatoksin B1, B2, G1,G2, ve M1, OT-A, sterigmatosiztin ve patulin analizleri yapılmış, örneklerin hiç birinde toksin bulunmamıştır. İspanya'nın La Çoruna ve Arzua bölgelerindeki 10 peynir işletmesinden izole edilen 410 Penicilllum, 120 Aspergillus türlerinin toksin sentezleme kapasitelerinin araştırıldığı bir çalışmada ise elde edilen Penicllium türlerinin %21,1'inin ve Aspergillus türlerinin % 5.4'ünün OT-A sentezlediklerini belirtmişlerdir. Mısır'ın Kahire ve Giza kentlerinde piyasadan toplanan 30 sert, 28 kareis peynirinde mikotoksin içeriği incelenmiş, ancak hiç bir örnekte OT-A tespit edilmemiştir. Skinjar ve ark.(1996) yoğurt bakterilerinin ve bifidobakterlerin inkübasyon aşamasında sütteki OT-A miktarına etkisini araştırdıklarında çalışmalarında; 0.05 ve 0.1 mg/l

OT-A içeren sütten S. salivarlus subsp. thermophilus, L. delbrueckii subsp bulgaricus ve Bifidobacterium bilidus kullanarak yapılan ürünlerde hiç toksin saptanmadığını, ayrıca yoğurt bakterilerinin de (S. salivarius subsp. thermophilus, L delbrueckii subsp. bulgaricus) 0.5 mg/l OT-A içeren sütten yapılan yoğurtlarda tüm toksinleri degrade ettiğini bildirmişlerdir. Mikotoksijenik küflerin üremesine ve mikotoksin sentezine etki eden faktörler arasında su aktivitesi, ph, ortamdaki antimikrobiyal maddeler gibi iç etmenler ve depolama sıcaklığı, ortamın nisbi nemi, ortamdaki gazlar gibi dış etmenler yer almaktadır. Diğer yandan çeşitli antimikotik maddelerin, mikotoksijenik küflerin gelişimi ve mikotoksin sentezi inhibisyonlarına ilişkin etkileri araştırılmaktadır. Bu çerçevede yapılan çalışmalarda sorbik asit, propiyonik asit, benzoik asit ve bunların tuzları, sodyum diasetat, esansiyel yağlar en çok kullanılan maddelerdir. Çeşitli bitkisel ve hayvansal gıdalarda oldukça yaygın olan OT lerin gıda ve yemlerde izin verilen maksimum miktarlarını içeren limitler son yıllarda çeşitli ülkelerin yönetmeliklerinde yer almaya başlamıştır. Dünyada 77 ülkede mikotokslnlerle ilgili çeşitli yönetmelikler mevcut olup, 8'inde bir veya birden fazla üründe OT-A ile ilgili standart, 3'ünde ise tavsiye niteliğinde kararlar vardır. Bu ülkelerdeki OT-A'ya ait limitler Çizelge 3'de verilmiştir. Ayrıca birkaç ülkede OT-A yönetmeliği ile ilgili tavsiye niteliğinde kararlar vardır. OT-A için tavsiye edilen limitler bebek ve çocuk mamalarında 1-5 pg/kg, diğer gıdalarda 2-50 fig/kg ve yemlerde 5-300 pg/kg arasındadır. Avrupa Topluluğunda ise OT-A düzeyinin bebek mamalarında 1 pg/kg ve hububatlarda ise 5 pg/kg olması gerektiği belirtilirken, 1997 yılında Avrupa Topluluğuna dahil ülkelerde tüm gıdalar için OT-A miktarının 4-5 ppb olarak sınırlandırıldığı bildirilmiştir. Türkiye'de ise 1997 yılında yürürlüğe giren Türk Gıda Kodeks Yönetmeliğinde gıdalarda mikotoksinlerden sadece aflatoksin, patulin ve ergotlarm miktarına ilişkin değerlere yer verilmiştir. 6. SONUÇ Yapılan bu çalışmadan da anlaşılacağı üzere süt ve ürünlerinde OTA varlığı üzerine yapılan araştırmalardan bir kısmı bu gıdaların OT-A açısından riskli gıdalar olduklarını gösterirken blf kısmı ise yönetmeliklerle kıyaslandığında, oldukça yüksek miktarda toksin içerdiğini göstermektedir. Bu kapsamda yemlerden süt hayvanlarına OT-A geçişi toksini! sütlerin süt ürünlerine işlenmesi, fermente süt ürünü kültürlerinin toksini etkilemesi ayrıca süt

ve ürünlerinin OT-A miktarları gibi Türkiye profilinin ortaya konması açısından ihtiyaç olduğu kanısındayız. Çizelge 3. Bazı ülkelerde OT-A için izin verilen maksimum tolere edilebilir miktarlar. Ülke Ürün Tolere edilen miktar ( g/kg) Brezilya Pirinç, arpa, kuru baklagiller, mısır 50 Çekoslovakya Aşağıdakiler dışındaki tam gıdalar 20 Bebek mamaları (tüketime hazır üründeki miktar) Çocuk gıdalar) 5 Danimarka Domuz böbreği 25 OT-A içeriği >25pg/kg ise tüm karkas red edilir Domuz böbreği 10 ÖT-Â içeriği 10>25 g/kg ise böbrek, karaciğer ve diğer iç organlar red edilir. Domuz böbreği <10 Sadece böbrek red edilir Fransa Hububatlar 30 Öneri niteliğinde Macaristan Tüm gıdalar 20 İsrail Yemlik tahıllar 300 Hollanda Hububatlar 3 Öneri nitelisinde Romanya Tüm gıdalar ve tüm yemler 5 İsveç Tüm domuz yemleri 00 tüm kanadı yemleri 1000 İngiltere Hububatlar 10 Endüstriyel öneri Yunanistan Kahve 20 1